（材料物理与化学专业论文）微囊藻毒素的分离、分析和制备.pdf

摘要 摘要 随着水体富营养化的日益加剧，有毒蓝藻水华在世界范围内频繁发生，蓝藻水华爆发带来的 微囊藻毒素污染已成为一个全球关注的环境闯题。微囊藻毒素是由有害蓝藻水华释放的有毒代谢物， 该毒素可引起动物中毒并对人类产生危害，迫切要求对饮用水源中的微囊藻毒素进行快速定性、定 量分析同时，为了深入进彳亍微囊藻毒素的生物化学，环境化学性质、生态毒理学等方面的研究， 需要微囊藻毒素的纯品作为检测标准和材料 本文对微囊藻毒素在反相高效液相色谱体系中的保留特性及分离条件进行了较系统的考察，初 步探讨了两种徼囊藻毒素在该体系中的保留规律和机理，建立了固相萃取( s p e ) 结合高效液相色谱 法( h p l c ) 分析水中痕量微囊藻毒素的方法，方法快速、灵敏，适用于快速分析环境水样中的两种常 见微囊藻毒素m c - l p 和m c r r ，绝对量检出限可达1 0 0 n g ，线性定量范围为0 1 2 s p r l - 5 0 弘g l ，方 法对两种微囊藻毒素的平均回收率分别为9 7 3 s o k m c r r ) ，9 2 4 7 ( m c - l r ) 实验对采集于无锡太 湖梅粱湾处实际水样进行分析，发现水样中主要害有两种徽囊藻毒素，其含量分别为 m c - r r 3 3 4 s v l g a 和m c - l r 0 9 4 1 班 在参考已有关于蓝藻毒素提取和提纯方法的基础上，摸索改进实验条件，以高效制备液相色谱 法为主要手段，刺用太湖自然水域中的蓝藻制作了微囊藻毒素m c - l r f f 目m c - r r 的高纯度样品，样品 经f i p l c 进一步分析，纯度可达9 8 以上，于燥后可得两种微囊藻毒素纯品分别为m c r r l 2 1 ，1 蜡， m c - l r 6 2 8 v g 。 关键词：微囊藻毒素，高效液相色谱，固相萃取，分离纯化，制各 东南大学硕士学位论文 a b s t r a c t m a s sg r o w t ho fc y a n o b a c t e r i a ( b l u e g r e e na l g a e ) , l e a d i n gt ot h ep r o d u c t i o no fb l o o m s , c a l lo c c t t ri n e r t r o p h i c w a t e r b o d i e st h r o u g h o u tt h ew o r l d , t h em i e r o c y s t i n sp o l l u t i o nh a s a l r e a d yb e c o m ea e n v i r o n m e n t a lq u e s t i o nt h a tt h ew h o l ew o r l dp a y sc l o s ea t t e n t i o nt o , m i c r o c y s t i u sa r et o x i cm e t a b o l i t e s r e l e a s e df r o mc y a n o b a c t e r i a lb l o o m , c a l ac a u s ep o i s o n i n go f a n i m a la n da l s op o s eah e a l t hh a z a r dt oh u m a n r e q u i r eu r g e n t l yt h a tc a r r i e so nf a s tq u a l i t a t i v e ，q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s 如m i c r o c y s t i n si nt h ed r i n k i n gw a t e r s o t l r e 2 ，p u r i f o dm i c r e c y s t i n sa r en e e d e dt ou t i l i z ea st h es t a n d a r da n dr e a g e n tm a t e r i a li nar a n g eo f e x t e n s i v er e s e a r c ha p p l i c a t i o n si n c l u d i n gb i o c h e m i c a la n de c o t o x i c o l o g i c a ls t u d i e s t h er e t e n t i o nb e h a v i o r so fm i c r o c y s t i n sa n ds e p a r a t i o nc o n d i t i o no i lr e v e r s ep h a s el i p l cs e t u pw e r e s