（纺织工程专业论文）非水相体系中蛋白酶aot离子对制备及其转酯化活性研究.pdf

摘要 摘要 新型纺织功能性材料是当前材料领域研究开发的重要方向。而对棉纤维进行复合、 改性来制备新型功能纤维是目前研究的热点之一。酶催化活性的双向性使某些蛋白酶能 在特定的环境( 如非水相体系) 中催化醇类与酯类的转酯化反应，这为棉纤维改性提供 了新途径。 本论文研究了表面活性剂a o t ( 二辛基磺化丁二酸钠) 含量的测定方法；并使用 a o t 以离子对转移枯草杆菌蛋白酶( b a c i l l o l y s i n ，e c3 4 2 4 2 8 ) 至有机相；考察了影 响转移的各因素并通过圆二色谱探讨转移前后酶在有机相中的酶结构；探讨了转移后酶 在有机相中的转酯化活性。 实验证明：a o t 与罗丹明6 g ( r h o d a m i n e6 g ) 溶液反应1 0m i n 即可反应充分， 甲苯萃取9h 可以萃取完全；制作离子对时，采用1 2 0r p m 磁力搅拌使两相混合能得到 较好的酶转移率，确定作用时间为6h 。水相初始p h 为5 0 有利于离子对的形成及酶蛋 白的转移。水相中c a c l 2 的加入有消除两相混合过程中的乳化的作用，但是过高浓度的 c a c l 2 会减弱酶分子与a o t 间的静电引力，不利于酶分子与a o t 的结合。水相中酶浓 度不变，随着有机相中a o t 初始浓度的增加，酶的转移率呈现增长趋势。固定异辛烷 中a o t 浓度，随着水相中初始酶浓度的增加，转移至有机相中酶量先增加后减少。转 移后的酶结构上并没有较大改变。进入异辛烷的酶分子仍旧保持活性，能催化转酯化反 应的进行，但随着反应时间的延长，酶的催化效率出现下降；在转酯化时发现离子对对 水相p h 有“记忆 效果。有机溶剂对酶活影响很大，考察了甲苯、异辛烷、吡啶三种 溶剂下的转酯化活性。 关键词：枯草杆菌蛋白酶；表面活性剂；非水相；离子对；转酯化 a b s t r a c t a b s t r a c t n e wf u n c t i o nm a t e d a l so ft e x t i l ei sa l li m p o r t a n td i r e c t i o no fr e s e a r c hn o w a d a y s t h e c o m p o s i t ea n dm o d i f i c a t i o no nc o t t o nt ot h ep r e p a r a t i o no fn e wf u n c t i o nf i b e ri so n eo ft h e h o t t e s t b e c a u s et h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fs o m ee n z y m e si sr e v e r s i b l e , t h et r a n s e s t e r i f i c a t i o n b e t w e e na l c o h o l sa n de s t e r sc a l lb ec a t a l y z e dw h e ne n z y m e si nas p e c i f i ce n v i r o n m e n t ( s u c h a sn o n a q u e o u sp h a s es y s t e m ) ，w h i c hp r o v i d e san e ww a yf o rc o t t o nf i b e rp r o c e s s i n g t h i sp a p e ri n v e s t i g a t e dt h em e t h o do fd e t e r m i n i n gt h ec o n t e n to fa o t ( d i o c t y ls o d i u m s u l f o n a t e ds u c c i n a t e ) t h e nu s e da o tt oe x t r a c tb a c i l l o l y s i n ( e c3 4 2 4 2 8 ) i n t oo r g a n i c p h a s ev i as u r f a c t a n t - e n z y m ei o np a i r t h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h e i o np a i rf o r m a t i o nw e r e i n v e s t i g a t e d t h es t r u c t u r eo fe n z y m eb e f o r ea n da f t e re x t r a c t i o nw a so b s e r v e db yc d s p e c t r o s c o p y a f t e re x t r a c t i o n t h et r a n s e s t e r i f i c a t i o na c