（分析化学专业论文）液固界面上蛋白质迁移规律研究.pdf

摘要 蛋白质分离纯化是重组蛋白生产的瓶颈，高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 是分离和纯化蛋白，特别是制备规模上的最有效的方法，也是 制药工业中一种基本的分析和制备工具。蛋白质的性质与小分子不同，分离过程中，不 仅会因分子大小的巨大差别，而且还会因分子构象发生的变化，使两者在色谱中保留行 为存在很大差别。基于分离介质功能团和蛋白质的性质不同，优化分离操作参数是费时 且耗财的过程。不同的样品中多肽，蛋白，小分子在色谱中的保留行为差别很大，所以， 研究蛋白质在色谱中的保留行为规律对于色谱分离的条件优化和保留分子机理的研究 有重要意义。本文研究内容分为5 部分： 文献综述：现有的描述蛋白色谱保留模型都是从小分子的色谱保留模型发展而来， 在预测蛋白保留时间方面存在很大偏差。对现有的描述溶质色谱保留模型进行综述。共 引用文献1 4 8 篇，其中近三年的文献占到1 6 。 以疏水色谱柱为例，研究蛋白质在疏水色谱( h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y ，h i c ) 固定相界面上的迁移规律，对其保留时间和洗脱剂浓度、进样时 间等之间关系进行研究。首次发现梯度洗脱中，蛋白质在分子构象基本不发生变化的条 件下，其保留时问可分为不随进样时间变化的直线部分和随进样时间变化的开始迁移部 分，并首次提出蛋白质在色谱中不连续迁移的概念。通过对该过程的自由能变化计算发 现，对于同一根色谱柱，各种蛋白从开始迁移到完全洗脱的自由能变化为一定值，该自 由能变化的大小与所使用的色谱柱有关。最后利用大分子在h i c 中的保留行为规律，进 行大小分子的分离和缓冲溶液交换理论研究。 研究反相色谱( r e v e r s e dp h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，r p l c ) 乙腈一水体系中，在蛋 白质分子结构会发生变化，甚至变性的条件下，研究了流速对分离度和迁移的影响。结 果发现：r p l c 中小分子溶质的迁移速度随流速变化大，蛋白质类大分子溶质迁移随流 速变化小。且溶质的相对保留值与流速之间存在双对数线性关系。 研究了4 根商品弱阴离子交换( w e a k - a n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，w a x ) 柱中 存在的疏水相互作用机理。发现尽管存在的疏水作用强度不同，但是w a x 中存在h i c 机理是一个普遍现象。从分子机理上对该现象进行了解释，利用计量置换理论 ( s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r y ，s d t ) 对该现象进行了验证。 利用w a x 柱中存在h i c 机理进行了在线单柱二维液相色谱分离纯化工业0 【淀粉 酶，并进行在线缓冲溶液交换。与单独的商品h i c 柱进行比较发现，在线单柱二维分离 纯化效果要远优于单独的h i c 效果。 关键词：在线单柱二维液相色谱，蛋白质迁移规律，在线缓冲溶液交换，疏水色谱，弱 阴离子交换色谱，淀粉酶，蛋白分离 a b s 仃a c t t h ep u r i t ya n ds e p a r a t i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i n sa r et h et e c h n i c a lb o t t l e n e c ki n d o w n - s t r e a mt e c h n o l o g yo fb i o t e c h n o l o g y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) i st h eb e s tw a yf o rp u r i f y i n ga n ds e p a r a t i n gt h ep r o t e i n s ，e s p e c i a l l yi np r e p a r a t i v es c a l e ，i ti s a l s oa ni m p o r t a n ta n a l y t i c a lt o o li np h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y d u et ot h ed i s t i n c t i o no fp r o t e i n s a n ds m a l lm o l e c u l a rm a s s ，t h er e t e n t i o nc h a r a c t e ro fp r o t e i n sd u r i n gs e p a r a t i o np r o c e s sb y h p l ci sq u i t ed i f f e r e n tf r o mt h