y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e d o p t i m u mi - l p l cs y s t e mf a c t o ra n dm e c h a n i s mw e r ed e v e l o p e d am e t h o df o r t i - a c el e v e la n a l y s i so f m i c r o c y s t i n si nw a t e ru s i n gs p ea n dh p l ch a sb e e nd e v e l o p e di nt h i sr e ! p o r t , w h i c h i sf a s t , 黜i t i y ca n ds u i t a b l ef o rt h ed e t e r m 讯a t i o no ft h et w om o s tc o m m o nm i c r o c y s t i n s , m “ra n t i m c - r r 1 1 1 i sm e t h o de n a b l e st h ea b s o l u t ed e m r m i n a t i o no f m i c r o c y s t i u se v 明a tt h el e v e l 鼬l o wa s1 0 0 n g , a n dt h el i n e a r r a n g ei s f r o mo 1 2 5 t t g lt o5 0 烬kr e c o v e r yo ft w om i c r o c y s t i n si s r e s p e c t i v e l y 9 7 3 5 0 缸m c - r r ) , 9 2 4 7 ( m c - l r ) t h i se x p e r i m e n ta n a l y z e dt h er e a lw a t e rs a m p l ef r o mm e i l i a n gb a y o ft a i h ul a k ei nw u x i ，t h e r e 辩t w om i c r o c y s t i n sm a i n l yi ni t , a n dt h e i rc o n t e n ti sr e s p e c t i v e l y m c - r r 3 3 4 8 i i g km c - l r o 9 4 1 蜡以 r e f e r r i n gt ot h em e t h o d sa v a i l a b l eo fm i c r o c y s t i n se x t r a c t i o na n dp u r i f y i n g , a n da m e l i o r a t i n gt h o r n , w eu s e db l u e - g r e e na l g a ei nt a i h ul a k et op r e p a r em c - l ra n dm c o r r s a m p l e so fh i 幽p u r i t yb yu s i n g h i g h - p e r f o r l l l a n c op r e p a r a t i v el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t i ms a m p l e sw e r ea n a l y z e db yh p l ca n dt h ep u r i t y e x c e e d s9 8 t w om i c r o c y s t i n ss t a n d a r d sw e r eg a i n e db ye v a p o r a t i n gs a m p l e s m a 硒o f t w om i c r o c y s t i m i sr e s p e c t i v e l ym c - r k l 2 1 1 9 9a n d m c l r 6 2 8 9 9 a b s t r a c t ：m i c r o c y s t i n s ，h p l c ，s p e s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，p r e p a r a t i o n 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：兰塑日期：呈竺壹f o 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名： 第一章绪论 第一章绪论 随着人类生活方式的改变、工业化、城市化的发展以及农业生产大量使用化肥，大量的营养物 质注入水体，致使水体富营养化日益严重。