t i v i t yw a sm e a s u r e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t10m i nw a sr e q u i r e df o ra o ta n dr 6 g ( r h o d a m i n e6 g ) t o r e a c ta n d9hw a sn e e d e df o rt o l u e n et oe x t r a c t i nt h ep r e p a r i n go fi o np a i r ，t h er e s u l t sp r o v e d t h a tm a g n e t i cs t i r r i n ga t12 0r p mf o r6hw a sb e t t e rt h a no t h e rm i x i n gm e t h o d s t l l ei n i t i a lp h o ft h ea q u e o u sp h a s ea f f e c t e db o t hf o r m a t i o no fe n z y l l e s u r f a c t a n ti o np a i ra n dt r a n s f e ro ft h e e n z y m ei n t ot h es o l v e n t 功eo p t i m a lp hw a sa b o u t5 0 。a d d i t i o no fc a c l 2c o u l dp a r t i a l l y p r e v e n te m u l s i f y i n gd u r i n gm i x i n g , b u te x c e s s i v ec a c l 2c o u l dn e g a t i v e l y a f f e c t e d t h e f o r m a t i o no fi o np a i ra n dt r a n s f e ro ft h ee n z y m ef r o ma q u e o u sp h a s ei n t os o l v e n t t h e t r a n s f e r r e da m o u n to fe n z y m ei n t ot h es o l v e n ti n c r e a s e dw h e na o tc o n c e n 仃a t i o nw a s i n c r e a s e d ，a l t h o u g ht h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no ft h ee n z y m ei nt h ea q u e o u sw a sk e p tc o n s t a n t h o w e v e r , w i t hac o n s t a n ta o ti nt h es o l v e n t ，t h ee n z y m et r a n s f e ri n c r e a s e dw i t ht h e i n c r e a s i n go ft h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no ft h ee n z y m ei nt h ea q u e o u sf i r s tb u td e c r e a s e dt h e n w i t hf u r t h e ri n c r e a s i n g t h ee n z y m es t r u c t u r eh a sn o tc h a n g e dal o ta f t e re x t a c t i o n r e s u l t s s h o w e dt h a te n z y m ee x t r a c t e di n t ot h eo r g a n i cp h a s ew a ss t i l la c t i v ea n dc o u l dc a t a l y z et h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o n t h er e s e a r c hs h o w e di o np a i rh a dt h ec h a r a c t e ro f ”p hm e m o r y ”t h e o r g a n i cs o l v e n t sc a ni m p a c tt h ea c t i v i t ys t r o n g l y t h et r a n s e s t e r i f i c a t i o na c t i v i t yo fe n z y m e i n t o l u e n e ，i s o o c t a n ea n dp y r i d i n eh a sb e e ni n v e s t i g a t e d k e y w o r d s ：b a c i l l o l y s i n ；s u r f a c t a n t ；n o n a q u e o u sp h a s e ；i o np a i r ；t r a n s e s t e r i f i c a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是举人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 签整掳! 