（化学工程与技术专业论文）γ氨基丁酸的制备研究.pdf

一 iyiii t 1187l 1 1111 1 1 1 8 i l l11111必111 学位论文数据集 中图分类号t c 的2 8 学科分类号 5 3 0 6 4 论文编号1 0 0 1 0 2 0 1 1 1 1 6 2密级 公开 学位授予单位代码 1 0 0 1 0 学位授予单位名称 北京化工大学 作者姓名沈萌学号2 0 0 8 0 0 1 1 6 2 获学位专业名称 化学工程与技术获学位专业代码 0 8 1 7 课题来源 自选研究方向双极性膜电渗析分离 论文题目y 一氨基丁酸的制备研究 关键词y 氨基丁酸，双极性膜，电渗析 论文答辩日期 2 0 1 1 5 2 3 幸论文类型应用研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名职称工作单位 学科专长 指导教师陈劲春教授北京化： 大学基因工程 评阅人1 马润宁教授北京化工大学化学工程 评阅人2黄正明 教授 三零二医院 药学 评阅人3 评阅人4 评阅人5 答懒僦袁其朋 教授北京化丁大学分离提取 答辩委员1乔仁忠教授北京化工大学 有机合成 答辩委员2喻长远教授北京化工人学 中药研究 答辩委员3阎爱侠教授北京化工人学计算机模拟 答辩委员4 干文雅副教授北京化i ：人学生物研究 答辩委员5 注：一论文类型：1 基础研究2 麻h j 研究3 开发研究4 其它 _ 二中图分类号在中国图1 5 资料分类法布淘。 三学科分类号在中华人民共和国国家标准( g b r1 3 7 4 5 9 ) 学科分类与代码中查询。 四论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 y 一氨基丁酸( g a b a ) 是目前研究较为深入的一种重要的抑制性 神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性。研究表明， g a b a 不仅可以镇静神经、抗焦虑，还可降低血压、治疗某些神经疾 病如老年痴呆症，还有提高脑活力、防止动脉硬化等功效。2 0 0 9 年 卫生部批准y 一氨基丁酸为新资源食品，这意味着g a b a 在国内市场 进入了一个崭新的时代。 本论文考察了用化学合成法和生物法分别制备y 氨基丁酸。化 学合成法以2 比咯烷酮为原料，在k o h 碱性条件下，制备氨基丁酸， 转化率达9 5 以上。生物法是从酸奶中筛选得到的菌株，经初步鉴定 为乳酸球菌，以谷氨酸钠为原料，发酵生产g a b a ，终产物浓度约为 3 9 9 l 。 同时还创新性的使用双极性膜电渗析装置来分离化学合成法得 到的氨基丁酸粗品。比较了二隔室装置和三隔室装置分离纯化效果， 最终选定三隔室双极性膜电渗析装置进行氨基丁酸粗品的分离。在经 济可行的条件下回收效率达到6 0 以上，其母液可以回收再进行补料 操作。同时，还可以在碱室回收得到浓度为2 5 以上的k o h 。 并且对双极性膜电渗析装置分离得到的g a b a 产品进行后处理， 利用弱酸性阳离子树脂进行进一步的纯化，并利用结晶的方法得到 北京化t 人学坝1 j 研究生学位论文 g a b a 产品，产品纯度达9 9 。 关键词：y 氨基丁酸，双极性膜，电渗析 a b s t r a ( 了 p r e p a r a t i o no fy - - a m i n o b u t y r i ca c i db yt w om e t h o d s a b s t r a c t ) , - a m i n ob u t y r i c a c i d ( g a b a ) ， aw e l l - s t u d i e d i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r , i si n v o l v e d i nl o t so fm e t a b o l i ca c t i v i t i e s p r e v i o u s s t u d i e ss h o w e dt h a tg a b an o to n l yh a st h ea b i l i t yt os e d a t i v en e r v e ，t o d e c l i n eb l o o dp r e s s u r e ，b u ta l s oc a nb eu s e di nt h et h e r a p yo fs o m e m e n t a ld i s e a s e s f o rp r e p a r a t i o no fy a m i n o b u t y r i ca c i d ，t