当环境条件适宜时，湖泊中浮游蓝藻大量繁殖，形成水 华，严重影响了水质和环境卫生，引起了公共卫生部门、供水机构、生物学、环境学、生态学等研 究工作的广泛重视，有关蓝藻水华及其毒桑的研究也日盏深入本章参考了国内外学者的相关研究 以及报道文献，主要介绍了蓝藻水华污染的现状、爆发、危害和防治，同时概述了微囊藻毒素的研 究进展，为进一步研究微囊藻毒素提供了较为深入的理论基础。 1 1 水华污染现状、爆发、危害及防治 1 1 ，1 水华污染现状 1 国内外水体富营养化概况 国外：现在水华现象已经是世界性的水污染公害，它既是水污染的突出表现，同时它又进一步 加剧了水体污染。甚至有人将水华称作水体的癌症，足见水华问题熙严重性近年来，有关水体富 营养化及其毒桑的污染问题成为全球关注的热点。日本、美国，澳大利亚、德国等2 0 多个国家都曾 对其境内的淡水湖泊、水库等水体中的水华现象进行过报道，分离并检测到了多种毒素 世界上淡水湖泊藻类水华发生的频率与严重程度都呈现增长的趋势，其中蓝藻是引起藻类水华 污染的主要藻类欧洲、非洲，北美洲和南美洲分别有5 3 ，2 8 。4 8 和4 1 的湖泊存在不同程度 的水体富营养化现象，亚太地区5 4 0 的湖泊处于富营养化状态 国内：在我国，由于环境意识、法规措施等方面的原因，许多工业废水和生活污水未经处理即 捧入水体同时由于农业生产中大量使用化肥、农村大规模圈网拦坝进行多种养殖，使水流改向、 水速减缓，水体自净能力不断下降。这些都大大促进了藻类特别是蓝藻的生长繁殖。我国曾在2 0 世 纪8 0 年代对全国范围内的水源水质进行过全面的调查，结果表明3 4 个湖泊中有一半以上的湖泊面积 处于富营养化状态，水藻污染严重，并且这些富营养化湖泊主要集中在城市近郊“进k 2 0 世纪9 0 年代，全国淡水水体富营养化状态旦益严重，涉及范匿不断扩大o 。1 。在对长江、黄河、松花江等主 要河流以及鄱阳湖、太湖，巢湖、武汉东湖、昆明滇池，上海淀山湖等几大淡水湖泊的调查中发现 有大量藻类繁殖。1 9 8 9 1 9 9 2 年合肥市多次发生因自来水发腥发臭而短期停止供水现象，1 9 9 2 年以 来以黄河水为水源的郑州市水源水厂的调蓄池内经常出现因藻类大量生长而导致自来水出现明显鱼 腥味的现象，而且产生了徽囊藻毒素( 简称m c s ) ，调蓄池水中m c s 含量达2 “f i g 几“根据m c s , 霸j 猪毒性的实验结果，世界卫生组织( w h o ) 推荐饮用水中的m c s 浓度不高于1 o p 妒。脚此外，在一些 小城镇及农村地区的湖塘，河港内也均存在较为严重的藻类污染，1 9 9 6 年以来以傀儡湖为水源的昆 山市巴城第二水厂因多次遭受蓝藻爆发的影响而被迫减产、停产。 2 本课题的水样和水藻来源地( 太湖) 承华污染状况 太湖位于北纬3 t 3 0 ，东经_ 1 2 0 。3 0 ，湖泊面：积2 4 2 8 k m 2 ，平均深度1 8 9 m ，总蓄水量约为4 7 6 亿立 东南大学硕士学位论文 方米，是我国第三大淡水湖，地处经济发达的长江下诲沪、宁，杭三角带的中心，是太湖流域重要 的饮用水源地。早在6 0 r 年代，南京地理所在进行太湖科学考察时就曾发现有条状分布的蓝藻出现， 尤其近十多年来，随着周围地区工农业和旅游业迅速发展，摊入太湖的生活污水和工业废水量旦濒 增加。大量化学肥料的使用引起氮、磷物质流入环湖河道，年年出现蓝藻爆发，造成水质恶化，水 体异常腥臭，严重阻碍无锡市8 个自来水厂的正常运行，使全市8 5 的供水受到威胁”结果太湖平 均水质由原来的以i i 类为主变为以i v 类为主，水体营养状况以富营养为主。夏季，藻类疯狂生长， 造成水厂取水困难，自来水有霉臭味。水质低劣，严重威胁城乡环境和人民的身体健康。 1 1 2 水华爆发的机理及条件 因为水华现象发生的机理很复杂，它涉及许多因子的影响，知氮、磷的含量以及二者含量之比， 以及温度、光照、水深、水的流动性、微量元素等因子都对水华的发生有重要的作用”1 ”，其主要 包括以下几种： 第一：水体中氮袒磷之比 基本可以肯定，大多数情况下，水体中的氮、磷等营养物质过多是发生水华的基本因素同时， 还有不少研究发现水体中氮、磷之比和水华的发生关系密切有人观察测定发生水华的水体中氮和 磷之比为1 1 左右比1 ；也有人观察测定二者之比为1 5 ：1 。还有其他人报道过氮、磷之比为1 0 1 5 比1 ，2 0 或3 0 比1 以及6 3 比1 等也都可能发生水华现象由于水华发生的因子多而复杂，目前主 要还是根据水体实际的测定结果，围隔试验和实验室藻类生长潜力试验的结果提出的一些看法，尚 不能作出仅在某个氮，磷比时才发生水华的结论当然，大多是在水体中不仅氮、磷的含量较商， 而且氮、礴之比较大时容易发生水华，并发现大多数水体中磷是藻类生长的“限制因子”，而氮磷之 比小于1 0 ：1 时，或在某个季节，氮也可能成为限制因子不仅如此。还发现有些水体中氮和磷的含 量并不很高，甚至尚未达到富营养化水平也发生了水华现象，其原因何在? 仍需要进一步深入探讨 此外，氮，磷在水体中还有多种存在形态，如氮通常可分为氨、分子氮、亚硝酸盐、硝酸盐、有机 氮：磷通常有元素磷、正磷酸盐、缩舍磷酸盐、有规磷等多种形式存在于水体中由于藻类对不同 形态的氮和磷的吸收和利用情况不同，所以，水体中存在的氮、磷的形态也会对水华的发生有重要 影响。 