（细胞生物学专业论文）α半乳糖苷酶基因mel1在大肠杆菌和酵母中的表达.pdf

独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。 尽我所知， 除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他 人己 经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研 究 生 签 名 : a 4 -2 1 时间:俨硬 年 6月 ， 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了 解湖南农业大学有关保留、 使用学位论文的规定， 即: 学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅， 可以 采用影印、 缩印或 扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研 究 生 签 名 :? i ， 叫 士 年 d 月 )日 导师签名: 时间 时间 夕 了 - 4 f-柳 摘要 。 一 半乳糖昔酶也称蜜二糖酶， 是催化。 一 半乳糖昔键水解的酶类， 是广泛存 在于自 然界的一种外切糖昔酶.能催化二半乳糖昔键的水解，即能水解非还原 性末端以。 键结合的半乳糖昔化合物， 因此它能水解蜜二糖、 棉子糖、 水苏糖和 毛蕊花糖等低聚糖， 还能水解含有a 一 半乳糖普键的杂多糖. 现今对a 一 半乳糖昔酶的研究表明，该酶在饲料、制糖、食品、医药工业等 领域具有广泛的应用前景. 豆粕是目 前应用最广泛的植物性蛋白饲料， 但豆粕中 含有一类a 一 半乳糖营低聚糖抗营养因子， 影响营养物质的吸收利用， 如棉子糖， 水苏 糖等. 。 一 半乳糖昔酶的应用一方面使这类寡糖得以 利用， 同时可以 通过减少 抗营养因子来提高豆粕的利用率， 消除胀气.实验表明， 添加。 一 半乳糖普酶可 提高豆粕饲料有效代谢能8 % ,可消化蛋白7 % .目 前我国豆类饲料的年消耗约为 1 0 0 0 万吨，广泛使用酶制剂后，相当于增加利用豆类达8 0 万吨/ 年，因此开发 a 一 半乳糖普酶作为饲料添加剂，极富社会与经济价值. 本研究通过比较a 一 半乳糖普酶基因m e l t 在酿酒酵母、 大肠杆菌、 毕赤酵母 中的表达情况， 来选择a 一 半乳糖昔酶适宜的表达系统， 为a 一 半乳糖昔酶最终的 工业化生产奠定基础. 1 . a 一 半乳糖昔酶基因m e l 1 在酿酒酵母中的表达 用p c r方法从酿酒酵母a h 1 0 9 中扩增出a 一 半乳糖普酶m e l i 基因片段， 与乙醇脱氢酶组成型启动子重组后构建成表达重组质粒 p g a d - g a l .将重组质粒 p g a d - g a l转化不带a 一 半乳糖昔酶基因的酿酒酵母后， 在预先涂布有 x - a - g a l 的亮氨酸缺陷培养基 ( s d / - l e u ) 平板上选择到蓝色菌落. 实现了。 一 半乳糖昔酶 在酵母内的组成型表达，但其表达量低，蛋白分泌能力差， 2 . a 一 半乳糖昔酶基因m e l 1 在大肠杆菌中的表达 酵母编码。 一 半乳糖昔酶的基因m e l t 被扩增并克隆到表达载体p r s e t中. 重组质粒p r s e t - g a l 转化至相应的受体菌b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s ,阳性克隆经液体 培养和工 p t g 诱导表达. 通过s d s - p a g e 分析， 在5 0 k u 处有一目 的分子大小的亮带. 裂解细菌后经x - a - g a l 的显色底物反应， 液体变蓝. 表明:a 一 半乳糖普酶基因 m e l 1在大肠杆菌中得到了表达，糖基化对于维持此酶的生物活性不是必须的， 但a 一 半乳糖昔酶在此系统中表达后，往往形成包涵体，蛋白的分离纯化及酶复 性过程繁琐. 3 .。 一 半乳糖昔酶基因m e l t 在毕赤酵母中的表达 用p c r 方法从酵母a h 1 0 9 中扩增出。 一 半乳糖昔酶的m e l 1 基因， 将其克隆至 整合型载体 p g a p z a a中构建成组成型分泌表达酶产物的重组质粒 p g a p z a - g a l . 将线性化的重组质粒 p g a p z 。 - g a l电击转化至毕赤酵母 k m 7 1 ， 在含有 1 0 0 m g 加1 z e o c i n 和预先 涂布有x - 。 - g a l 的y p d s 平板上 选择到蓝色阳 性菌落， 发 酵培养酵母的上清夜经s d s - p a g e 分析， 在5 3 k u 处有特异分子带: 重组菌p g a p z 。 - g a l / k m 7 1 摇瓶发酵6 d 后，粗酶活达1 2 u / m l . 毕赤酵母可进行高密度发酵， 蛋白 具有较好的分泌能力， 糖基化程度低，a 一 半乳糖昔酶可进行组成型分泌表达， 此为。 一 半乳糖昔酶的工业化生产奠定了基 础. 通过比 较三种表达系统表达a 一 半乳糖昔酶的 情况， 毕赤酵母表达系统较适合 m e l 1 基因的表达. 