日 期： 幽： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：丝壑堑导师签名：】乏丛 日 期： 渺7 6 第一章前言 第一章前言 1 1 非水相酶学 1 1 1 非水相酶学的概况 众所周知，酶作为一种高效的生物催化剂，能在十分温和的条件下起高效率的催 化作用，并且具有高度底物专一性。因此，它有着普通化学催化剂所无可比拟的优越性， 已广泛应用于食品、制药、轻纺和洗涤剂等工业领域。应该指出，这些应用大多是在水 溶液中进行的。1 9 8 4 年，美国麻省理工学院的科学家k l i b a n o v t l 】成功地实现了猪胰脂肪 酶在9 9 的有机溶剂中催化三丁酸甘油酯与醇之间的转酯化反应，并证实了酶在1 0 0 高温下，不仅能够在有机溶剂中保持稳定，而且还显示出很高的催化转酯化反应的活力。 他们的研究表明，只要条件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然 的疏水性底物和产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机 溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水的体系中表现出催化活性。通常 把仅含微量水或几乎无水的有机溶剂或无溶剂中进行的酶催化反应理解为宏观上的非 水相，而微观上是微水相反应【2 训。 在非水相中由于酶处于与水相完全不同的体系中，因此在水相中建立起来的酶反应 动力学不能直接应用于非水相介质中。用于酶催化的非水相介质【5 】主要有： 1 ) 水一有机溶剂两相体系。有机相一般为烷烃、醚、氯代烷烃等亲酯类溶剂，这种体系 已经成功应用于强疏水性底物如脂类、烯烃类的转化； 2 ) 单相有机溶剂体系。用水不互溶的有机溶剂取代水，酶以固相分散在有机溶剂的单 相体系中； 3 ) 单相水有机溶剂体系。是指用能与水互溶的有机溶剂组成单相体系，常用有机溶剂 有二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃低级醇等； 4 ) 超临界流体体系； 5 ) 反胶束体系。利用表面活性剂在有机相中形成反胶束，酶存在于反胶束中的“小水池” 中，底物和产物可以自由的出入胶束； 6 ) 固相合成。即无溶剂的反应体系，在反应底物熔融的状态下直接以底物为反应介质 进行酶催化作用，目前有关这方面研究的报道还非常少。 7 ) 离子液体( i o n i cl i q u i d s ) 【6 j 。 到目前为止已被证明能应用于非水相的酶有：过氧化氢酶、脂肪酶、酯酶、a t p 酶、 多酚氧化酶、蛋白酶等。 1 1 2 非水相酶催化作用 目前为止，发现能在非水介质中起催化作用的酶有几十种，能够催化的反应类型包 括氧化、还原、水解、酯合成和酯交换、转氰和氰化、酞胺化、甲基化、磷酸化、异构 化、环氧化、开环聚合、侧链切除、缩合( 聚合) 及卤化等【7 - 8 】，在工业应用方面也有许多 江南大学硕士学位论文 成功的例子。 非水介质中酶催化反应有几大优点【9 】： 1 ) 增加了非极性底物的溶解度，有利于疏水性底物的反应； 2 1 增强了酶的热稳定性，可提高反应温度加速反应； 3 1 能催化在水中不能进行的反应，可防止因水引起的副反应； 4 ) 可改变反应的平衡； 5 ) 可控制底物专一性； 6 ) 酶易于实现固定化，酶和产物易于回收； 7 ) 便于消除产物和底物抑制作用； 8 ) 可避免微生物污染； 9 ) 氨基酸侧链一般不需保护。 1 1 3 酶在非水相中的特性 1 ) 热力学稳定性的提高。有许多酶在有机相中比在水相中稳定，这种特性的产生是因 为有机相中水含量大大减少，相对来说酶分子的构象比在水中更具有“刚性。酶稳定 性的提高，限制了由水引起的酶分子中的天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨基作用和天冬氨酸 处肽键的水解以及二硫键的破坏，使蛋白质失活全过程难以进行。水是酶失活必须的因 素，酶的热失活需要其本身具有高度的柔性。但在有机溶剂中酶的不溶性使酶分子构象 的刚性大大增强。所以在高温下酶在有机溶剂中也能保持适当的折叠【1 0 】。 2 ) p h 记忆。由于在有机介质中质子化和去质子化作用难以进行，因此酶分子将保持其 在水溶液中的电离状态，即酶能“记住 它最后所处的水溶液的p h 值，这就是所谓的 “p h 记忆【1 1 1 。 3 ) 专一性改变。酶在有机溶剂中具有的刚性结构导致其表现出与在水相中许多不同的 特性，包括底物选择性、对映体选择性、前手性选择性、区域选择性和化学选择性等的 改变。 