w om e t h o d si n c l u d i n g c h e m i c a l s y n t h e s i s a n d b i o l o g i c a l t r a n s f o r m a t i o nw e r e e m p l o y e d i n d i v i d u a l l y i nt h i s s t u d y b ym e a n so fc h e m i c a ls y n t h e s i s ，t h e p r e p a r a t i o nw a sc a r r i e do u tw i t h2 - p y r r o l i d o n ea sr a wm a t e r i a l su n d e r t h ea l k a l i n ec o n d i t i o no fk o h t h ec o n v e r s i o nr a t ec o u l dr e a c h9 5 o r m o r e w i t ht h eb i o l o g i c a lm e t h o d ，t h eb a c t e r i a ls t r a i ns c r e e n e do u tf r o m y o g u r tw a sp r e l i m i n a r yi d e n t i f i e da sb a c t e r i u ml a c t o c o c c u s ，g a b aw a s p r o d u c e db yf e r m e n t a t i o nw i t hs o d i u mg l u t a m a t ea sr a wm a t e r i a l s t h e c o n c e n t r a t i o no ff i n a lp r o d u c tc o u l dr e a c ha b o u t3 9 9 l f o r d e s a l t f r o m g a b a p o t a s s i u mb i p o l a r m e m b r a n e e l e c t r o - d i a l y s i s ( b m e d ) m e t h o di si n v e s t i g a t e di nm o r ed e t a i l b yu s i n ga t h r e e - c o m p a r t m e n tb m e d ，g a b aa n dk o hf r o mi t ss a l tc o u l db e s e p a r a t e di n d i v i d u a l l y m o r e o v e r , g a b ac r y s t a lc a l lb ec o l l e c t e dw h e n t h eg a b as o l u t i o ni sc o o l e dd o w n t h e p u r i t yo fg a b a c a ne x c e e d9 9 北京化工人学硕【j 研究生学位论文 s t a n d i n go nt h ee c o n o m i cv i e w , f o rf u l lp r o c e s s i n g ，t h ea v e r a g ee l e c t r i c c u r r e n te f f i c i e n c yw a sa b o v e6 0 ，t h ee l e c t r i ce n e r g yc o n s u m p t i o nw a s a p p r o x i m a t e l y2 k w hp e rk go f g a b a k e yw o r d s ：g a b a ip r e p a r a t i o n 。c h e m i c a ls y n t h e s i s 。