a to fs m a l ls o l u t e s t h ec h a n g e si nt h em o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n o f p r o t e i n sd u r i n gt h i sp r o c e s sm a yc h a n g ea n db r i n gi nm o r ed i f f i c u l t i e s s oi ti si m p o r t a n tt o o p t i m i z et h es e p a r a t i o np a r a m e t e ra n dt ou n d e r s t a n dm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fp r o t e i n r e t e n t i o n b e s i d e st h e r m o d y n a m i cf a c t o r s ，t h em i g r a t i o nr u l eo fs o l u t ei n v o l v i n gi nd y n a m i c f a c t o r si st h eo t h e ri m p o r t a n tt h i n gf o rt h i so p t i m i z a t i o n t h et h e s i si st oi n v e s t i g a t et h el a t t e r i n s t a n c e t h et h e s i sc o n t a i n sf i v ep a r t sa sf o l l o w ： f r o mt h er e c e n td e v e l o p m e n to fp r o t e i nr e t e n t i o nm o d e lw a sr e v i e w e d w h e nt h e r e t e n t i o nm o d eo fs m a l ls o l u t e si se m p l o y e df o rt h ep r e d i c t i o no fp r o t e i nr e t e n t i o n , ag r e a t d e v i a t i o no c c u r s t h i sf a c ti n d i c a t e st h a ts o m ep r o b l e m ss c i e n t i s t sh a v en e tb e e nf o u n dy e t 1 4 8r e f e r e n c e sw e r ec i t e d ，t h er e c e n t3y e a r sr e f e r e n c e sa c c o u n tf o r16 t a k eh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h yf f i i c ) c o l u m na sa ne x a m p l e ，t h e m i g r a t i o nr u l eo fp r o t e i n so nt h ei n t e r f a c eb e t w e e nt h es t a t i o n a r yp h a s eo fh i ca n dm o b i l e p h a s ew a si n v e s t i g a t e d i ti sf i r s t l yf o u n dt h a td u r i n gg r a d i e n t se l u t i o na n dt h em o l e c u l a r c o n f o r m a t i o no fp r o t e i n sr e m a i n si n v a r i a n c e ，p r o t e i n sr e t e n t i o ni si n d e p e n d e n to ft h ei n j e c t i o n t i m eu n t i lt oas p e c i f i cv a l u ef o re a c hp r o t e i n t h u s ，t h er e t e n t i o no f p r o t e i nc a l lb es e p a r a t e d t w op a r t s ：p r o t e i na l m o s td o e sn o tm o v e 勰m o b i l ep h a s es t r e n g t hi sw e a k e rt h a nac e r t a i n v a l u ea n dp r o t e i ns t a r t st om i g r a t eu n t i li ti se l u t