4 ) 酶活性改变。非水相酶催化有着诸多的优点，但其本身也有一个明显的不足之处， 酶在有机溶剂中的活性要比水中低2 6 个数量级【1 2 】。主要原因有：酶与底物的扩散限制： 酶在冷冻干燥过程中引起的部分失活；由于酶不溶于有机溶剂，酶颗粒的一些活性中心 被相邻的酶分子遮住，不能与底物接触，妨碍了酶分子参加催化；在有机溶剂中酶的活 性中心构象难以发生变化，不易与底物结合等。虽然酶在非水介质中的活性普遍较水溶 液中的低，但也有一些例外：在反胶束体系中，过氧化物酶的活性约为水中的1 0 0 倍， 漆酶约为水中的6 倍，核糖核酸酶相对于水中略有增加。m o r g a n 等【1 3 】的研究表明，酶和 盐一起冻干可大大提高其在非水介质中的活性，加盐冻干的黄嘌呤氧化酶在乙酸丁酯中 的活力约为水中的2 5 倍。 1 1 4 非水相中酶催化转酯化 酶的催化活性往往具有双向性，在水相中催化分解反应的一些酶在特定环境( 如非 水相体系中) 中却能够催化合成反应或基团转移反应，例如，某些酯酶、蛋白酶在非水 2 第一章前言 相条件下能够催化酯类和醇类进行转酯化反应【1 4 1 。 转酯化反应在手性物质拆分、生物柴油的生产等方面具有广泛的应用前景。国内已 有研究者利用脂肪酶催化的转酯化反应进行小分子物质和生物柴油的生产【l5 。1 6 】。而最近 研究表明，酶催化的转酯化反应在某些固体高分子聚合物( 如淀粉、纤维素等) 的修饰 改性方面同样具有很大的潜力。如酯酶在二甲亚砜、n ，n 二甲基甲酰胺或者n ，n 二甲 基乙酰胺中可以催化烷基烯酮二聚物和固体淀粉发生酯化反应得到表面疏水的改性淀 粉；而在一己内酯本体中，猪胰酶能催化羟乙基纤维素薄膜与一己内酯的接枝共聚 反应。 之前已经有学者成功的对直连淀粉、多糖进行了酶催化转酯化反应【1 7 d9 1 。当反应的 底物是某些特殊的醇( 如烯醇) 形成的酯时，转酯化后生成的烯醇会发生自身异构而形 成醛，这样就更阻止了转酯化的可逆性【2 0 】，更有利于转酯化的发生。 r c = 0 l 0 l o r c = 0 l o + + r c ( o ) o c h - - - c h 2 h 2 c = c h o h + c h 3 c h o 图1 1 纤维素转酯化反应示意图 f i g1 - 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f t r a n s e s t e r i f i c a t i o no nc e l l u l o s e 1 1 5 水在非水相催化中的作用 酶分子的活性构象主要由静电作用力、范德华力、疏水作用以及氢键【2 i 】作用构成一 个复杂的网络来维持，水直接或间接地参与这些非共价作用力的形成或维持，其作用类 似于润滑剂。酶蛋白分子表面因含有大量带电基团和极性基团，在无水条件下，这些带 电基团因相互作用而形成“锁定 的无活性结构。加入适量水充当润滑剂可使酶的柔性 增大，维持酶的活性。但并非水溶液中的水分子都与酶的催化活性构象有关，只有那些 与酶分子紧密结合的水化层中的水才对酶的催化活性构象至关重要，这部分水称为结合 水( b o u n dw a t e r ) ，其余绝大多数的水称为溶剂水( b u l kw a t e r ) 。结合水的物理性质如熔点、 热容、e r p 和瓜的光谱特征与溶剂水均不同。结合水对酶的结构和催化活性非常重要， 因此结合水又称结构水( s t r u c t u r a lw a t e r ) 或必需水( e s s e n t i a lw a t e r ) 。只要这层必需水不丢 失，其他大部分水即使都被有机溶剂取代，酶仍能保持其催化活性【2 2 1 。 酶保持其催化活性所需的必需水量依酶不同而异。如每个a - 胰凝乳蛋白酶分子需要 5 0 个水分子保持其催化活性：有些酶如枯草杆菌蛋白酶和各种脂肪酶只需要微量的水，而 另外一些酶如多酚氧化酶就需要更多的水保持其催化活性，每个酶分子大约需要3 5 1 0 7 个水分子。从某种程度上讲，一些能形成多氢键的与水类似的有机溶剂( w a t e r - m i m i c k i n g 江南大学硕士学位论文 o r g a n i cs o l v e n t ) 女n 甘油、乙二醇可以用来代替水。k l i b a n o v 等研究用甘油、乙烯甘油醇和 甲酞胺作为“氢键形成体”代替水酶结构的变化，结果表明，三种溶剂可部分代替水作 为酶的活化剂，只是与水相比，它们形成氢键的能力较差，因而溶剂化效率较低。 1 1 6 有机溶剂对酶活的影响 有机溶剂作为反应介质是影响非水相酶催化反应的一个重要因素，它可通过以下几 种方式影响酶催化： 1 ) 有机溶剂通过影响底物、产物在水相和有机相中的分配，从而影响它们在酶必需水 层中的浓度来改变酶促反应速度。 2 ) 有机溶剂对酶的影响。主要包括两个方面：首先，有机溶剂与酶的必需水作用。一 般地，疏水性有机溶剂不易夺取酶分子周围的必需水，对酶活性影响较小，适用于酶催 化反应。强极性有机溶剂可溶解大量水，有夺走大量必需水的趋势，从而导致酶失活； 其次，有机溶剂对酶的影响。