b i o t r a n s f o r m a t i o n b i p o l a rm e m b r a n ee l e c t r o d i a l y s i s 目录 目录 第一章绪论1 1 1y 一氨基丁酸概述1 1 1 1 非蛋白质氨基酸1 1 1 2y 一氨基丁酸的化学结构和性质1 1 1 3y 一氨基丁酸的生理功能3 1 1 3 1 镇静、安神、抗脑衰老作用3 1 1 3 2 降低血压作用3 1 - 1 3 3 抑制心律失常作用4 1 1 3 4 治疗癫痫等疾病一4 1 1 3 5 对脑组织的保护作用4 1 1 3 6 镇咳、治疗哮喘等作用4 1 1 3 7 其他功能5 1 1 4y 一氨基丁酸的制备5 1 1 4 1 化学合成法5 1 1 4 2 生物合成法6 1 1 4 3 天然产物提取法8 1 1 5y 一氨基丁酸的分离纯化9 1 2 双极性膜电渗析装置概述1 0 1 2 1 双极性膜的结构和特性1 0 1 2 1 1 离子交换膜1 0 1 2 1 2 双极性膜1 l 1 2 2 双极性膜电渗析1 2 1 2 3 双极性膜电渗析的应用i 2 1 3 本课题的研究内容和意义1 4 1 3 1g a b a 的分离纯化方法1 4 1 3 2g a b a 的制备方法1 4 第二章y 一氨基丁酸的生物合成法制备1 5 v 北京化t 大学硕i j 研究生学位论义 2 1 引言1 5 2 2 实验材料与仪器1 5 2 2 1 实验材料1 5 2 2 2 实验仪器1 6 2 2 3 培养基1 6 2 2 4 实验试剂1 7 2 3 实验方法1 7 2 3 1 菌种的分离1 7 2 3 2 菌种的形态特征鉴定1 7 2 3 3 菌种的需氧实验1 7 2 3 4 菌种的接触酶实验1 7 2 3 5 菌种的产酸实验1 8 2 3 6 菌种的产g a b a 实验1 8 2 4 结果与分析1 8 2 4 1 菌种的初步分离与鉴定1 8 2 4 2 菌种的形态特征1 9 2 4 3 三种菌的转化液中g a b a 含量比较1 9 2 4 3 1 转化液中g a b a 的定性分析1 9 2 4 3 2g a b a 的标准曲线测定2 l 2 4 3 3 三种菌株产量比较2 1 2 4 3 4 温度和g a d 辅酶p l p 对g a b a 产量的影响2 2 2 5 本章小结2 3 第三章g a b a 的化学法制备及b m e d 分离2 5 3 1 引言2 5 3 2 实验材料与仪器2 6 3 2 2 实验仪器2 7 3 2 3 实验试剂2 7 3 3 实验方法2 8 3 3 1g a b a 的化学合成法2 8 3 3 2 吡咯烷酮的残留测定2 8 3 3 3g a b a 的脱色工序2 8 3 3 4g a b a 的标准曲线的测定2 8 日录 3 3 5 二隔室双极性膜电渗析装置分离g a b a 2 9 3 3 6 三隔室双极性膜电渗析装置分离g a b a 2 9 3 4 结果与分析3 0 3 4 1g a b a 的化学合成法3 0 3 4 22 一吡咯烷酮的残留量测定3 1 3 4 3g a b a 的标准曲线的测定3 2 3 4 4 二隔室双极性膜电渗析装置分离g a b a 3 3 3 4 4 1 料液浓度的影响3 3 3 4 4 2 二隔室电渗析过程实验终点的判定3 3 3 4 4 3 二隔室电渗析装置的转化率3 5 3 4 5 三隔室双极性膜电渗析装置分离g a b a 3 6 3 4 5 1 膜堆电压的选择3 6 3 4 5 2 氨基丁酸盐初始浓度与g a b a 转化率的关系3 7 3 4 5 3 三隔室电渗析过程的电流效率3 8 3 4 5 4 三隔室电渗析过程的能耗：3 9 3 4 5 5 三隔室电渗析过程和二隔室电渗析的优缺点比较4 0 3 5 本章小结4 1 第四章g a b a 的纯化与结晶4 3 4 1 引。言4 3 4 2 实验材料与仪器4 3 4 2 1 实验材料4 3 4 2 2 实验仪器4 4 4 2 3 实验试剂4 4 4 3 实验方法4 4 4 3 1 树脂筛选与预处理4 4 4 3 2 树脂的静态吸附试验4 4 4 3 3g a b a 粗品的收集4 5 4 3 4g a b a 的结晶4 5 4 3 5g a b a 的表征与纯度鉴定4 5 4 4 结果与分析4 6 4 4 1 树脂筛选与预处理4 6 4 4 2 树脂的静态吸附试验4 6 v 北京化t 大学硕 ：研究生学位论文 4 4 3g a b a 的表征与纯度鉴定4 7 4 5 本章小结5 0 第五章结论和建议5 3 5 1 结论5 3 5 2 建议5 4 参考文献5 5 致谢5 9 1 1 1 非蛋白质氨基酸 在人体六大营养物质之中，蛋白质是生命的重要的物质基础。氨基酸，则是 作为蛋白质的一级结构的组成部分。而除了组成蛋白质的二、三十种氨基酸以外， 在生物体的各个组织和细胞中，还存在着上百种不同的氨基酸，它们也有各自的 作用。这些氨基酸大部分是已知蛋白质中存在的l 型q 氨基酸的衍生化后的产 物，还有一些是b ，y 一和6 氨基酸，并且还有些氨基酸是d 型的，这些非蛋 白质氨基酸都对生物体的代谢调控和生理活动起着不容忽视的作用，其中y 氨 基丁酸( y a m i n ob u t y r i ca c i d ，g a b a ) ，就是一种天然的非蛋白质氨基酸。 