e do u t i nt h el a t t e ri n s t a n c e ，aq u a n t i t a t i v e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep r o t e i nm i g r a t i o na n dt h em o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o nw a sf o u n d b a s e do nt h i sf a c t ，an e w c o n c e p to f p r o t e i n sd i s c o n t i n u o u sm i g r a t i o ni sf i r s t l yp r o p o s e d f o rr e v e r s e dp h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p l c ) ，u s i n ga c e t o n i t r i l e - w a t e ra sm o b i l e p h a s e ，w h e np r o t e i n sw e r es e p a r a t e du n d e rt h ec o n d i t i o no fm o l e c u l a rc o n f o r m a t i o no f p r o t e i n sc h a n g e s ，e v e nd e n a t u r e ，t h ef o r e g o i n gd i s c o n t i n u o u sm i g r a t i o nw a s a l s of o u n d s m a l l s o l u t e sw e r ef o u n dt om o v ef a s t e rt h a np r o t e i n sw h e nv e l o c i t yo fm o b i l ep h a s ei n c r e a s e ，a n d a l s of o u n dal o g l o gl i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nr e l a t i v er e t e n t i o nt i m ea n df l o w - r a t e f o u rc o m m e r c i a lw e a k a n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ( w a x ) c o l u m n sw e r et e s t e d w h e t h e rh i cr e t e n t i o ne x i s t s ，o rn o t t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l ti n d i c a t e st h a tt h ee x i s t e n c eo f h i cm e c h a n i s mi na l lo fw a xc o l u m ni sau n i v e r s a lp h e n o m e n o n ，i e ，e a c ho fw a xc o l u m n u i h a sam i x e d r e t e n t i o nm o d eo fw a xa n dh i c ，a l t h o u g ht h ee x t e n ti sd i f f e r e n t t h e p h e n o m e n o nw a se x p l a i n e db ym o l e c u l em e c h a n i s ma n dt h es t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n t t h e o r y ( s d t ) w a su s e dt ot e s tt h i sp h e n o m e n o n t h eh i cm e c h a n i s me x i s t e di nw a xw a su s e dt oo n l i n et w o d i m e n s i o n a l l i q u i d c h r o m a t o g r a p h yu s i n gas i n g l ec o l u m n ( 2 d l c 一1c ) t os e p a r a t ei n d u s t r ya a m y l a s ef i r s t l y , a n d b u f f e re x c h a n g ew a sc a r r i e do u ta l s ow i t ho n - l i n em a n n e r c o m