关键词:a 一 半乳糖昔酶，m e l t，克隆，表达 a - g a l a c t o s i d a s e ab s t r a c t m e l i b i a s e i s t h e i t e n z y me - g a l a c t o s i s b o n d s , - g a l a c t o s i d a s e c a n a e x o g l y c o s i d a s e e x i s t o f h y d r o l y s i s i n g i n n a t u r e w i d e l y . h y d r o l y s i s a - g a l a c t o s i s b o n d， n a m e l y i t car h y d r o l y s i s g a l a c t o s i s c o m p l e x o f n o n - r e d u c t i v e e n d s b i n d i n g a - b o n d , s o i t c a n h y d r o l y s i s o l i g o s a c c h a r i d e s s u c h a s r a f f i n o s e , s t a c h y o s e , v e r b a s c o s e , e t a l . i t a l s o c a n h y d r o l y s i s h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e i n c l u d i n g a - g a l a c t o s i s b o n d s . r e c e n t r e s e a r c h t o a - g a l a c t o s i d a s e i n d i c a t e s t h a t t h e e n z y m e h a s w i d e l y a p p l i c a t i o n p r o s p e c t i n f i e l d s o f f e e d s t u f f , r e f i n i n g s u g a r , f o o d s t u f f a n d p h a r m a c e u t i c a l i n d u s t r y , e t a l . s o y a b e a n c a k e i s a p p l e d a s t h e w i d e s t v e g e t a l p r o t e i n f e e d s t u f f a t p r e s e n t t i m e , b u t i t i n c l u d e s a k i n d o f a n t i - t r o p h i c f a c t o r o f a l p h a - g a l a c t o s i s o l i g o s a c c h a r i d e s u c h a s r a f f i n o s e , s t a c h y o s e , v e r b a s c o s e e t c , w h i c h a f f e c t s a b s o r b a t i o n a n d u t i l i z a t i o n o f n u t r i m e n t s . a p p l i c a t i o n o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e c a n u t i l i z e t h i s k i n d o f o l i g o s a c c h a r i d e o n t h e o n e h a n d , a n d i n c r e a s e u t i l i z a t i o n r a t i o o f s o y a b e a n c a k e a n d e l i m i n a t e f l a t u l e n c e b y r e d u c i n g a n t i - t r o p h i c f a c t o r s a t t h e s a m e t i m e . e x p e r i m e n t a t i o n i n d i c a t e s t h a t a d d i t i o n o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e c a n i n c r e a s e p o t e n t m e t a b o l i s m e n e r g y 8 p e r c e n t a n d d i g e s t i b l e p r o t e i n 7 p e r c e n t . n o w t h e a n n u a l u s a g e o f l e g u m e f e e d s t u f f i s t e n m i l l i o n a n n u a l l y , e i g