1 1 2 丫一氨基丁酸的化学结构和性质 y 氨基丁酸【2 1 ，又名哌啶酸，p i p e r i d i ca c i d ，g a b a ，g a m e r e x ，g a m m a l o n ； 其结构式为h 2 n ( c h 2 ) 3 c o o h ，( 见图1 1 ) ，为小叶状结晶( 甲醇乙醚) ，针状结 晶( 水乙醇) ，微臭，微苦，无手性异构体，熔点2 0 2 摄氏度，溶化时分解为水 和吡咯烷酮，极易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于或难溶于其他溶剂。 o 图1 - 1y 氨基丁酸 f i g 1 1y - a m i n ob u t y r i ca c i d y 氨基丁酸在溶液中一般是以两性离子存在的【3 4 1 ，溶液的p h 值决定了 g a b a 以何种形式存在。 北京化t 人学硕i j 研究生学位论义 k 。= 耻嗡笋 由公式1 1 和1 2 可以计算出各种形式的g a b a ，在各个p h 值下的分伟状 况，如下图1 2 所示【5 】： 图1 2 各种形式的g a b a 在不同p h 下的分布状况 f i g 1 2d i s t r i b u t i o nc u r v e so fd i f f e r e n t i o nf o r m so fg a b aa td i f f e r e n tp h 因为g a b a 的等电点( p l g a b a ) 由两性离子两侧的p k 值决定，因此， 倒删= 去挑。+ p 9 6 ) = 1 ( 4 0 2 + 1 0 3 5 ) = 7 1 9 z二 y 氨基丁酸同样具有氨基酸的一些特征反应，比如酰化反应、与茚三酮的 显色反应，成盐作用，烃基化等。由于g a b a 在紫外区域无光吸收，所以不能 直接用紫外分光光度法进行定量测定，但是在碱性环境中，g a b a 可以与衍生剂 邻苯二甲醛( o p a ) 反应【6 1 ，生成具有较强荧光活性的产物，再进行h p l c 测定， 其反应见图1 3 所示。 同时，为了方便快捷的测定样品中g a b a 的含量，还可以采用纸层析法或 者b e r t h e l o t 比色法，这两种方法测定得到的结果与h p l c 测定结果相比，相对 误差均小于5 t 7 1 。 2 豢一黥曩ua2u纵 r 图l - 3 g a b a 的衍生化反应 f i g 1 - 3d e r i v a t i v er e a c t i o no fg a b a 1 1 3y - 氨基丁酸的生理功能 y 氨基丁酸，最早人工合成于18 8 3 年【8 】，19 5 0 年r o b e r t s 9 】和a w a p a r a 1 0 】 观察到哺乳动物脑和视网膜中含有很高浓度的g a b a ，后来被众多学者证实为抑 制性神经递质。1 9 8 2 年l l ，b a m a r d 从牛脑中分离得到了g a b a 受体。 研究表i t ) 8 , 1 2 , 1 3 , 1 4 】：g a b a 受体可分为3 中类型，即g a b a a 、g a b a b 和 g a b a c ，其中a 和c 两种受体激动时，氯离子通道开放，氯离子内流使得神经 元膜超极化，产生抑制性突触后电位( i p s p ) ，抑制突触后神经元兴奋；同时， g a b a 在中枢神经系统( c n s ) 中，可以参与多项重要的生理生化反应，如镇痛、 调节食欲以及心血管活动等。y 氨基丁酸的主要药理功能如下所示。 1 1 3 1 镇静、安神、抗脑衰老作用 g a b a 由于能增加葡萄糖磷脂化酶的活性，从而加速大脑内的能量代谢，提 高脑部氧的供给量，恢复脑细胞活力【15 1 。李绍旦等【1 6 1 发现在亚健康失眠人群中， 脑内神经递质( 如y 氨基丁酸) 的活动变化情况及其脑功能状态，普遍低于正 常参考值，并且差异都具有显著性。饶曼妮等的研究成果也表明，脑内y 氨 基丁酸的含量对催眠和安神等方面都能起到一定的作用。 1 1 3 2 降低血压作用 由于y 氨基丁酸是脑内一种重要的抑制性神经递质，它可以通过调节c n s ( 中枢神经系统) ，调节脊髓的血管运动中枢，最终有效地促进血管扩张，实现 降低血压的目的【1 8 , 1 9 】。胡家澍2 0 1 等人的研究结果表明了g a b a 对哺乳动物能起 到降血压和抗惊厥的生理作用。吴惠玲 2 i 】等，用自发高血压大鼠作为实验对象， 考察了g a b a 对实验动物辅助降血压作用，结果表明食用g a b a 茶水的对照组 北京化t 人学硕l ：研究生学位论文 大鼠血压明显降低。 