p a r e dt oc o m m e r c i a lh i c ，t h e p u r i t ye f f i c i e n c yo f2 d l c - 1ci ss u p e r i o rt oe i t h e ras i n g l eh i cc o l u m n ，o ra 懈i e c c o l u m n k e yw o r d s ：o n l i n et w od i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h yu s i n go n ec o l u m n , p r o t e i n m i g r a t i o nr u l e ，o n - l i n eb u f f e re x c h a n g e ，h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y , w e a k - a n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , a - a m y l a s e ，p r o t e i ns e p a r a t i o n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 茎主薹妻嚣：主雪一指导教师签名：监 学位论文作者签名：塞：l 毖：指导教师签名：= j 堕坠1 1 里= 三 伽7 年月加加7 年易月旧 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：玉j 硼刍 伽7 年厂月p 日 西北大学博士学位论文 第一章文献综述 蛋白质分离纯化是重组蛋白生产的技术瓶颈，快速的发展和优化纯化过程对于缩短 和降低蛋白生产成本至关重要【。高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ， 玎p l c ) 是制药工业中一种基本的分析和制备工具。基于分离介质功能团的性质、配基 的浓度、间隔臂、孔结构、传质特征和基质的不同，色谱吸附剂可分为不同的种类。筛 选合并分离操作参数和色谱吸附剂是费时且耗财的过程。在复杂生物体系和制药工业 中，有大量需要定性和定量的目标分析物，如药物、代谢物、生物标记物、杂质、降解 产物等【2 】。它们存在于各种不同的基体及化学反应过程中、包括合成反应、生物流、微 生物代谢过程等。由于生物样品的成份复杂，性质含量差别都很大，所以分离鉴定不同 的成份就变得很复杂，另外对于生物样品中的基础功能性蛋白的研究，还要求分离的同 时保持其生物活性，这就要求在分离分析时，选择合适的方法。不同的样品中多肽，蛋 白，小分子在色谱中的保留行为差别很大，所以研究溶质在色谱中的保留行为规律对于 色谱分离条件的优化和分子保留机理的研究具有重要意义。 1 1 反相高效液相色谱在生物大分子分离纯化中的应用 反相高效液相色谱( r e v e r s e dp h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，r p l c ) 是当前非常流行 的分离模式，可用于分离不同种类的化合物，如多环芳烃、脂肪酸酯和离子化合物如羧 酸、氨基酸、多肽、蛋白质等 3 1 。r p l c 代表了一种最重要的蛋白和多肽分析方法 4 4 1 ， 除了具备高分离能力外【9 d 1 1 ，由于r p l c 使用可挥发性流动相，所以与其它蛋白纯化技术， 如疏水色谱( h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，h i e ) 和离子交换色谱( i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ，i e c ) 相比有很大优势，因为在h i c 和i e c 中必须进行样品的除盐。但 在r p l c 中难以回收蛋白，因为r p l c 中使用如水三氟乙酸( t r i f l u o r o a c e t i ca c i d ，t f a ) 乙腈( a c e t o n i t r i l e ，a c n ) 混合溶液等苛刻条件【1 2 d 4 1 ，容易导致蛋白伸展，质量和活性 损失。蛋白和多肽为大分子，具有不同物理化学特性如酸碱特性、疏水性等的基团随机 的分布于他们的结构中。使用的流动相条件( 即有机添加剂的种类和量，p h ) 决定了这 些大分子的特殊结构【1 5 ，1 6 】。此外，在梯度洗脱过程中，由于溶质的溶剂化效应会附加的 改变其结构。反相分离中一个重要的特征就是多肽和蛋白在r p l c 中，当流动相中有机 添加剂的量改变- d , 部分时，就会导致溶质立即洗脱1 1 7 - 2 7 1 。