有机溶剂使底物基态能级下降或使酶一底物复合物能级升 高，从而增大酶反应的活化能来降低酶反应速度；有机溶剂分子进入酶的活性中心，降 低活性中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降；有机溶剂会造成 酶的三级结构发生变化，改变酶活性中心结构影响酶活性【2 3 1 。 l a a n e 等【2 4 】报道了溶剂疏水性和酶活力之间的相关性。他以溶剂在水和正辛醇两相 间分配系数的对数l o gp 来描述溶剂的疏水程度，认为酶在l o gp 高于4 的溶剂( 如癸醇、 十六烷、苯二酸醋等) 中可保持较高活力。l o gp d 于2 的溶剂则不适用于生物催化。但 不少文献报道了偏离l o gp 理论模型的实例。可见有机溶剂的疏水性并不是导致酶变性失 活的唯一原因，酶失活还与溶剂的溶解能力和分子几何构型有关。大量实验表明：通过改 变溶剂可以调节酶的活性和选择性，改变酶的动力学特征和稳定性。k l i b a n o v 首次称这 种方法为：溶剂工程( s o l v e n te n g i n e e r i n g ) ，并认为有可能成为蛋白质工程的一种辅助方 法，在生物催化剂的开发和利用中起着重要的作用。 1 2 理论基础 1 2 1 离子对萃取法 把酶从水相转移至有机相的方法有好几种。较早的是反相胶束的研究，利用表面活 性剂形成的反胶束，酶在其中的微型“水池中，一定量的水有效地起到了保护作用 2 5 - 2 8 】。但是反胶团中较多的水实际上是破坏了真实的非水相特征。而利用离子对可以解 决这个问题。1 9 9 4 年p a r a d k a r 等【2 9 】人发现低浓度下的表面活性剂能将酶以离子对的方 式转移至有机相。调节水相p h 使酶带与表面活性剂相反的电性，作用两相，酶与表面 活性剂因静电作用而结合。表面活性剂可以提高酶的疏水性，当与酶分子结合的表面活 性剂足够多时表面活性剂一酶离子对就能进入有机相。 其原理大致如下图： 4 第一章前言 v v v v w w v v v v v 纱3 两相界面 水相 图l - 2 离子对萃取法原理图 f i g1 - 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fe x t r a c t i o nb yi o np a i r 酶的非水相反应体系中，保持酶在非水溶液中的高活性是反应进行的首要条件。酶 是水溶性的，在有机溶剂中呈现悬浮状态，悬浮状态的酶催化固体底物反应效率不高， 因为不溶状态的酶和不溶状态的底物之间的相互作用频率较低【1 4 】【1 7 郴】【3 0 。3 1 1 ，而且在极 性有机溶剂中酶容易失去结合水而失活。有机溶剂的极性越弱，酶活受到的影响也就越 小 9 】。在水溶液中活性中心依靠疏水力和底物结合的一些蛋白酶、酯酶在有机溶剂中由 于疏水作用的消失，催化效率会下斛3 2 】。将酶和缓冲溶液、大量中性盐等一起冷冻干燥， 能够提高酶在非水溶剂中的活性【3 3 1 ，在非水溶剂中加入冠醚也能增加酶的稳定性【3 3 1 ，但 是不能改善酶的分布状态。通过对酶分子进行化学改性，引进疏水官能团，能增加酶表 面的疏水性，提高酶在非水溶剂中的溶解度，改善酶的分布状态，但是化学改性本身会 大幅度降低酶的活性【3 钔。将酶固定化会增加酶的刚性，也会造成酶活性的下降。离子对 萃取法的应用能很好的解决以上问题。 1 2 2 影响离子对萃取的因素 多种因素影响萃取过程中酶的转移率，其中两相作用方式、p h 、表面活性剂浓度及 初始酶含量、离子强度等是已被证明的重要因素。根据离子对萃取法的原理，酶与表面 活性剂在两相界面处因静电力而作用结合生成离子对，如果两相作用太微弱则表面活性 剂会与酶分子因接触不充分而降低转移率，如果过于激烈则可能因为剧烈的剪切力而导 致乳化，因此选择什么样的作用方式对于离子对的制备很关键；表面活性剂与酶分子结 合依靠静电引力，p h 的改变会影响酶分子的带电强度，所以水相p h 也在很大程度上影 响酶的转移；初始酶含量如果过高会导致表面活性剂不足而降低转移率；表面活性剂浓 度提高虽然有助于酶的转移，但是过高的浓度会容易产生反胶束，因此需要控制其浓度。 5 江南大学硕士学位论文 水相中适度的离子强度可以有效的减轻两相的作用时的剪切力防止乳化，但是离子强度 的提高会降低酶与表面活性剂的静电引力而不利于酶的转移【2 9 1 。 1 2 3 荧光分光光度法测量转酯化酶活5 1 使用乙烯基酯和醇类物质问的转酯化反应，乙烯基酯和醇反应的产物乙烯基醇不稳 定容易异构生成乙醛，乙醛和肼类物质如：4 肼基7 硝基2 ，1 ，3 苯并氧杂二唑 ( n b d h ) 反应生成荧光衍生物。 o r 1 儿+ 酩o t j p e s o o v g s o l v e n t o r 八昭 + 且h n h n h 2n 。h - n = c c ll 驻+ 八oh 面缸n h n 0 2 n 0 2 12 微弱的荧光强烈的荧光 图1 - 3 荧光法的反应机理 f i g1 - 3t h er e a c t i o nm e c h a n i s mo f f l u o r e s c e n c em e t h o d 通过测量荧光确定物质的含量，荧光越强说明转酯化反应生成的醛含量也就越多，即酶 的催化效率越高。