第二：温度是水华形成的重要因素。 温度( 气温和水温) 对水华的发生影响很大。由于大多数水华藻类( 特别是蓝藻类) 在温度较高的条 件下才能发生异常繁殖的情况因此水华多见于光照充足温度高的夏季( 水温大约在2 5 c 3 5 c ) ， 温度在2 0 ( 2 以下时一般蓝藻水华较少发生。但是，不同地区也有一定的差别，既使是同一地区也不 完全样，如北京通常是在6 月下旬开始发生，最严重的时期是7 、s 月例外的情况也有，如2 0 0 2 年北京的红领巾公园在4 月上旬就爆发了严重的水华现象，那时水温仅有十几度。此外，不同的藻 类发生水华的时间也有所不同，如北京在春季和秋季常会发生衣藻水华和裸藻水华。而在夏季则很 少见到衣藻水华，而主要是蓝藻类( 如微囊藻等) 水华在我国的南方，由于气温和水温较高，所以 发生永华的时闻一般都比北方早，有的地方甚至全年都可以发生，如云南的演池等而在我国北方 的冬季，由于气候寒冷，水面结冰，所以决不会发生水华现象。 2 第一章绪论 第三：水深、水量、水面的大小和水的流动性等都对水华的发生有重要影响。 通常在浅水湖泊、水面较小、水的流动性很小甚至为死水，而且没有清洁的水补充更换的富营 养水体最容易发生水华现象。同样，也有些水面较大、水教深的水库甚至有些流动水的河流也会发 生水华。 第四：据报道，f e 、m n 、n a 等元素和维生素的含量也会对水华的发生有重要影响。 总之，目前虽然对水华发生的机理已经有了基本的了解，对其发生的基本条件和规律也已基本 掌握。但由于水华发生的原因比较复杂，并不是简单的一，二个因子的问题，而是多个因子之间相 互影响相互制约的结果。不同的水体情况也不一样。所以，现在还不能说对各种情况下水华发生的 原因都搞清楚了，仍然需要进一步观察、试验和研究。以便真正掌握水华发生的机制。只有这样。 才能为防治水华的发生制定出相应的有效措艚“” 1 1 3 蓝藻水华危害 1 1 3 1 危害水域生态环境栖息的生物的生存与发展 在湖泊、水库和池塘，浮游藻类的大量繁殖且在水面高度密集，其危害在于： ( 1 ) 密集的浮游藻类阻挡了阳光的光线透射，底栖的水生植物因得不到充足的太阳能，使其光 合速率降低，减少了光合产物的产量，进而影响箕正常的生长发育，同对还因其强烈吸收可见 光的短波部分使水温升高影响了对水温敏感的生物种群的生存； ( 2 ) 浮游的藻体充塞鱼、贝类鳃的空隙，阻碍了鱼，贝类鳃的气体交换功能，引起鱼、贝类等 水生动物窒息而死； ( 3 ) 水华藻藻体死亡后腐败，使水体中生化需氧量激增，急剧降低了水体的溶解氧含量，造成 水体严重缺氧，进而导致鱼类浮头，直致死亡 ( 4 ) 浮游藻类自身分泌粘液到水体，鱼类呼吸时吸附在鱼鳃上。使鳃丝气体交换发生障碍，最 终鱼类因缺氧而死亡，或释放毒素如水华鱼腥藻的口变性毒素“”，导致水生浮游动物、鱼类以 及水生植物因缺氧或中毒而死亡，其最终结果就是既降低了水生群落的生物多样性，又造成经 济损失 1 1 3 2 导致水生生态系统的失衡 由于水华的浮游藻类藻体高度密集与产生毒素便水生群落中的物种死亡( 如微囊藻在水体中的 密度达3 0 0 0 0 个体l 时鲑鱼、草鱼大量死亡“”与消失) ，不但造成初级生产量下降，同时浮游藻类的 分泌与排泄物以及死亡的水生生物残体沉积于水底。使水体逐渐变浅，湖泊、沼泽陆地化；而且使 原有的群落结构被破坏，水生生态系统内的物质循环和能流( 能量按食物链顺序流转) 发生障碍，导 致整个生态系统平衡严重失调 1 1 3 3 破坏水域生态景观 浮游藻类的大量繁殖往往密集在水面形成一层薄皮或泡沫，加之死亡的浮游生物和鱼类漂浮在 其中，不仅使原来干净、清澈、透明的水体变得色泽混杂、满目疮痍，浮游藻类死亡后沉入水底并 堆积使水体变浅，加速了湖泊水库的沼泽化进程，破坏了原有的生态景观；还不断发出鱼虾腐烂分 3 东南大学硕士学位论文 解时产生另人厌恶的硫化氢臭昧和浮游藻类的鱼腥臭味，使生态旅游的游客掩鼻而过，大大降低了 景观的使用价值，影响旅游业的发展，同时也造成一定的经济损失。 1 1 3 4 威胁人类身体健康 位于江河的上游，湖泊、水库等大型水体若发生有害水华现象，浮游藻类释放的毒素和死亡的 浮游生物既污染了水源，导致水质下降，影响下游城乡居民的生活用水质量，造成用水不便与困难； 浮游藻类产生的毒素还可以在鱼虾体内存留和富集，通过生态系统的食物链对人类的身体健康造成 潜在的威胁，同时浮游藻类的生命活动还会产生亚硝酸盐等致癌物质，可使水体p h 值升高促进霍乱 弧菌的生长与繁殖，危害人体健康。 