b o a r d m a n 和p a r t r i d g e1 2 8 】在研 究细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ) 吸附等温线中首次提出多个氨基酸残基参与蛋白质在r p l c 第一章文献综述 吸附过程的概念，蛋白质和多肽的色谱行为很大程度上依靠自身与吸附剂接触部分的分 子组成，耿信笃等发展了一种能定量处理i e c 、h i c 、r p l c 中控制固定相和生物大分子 间吸附的置换剂的数量的模型【18 1 9 l 。按照这一模型，一定数量的洗脱剂分子围绕在大分 子结构周围，硅烷链也被平均数目的洗脱剂分子溶剂化。吸附过程被认为是一个多步骤 过程。在每一个吸附界吸附色谱过程中，大分子表面和疏水吸附剂间的洗脱剂分子被置 换，色谱保留k 与总的置换剂数目( z ) 和置换剂浓度有关吼】。 扣寿 m d 伪一个常数，包括固定相配基浓度，固定相与流动相比和这一过程中的平衡常数【墙l ， 式1 1 允许k 为流动相中洗脱剂浓度的函数来评估z 值。实验发现对于分子量为3 3 0 0 至1 4 4 0 0 0 d a 的蛋白质，z 值为3 2 0 之间( 流动相：异丙醇甲酸) 。水有机溶剂两相反相梯 度洗脱为多肽、蛋白和其它生物大分子的纯化提供了一个有用的工具。大的蛋白质通常 比小的后洗脱，但是这仅为一个近似的规律【2 9 t 州。梯度理论最初发展用于低分手化合物， 后来被扩展描述反相梯度 玎，l c 中生物大分子的行为p 。由于蛋白具有不同程度的离子 化，p h 和溶剂强度梯度离子交换色谱能被用作有价值的补充分离技术1 3 2 1 。合并第一维 的离子交换p h 梯度，反相色谱溶剂梯度能被用作二维分离蛋白质p 3 1 。 1 2 反相填料孔结构对溶质扩散的影响 溶质分子进出固定相的传质速率主要受柱床孔中的扩散影响1 3 4 1 。生物大分子在键合 硅胶固定相中的孔中的传质动力学速度较慢，因为有限的孔结构限制了大分子的扩散， 并导致了阳，l c 谱带的扩展和生物活性回收率的降低。孔的分布和大小对保留有很大的 影响。据报道减小填料孔大小能降低多肽的保留【2 9 1 。为最小化孔扩散和传质阻力，实心 非孔和薄层孔填料被研发。薄层孔填料具有很薄外层多孔层，相比于多孔填料，这些填 料能提供较短的分析物扩散路径，溶质在孔内有较好的传质特征，尤其对慢传质溶质， 如多肽和蛋白质p 引。非孔固定相装填色谱柱很大程度上减小了表面积，与多孔柱相比保 留较低【3 们。较弱的保留允许快速分离蛋白质和多肽，非孔反相短柱甚至可在几秒钟内完 成分离【3 7 3 射。薄层孔填料提供了好分离度与大负载量之间的一个折衷，具有薄层外壳的 填料被广阔的使用于液相色谱中【3 9 1 ，并在早期的液相色谱中作为化学键和相的支撑【柏1 ， 如今具有5 9 m 实心的和0 2 5 9 i n 厚的薄层孔3 0 n m 孔的填料已经实现商品化。最近，市场上 2 西北大学博士学位论文 也已出现了2 7 9 m 的薄层孔填料。与填充柱相比，整体柱分离介质由一整体的多孔分离 材料组成，在过去十年被集中研究，如提供了快速分离。整体柱与其它色谱填料的区别 在于其结构特征，这导致了流速阻抗的改善和高速分析。相比于多孔填料，整体柱床形 成了大直径的交连网络通道( 大孔) ，允许流动相快速流过柱床，内部孔( 内孔) 的比 例小于颗粒柱填料。大孔网络约占8 0 的总孔率，而内孔网平均孔大小1 0 2 0 n m ，约占 1 0 1 5 总孔率，小的微孔只占到很小的比例【4 1 1 。整体柱可通过不同方法制备且具有无机 和有机骨架【4 “7 1 。u r b a n 等【锕】比较了不同类型孔结构色谱填料，包括全孔、薄层孔、非 孔填料和硅胶基质整体固定相，除研究孔介质( 多孔性和孔大小分布) 结构的影响外， 还测试了用适用于小分子的梯度洗脱模型1 5 0 】来描述和预测蛋白质的梯度洗脱数据的有 效性，并考虑大分子蛋白在固定相中可利用的有限的孔。结果发现固定相的孔结构以不 同方式影响低分子量和大分子化合物分离效率( 塔板高度) 。当流速增加时，相比于其 它被测试的色谱柱，非孔和薄层孔柱折合板高增加较小。这些结果显示在薄层孔分离大 分子，限制扩散路径长度是有益的。梯度保留时间独立于色谱柱类型，并可通过反相梯 度洗脱理论进行计算。固定相的化学性质和孔的结构对色谱中蛋白分离度和保留有重要 影响。r p l c 蛋白梯度洗脱时色谱峰的乙腈浓度伊与色谱柱的类型有很大关系，而与梯度 模式关系较小，通常随着蛋白增大而增加。多孔填料柱中施常稍微大于薄层孔和非孔 填料和整体柱中的保留。装填非孔和薄层孔填料色谱柱以及整体柱在高流速下显示出对 蛋白分离效果好，这是因为与装填多孔填料色谱柱相比，这些色谱柱具有较低的传质阻 力小，能进行快速蛋白梯度分离。 1 3 离子交换疏水相互作用色谱及其混合模式色谱 两种分子作用力，静电相互作用力对应于离子交换色谱，疏水相互作用对应于反相 色谱和疏水相互色谱，用于各种蛋白分离纯化。静电作用力在四种液相色谱中存在，强 阳离子交换色谱( s t r o n gc a t i o ne x c h a n g e ，s c x ) ，强阴离子交换色谱( s t r o n ga n i o ne x c h a n g e ， s a x ) ，弱阳离子交换色谱( w e a kc a t i o ne x c h a n g e ，w c x ) 和弱阴离子交换色谱( w e a ka n i o n e x c h a n g e ，w a x ) ；而疏水相互作用色谱在两种类型的液相色谱中存在的较普遍，r p l c 和h i c ，反相色谱通常不适合天然蛋白或者以天然态存在的蛋白纯化，这是因为反相液 相色谱会使大多数天然蛋白变性。