h t y t h o u s a n d t o n s l e g u m e w a s i n c r e a s e l y u t i l i z e d c o m p a r a t i v e l y a f t e r u s i n g e n z y m e p r e p a r a t i o n w i d e l y . s o i t h a s g r e a t s o c i e t y a n d e c o n o m y v a l u e t o d e v e l o p a n d p r o p a g a t e a l p h a - g a l a c t o s i d a s e a s f e e d s t u f f a d d i t i v e s . t h i s r e s e a r c h c h o o s e f e a s i b l e e x p r e s s i o n s y s t e m f o r a l p h a - g a l a t o s i d a s e b y c o m p a r i n g e x p r e s s i o n o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e g e n e m e l i i n s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e , e . c o l i a n d 川c h i a p a s t o r i s , w h i c h w i l l s e t u p f o r i n d u s t r i a l i z e d p r o d u c t i o n o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e 1 . t o e x p r e s s m e i i g e n e o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e i n s a c c h a r o m y c e s -3- cerevi siae. m e l t g e n e w a s a m p l i f i e d i n s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e a h 1 0 9 w i t h p c r , a n d r e c o m b i n a t e d w i t h a d h i c o n s t i t u t i v e p r o m o t o r t h u s r e c o m b i n a n t p l a s m i d p g a d - g a l i s c o n s t r u c t e d . t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p g a d - g a l w a s t r a n s f o r m e d i n t o y e a s t , a n d t h e b l u e y e a s t c l o n i e s w a s s c r e e n e d o u t o n s d / l o u - n u t r i t i o n a l m e d i a w i t h x - a l p h a - g a l . b l u e c o l o n i e s i n d i c a t e t h e a l p h a - g a l a c t o s i d a s e w a s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s i o n i n s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e , b u t e x p r e s s i o n q u a n t i t y o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e i s l o w a n d s e c r e t i v e c a p a b i l i t y o f p r o t e i n i s p o o r . 