1 1 4 水体富营养化防治措施 环境污染的加剧，水体富营养化程度越来加剧，鉴于蓝藻水华对环境及人类存在的危害性，对 其进行控制和消除势在必行蓝藻水华尤其是大型湖泊中蓝藻水华的治理是世界性的难题，除了降 低水体中n 、p 营养盐水平外，各国的环境学家、生态学家、藻类学家等广大科技工作者和各国政府 的有关职能部门都对水华现象进行了大量的研究工作，投入了大量的人力、物力和财力，采取了许 多防治措施，目前国内外对于已经富营养化的水体所采取的防治措施主要为以下几个方面： 1 ) 工程措施：如整修河道，清淤，修建氧化沟等； 2 ) 物理除藻：利用超声波的机械振动、声流和空化效应造成生物细胞组织的损伤、断裂或粉碎，使 生物组分发生物理和化学变化，高效节能地破坏蓝藻天然复合物的关键组分，或抑制其生物合成， 从而抑制光合作用的进行达到抑制蓝藻生长、防止水华爆发的目的；还可以通过重力斜筛自动 脱水设备进行脱水处理，脱水后形成的藻浆经去毒处理，将成为上好的有机肥料或饲料“”； 3 ) 生物和生态调控措施：如生物操纵法，即在水体中放养食藻类的鱼类( 白链、花链、罗非鱼等) ”“1 ， 或减少食浮游动物的鱼类，增加浮游动物的数量，用浮游动物来控制藻类；也有的采取修复水体 中大型水生植物的方法，或在水面建人工浮床栽种水生植物，以加大吸收和去除水体中过量的营 养物质；还有的采用微生物来降解水体中的有机物和营养物质等： 4 ) 化学方法：有的在水华发生时在水中泼洒硫酸铜或铜的络台物，有的使用其他的多种杀藻剂，有 的在水中泼洒絮凝剂等此法易造成化学污染，应慎用； 5 ) 其他方法；如机械捞藻、气浮技术、曩气技术、引水冲洗稀释、增大水的流动等。还有的将上述 某些方法结合起来的技术等。 上述所介绍的各种方法都有一定的效果，但各有利弊，效果也有差异比较公认的还是主张采 用生物和生态调控的方法，因为这种方法安全、有效而且经济最后，还需要强调的是我们每个人 必须努力提高环保意识，特别是各级领导只有大家都重视环境问题了，人人都来保护水资源，水 污染才能得到有效的防治另一点就是必须进一步加强环境法制建设，真正实行依法保护水环境。 只要我们大家都重视了，法制进一步健全了，污染源才能真正得到控制，各项治理技术也才能有效 的发挥作用。 4 第一章绪论 1 2 微囊藻毒素研究的进展 1 2 1 微囊藻毒素的概述 淡水藻类中，毒性最强、污染最广、最严重的是蓝藻门。蓝藻( c y a n o p h y t a ) 是生物界中一类古老 且十分特殊的生物类群，分布广泛、适应力强，在腐烂物质、水体表面或底层皆有分布其重要繁 殖场所之一是淡水，尤其是富营养化淡水湖泊淡水湖泊中常见蓝藻主要有微囊藻o “i c r o c y s t i s ) 、鱼 腥藻( a n a b a e n a ) 、颤藻( o s c i l l a t o r i a ) 、聚球藻( s y n e c h o c o c c u s ) 、层理鞭线藻( m a s t i g o c l a m i n o s u s ) 等。目 前已知产生毒素的淡水蓝藻约1 2 属2 6 种“”这些蓝藻所产生的毒素根据毒作用的不同可分为三类： 多肽肝毒素、生物碱类神经毒素及脂多糖内毒素。其中肝毒素根据其化学结构又分为；徽囊藻肝毒 素( m i c r o c y s t i nm c s ) 和节球藻毒素( n o d u l a r i n ) 已有证据表明：蓝绿藻中微囊藻、颤藻，鱼腥藻、念 珠藻、束丝藻等都能产璺e m c s ，其在全世界地面水中广泛存在且与入类关系最为密切 1 2 2 微囊藻毒素的结构 m c s 是环七肽化合物，其基本结构为环( d - 丙氨酸l x n 赤甲基一b d - 异天冬氨酸 也z a d d a d 异谷氨酸矗甲基脱氢丙氨酸) 如图i 所示，其中n - 甲基脱氢丙氨酸为一种特殊的氨基 酸，含有口、b 不饱和双键；a d d a 结构为3 氨基9 甲氧基- 2 ，6 ，8 - 三甲基1 0 苯基一4 ，6 - 二烯酸。 两个可变的。氨基酸( ) 【和z ) 的更替及其它氨基酸的去甲基化，衍生出众多的毒紊类型，至今已发 现的6 0 多种异构体分别在甲基化、去甲基化、羟基化、差相异构化、多肽序列上各有差异一，其 中存在最为普遗、含量相对较多的是m c - l r 、r r 和y r ( l 、r 、y 分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨 酸) ，急性毒性以一l r 型最强。a d d a 基团对毒素的生物活性有很大影响，研究发现将a d d a 基团结 构破坏以后微囊藻毒素的毒性消除 疆) d 异谷氮馥 ( 3 ) m 异天冬氨酸 图l 微囊蕞毒幕m c s 一般结构圈中r l 、r 2 、代表h 或者c 地 东南大学硕士学位论文 i 2 3 微囊藻毒素的产生 m c s 主要存在于藻细胞内部，但在不周的生氏阶段，细胞内外环境中的毒素分布是变化的。研 究发现，m c s 在藻类的对数生长期明显增加，毒素主要集中于细胞内部，在对数生长末期达最大含 量；停止生长后随着藻细胞的死亡解体，细胞内的水溶性毒素不断释放进入水体由于它有很小 的体积( 分子量1 0 0 0 2 e 右) 、环状结构及其氨基酸的特殊结构，一般认为它不在核糖体内合成，而是由 肽合成酶复合体合成的生物活性小肽，类似于在一些杆菌和真菌中小肽的合成这些小肽大多是抗 生素、免疫抑制物和一些对动物和植物有毒的物质关于微囊藻毒素产生的机理有很多假设，但目 前为止尚无令人满意的结果。有两种考虑的可能性：一是环境因子影响，另一是遗传差异。 