这样就能以反应前后荧光强度的变化来反映转酯化酶活。 1 2 4 棉纤维改性 棉纤维可降解且来源于可再生资源，纤维天然转曲使其具有优良的可纺性能。棉织 物具有良好的吸水性、吸湿性、易染色性，手感柔软，强度适度，穿着舒适等优点，但 同时存在着抗皱性差，易收缩，保型性差，放湿慢，染色牢度低等缺点。为提高产品档 次，提高其服用性能，科技人员对棉纤维进行改性处理。并已取得一定的进展。棉纤维 改性技术是利用物理、化学、生物工程、纳米技术等高新技术对棉纤维结构或性能进行 改性，其目的是改善棉纤维及织物存在的不足或赋予它们新的性能，使棉纤维的潜在功 能得到了有效的开发【3 6 】。目前常用的改性方法有： 1 复合改性技术。属于物理改性技术，主要包括混纺、复合纺纱和交织。混纺是棉纤 维与其他天然或化学纤维按一定比例混合后纺纱【3 7 】；复合纺纱包括包芯纺、包覆纺、包 缠纺等纺纱方法，通过复合纺纱可得到性能形态各异的花式纱线；交织是将不同原料的 纱线分别作为经纱和纬纱来织造成布，得到性能优良，风格独特的纺织品。 2 等离子体改性。低温等离子体对棉纺织物进行表面改性，使其表面的化学组成与结 构发生变化，在棉纤维表面产生刻蚀、氧化、分裂和接枝含氧基团等作用。近年来，还 有人采用等离子体处理引发不同乙烯基单体，含氟单体对棉纤维进行接枝聚合改性，赋 予棉纤维良好的拒水性。还有人将等离子体处理用于阻燃、抗皱和卫生等功能整理【3 8 】。 3 化学改性。是指通过改变纺织纤维高分子材料的化学结构来达到改性的目的。目前 主要有两种途径：a ) 采用比羟基亲核性更强的基团代替纤维素纤维上的羟基；b ) 采用阳 离子化助剂对纤维素纤维进行改性。 6 第一章前言 4 生物技术改性。主要包括：曲基因工程改性，天然彩棉是其成果之一。通过产生颜 色的基因的植入，可以让棉花自然带色。b ) 生物酶改性。此方面技术已在棉织物的实际 生产中有了较大进展【3 9 1 。如果胶酶可以去除棉纤维中的果胶质。纤维素酶可以对纤维素 起水解作用从而应用于柔软整理及抛光整理。 1 2 5 有机相中酶对棉纤维转酯化改性 因纤维素纤维中葡萄糖单元上含有大量可反应的羟基，因此可以在纤维素主链上通 过酯化或醚化反应引入不同的侧链基团，可以改进棉织物的抗折皱、耐磨、耐久烫、弹 性和尺寸稳定等性能并赋予棉织物抗菌、抗油抗水、防紫外等新的功能t 4 0 l ，此外，改性 棉纤维还可应用于螯合纤维【4 1 1 、酶固定化载体的生产【4 2 1 、与人造高聚物形成复合材料【4 3 】 等方面。 这方面的改性通常会使用化学试剂做催化剂直接催化进行酯化或醚化引入特定的 基团。或者采用高能量射线或化学试剂对纤维素中葡萄糖单元上的羟基进行活化，产生 自由基，从而引发棉纤维与含不饱和化学键的单体进行接枝共聚反应【4 2 1 1 4 4 1 。高能量射线 在引发反应的同时会对棉纤维本身造成损伤，降低棉纤维的聚合度，在反应时要严格控 制反应条件，并且高能射线引发反应对设备要求高。化学试剂做催化剂时苛刻的反应条 件也会对棉纤维产生损伤，并且一些对人体有害化学试剂的残留问题会限制产品的使用 范围。 酶是高效的生物催化剂，反应条件温和。酶催化反应的高选择性、高效性和环境友 好的特点使它具有常规化学催化反应不可比拟的优越性。用酶代替高能量射线和化学试 剂催化棉纤维的改性反应，不但可以避免对棉纤维的损伤，而且能针对性地改善棉纤维 的性能。酶的催化活性往往具有双向性，在水相中催化分解反应的一些酶在特定环境( 如 非水相体系中) 中却能够催化合成反应或基团转移反应，例如，某些酯酶、蛋白酶在非 水相条件下能够催化酯类和醇类进行转酯化反应【1 4 】。 1 3 课题创新点及解决的问题 虽然非水相酶学在国内外已经有了长足发展，但是以离子对法转移酶至有机相的方 法国内还鲜有报道，本课题将对这种方法进行系统研究，对影响酶转移的各因素做深刻 探讨。另外非水相条件下通过表面活性剂一酶离子对在棉纤维表面进行蛋白酶催化的原 位转酯化反应从而引入特定的基团，国内外还没有相关的报道。因此对于这种方法的研 究将起到一定的探索作用。 本论文主要将针对以下两个问题进行研究： 首先，将研究离子对法转移酶至有机相的具体方法，探讨各种因素对转移的影响， 以及转移前后酶结构的变化；第二，将探索酶在有机相中的转酯化反应，探讨各因素对 转酯化的影响，并对固体纤维素粉末进行转酯化作用。 7 第二章表面活性剂a o t 含量的测量方法 第二章表面活性剂a o t 含量的测量方法 2 1 引言 前己述及，利用离子对法转移酶至有机相，关键要选用合适用量的表面活性剂，就 不可避免的涉及到所用表面活性剂a o t 含量的测定。前有学者利用一种阳离子的染色 剂罗丹明6 g ( r 6 g ) 通过静电引力和阴离子表面活性剂a o t 形成a o t - r 一6 g 结合物， 这种结合物不溶于水却可以溶于甲苯中【2 9 】，当溶于甲苯中时5 1 2 n m 是它的最大吸收波 长。通过分光光度计测量5 1 2 n m 处的吸光度可以来测量a o t 的含量。此方法虽已有研 究者使用过，但具体实验条件等尚需要重新系统考察。 