2 . t o e x p r e s s m e l t g e n e o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e i n e c o l i m e l t g e n e w a s a m p l i f i e d i n s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e a h 1 0 9 w i t h p c r , a n d r e c o m b i n e d i n t o e c o l i e x p r e s s i o n v e c t o r p r s e t . r e c o m b i n a n t p l a s m i d p r s e t - g a l w a s o b t a i n e d a n d t r a n s f o r m e d i n t o h o s t e . c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s . t r a n s f o r m e d s t r a i n w a s c u l t u r e d i n l i q u i d l b , a n d i n d u c e d w i t h i p t g . i t h a s a b r i g h t b a n d a b o u t 5 0 k u b y s d s - p a g e a n a l y s i s . x - a - g a l w a s a d d e d i n t o l y s e d c u l t u r e s , b l u e r e a c t i o n i n d i c a t e d a l p h a - g a l a c t o s i d a s e w a s e x p r e s s e d i n h : c o l i . g l y c o s y l a t i o n w a s n o t n e c e s s a r y t o k e e p a c t i v i t y o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e . b u t i t s o m e t i m e s f o r m s i n c l u s i o n b o d y a f t e r e x p r e s s i o n o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e i n t h i s e x p r e s s i o n s y s t e m , t h e p r o c e s s o f p r o t e i n p u r i f i c a t i o n a n d e n z y m e r e n a t u r a t i o n i s c o m p l i c a t e d 3 . t o e x p r e s s n m g e n e o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e i n p i c ma p a s t o r f s m e l l g e n e w a s a m p l i f i e d i n s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e a h 1 0 9 w i t h p c r , a n d c l o n e d i n t o i n t e g r a t e d v e c t o r p g a p z a a , c o n s t i t u t i v e a n d s e c r e t e d e x p r e s s i o n p l a s m i d p g a p z a - g a l w a s c o n s t r u c t e d . t h e l i n e d r e c o m b i n a n t p l a s m i d p g a p z a - g a l w a s t r a n s f o r m e d i n t o p i c h i a p a s t o r i s k m 7 1 b y e l e c t r o p o t a t i o n , a n d t h e b l u e p o s i t i v e c o l o n i e s w a s s c r e e n e d o u t o n y p d s p l a t e w i t h x - a - g a l a n d 1 0 0 m g / m l z e o c i n . t h e r e w a s a s p e c i a l 5 3 k u b a n d b y s d s - p a g e f r o m s u p e r n a t a n t o f y e a s t c u l t u r e ; a l p h a - g a l a c t o s i d a s e e n z y m e 一 4; a c t i v i t y w a s 1 2 u 加1 a f t e r f e r m e n t i n g p g a p z 。 - g a l / k m 7 1 f o r 6 d a y s . p i c h i a p a s t o r i s c a n p r o c e s s h i g h d e n s i t y f e r m e n t a t i o n . p r o t e i n h a s b e t t e r s e c r e t i v e a b i l i t y a n d l o w e r g l y c o s y l a t e d d e g r e e i n t h i s e x p r e s s i o n s y s t e m . a l p h a - g a l a c t o s i d a s e c a n p r o c e s s c o n s t i t u t i v e a n d s e c r e t i v e e x p r e s s i o n . a l l o f w h i c h e s t a b l i s h a r o u t i n e f o r i n d u s t r i a l i z e d p r o d u c t i o n o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e . p i c h i a p a s t o r i s i s c h o s e a s f e a s i b l e r e x p r e s s i o n s y t e m f o r e x p r e s s i o n o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e b y c o m p a r i n g e x p r e s s i o n o f a l p h a - g a l a c t o s i d a s e g e n e m e l 1 i n s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e , e . c o l i a n d p i c h i a p a s t o r i s k e y w o r d s : a l p h a - g a l a c t o s i d a s e , m e l t , c l o n e ,e x p r e s s i o n . ， . 食 占 曰雀 纷 潇r 侣 犷 门j书f白口”1 一半 乳 糖 昔 酶( a - g a l a c t o s i d a s e , c c - d - g a l - a c t o s i d e g a l a c t o h y d r o l a s e , 。 - g a l , e c 3 . 2 . 1 . 2 2 ) 也称蜜二糖酶， 是催化。 一 半乳糖昔 键水解的酶类，是广泛存在于自 然界的一种外切糖昔酶.能催化a - 半乳糖昔键 的水解， 即能水解非还原性末端以a 键结合的半乳糖昔化合物， 因此它能水解蜜 二糖、 棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖， 还能水解含有a 一 半乳糖昔键的杂 多 糖 d . 幻 ， 现今对a 一 半乳糖昔酶的研究表明， 该酶在饲料、制糖、 食品、医药工业等 领域具有广泛的 应用前景. 国外从6 0 年代即开始从微生物中筛选产a 一 半乳糖昔 酶的菌种、 并对a 一 半乳糖昔酶进行纯化及性质的研究c2 . 3 7 .我国于7 0 年代后期 开 始进 行微生 物产。 一 半 乳糖昔酶 及酶性 质的 研究f2 . ” . 1 . 1 a 一 半乳糖普酶研究概况 1 . 1 . 1。 一 半乳糖昔酶的结构特点 a 一 半乳糖昔酶与其它的糖普酶一样都是糖蛋白，由单肚糖基化而成，将纯 化的。 一 半乳糖昔酶用凝胶电 泳显示的是均一带.用考马斯亮蓝和s c h i f f 碱染 色c2 , 3 a ， 证明了。 一 半乳糖昔酶是一种塘蛋白， 将产a 一 半乳糖昔酶的细胞放在i c 的果糖溶液中培养，再将所产生的a 一 半乳糖昔酶进行凝胶电 泳14 c 标记的酶， 显 示出 一个单一的 放射性带，再将放射性的酶用一种p r o n a s e 的酶进行充分水解， 通过s e p h a d e x - 2 5 柱分离， 进一步证明。 一 半乳糖昔酶是由蛋白 质和搪两部分组 成.从a 一 半乳搪普酶这种糖肤分离下来的糖进一步分析， 这种连接于多肤上的 糖基是由6 - 8 个单糖组成的. 它们是甘露糖和乙酞葡萄糖胺， 并且甘露糖和乙酞 葡 萄 糖 胺的比 例大 约是2 . 8 : 1 1 . 1 . 2 a 一 半乳糖普酶的专一性 a 一 半乳糖昔酶对 0 - 糖昔键有高度专一性， 可作用于含有这种糖营键的多种 天然及人工底物， 如蜜二 糖、 棉子糖、 水苏糖、 人的b 型血抗原和对硝基苯a - d - 半 乳 毗喃糖普( p - n i t r o p h e n y l - a - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e , p n p g ) 等9 . 5 . 一般的 研究认为。 一 半乳糖昔酶的作用方式是断裂非还原性末端的a - d - 半乳糖昔键， 产 生一分子的。 - d 一 半乳糖， 但在9 0 年代以来的研究表明. 有些微生物。 一 半乳糖 昔酶 还能 水 解侧链 基团 是。 一 半乳糖昔键连接的 杂多 糖3 . 