1 2 3 1 环境因予对微囊藻毒素产生的影响 微囊藻毒素受光照、温度、营养盐等多种环境因素的影响，其中光照可能起着非常重要的作用 目前比较一致的研究结果显示，光强对微囊藻毒素有显著影响，而适于藻细胞生长的温度并不适于 毒紊的形成。宋立荣等对滇池水华铜锈微囊藻和绿色微囊藻的实验室研究中发现，两种微囊藻在 低细胞浓度时，对光强的耐受力差，在低光强下( 1 5 皿m 2 s 1 ) 毒紊产量较高；研究还表明，光强对毒 素的影响效果受到培养温度的调节，而在同一光强下，温度的变化对毒素含量影响甚微u t k i l e n 等 “的研究也表明光能是毒素产生的一个重要制约因子，温度在高光强下对毒素的产生几乎没有影响， 只有低光强下温度才影响毒素的产生有研究表明，微囊藻细胞的腺苷酸能荷控制毒素的产生， 因此，任何影响腺苷酸能荷的因素都会调节毒素的产生，其中光照，营养盐的作用最大在营养盐 中，以磷的作用较明显，碳、氮的影响不大；微量元素中铁、锌的影响极明显。 1 2 3 2 毒素遗传差异对微囊藻毒素产生的影响 持毒素遗传决定论者认为，微囊藻有毒株( t o x i cs t r a i n s ) 和无毒株( n o n t o 硒cs 砌n s ) 的毒性是由遗传 决定的。对微囊藻的遗传结构的研究表明，微囊藻毒素的合成是由毒素肽合成酶基因等多基因控 制，并由肽合成酶复合体合成( 非核糖体合成的多肽) o t s u k a 等“研究了有毒和无毒微囊藻 ( m i c r o c y s t i s ) 之间的关系他们检涮t m i c r o c y s t i s 的4 7 个藻株的1 6 s 到2 3 s 核糖体d n a 内转录问隔序 列。结果表明，m i c r o e y s t i s 可被划分为三群：第一藻群包括有毒和无毒藻株；第二群只有有毒藻株； 第三群只有无毒藻株三个藻群之间的差别与表现型或藻胆色素成分之同的差别并无必然联系，且 同一种基因型可能有超过一种的表现型。通过对m a e r u g i n o s a p c c 7 8 0 6 的d n a 序列顺序分析研究发 现，这种产毒的微囊藻岔有具同源性的肽合成酶基因保守序列，其中至少含有两个多肽合成酶基因， 而微囊藻无毒株不具有这些基因 1 2 4 微囊藻毒素的毒作用机制和危害 研究表明，m c s 结构中，a d d a 是m c s 毒性表达所必须的，a d d a 结构改变则毒性减弱或丧失 此外，下列组成的改变或不同，决定m c s 毒性不同：两个可变的l - 氨基酸，m d h a 或p m e - a s p 的 甲基基团，谷氨酸，a d d a 。据此可将m c s 分为三类：1 ) 强毒性：m c - l r ，l a 和y r ；2 ) 中度毒 性：m c - w r ；3 ) 弱毒性：m c r r ，- m ( o ) r 6 第一章绪论 1 2 4 1 微囊藻毒素的毒作用机理 毒理学研究发现m c s 引发肝脏损伤的机理可能是m c s 是一种具有肝毒性的环状七肽化合物， 可作用的主要靶器官是肝脏，作用于肝脏的两种细胞，即肝脏细胞和肝巨噬细胞。m c s 主要经饮用 水摄入人机体后通过胆汁酸的携带转运至肝细胞，在肝细胞中通过抑制丝氨酸和苏氨酸的蛋白磷酸 酯酶1 0 ，p d 和蛋白磷酸酯酶2 a ( p p 2 a ) 的活性，激活蛋白激酶和环加氧酶，导致细胞内多种蛋白质的 过渡磷酸化”，使细胞内的蛋白磷酸化和去磷酸化作用调节失衡，抑制磷酸脱磷酰作用，使蛋白激 酶补充的酰基积聚，并通过细胞信号系统进一步放大这种生化效应“，改变了多种酶的活性，造 成细胞内一系列的生理生化反应紊乱，导致两种主要的结果：1 细胞骨架( 中间丝和微丝) 损坏， 直接引起细胞毒性效应；2 细胞增生失控，引发肿瘤增生活性1 。在巨噬细胞中m c s 可诱导肿瘤坏 死因：子c r n f - a ) 和白细胞介素l ( i l - 1 ) 。这些细胞因子能诱导产生血小板激活医子( p a f ) ，并激活环加 氧酶，环加氧酶可诱导产生血栓素和前列腺素，引起肝细胞炎症，肝损坏甚至肝坏死 1 2 4 2 微囊藻毒素对人类的危害 1 徽囊藻毒素对人类健康的直接影响 由铜绿微囊藻所产生的“致死因子”( 若对小白鼠注射藻浆。染毒小鼠死亡时间为2 2 5 h 的半 致死剂量为9 9 酬l ( g 体重“”) 据研究分析是一种分子量为1 3 0 0 2 6 0 0 。且不易为蛋白酶分解的环状七 肽肝毒舞叫m c s ”1 ，能一方面提高巍酸脱氢酶( l d i ) 释放率和自由基皿o s ) 的释放率；另一方面能 抑制蛋白磷酸化酶i 、酶2 的活性，打破蛋白磷酸化脱磷酸化的平衡，造成肝损伤或坏死”。国外 已多次报道饮用有产毒藻污染的水而导致家禽、家畜中毒死亡；游泳者因一次接触含m c s 较高的水 而引起皮炎、中毒性肝炎等，1 9 9 6 年2 月巴西一血液透析中心由于使用了含藻类毒素污染的水作肾 透析液，造成1 2 6 人出现了急性或亚急性肝中毒症状，其中6 0 人死予肝衰竭有研究表明。