2 2 实验材料与方法 2 2 1 实验用材料、仪器 表2 - 1 实验材料 t a b3 - 1e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 表2 - 2 实验仪器 t a b2 - 2e x p e r i m e n t a le q u i p m e n t s 2 2 2 实验方法- r - 6 g 标准液的配置：3 5 m g r - 6 g 溶于5 0 0 m l 水中，再用5 0 0 m l ( o 1 m ，p h 5 o ) 的柠 檬酸缓冲液( 其中含有2 9e d t a 和1 0 9 n a c l ) 稀释。之后再用去离子水稀释2 倍。 配制一定浓度a o t 的异辛烷溶液，使用异丙醇稀释5 倍，用移液枪分别吸取一定 量加入到4 l i l l 上面所配的r 6 g 水溶液中，用水浴震荡锅2 5 0r p m 速度下振动，加入3m l 甲苯，两相用混匀器振动混匀、来回多次混匀，最后将挂在管壁上的液珠尽量冲回两相 9 江南大学硕士学位论文 溶液，将水相内的甲苯液滴尽量弹回甲苯，然后静置，分相取上层甲苯测量在5 1 2n l t l 处的吸光度。 工作曲线制作：分别加入一定梯度量的a o t 进行实验，以a o t 含量和吸光度为坐 标制作工作曲线。 反应时间的影响：分别选取1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 m i n 于水浴锅中震荡反应。 萃取时间的影响：将反应后的两相液打匀，分别静置萃取0 、6 、1 2 、2 4 h 再分相测 量。 a o t 含量的计算：制作好工作曲线，取未知a o t 浓度的待测液x 肛l 加入到 4 m l r 6 g 水溶液中，经过相同操作测量5 1 2n n l 处的吸光度，于工作曲线查出a o t 含量 y m o l ，则待测液a o t 浓度j 妫( y x ) * 5 * 1 0 9m m 。 2 3 结果与讨论 2 3 1a o t 用量 为保证吸光度在现有分光光度计测量范围内，需对a o t 用量做详细的探索。 经多次调整，确定a o t 的加入量。配制2 m ma o t 的异辛烷溶液经异丙醇稀释后 分别加入3 0 、5 0 、7 0 、9 0 、11 0p l ，测量反应、萃取后吸光度以绘制a o t 含量与吸光 度的工作曲线。在此加量下能保证吸光度分光光度计读数在正常范围内。 同时实验中带入0p l 的对照样，其吸光度在0 附近，由此证明，在不加a o t 的时 候r 6 g 不会溶于甲苯而影响吸光度。因而在以后的实验中不再带入此对照样，认为其 吸光度为0 。 2 3 2 反应时间的影响 为验证反应的充分性，选择2 m m 的a o t 异辛烷溶液经稀释后取7 0 p l 分别在不同 反应时间下进行实验： 恻 米 登 o加406 0 反应时间( n f i n ) 图2 - 1 反应时间对吸光度的影响 f i g2 - 1t h ei m p a c to nt h ea b s o r b a n c eo f t h et i m eo f r e a c t i o n 由图2 1 可以看出，l o 至5 0 m i n 的反应时问下，吸光度并不会有较大改变，因此认 l o 5 l 5 o 协 。 帖 o 第二章表面活性剂a o t 含量的测量方法 为1 0m i l l 已经能使反应充分。所以选择1 0m i n 反应时间即可。 2 3 3 萃取时间的影响 考察萃取时间的影响时，采取与2 3 2 中同样的a o t 加量，反应1 0m i n ，分别萃取 不同时间，结果如下： i 2 o 9 毯 米0 6 督 o 3 0 o48 1 21 6 萃取时间( h ) 图2 - 2 萃取时间对吸光度的影响 f i g2 - 2t h ei m p a e to nt h ea b s o r b a n c eo ft h et i m eo fe x t r a c t i o n 由图2 2 可发现萃取9 h 的试样吸光度略高于其它样。出现这种现象可能的原因是 时间太短萃取不够完全，而时间太长可能会影响a o t - r 6 g 这种缔合物的稳定性。因此， 最终将萃取时间确定在9h 。 2 3 4 工作曲线的制作 在实验条件基本确定后，制作出工作曲线： 2 1 6 越1 2 栗 整0 8 o 4 o 0 l2345 a o t 含量( * l f f 8 瑚1 ) 图2 3 a o t 含量工作曲线 f i g2 - 3t h es t a n d a r dc u r v eo f a o t c o n t e n t 此工作曲线可直接用于a o t 含量测定。 江南大学硕士学位论文 2 4 本章小结 从应用角度出发，确定了a o t 含量测量的具体操作方法，考察了反应时间及萃取 时间的影响，结果表明1 0m i n 的反应时间即可使a o t 与r 6 g 反应充分；甲苯萃取9h 可以萃取充分。据此制作出了工作曲线，为以后实验中测量a o t 含量做好基础。 