所以h i c 色谱是最适合的利用各种疏水作用纯化天然 态蛋白的方法【1 1 。i e c 色谱柱用各种配体化学修饰后可分为四种类型，这为优化蛋白质的 纯化提供了多种选择。由于氨基酸侧链的天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸使所有的 第一章文献综述 蛋白带电荷，蛋白在i e c 柱上的保留依靠固定相和蛋白之间的静电作用力强弱，所以i e c 成为蛋白分离纯化的通用型液相色谱( 1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，l c ) 。特定的蛋白所带的 净电荷与p h 和蛋白自身的确切组成有关。因此，在特定的p h 时，不同的蛋白质有不同 的净电荷，p h 的变化会改变每种蛋白的净电荷值，尽管在高p h 时，蛋白带更多的负电 荷，在低p h 时带更多的正电荷n 1 。阴离子交换色谱柱( a n i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , a e x ) 带正电荷能吸引代负电荷的蛋白质，在中性p h 条件下，大多数天然蛋白带负电荷。 对于少数带正电荷的蛋白质( 高等电点) ，可使用阳离子交换色谱( c a t i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , c a x ) 。 i - i i c 和i e c 是两种在生物大分子分离中使用最广泛的色谱，是由于i e c 具有高分离度 并且可以在接近生理条件下操作，这对于生物活性物质的分离尤其重要，因为需要维持 他们的天然形式。i e c 对敏感的生物大分子破坏小，如蛋白质。另外，i e c 为分离方法的 发展提供了很大的灵活性。疏水相互作用色谱也是纯化生物大分子的一种有用的色谱技 术f 5 1 5 2 】，h i c 利用中等盐浓度时色谱分离介质的疏水配基与蛋白疏水表面区域的可逆相 互作用进行分离【5 3 1 。在高盐浓度时，蛋白被吸附在h i c 上，如用于沉淀的盐，硫酸铵具 有很强的盐析效应。当盐浓度降低时，蛋白和配基表面包含的水也降低，因此趋向于降 低疏水相互作用强度。盐溶液的存在对蛋白的结构有退火效应，所以h i c 和分离蛋白质 不会使蛋白失活。h i c 为i e c 提供了一种正交色谱技术，由于h i c 和m c 的是操作色谱条 件很接近于人体的生理条件，如中性p h 盐，水溶液和室温等优点，所有这些都适合保持 蛋白的生物活性。当今，典型的生物大分子由两种色谱步骤组成：第一种，i e c ，接着 是h i c 5 引。 k e n n e d y 等首次合成了一种具有弱阴离子交换和疏水相互作用的混合模式填料，并 称之为用于蛋白分离w a x - h i c 混合模式填料【 】。后来r a s s i 等1 5 6 1 报道了一种聚合物基质 的w a x 填料具有相同的混合模式。前者解释h i c 模式来源于填料表面的化学结构，而后 者将h i c 机理来源归因于聚合物基质。一种商品化的w c x 柱被报道具有w c x 和h i c 混合 保留模式，并对其保留机理进行了定量地解释【期。使用混合机理在线单柱二维色谱 ( t w o d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h yu s i n gas i n g l ec o l u m n , 2 d l c - 1 c ) 法可快速纯化 蛋白，c r c n g 等对该方法的原理进行了解释i 弼】。然而混合机理可能导致一些问题出现，疏 水相互作用一种典型的非选择性作用力【5 9 j ，并引起蛋白的非选择性吸附，这在离子交换 色谱模式下的蛋白分离是不受欢迎的。相反静电相互作用是选择性作用力，有利于蛋白 在h i c 模式下分离。存在的其他种类的相互作用力可能会降低蛋白分离度及质量或活性 4 西北大学博士学位论文 回收率。为减小混合模式相互作用柱对蛋白分离的缺点，提高优点，需要对其进行进一 步的研究。 1 4 溶质色谱保留模型及保留时间的预计 目前对于色谱保留行为的描述有很多模型，如定量结构保留关系( q u a n t i t a t i v e s t r u c t u r e - ( c h r o m a t o g r a p h i c ) r e t e n t i o nr e l a t i o n s h i p s ，q s r r ) 、人工神经元网络( a r t i f i c i a l n e u r a ln e t w o r k s ，a n n ) 、计量置换理论( s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r y ，s d t ) 、线 性溶剂强度( 1 i n e a rs o l v e n ts t r e n g t h ，l s s ) 模型等。 