1 1 3 3 抑制心律失常作用 据相关报道表明【2 2 2 3 1 ，g a b a 能对抗多种实验性心律失常，而且g a b ai c v ( 侧脑室注射) 可以抑制心律失常的发生。孟娟如【2 4 】等人实验发现，y 氨基丁 酸不仅可以延长乌头碱诱发的麻醉大鼠室性早搏( v p ) 和室性心动过速( v t ) 的出现，还能降低心室纤颤( v f ) 的发生率，并且还能提高乌头碱诱发大鼠心 脏产生v t 、v f 、心跳停止的阀剂量，这些都可以说明g a b a 是主要通过对心 脏的直接作用来抵抗乌头碱性心律失常。 1 1 3 4 治疗癫痫等疾病 研究表明【2 5 2 6 2 7 ，2 8 2 9 】：在脑内的g a d 活力降低，导致g a b a 含量减少，是 惊厥和癫痫的主要病因之一；而g a b a a 受体q1 或y2 亚基突变引起的受体数 量和功能异常则是人类原发性癫痫的主要病因。我国学者杭维亮【3 0 1 ，也发现临床 应用g a b a 能够治疗癫痫病。 1 1 3 5 对脑组织的保护作用 赵彤【3 1 l 等人研究发现：g a b a 对大鼠海马脑片缺氧损伤时有一定的保护作 用，同时，如果施加g a b a a 的受体拮抗剂或者氯离子通道阻抗剂的话，便可破 坏g a b a 对脑的保护作用。故而，可以知道，g a b a 有提高海马脑片的抗缺氧 的能力。之后，甘平【3 2 1 又报道其研究结果，发现g a b a 受体可以在一定程度上 对脑缺血起到保护作用，但由于其机制复杂，尚未能完全解释g a b a 保护作用 存在的差异。 1 1 3 6 镇咳、治疗哮喘等作用 g a b a 有三种受体【3 3 】，a 型、b 型和c 型，其中a 型和b 型均与呼吸道密 切相关。相关研究表明【3 4 】：g a b a a 通道可以在气道平滑肌上表达，同时g a b a a 受体激动剂可以松弛气道平滑肌，这样可以减弱气道狭小而引起的气道通气压 力，为治疗哮喘等疾病丌辟了一条新的道路。还有结果表d ) j 1 3 3 1 ，g a b a 抑制小 鼠的支气管痉挛，是通过作用于g a b a b 受体，抑制乙酰胆碱的释放而发挥作用 的。此外，g a b a b 受体在气道平滑肌也有一定的表达【3 5 1 ，但其作用机制暂不清 楚。 4 第一章绪沦 1 1 3 7 其他功能 g a b a 作为一种抑制性神经递质，通过影响垂体和性腺等组织，进而参与激 素的分泌与调制3 6 1 。g a b a 还恶可以提高精子地体外受精能力，调节输卵管和 子宫的收缩，促进精子的转运过程【3 6 , 3 7 】。有研究成果表i 明 3 8 , 3 9 】：g a b a 可以促进 胰岛素的分泌，进而有效的预防糖尿病的发生。 1 1 4 丫氨基丁酸的制备 目前的工业单元操作中，化学合成法、生物合成法和天然产物提取法是主要 制备g a b a 的三种方法：。其中，生物合成法主要是利用微生物中体内的g a d ( 谷氨酸脱羧酶) ，将底物l 谷氨酸( g l u ) 或l 谷氨酸钠转化为y 氨基丁酸 ( g a b a ) ；天然产物提取法则是从植物组织中提取g a b a 。 1 1 4 1 化学合成法 目前，制备g a b a 的最常见的方法是用邻苯二甲酰亚氨钾和y 一氯丁氰在高 温条件下( 1 8 0 摄氏度) 反应，产物再与浓硫酸反应水解得到【删，见图1 4 ： 一叫一 。娶一、 h i o 图l - 4 制备g a b a 反应 f i g 1 - 4t h ep r e p a r a t i o no f g a b a 另一种方法【4 1 4 2 1 就是以2 一吡咯烷酮为起始原料，在碱性条件下水解开环反 应制得g a b a ，见图卜5 ： 水麓开环) c 0 h ) 2 n h 4 h c 岛 1 2 1 3 5 。1 0 - - ! 铀 图l - 5 制备g a b a 反应 f i g 1 - 5t h ep r e p a r a t i o no f g a b a 北京化r t 人学钡l ：研究生学位论文 最近，杨东元【4 3 】等人采用了一种新的方法，是以y 一丁内酯为原料，经过一 系列复杂的反应制得g a b a ，见图卜6 所示： 啬一一h c l c l c c h , c h c o o c h , n h h 是h h 0 0 c h ， 些坚三! n h 茹h 菇h h o ) n n h 正h 正h 2 c h ，c o o h 图l - 6 制备g a b a 反应 f i g 1 6t h ep r e p a r a t i o no fg a b a 化学合成法与其他两种方法相比，具有反应时问短，产品纯度高等优势，但 同时相对而而言，化学合成发要求的反应条件苛刻，能耗也比较高。 