1 2 第三章离子对的制备 第三章离子对的制备 3 1 引言 本研究室在前期研究中通过改良的荧光分光光度法证实了枯草杆菌蛋白酶 ( e c 3 4 2 4 2 8 ) 能够在非水相体系中催化丙酸乙烯基酯和正丙醇发生转酯化反应【4 5 1 ，枯 草杆菌蛋白酶等电点( p i ) 为8 9 5 【4 6 1 ，在酶适宜p h 范围内酶分子表面带正电荷，本论 文选择a o t 做为阴离子表面活性剂，研究了两相接触模式、水溶液p h 、离子强度、水 溶液中初始酶浓度等因素对枯草杆菌蛋白酶一a o t 离子对制备及转移效率的影响，并考 察了转移后酶结构的变化。 3 2 实验材料与方法 3 2 1 试剂与仪器 表3 1 实验材料 t a b3 1e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 表3 2 实验仪器 t a b3 - 2e x p e r i m e n t a le q u i p m e n t s 3 2 2 紫外分光光度法测量酶含量h 力 枯草杆菌蛋白酶浓度通过紫外分光光度法于2 8 0h i l l 处进行测量，制得的工作曲线如 下图t 1 3 江南大学硕士学位论文 o 3 5 0 3 o 2 5 醚0 2 叶、 签0 1 5 o 1 o 0 5 o 00 20 40 60 8l1 2 酶浓度( m g m 1 ) 图3 1 酶含量工作曲线 f i g3 - 1t h es t a n d a r dc u r v eo fe n z y m ec o n t e n t 3 2 3 酶一表面活性剂离子对的制备n 9 1 准确称取一定量酶，溶解于n a a c h a c 缓冲溶液中( p h 5 0 ，1 0m m ，含1 0m m k c l 和1 0m mc a c l 2 ) ，取2 m l 置于1 0m l 锥形瓶中，缓慢加入2 d 异辛烷( 含3m ma o t ) ， 置于磁力搅拌器上，室温下以1 2 0r p m 转速搅拌6 d 时，之后转入5m l 离心管，静置1 0 m i n ，于1 0 0 0 0r p m 下离一t , 2 0m i n ，离心结束即分相分别测定两相中的酶蛋白浓度和异辛 烷中a o t 浓度。 e ( ) ：盟1 0 0、。 e 】叼 酶蛋白的转移效率e ( ) 用转移到异辛烷中的酶 e o 占水溶液中初始酶量 e a q 的 质量百分数来表示。 考察水溶液p h 对酶转移率的影响时，在p h 5 8 问使用磷酸缓冲液( 1 0m m ，含4 0m m k c l ) ，进一步考察p h 3 8 5 5 间时使用n a a c h a c 缓冲液( 1 0m m ，含1 0m m k c l 和1 0m m c a c l 2 ) 。 考察盐种类与水溶液离子强度对酶转移率的影响时均使用n a a c h a c 缓冲液( p h 5 0 ， 1 0 m m ) ，更换水溶液中盐种类及调节离子浓度。 考察水溶液初始酶浓度对酶转移率的影响时，使用p h 5 0 的n a a c h a c 缓冲液( 1 0 m m ，含1 0m mk c l 和1 0m mc a c l 2 ) ，异辛烷中a o t 浓度为4m m 。 考察有机相初始a o t 浓度对酶转移率的影响时，使用p h 5 0 的n a a c - h a c 缓冲液( 1 0 m m ，含1 0m mk c l 和1 0m mc a c l 2 ) ，水溶液中酶浓度为1g l 。 实验过程中控制异辛烷中a o t 浓度在临界胶束浓度( c m c ，4 9m m ) 下，确保有 机相中不出现反相胶束【4 8 】。 3 2 4 转移后有机相中酶结构的变化 通过圆二色谱法制得18 5 2 5 0n l l lc d 光谱以考察有机相中酶与水相酶相比二级结 构的变化。 1 4 第三章离子对的制备 3 2 5 荧光分光光度法测量转酯化活性b 5 1 1 因转酯化反应后生成的烯醇会自身异构为乙醛，乙醛可以与荧光底物 n b d h n h 2 n h 2 发生反应生成荧光性非常强的另一种物质。依靠测量激发光波长 4 3 5 n m ，发射光波长5 3 5 n m 下的荧光强度，可以得到乙醛生成量。然后用生成的乙醛量 的多少来表征酶活性的大小。在总体积4l i l l 的体系下制作乙醛量与荧光强度的工作曲 线如下： 8 0 6 0 倒 蔡4 0 弑 2 0 o 00 0 4口0 8口1 2a 1 6 乙醛浓度( m m ) 图3 - 2 乙醛含量工作曲线 f i g3 - 2t h es t a n d a r dc u r v eo fa c e t a l d e h y d ec o n t e n t 2 配制3 m ma o t 的异辛烷溶液。称取荧光底物n b d h n h 2 n h 2 加入到大离心管中， 加入配好的3 m ma o t 的异辛烷溶液，使n b d h n h 2 n h 2 的浓度为0 2 m m 。使用混匀 器不断打匀使其尽量溶解。 3 参照样的设定： 加底物丙醇和 丙酸乙烯基酯。 ( 对照2 ，无酶有底物) 不加底物，加 3 4 4 9 l 异辛烷。 ( 对照3 ，无酶无底物) 4 用移液枪吸取3 6 7 5 肛l 有机相至5m l 离心管中，加入3 0 0l x l 丙醇( 4m m ) 和4 4 斗l ( 0 4m m ) 丙酸乙烯基酯，于2 0 0r p m 条件下在恒温震荡水浴中反应一定时间后测定荧 一