6同时 还发现同 一种 微 生物的几种a 一 半乳糖昔酶的作用方式不一样.r e i j i k a n e k a 7 在研究 a s p e r g i l l u s n l g e r 5 - 1 6的a 一 半乳糖昔酶的作用底物特异性时发现，粗酶液能 分解对硝基苯基一 a 一 半乳糖( p n p - g a l ) 和蜜二糖. 将粗酶液先用硫酸按沉淀，然 后经d e a f 一 纤维素柱、 s p - s e p h a d e x - 5 0 柱、亲和色谱柱进行纯化得到一种。 一 半 乳糖昔酶， 它能水解p n p - g a l ， 但不能水解蜜二糖.一方面说明此酶至少存在两 种同 工酶，另一方面说明 不同的a 一 半乳糖昔酶具有不同的底物特异性. 1 . 1 . 3。 一 半乳 糖昔酶的 活 性研究 a 一 半乳糖昔酶的活性可用蜜二糖及棉子糖， 也可利用对硝基苯酚a - d 一 半乳 糖昔作为 底物来测定(a . 不同的 微生 物产生的。 一 半 乳糖 昔酶的 最适p h 和温度的 范围各不相同.一般细菌分泌的最适p h 范围 在6 . 5 - 7 . 5 之间， 最适温度在3 7 c- 4 0 之间: 丝状真菌及酵母分泌的a 一 半乳糖昔酶的 最适温度范围比细菌要高 a ， 一般在5 0 0c - 6 0 之间， p h 范围 变化很大， 在4 . 0 - 8 . 0 之间. 一般来说，同 一种微生物的粗酶和纯化后的酶其作用最适温度相同， 但其热稳定性有差异c3 , 。 1 1 . 1 2 . 1 3 , 1 4 , 1 6 1 1 . 1 . 4。 一 半乳糖昔键的 分布 。 一 半乳糖昔键常见于一些寡糖， 如与一个葡萄糖结合形成密二搪，与一个 蔗糖结合形成棉子糖， 还有水苏 糖、 毛蕊花糖等中， 这些寡糖在植物和动物体内 广泛 存在， 如 大豆中 便含有约5 % 的 含。 一 半乳糖 昔键寡 糖u 6 . 1 7 。 大豆粕是一种优 质的植物性蛋白 质饲料， 具有粗蛋白 质含量高、 富含赖氨酸及其它氨基酸含量平 衡的营养特点， 因此被广泛作为畜禽饲料原料. 然而大豆中还存在一类对热稳定 的 抗营养因 子 大豆寡糖. 大豆寡搪主要由 蔗糖、 棉子糖和水苏糖组成， 占 大 豆碳水化合物的2 0 % 左右. 除蔗糖可以被充分利用外， 通常大豆碳水化合物的消 化率很低， 仅为总量的6 0 % ，与葡萄糖生物学利用的相对值仅为4 0 % 1 7 . 研究发 现，大豆碳水化合物消化率低与大豆寡糖的存在有关. 1 . 1 . 5。 一 半乳糖昔键的应用 1 . 1 . 5 . 1 a 一 半乳糖昔酶与豆粕饲料 豆粕是目 前应用最广泛的植物性蛋白 饲料，但豆粕中含有一类a 一 半乳糖昔 低聚糖抗营养因子，影响营养物质的吸收利用，如棉子糖，水苏糖.。 一 半乳糖 昔不能被家禽内源消化酶消化. 在肠道中经微生物发酵， 这些低聚糖转化成挥发 性脂肪酸，禽类能从中获得一部分能量，但比a 一 半乳糖普经酶水解直接转化成 单糖所提供给动 物的 总净能 要少得多( 16 . 7 田 。 一 半乳糖昔的代 谢能 较高， 微生 物发酵降低其代谢能值， 并增加了胃 肠道中的气体， 如二氧化碳， 氨和氢等， 可 引起胀气.研究表明，豆粕中含a 一 半乳糖普寡糖占 干重的 5 % 左右，。 一 半乳糖 昔酶的应用一方面使这类寡糖得以利用， 同时可以 通过减少抗营养因子来提高豆 粕的利用率，消除胀气. 玉米一 豆粕型饲料中含有大量的a 一 半乳糖昔，它是由 一 个蔗糖单位以a - 1 , 6 糖昔键连接一个或两个半乳糖构成的低聚糖。 a 一 半乳糖昔 具有良 好的热稳定性， 即使在很高的温度下都不会分解， 因此普通的饲料加工过 程不会使其失活9 ， .由 于动物消化系统内 缺乏分解a - 半乳搪普的酶， 饲料中 的a 一 半乳糖昔往往不能被动物吸收.a 一 半乳糖昔的存在，一方面增加了小肠内 容物的持水力和渗透性;另外，a 一 半乳糖昔在消化道后段被厌氧菌所代谢，产 生二氧化碳、 氢气及少量的甲 烷气体， 引起动物的消化不良， 腹胀等症状. 为消 除大豆的 抗营养因子， 传统的方法是提高大豆的加工温度、 压力、 湿度和时间. 然 而提高大豆加工温度、 压力、 湿度和时间， 势必造成豆粕品质的下降(19 , 2 0 1 . 现在， 经过研究发现，在传统的豆粕饲料中添加a 一 半乳糖昔酶，可显著提高豆粕的代 谢能和消化率， 又不致于损害豆粕的品质n a y 1 . 1 . 5 . 2。 一 半乳糖昔酶与制糖工业 在制糖工业中， 甜菜是重要的 制糖工业原料， 其中含有0 . 1 - 0 . 1 5 % 棉子糖， 虽然含量不多， 但却增加糖蜜粘度， 妨碍蔗糖结晶， 以 致产生大量废糖蜜， 既降 低产糖率又影响 蔗糖质量; 棉子糖本身又不能被利用， 因而， 棉子糖是甜菜制糖 工业中的一种有害物质， 为提高 蔗糖的收率曾 采用过化学提取法， 但均因工艺复 杂， 成本高， 难于 在工业中 应用. 玲木f o l 等 分离。 一 半乳糖 昔酶 用于甜菜制 糖工 业中， 可使甜菜废糖蜜中所含的6 - 1 0 % 棉子糖水解7 6 - 8 7 % ， 分解生成的蔗糖和废 糖蜜中原来所含的 蔗糖均能 提取出来， 使蔗糖产率提高 3 - 4 % .因 此， 这种工艺 称为“ 无废糖蜜制糖法” . 甜菜上部因含棉子糖过多，往往不能利用而废弃，采 用酶法制糖后， 则能充分利用. 