1 1 4 2 生物合成法 谷氨酸脱羧酶( g l u t a m i ca c i dd e c a r b o x y l a s e ，g a d ) ，是一种专一的g a b a 合 成酶【4 4 1 ，它是以磷酸吡哆醛( p h o s p h o p y r i d o x a l ) ，即维生素b 6 ( v i t a m i nb 6 ) 为 辅酶，在p h 为6 5 左右时，酶活力达到最高，但是谷氨酸和a t p 又都会在一定 程度上影响g a d 的活性：前者会促进酶蛋白与辅酶分离，而后者则是抑制酶蛋 白与辅酶结合。目前，研究学者们已经在很多种类的微生物中发现了g a d ，比 如：大肠杆菌、曲霉菌、短杆乳酸菌、酵母菌、屎肠球菌、乳酸链球菌、乳酸乳 球菌等等。 g a b a 的形成途径如1 7 副4 5 】所示： c o o 。 l h - - c 一n h 3 + 。 c h ， l 。 c h ， i c o o 谷氨酸 谷氨酸脱羧酶 c h ，一 。 c h ， i c h ， i c o o 氨基丁酸 图1 - 7 发酵法制备g a b a f i g 1 - 7t h ep r e p a r a t i o no f g a b ab yf e r m e n t a t i o n 6 第章绪论 ( 1 ) 利用大肠杆菌发酵生产g a b a 大肠杆菌是发现最早，并且具有很高g a d 活性的微生物，至今为止，已经 有诸多的研究学者对其进行了研究，并且已经采用酶的固定化和细胞固定化等方 法进行生产。赵景联m 】等人将大肠杆菌细胞用海藻酸钙包埋，制备成固定化细胞， 用o o l m g m l 浓度的l g l u 溶液l 、日j 歇反应5 小时，转化率可以达到1 0 0 。谢凤 英【47 】等人采用二次回归正交旋转组合设计方法对g a b a 发酵过程进行了优化， 最终使得g a b a 的产物浓度达到0 8 4 m g m l 。最近，王期【4 8 】等成功重组了质粒 p e t 2 8 a g a d a ，并转化到e c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) 中，经诱导表达，g a d 活性可以达 到出发菌株的6 0 倍，并且以3 1 l 的l 谷氨酸钠为底物，最终g a b a 浓度可以 达到1 9 5 7 彰l ，转化率为9 3 。 尽管大肠杆菌有着如此之高的g a d 活性，也能获得较高浓度的g a b a 产品， 但是对于食品工业来说，食品安全是必须放在第一位的，而这又恰恰是利用大肠 杆菌发酵的不足之处。所以，国内外专家学者纷纷将注意力转向了那些无致病性 的微生物，如乳酸菌、酵母、曲霉菌等等。 ( 2 ) 利用酵母发酵生产g a b a 由于利用酵母发酵的产品无毒无害，所以在很多食品行业酵母已经被广泛应 用。利用酵母发酵生产g a b a 也有些报道，高年剔4 9 】等人以味精厂的等电废液 为出发原料，用l o j 罨l 的酵母粉发酵7 2 h ，经过优化，最终g a b a 产量可以达到 2 7 l 。徐晓波等人【5 0 】，从自然界中筛选到了5 株酵母菌株，其中最好的一株酵 母经发酵得到g a b a 含量为3 6 5 3 g l 。而蒋冬花【5 l 】等从水果表面分离得到一株 相对高产的酵母菌株，经优化发酵条件，最终发酵液中g a b a 的浓度可以达到 7 5 3 9 9 l 。 相对于利用大肠杆菌发酵而言，酵母菌体内的g a d 活性不如大肠杆菌活性 高，但是从安全性考虑，酵母属于安全级发酵菌株，适合食品工业的发酵生产， 所以有一定的发展前景。 ( 3 ) 利用乳酸菌发酵生产g a b a 在国内外，食品工业中利用乳酸菌发酵早已是司空见惯的事情了。崔晓波【5 2 】 等人就用乳酸菌s k 0 0 5 发酵生产g a b a ，产品浓度为5 4 9 l 。朱晓立【5 3 】用乳酸 乳球菌在p i t 6 5 的发酵液中，3 0 摄氏度下转化2 6 h ，最终g a b a 浓度达9 0 1 l 。 卢彦梅瞰】等从自然界中分离得到一株乳酸链球菌( s t r e p t o c o c c u sl a c t i s ) ，经发酵 培养最终g a b a 含量可达4 2 3 9 l 。浙江大学的黄俊【5 5 1 ，利用短乳杆菌发酵3 d ， 经过四次补料操作，最终发酵液中g a b a 浓度达到7 6 3 6 l 。 下表1 1 是部分研究学者利用微生物发酵生产g a b a 的研究情况概述【5 0 】： 7 北京化1 二人学硕i j 研究生学位论文 表1 - 1 微生物合成g a b a 的研究概况【5 0 】 t a b l e1 - 1o u t l i n eo f b i o s y n t h e s i so fg a b ab ym i c r o o r g a n i s m s 综上所述，利用微生物发酵生产g a b a 还处于一个研究发展阶段，还需要 更多的研究工作才能将该技术应用于食品工业化。 