饮用 水中m c s 的存在与人群中原发性肝癌等一系列肿瘤发病率有明显的相关性“”，我国一些肝癌高发 区( 如广西扶绥) 的肝癌高发与当地水源中含该毒素有关。饮水中含有m c s 是我国南方肝癌的三大危 险因素之一( 曾有报道肝癌高发区饮沟塘水居民肝癌死亡率较饮井水者高5 胡倍) 。在澳大利亚有饮 用污染了能产生肝毒素m c s 的蓝藻的水与亚急性肝损伤有联系的证据；在动物实验中显示出肝肿瘤 的促进作用”。 2 生物蓄积性 当毒素浓度较低时，存活的永生动植物体内含有的毒素可能通过食物链转移到人体内，继而危 害人体健康。m a g a m a e s 等通过对一个浅海湾的鱼类连续3 年的追踪检测发现，既使在藻类低爆发 时期，人每日食用的鱼肌肉中m c s 浓度也接近或者超过w h o 推荐的每日容许摄入量( t d i ) f o 0 4 “g 蚴d ) 】而在最高时期更是达到此标准的4 2 倍毒素不仅可以在鱼体内蓄积，还可以在小龙虾、贝 蛤等软体动物体内蓄积，而且排出较慢，一般需数天时间。m c e l h i n e y 等1 甚至在茄子、菜豆等可食 植物用e l i s a 法检测到m c s ，由于人类对这些动植物需求摄入量较大，而毒紊在其体内蓄积短期 内不易被察觉，故其慢性危害不可忽视。 7 东南大学硕士学位论文 1 2 5 徼囊藻毒素污染的控制与去除 1 2 5 i 藻毒素理化特性 微囊藻毒素具有水溶性和耐热性。微囊藻毒索在水中是中性或带负电荷的分子集团，易溶于水 m c - l r 的分子量为9 9 6 ”1 ，其在水中的溶解性大于l g ，l ，不易沉淀或被吸跗于沉淀物和悬浮颗粒物 中。在水中徽囊藻毒素自然降解过程是十分缓慢的，当水中的含量为5 9 九时，3 天后，仅1 0 被水 体中微粒吸收，7 随沙沉淀另有研究中发现m c s 在水体中的稳定对间与水俸的特征有关，水 库水中低浓度m c l 取l o 腭皿) 不到1 个星期即发生初级降解，在去离子水中超过2 7 天毒素依旧很稳 定。毒素在消毒的水库中可保持稳定1 2 天。在自然水库水中其不稳定性是由于生物降解通过a d d a 旁链的修饰而灭活这一机制实现1 在色素存在的情况下，m c s 却被迅速降解，使其活性降低此 外，纯化的m c s 在阳光照射下依然保持其稳定性，但当毒素暴露在紫外线时即可被水解或发生化 学异构和化学键合反应而使毒性丧失，其半衰期是1 0 天当紫外线波长接近其吸收蜂周围( 1 i p2 3 8 2 5 4 n m ) ，m c s 被迅速地降解j m c s 有很高耐热性，加热煮沸( 水浴1 0 0 c ) 3 0 分钟后不失活，不挥 发，抗p h 变化，可溶于甲醇或丙酮，现行自来水处理工艺的混凝沉淀、过滤、加氯也不能将其去 除i 3 】董传辉等“1 人的调查试验研究表明在某湖周围3 个自来水厂的出厂水中检出低浓度的m c s ( 1 2 8 1 4 0 0 r i g l ) ，结果提示采用常规的饮水消毒处理不能完全消除水体中的m c s 美国c a r m i c h a e l 和他的同事对1 9 9 6 - 1 9 9 7 年间美国和加拿大的部分市政供水水质中研究发现水中6 5 * , 的微囊藻毒紊 未去除水样中1 3 的阳性样本超过w h o 规定的! 0 1 9 l 的m c s 浓度标准”1 由此可见，尽管去 除藻类后，在水中仍残留有溶解的m c s ，要去除这些m c s 必须采用新的水处理工艺 1 , 2 5 ，2 藻毒素控制标准 目前，尚没有强制性的饮水中藻毒素含量卫生标准，各国已有饮水中的微囊藻毒素含量标准一 般都为徽囊藻毒素一l r 的含量。世界卫生组织( w h o ) 推荐的饮水中的微囊藻毒素标准为1 0 p g l t a a ， 加拿大健康组织规定饮水中可接受的微囊藻毒素标准为o 5 1 9 lr 捌，澳大利亚学者建议1 0 p g a _ , 的含量 为安全饮用术的上限我国尚未制定饮水中微囊藻毒素含量的准确标准，在已颁布的生活饮用水卫 生规范中也只是将微囊藻毒素一l r 的标准值列入，参照w h o 标准，定为0 0 0 1 m g l m c s 通常存在 于细胞内，只有细胞死亡并溶解后才释放到周围环境中因此，在水处理过程中去除完整的蓝藻细 胞及其细胞内化合物，将有助于减少处理水中的有毒有味细胞代谢物的浓度。 1 2 5 3 微囊藻毒素的去除 由于微囊藻毒素具有水活性，且分子量较小，较难为常规的水处理工艺去除，需使用一些特殊 的处理方法目前去除微囊藻毒素的方法包括絮凝、化学降解、光降解及生物降解等 1 絮凝方法对微囊藻毒素的去除。 c h 停”1 研究了传统的凝结，絮凝一沉降一过淀的水处理方法对镐锈微囊藻( m j c n d 咖i 皤m g i n o 鼢) 细胞的影响结果表明。以硫酸铝絮凝去除m a e r u g i n o s a 细胞，不对细胞膜的完整性造成破坏， 也不影响细胞代谢物的释放，大部分细胞都能被完整地去除。处理后的水体中末发现m c s 浓度增加 2 化学降解方法对微囊藻毒素的去除。 m c s g 学及物理性质极稳定，只有在酸性条件( 如6 m i 盐酸) 下对其进行化学娃理，才能彻底地化 8 第一章绪论 学降解。