并且节约能源， 缩短结晶时间， 使加工能力和设 备周转率都有很大提高 s 1 1 . 1 . 5 . 3 a 一 半乳糖昔酶与化学工业 在化学工业上， 利用a - 半乳糖昔酶的 转移酶活性，可改造环糊精.环糊精 是由多个d - 葡萄糖残基通过a - 1 4 - 键组成的环状、非还原性的寡糖， 它有与多 种无机物和有机化合物形成包含物的能力，可用于稳定敏感性物质、乳化油料、 掩盖气味等，用途十分广泛. a - 半乳糖营酶能把a 一 半乳糖残基直接连接到c d 环 上， 形成新的 支链c d ， 拓宽 c d 的应用范围(2 . 19 1 . 相关的研究正在进一步深入. 1 . 1 . 5 。 4。 一 半乳糖昔酶与血型改造 在医 学 上， 利 用a 一 半 乳 糖 昔酶 进 行 血型 改 造120 , 2 11 众 所周 知， 人 类的 血 型 有四种即0 型、 a 型、 b 型、 a b 型， 输错血易导致丧命，即使是被人誉为万能 血型的0 型血因有r h 阳性与r h 阴性之别， 在使用时也会偶而出现事故， 这己成 为一 种常识 人类b 型血红细胞膜上的 抗原决定簇即为末端含有a - 半乳糖基的 复 杂 糖链， 它具 有较强的免 疫 反应“ “ 2“ e ra . 如果 水解掉 这个半乳 糖残基， 就会使之转变为具有较弱免疫性的0 型血细胞. 这样使非0 型血细胞转变为通用 的。 型，以便于任何型的 血细胞都可输入任何血型的患者而勿需做配血试验 2 e 7 . 这种技术创新一旦成功， 将可避免血库因某种血型不足的问题， 降低某种血 型因 在有限期内用不完而过期报废的 数量， 还可降低血液的成本. 尤其是对保障 自 然灾害、 突发事件、 战争等特殊情况下的血液供应具有重要意义， 同时对镰刀 贫血症、地中海贫血症、白血病等需要反复输血以 维持生命的病人使用通用0 型血，也是最理想的 输血治疗方案ca u . ， 卜 2 3 1 . 1 . 5 . 5。 一 半乳糖昔酶与食品工业 在食品工业上， a 一 半乳糖昔酶可用于豆奶的发酵. a 一 半乳糖普酶可水解豆 奶中易使胃 胀气的蜜三糖和水苏糖，从而获得低a 一 半乳糖基寡糖含量的豆奶制 品. g a n i a t s 12. 31 等 研究了 一 种非 处 方的 a - 半 乳 糖 酶口 服 液b e a n o ， 利用 a - 半乳 糖 普酶缓解诸如胀气等胃 肠疾病. 这些疾病是由高纤维的饮食所致. 临床研究表明， a 一 半乳糖昔酶对预防胃 肠不适应某些寡糖有极好疗效(2 . 3 4 1 1 . 2 m - 半乳糖昔酶基因的研究进展 目 前从酵母等生 物中 获 得了 a 一 半 乳 糖昔酶的 基因， 被命 名为m e l t c- ， 并 构 成一个基因家族 1 . 2 . 1 m e l 1 基因的 特点 酿酒醉母m e l t 基因w ) 在g e n b a n k 中的登录号为: x 0 3 1 0 2. m e l t 基因是从酿 酒酵母菌a t c c 9 0 8 0 中克隆得到，其全长为2 . 8 k b :开放阅读框为1 4 1 3 b p， 编 码的蛋白为4 7 1 个a a， 其中n - 末端1 8 个a a 为信号肤序列: 成熟的肤段为4 5 3 个a a ， 分子量为5 0 k u 3$7 . 1 . 2 . 2蛋白 序列结构特点 m e l t 基因编码的蛋白 序列在氨基酸顺序数据库( s w i s s - p re y ) 中的登录号为: p 0 4 8 2 4，蛋白序列与结构如下: k e y s i g n a l c h a 州 a c t s i t e a c t s i t e d i s u l f i d d i s u l f i d c a r b o h y d c a r b o h y d c a r b o h y d c a r b o h y d c a r b o h y d c a r b o h y d c a r b o h y d c a r b o h y d c a r b o h y d f r o m t o l e n g t h d e s c r i p t i o n 1 1 8 1 8 1 9 4 7 1 4 5 3 1 4 9 1 4 9 2 0 9 2 0 9 4 2 7 4 1 2 1 1 5 1 1 0 5 1 0 5 1 7 5 1 7 5 2 7 0 2 7 0 3 7 0 3 7 0 4 0 3 4 0 3 4 1 3 4 1 3 4 2 2 4 2 2 4 3 5 4 3 5 4 5 4 4 5 4 a l p h a - g a l a c t o s i d a s e l . n u c l e o p h i l e( 毋 s l m i l a r i 动. p r o t o n d o n o r( 毋 s i m i l a r i 动， 毋 s i m i l a r i 扭 双 v s i m i l a r i t y . n - l i n k e d ( g i c n a c . . . )( p o t e n t i a l ) . n - l i n k e d ( g i c n a c . ， . )( p o t e n t i a l ) ， n - l i n k e d ( g i c n a c . . . )( p o t e n t i a l ) . n - l i n k e d ( g i c n a c . . . )( p o t e n t i a l ) . n - l i n k e d ( g i c n a c .