1 1 4 3 天然产物提取法 研究表明，在植物组织中，有两条合成和转化g a b a 的途径5 6 】：一条途径 就是以g a d 为催化剂，将l g l u 脱羧产生g a b a ；另一条途径就是有多胺类物 质降解，其中，第一条途径是植物体富集g a b a 的主要方式。我国学者张晖【5 7 】 研究发现，用米胚芽富集g a b a ，浓度可以约达到4 9 k g ，其工艺如图1 8 所示： 麓素 工 糸糠一二束一白荩 张一耒气软3 ，x 4 咖删 杀蕾一干爆一+ 培煎一耪辟一适轼 去杂一，束胚芽一，脱脂( 低温) g a 昂a 富集 l 抽出一分离精棚一浓缩杀盛一喷雾千燥 l l 高浓j r 硝认暾束胚芽( 50 0 0 - 8 加帆傀) l h b 侧l 阴2 c 俄h 2 a x m ( 谷氛酸) i 内潦晦) 期1 例2 c h ，q 扣【x 射( 卜氛鲞丁麓) 图1 8 植物富集法制备g a b a f i g 1 8t h ep r e p a r a t i o no fg a b ab yp l a n te n r i c h m e n tm e t h o d 8 1 1 5 y - 氨基丁酸的分离纯化 y 氨基丁酸的分离和纯化对于食品和医药工业来说，是非常重要的一个环 节。即要除去粗产品中的有毒有害的物质，又要尽可能的减少产品中g a b a 的 损失。 在天然产物提取方法0 0 5 8 , 5 9 】，一般都是利用g a b a 极易溶于水的性质，先 用水提，然后用乙醇将g a b a 浓缩，接着将浓缩后的g a b a 溶液经7 3 2 阳离子 柱吸附，再用氨水洗托，达到进一步纯化的目的。 而利用生物合成法生产g a b a 时，最终发酵液的组成成分非常复杂，除了 产品之外，不仅含有微生物的菌体，还含有部分未消耗完的培养基等物质，因此 发酵液的下游纯化过程是非常困难的，故而不得不采取“多步骤，多工艺”的方 法。g a b a 的生物合成法的一般提取工艺【删见下图1 - 9 。 发酵渡 l 预处理( 加热调p l l 、絮凝) l 麓体分离( 赢心分离、过滤、压滤) l 初步纯化( 沉淀吸附、离子交换，萃取，电渗柝) | i 高度纯化( 超滤吸附、结晶、重结晶) l 成品加3 2 ( 千攥、分餐) 图1 - 9g a b a 的生物合成法的一股提取j ：艺 f i g 1 - 9g e n e r a lp r o c e s so f s e p a r a t i o no f g a b a 李良铸【4 1 1 又介绍了一种以l g i u 为底物的g a b a 生产工艺，见图1 1 0 所示。 l 广g l u 在e c o l i 的g a d 的催化作用下，转化为g a b a ，然后经过7 3 2 型阳 离子柱将g a b a 吸附上柱，之后用氨水洗脱，再经过2 0 1 4 型强碱性阴离子树 脂纯化，浓缩结晶，得到g a b a 纯品，最终收率达到4 0 。 另外，近年来还有许多研究学者【6 l j 将膜分离技术应用于g a b a 的分离过程。 通过超滤和纳滤，将发酵液中提取g a b a 的回收率从5 0 提高到9 5 。 9 北京化t 大学硕 ：研究生学位论文 i 杰墅堑苎蕉王壅塑垂卜 磊飘d 盔墅! ! 壁墼壁璧垄墼鎏i 气i ：o 1 v ( v * i m ) 0p x 4 0 叫穗反应涟卜叫滤液l 3 幺i ，h t 弭至p 村4 。_ _ l 。【受用h c 婀 一 羹色 r o l l 辫。最麓) 簟性丙爆誓景阳奢于受基辨1 2 2薯i 傩基z 妊誓疆f 尘m l mo o ! _ ， ( 冀化l 穗簟) 叠t 性摹赣l 壁峨毫f 空套冀囊2 0 1 1 4 1 tu i & t 过t 下i ， 知3 镑9 s 己i l rp ，。 _ 爵i ；1 缝堕茎卜气菇i i ；h 鱼盆些垒些曼l 图1 1 0g a b a 的酶法合成的提取i ：艺 f i g 1 - 1 0t h ep r o d u c t i o no fg a b ab yg a dc a t a l y s i s 1 2 双极性膜电渗析装置概述 进入二十一世纪以来，和平和发展已经成为了新时代的主题，而可持续发展 自然而然的成为了发展过程中的重中之重。同时，在十二五规划中，党和国家也 明确指出要加大对发展过程中的环境保护力度，计划中提出了加大控制坏境污染 力度、健全生态补偿机制等方针。这就更要求我们，要坚定不移地走“绿色化学” 这条路，进而构建和谐社会。