在蒸馏水中，自然光及荧光都不能破坏m c s ，因此直接光降解无法消除自然水体中的m c s 研究还表明，微生物降解m c s 通常要经历几天的时间，降解速度才能达到较快水平这可能是由于 能降解m c s 的微生物的初始数量较少，或初始微生物的代谢活性发生了改变 3 光降解与光催化氧化方法对微囊藻毒索的去除 w e l k c r 等“”研究了腐殖质的存在对m c s 的光降解的效应。结果表明，3 种m c s 变型( l r ，y r ，r r ) 的浓度在腐殖质存在的条件下显著减少；而在纯水中，在自然光照下，这3 种m c s 的浓度则保持恒定。 不同浓度的腐殖质对降解效率没有影响。这可能是由于腐殖质起到了光敏剂的作用：腐殖质能吸收 波长范围较广( , 帕9 0 n m 到可见光) 的阳光，并形成高反应性分子( 如羟基自由基、单线态氧或过氧化 氢) ，这些高反应性物质就能激发惰性污染物发生光化学反应r o b e r t s o n 等8 研究y _ - 氧化钛光催化 降解m c - l r 的作用，并研究了影响此过程的因素。结果表明。m c l r 的降解是由羟基自由基攻击毒 素中的a d d a 基团引发的。在f e 娩等的研究中发现二氧化钛光催化降解m c - l r 的过程依赖于p h 值的变化，毒素降解的最大起始速率出现在p h = 3 5 时，在较商p h 值下，毒素的降解出现明显的迟滞。 这可能是因为在较低p h 值时，毒素吸附到二氧化钛表面，并被在氧化过程中产生的较长寿命的有机 自由基( 羟基自由基) 所降解；而在较高p h 值下，毒素吸附到二氧化钛的过程交得微弱，有机自由基 分散到溶液中，经历一段时间的迟滞，才开始氧化在溶解相中的毒素 4 生物降解方法去除微囊藻毒素。 吕锡武等”采用序批式生物膜反应器，对m v i r d i s 及微囊藻毒素r r 、y 期阳】承进行了生物降解 实验研究。结果表明，好氧生物处理对有毒蓝藻及其微囊藻毒素的降解远比缺氧生物处理工艺有效； 在好氧条件下，草履虫对有毒藻类和微囊藻毒素降解起重要作用 朱光灿等”采用生物活性炭( b a c ) 工艺去除饮用水中微囊藻毒素，1 5 h 后对m c - r r 、m c y r 和 m c - k r 的去除率分别为6 0 5 7 、6 3 3 0 和6 8 7 9 原水中较高浓度的易生物降解有机物会抑制b a c 对微囊藻毒素的去除，大部分m c s 可通过微生物降解去除( 同时活性炭得到一定程度的再生) ，部 分m c s 通过吸附作用被去除 1 2 6 微囊藻毒素的分析检测 由于目前对藻类水华的爆发和微囊藻毒素产生机制还缺乏系统的了解，对水源中微囊藻毒素的 水平无法进行预铡，因此只能通过一定的监铡手段，实时的掌握水体中微囊藻毒素的污染水平 目前，国内外比较通用的方法主要有生物监测、化学，酶联免疫吸附实验法、蛋白磷酸酶抑制测定 法和细胞毒性监测技术等。这些监测技术各有其优点和缺点，而对于水体中微囊藻毒素的检测，由 于含量低，干扰大，目前尚未有非常可靠的定性和定量检测方法，况且人类对微囊藻毒索的摄入也 并不一定仅通过饮水、直接接触和血透析这3 种途径，为微囊藻毒素的检测和控制增添了诸多困难， 人类对微囊藻毒素的摄入除了上述三种途径外，同时微囊藻毒素也可以通过食物链累积，供食用的 水产品姗鱼类、贝类等也可能携带蓝藻毒素进而危害人类。另外，那些用地表水进行喷灌的农作 物以及室外养殖的微藻食品都有受到蓝藻毒素污染的危险“为了防止微囊藻毒素对人类的危害， 需进行更加深入广泛的研究。 9 东南大学硕士学位论文 1 3 立题背景和意义 如何控制和清除蓝藻承华爆发带来的危害和改善恶化的水环境是世界各国共同面临的难题。这 些方面的研究是项长期而艰巨的工程，对于蓝藻的产毒机理、微囊藻毒素的毒作用机制以及微囊 藻毒素含量与各种环境因子之闫的相互关系等方面仍未十分清楚，有待进一步研究。对于微囊藻毒 素的生物化学，环境化学性质，生态毒理学等方面的研究，以及建立行之有效控制蓝藻水华的途径， 迫切需要对水体中特别是作为饮水水源的湖泊，河流和水库中的微囊藻毒素进行监测和分析考察 微囊藻毒素在细胞繁殖和死亡时的产生和发展。研究微囊藻毒素在水环境中的迁徙、转化规律，为 生物和化学方法控制水华方法提供坚实的理论依据。开展水华蓝藻的生物脱毒和资源化安全利用， 研究长期低浓度微囊藻毒素对人体造成的危害，开展流行病学调查，提供淡水微囊藻毒素污染对人 体健康影响的评价资料，同时微囊藻毒素在药物开发上也具有很好的应用前景此外，那些用地表 水进行喷灌的农作物以及室外养殖的微藻食品、水产品都有受到蓝藻毒素污染的危险为了进一步 研究微囊藻毒素，迫切需要建立对微囊藻毒素进行快速定性和定量分析。建立一套痕量、快速、灵 敏、准确的分祈方法，提供完善的永质恶化预警信息、藻类永华形成的预警信号，为微囊藻毒素风 险评价、监测水处理脱毒效能研究以及建立国际公认的能反映微囊藻毒素损伤的灵敏指标提供必要 的理论基础。 多年以来，人们一直致力于建立敏感的微囊藻毒素检测方法，如生物毒性实验、碱性磷酸酶抑 制性实验，e l i s a