， )( p o t e n t i a l ) . n - l i n k e d ( g i c n a c . . . )( p o t e n t i a 刀. n - l i n k e d ( g i c n a c . . . )( p o t e n t i a 刀. n - l i n k e d佑i c n a c . . . )( p o t e n t i a 刀. n - l i n k e d ( g i c n a c . . . )( p o t e n t i a 乃. i s l k g v f g v s p s y n g l g l t p q m g w d n w n t f l k d m g y k y i i l d d c w s s g r d s d g f l v a d e q n r v d y l k y d n d h l h n n s f l f c a g y p g s l g r i f y s l c n w g q e e e d a q f f a n d l t f y w g s g it a e f t r p d s r e i s y h r y k a m c p c d g d e y d c d t a d r i s d l g g m y s s a g e y t s d a l n k t g r p k y a g f h c s i m 酒酵母菌a t c c9 0 8 0 中克隆得到，熊全长为2 8 k b ；开放阅读框为1 4 1 3 b p ，编 羁麴蛋鑫淹4 7 1 个a 鑫，其中卜寒壤1 8 个矗鑫必镕号默穿烈；菇熟翳敖段淹4 5 3 个a a ，分子量为5 0 k u “8 1 2 2 蟹自序列结构特点 m e l l 蒸困编码戆爨鑫彦磺在鬣簇酸蹶序数撰簿( s w i s s - p r o ) 孛鳃登录譬为： p 0 4 8 2 4 ，蛋白序到岛结构如下： k e y s i g n a l c 队i n a c ts i t e a c ts i t e d i s u l f i d d i s u l f i d c a r b o h y d c a r b o h y d c 矗r 粥￥ c a r b o h y d c a r b o h y d c 矗r 器0 嚣￥转 c a r b o h y d c a r b o h y d c a r b 0 群d 疆、a 硝f t 舶铤 l k d m g y l c y i i c a g y p g s 撼r i h s l e n w g q f r o mt ol e n g t h d e s c r i p t i o n l1 81 8 1 9 4 7 1 4 5 3 1 4 9l 9 2 0 92 0 9 4 27 4 1 2 lt 5 1 5 0 51 0 5 1 7 51 7 5 2 7 02 7 0 3 7 03 7 0 4 0 34 0 3 4 1 3 4 1 3 4 2 24 2 2 4 3 54 3 5 4 5 4 4 5 4 i s l 蓦g v f g ￥s l d d c w s s g r d e e e d a q f f a n d l t f y w g s g i a l p h a g a l a c t o s i d a s e1 n u e l e o p h i l e ( 黟s i m i l a r i t y ) p r o t o nd o n o r ( b ys i m i l a r it y ) b ys i m i l a r i t y b ym m i l a r i t 舅 n - 1i n k e d ( g l c n a c ) ( p o t e n t i a ) n - l i n k e d ( g l c n a e ) ( p o t e n t i a l ) + n - l i n k e d 稻t c n a c ) ( p o t e n t i a ) n - 1 i n k e d ( g l c n a c ) ( p o t e n t i a ) n - 1 i n k e d ( g i c n a c 。) ( p o t e n t i a l ) n - l i n k e d ( g i c n a c ) ( p o t e n t i a i ) n - 1 i n k e d ( g i c n a c ) ( p o t e n t i a d n - 1i n k e d ( g l c n a c ) ( p o t e n t i m ) n - l i n k e d ( g i c n a c ) ( p o t e n t i a l ) p s y n g l g l t pq m g w d n 觥f s d g f l v a d e qk f p n g m g h v a