然而要想实现清洁化的绿色化工，这个过程不是一 蹴而就的，我们不仅要努力保护环境、减少污染物的排放，更要节约资源，进最 大可能的减少资源浪费，实现生产效率的最大化。就在这样一个使命的召唤下， 双极性膜电渗析装置逐渐受到了众多专家学者的重视。 1 2 1 双极性膜的结构和特性 1 2 1 1 离子交换膜 离子交换膜可以说是电膜过程的“，i i , 脏 【6 2 1 ，它通常是由聚合物骨架和附着 在骨架之上的离子基团构成，如果骨架上的基团是阴离子的话，那么就需要能在 骨架内部自由移动的阳离子来与之平衡；同理，如果骨架上的基团是阳离子，那 么就需要能在骨架内部自由移动的阴离子来与之平衡，因而，离子交换膜具有能 够选择性透过与膜层所带电荷相反的离子的特性。 第一章绪论 合适的离子交换膜，在使用过程中，其选择透过性可以高达9 9 ，但是，这 种离子的选择透过性会随着溶液中电解质浓度的升高而降低，所以，选择合适的 浓度的溶液进行分离也是非常重要的。 1 2 1 2 双极性膜 双极性膜( b i p o l a rm e m b r a n e ，b p m ) ，就是在离子交换膜的基础之上，经 过研究人员的不断努力而研制出的一种新型膜层，其结构和原理见图1 1 l 【6 3 】所 不。 州蚶科吾卜辕 啊溉卅囝 十薄三十 或磺袭 图1 1 l 离子交换膜& 舣极性膜 f i g 1 - 11 i o ne x c h a n g em e m b r a n e & b p m 图1 1 l 中，a 示意图表明，阳离子交换膜( c a t i o n e x c h a n g em e m b r a n e ，c e m ， 简称阳膜) 会选择性的让阳离子( n a + ) 透过，流向阴极，而阴离子交换膜 ( a n i o n e x c h a n g em e m b r a n e ，a e m ，简称阴膜) 则会选择性的让阴离子( c 1 一) 透过，流向阳极；如果我们将一张阳膜与一张阴膜紧密的合在一起，形成一张新 的膜层，这个膜就是双极性膜，示意图c 就是双极性膜的简图；而双极性膜的 工作原理就像示意图b 显示的那样，水会在双极性膜的阳膜阴膜之间的区域( 称 为过渡区域) 内，电离成h + 和o h 。，h + 和o h 能各自选择性的透过阳膜和阴膜 进行迁移。 有文献报道【州，双极性膜的水解离速度是常规水溶液解离速度的5 1 07 倍， 这主要是因为过渡区域的强电场所致( 过渡区的厚度一般在1 0 x1 0 。9 m 以内) ， 而且双极性膜不仅可用于水的解离，还可以用于其他自解离液体，如甲醇【6 2 1 。 北京化1 人学硕i j 研究生学位论文 1 2 2 双极性膜电渗析 传统中，最常见的电膜过程就是电渗析，而电渗析装置就是依靠阴、阳离子 交换膜的选择透过性实现料液分离的目的，其最主要的应用就是水溶液脱盐过程 或溶液浓缩过程。而双极性膜的出现，则将电渗析这一分离纯化工艺引向了一个 崭新的时代。 由于b p m 的出现，电渗析过程可应用的膜组件就有3 种，即b p m 、阳膜和 阴膜，因此我们可以对三种膜进行排列组合，以达到不同的分离目的。下图1 1 2 就是以g a b a 为例，解释双极性膜电渗析( b i p o l a rm e m b r a n ee l e c t r o d i a l y s i s ， b m e d ) 装置的分离过程。 0 少麓蹈觞秘鼢霉a 少袋鳓矗嬲a 觚 蜒0 蝉专糙0 辫i承 鞫蒋l 黔蛹黪l 鞫隧l 嚣捞8 藿f 粥貉 装+ 鹾毫 h ； 酸塞 滠宣 o 纠 辩 醪耋 缱 0 秘 k o h 黝8 墩k g a 8 衣硫欲 a 图1 1 2 双极性膜电渗析分离过程 f i g 1 - 1 2t h es e p a r a t i o np r o c e s so fb m e d b 图中，a 图为二隔室b m e d 装置，它是由b p m 和阳膜相问组成，料液中的 k + 在直流电场的作用下，穿过阳膜到达碱室，与水电解出来的o h 。形成k o h ， 而g a b a 一则留在原料液室内与水电解出来的h + 形成g a b a ，最终实现k + 和 g a b a 。的分离；b 图为三隔室b m e d 装置，它是按照阳膜、阴膜、b p m 的顺序 相间而成，料液中的1 0 在直流电场的作用下，穿过阳膜到达碱室，与水电解出 来的o h 。形成k o h ，而g a b a 。在直流电场的作用下，穿过阴膜到达酸室，与水 电解出来的h + 形成g a b a ，实现分离。 1 2 3 双极性膜电渗析的应用 双极性膜电渗析装置不仅可以独立的作为一个操作单元，也可以和生产过程 第一章绪论 耦合，进行连续操作，业已成为国