1 4 1q s r r 模型 q s r r 概念的首次被在1 9 7 7 年的三篇文献中报道【6 0 , 6 1 6 2 1 ，后来相继出现了关于 q s r r 的多篇专注和评论 6 3 - 6 9 1 。为预测一个给定化合物的物理化学和生物学性质，首先 需要建立化学结构与所期望性质之间的关系。最理想的情况是使用一种可靠地定量关系 来进行描述。色谱能够提供大量结构不同的化合物定量、精确、可重现的数据的比较， 因为这些数据相关的，且所有的数据是在相同的实验条件下测定或者通过外推或内推标 准化的。q s r r 被认为是一个进行性质预测的模型，q s r r 提供的色谱数据能够从大量合 成或者计算机辅助设计结构中预选择中最有前途的药物候选者。另外，q s r r 分析也被 用于促进蛋白质组学中的蛋白鉴定。可靠地q s r r 被建立解释不同固定相上的分子保留 机理，以便合理的设计需要性质的固定相。q s 脚究的方法和目标如图1 1 所示。 通过使用计算机统计计量学技术，不同分析物的描述符保留参数被特征化。如果统 计和物理意义的q s r r 被获得，然后就可应用来： ( 1 ) 鉴定非常有用的( 相关特征) 结构描述符； ( 2 ) 预测新的被分析物的保留，鉴定未知分析物； ( 3 ) 了解给定色谱系统条件下的分离操作分子机理； ( 4 ) 定量比较单独类型色谱柱的分离特征； ( 5 ) 评估被分析物的非色谱物理化学特性，如亲脂性和解离常数； ( 6 ) 评估一系列相关的药物生物活性一类化学物质的材料特征 7 0 , 7 1 】。 5 第一章文献综述 瓣盥筌麓畿。一 裟器i ：警 图1 1 q s r r 研究的方法和目标 f i g u r e l - 1m e t h o d o l o g y a n d g o a l so f q s a rs t u d i e s q s r r 报据被分析物的化学结构和流动相和固定相的物理化学性质评估保留，几个成功 使用q s p g 方程预测等度保留的参数己被几个作者报道，如k a l i s z a n l 7 。7 ”、c a n 田”i 、 f o r g a c s 和c s e r h a t i _ q 、v f l k o f f ”，p a r kp 6 1 等。色谱界对于q s r r 模型的发展主要基于线性 和非线性模型技术，包括主成分回归( p r i n c i p a lc o m p o n e n tr e g r e s s i o n p c r ) a t , 7 7 1 , 部 分最小平方( p a r t i a ll e a s ts q u a r e s ，p l s ) p 8 1 和人工神经元网络( a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k s a n n ) 【7 9 ”】。其主要的目的是构建提高的q s p r 模型来预测不同盐条件下或固定相的溶 质保留行为，建立有价值的色谱阐明工具来说明溶质保留机理，由于在描述符产生和机 器学习算法方面的瓶颈，所以目前的方法仅适用于小分子。最近的研究集牛在t a e ( t r a n s f e r a b l ea t o me q u l v a l e n l ) 电子密度衍生描述符技术对大分子如蛋白质的实用性川。 s o n g 等使用支持矢量回归预测阴离子交换色谱系统中的蛋白保留时间p “，结果显示这种 技术发展的q s r r 可包括很大范围内的蛋白包括不同的大小，形状功能，对树脂的 选择性。在将来这种技术可能适用于不同的色谱条件对决定适合的蛋白纯化条件很 重要。蛋白在阴离子交换色谱条件的行为可通过传统和电子密度分子特征描述符量化。 43a n n 预测多肽保留时间 由f 多肽的色谱保留时间与自身的化学组成有关，多肽保留行为的预测已经在反相 西北大学博士学位论文 色谱【8 3 渤1 和正相色谱色谱被描述【9 1 1 ，一种是使用线性回归模型【- 9 0 l 从自身的氨基酸序 列评估多肽的保留时间。然而，这些方法是有限的，因为不能应用于超过1 5 2 0 个氨基 酸的多肽f 别，另外的一种方法是利用a n n ，这是利用机器学习算法解决非线性问题【鹳， 珏1 0 1 1 ，并且用于模仿q r s s 预测被分析物的保留时间。其工作原理如图1 2 所示，先前报 道的a n n 预测液相色谱多肽保留时间的方法利用了由2 0 个输入点的多层建筑，2 0 个输入 点对应于2 0 个不同氨基酸【别。已经有关于胰蛋白酶酶解蛋白片段鉴定保留时间预测的研 究i 1 0 2 1 0 5 1 。 o z 口o ， o l 托u n dn r t 图1 2 人工神经元网络预测多肽分离原理图【1 0 5 1 f i g u r e1 - 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fa n np r e d i c t i o np e p t i d es e p a r a t i o n 软离子化技术的发展，如m a l d i 和e s l 2 与新型质谱连用驱动了多肽和蛋白分析化学 发展。典型的“自下而上一的l c m s m s 蛋白质组学实验要处理含几百到几千种物质的 复杂混合物。合理的分析产生数据包括假阳性可能性评估1 1 0 6 1 ，促进了蛋白质组学研究， 尽管最近质谱的进步被用于辅助提高蛋白鉴定的确定性姒1 0 2 , 1 0 7 l 或减小分析时间【1 0 引。多 肽色谱保留时间提供一个极好的过滤标准，这是由于容易利用，包含的信息与多肽的组 成和序列有关。为此，v i cs p i c e r 等发展了一种s s r c a l c 算法( s e q u e n c e s p e c i f i cr e t e n t i o n c a l c u l a t o r ) ，考虑了r p l c 多肽离子对【1 - 1 1 0 1 。 7 ， j 2 盆z奄暑卫堇 第一章文献综述 1 4 4 线性溶剂强度模型 r p l c 保留参数伴随着流动相组成的改变，与线性溶剂强度( l s s ，l i n e a rs o l v e n t s t r e n g t h ) 模型一致【1 1 1 1 1 2 1 。在该模型中，被分析物的保留因子的对数l o g , 与二元溶剂洗 脱剂中有机调节剂的体积分数碱性相关： i o g k = l o g k w s 伊 ( 1 - 2 ) k 是1 0 # 9 1 - 推至1 0 0 水做流动相时的值，即沪。时；s 是一个常数，与给定的被分析物的 性质和r p l c 系统有关。根据式l 一2 ，我们可通过外推至卿时测定l o g k 的值，然而，需 要几次的色谱循环因此消耗一定的时间。l s s 允许通过两个梯度r p l c 实验计算l o # w 和 g 儿1 - 1 1 扪。该计算可通过商品软件完成。当然，) 习l o g k w 和河计算对应于任何选择的等 度条件保留系数。所有这些都可能对应于基础的l s s 方程： k = ( t o b ) l o g ( 2 3 k 0 6 + 1 ) + f o + ，d ( 1 - 3 ) t o 是死体积，肠是硅梯度开始时等度值，幻是梯度延迟时间，6 为梯度斜率参数，测定方 法如下： 6 = t o a 筘t o = 圪筇t o f ( 1 4 ) 这里v m 是柱子死体积，q 是流动相组成的改变值，g 是梯度时间，是流速，s 定义 如前所述。文献中阐述了一个更加综合全面的方程i 3 1 。以溶质保留值与流动相中强溶 剂浓度线性关系方程作为理论基础，得到梯度洗脱条件下溶质的保留时间。该方法对于 小分子样品预测结果比较准确，是目前普遍应用的方法。但是对于蛋白质、多肽等生物 大分子，其色谱保留行为极其复杂，这些以线性色谱保留行为为基础的方法就不太适用 p 1 4 。 1 4 5 平均表面疏水性预测疏水色谱中的溶质保留 该方法基于蛋白质的平均疏水表面积( m 。) ，而疏水表面积通过三维结构数据 和溶剂可接近的蛋白疏水氨基酸残基进行评估。该方法使用缸。通过简单的二次方程 模型评估蛋白的保留时间。二次方程的系数与h i c 中使用的色谱条件( 初始盐浓度，盐 种类，基质类型) 有关【1 1 绷。为描述蛋白在c 中的保留，定义一个无量纲的保留时间 ( d i m e n s i o n l e s sr e t e n t i o nt i m e ，d r t ) ，如下式所示： d r t ：r t - t o( 1 5 ) f 厂一t o 8 西北大学博学位论女 尺，为色谱图中峰最高点对应的时间，删应的梯度开始时的时间，n 对应梯度结束时的盐 浓度。如果疏水柱中蛋白不保留，蛋白的d r g o 。该方法基于平均表面疏水性，假设 蛋白表面的每个氢基酸都对疏水性有一定的贡献，并与溶剂接触面积成比例；因此： 丸。：掣 ( 1 _ 6 ) o ， 南响。给定蛋白的疏水表面计算值，i ( i = l ，2 0 ) ：- 值代表不同的标准氨基酸) ， 是溶剂可接触的氨基酸面积，再“是给定氨基酸的疏水值，品是蛋白质的总的溶剂可 接触面积。图1 3 解释了该方法的操作原理：蛋白质数据库( p r o t e i nd a t ab a n k , p d b ) i t l 6 l 被输入程序g r a s p ( g r a p h i c a lr e p r e s e n t a t i o na n da n a l y s i so fs u r f a c ep r o p e r t i e s ) ，暴露的 氨基酸的总的( 墨) 和部分( 5 枷) 溶剂可接触面积被测定。然后，使用归一化的氨基酸 比例和式1 - 6 ，评估蛋白质的平均表面疏水性。最后一个二次方程被用于计算无量纲的 蛋白保留时间( d r t ) 。该方法对单体和多聚体蛋白都有效。 黝】 f h 0 也。；掣 气r 嘶“ v b 圈徽愁 “c e 銎要 图1 - 3 平均表面疏水性预测蛋白保田示意图1 f i g u r e 】3 s c h e m a l i cr e p r