（生物医学工程专业论文）细胞生长自动检测仪中的图像处理.pdf

上海大学硕士学位论文 以及采用修正的图像分割质量判断准则对分割结果进行评价。实验结果表明了 该细胞生长自动检测仪以及图像处理系统的有效性，具有很强的应用价值。 关键词：细胞生长自动检测仪，图像处理，骨髓瘤克隆斑 v i 上海大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nb i o l o g i c a lm e d i c i n es c r e e n i n ga n dc l i n i c a lt r e a t m e n t ，p a r t i c u l a r l yi nt h ea r e ao f m o n o c l o n a la n t i b o d yr e s e a r c h ，f i r s t l y , t h er e s e a r c h e r sc a r r yo u tt h ef u s i o ni nc a n c e r c e l l sa n da n t i g e ni m m u n ec e l l s ，t h e ns c r e e no u tt h eh y b r i d o m a lc e l l sw i t ht h es t a b l e a n ds p e c i f i ca n t i b o d ys e c r e t i o n ，a n de v e n t u a l l yd e v e l o po u th i g hs p e c i f i c i t y , a f f i n i t y a n dy i e l dm o n o c l o n a la n t i b o d y ( m c a b ) ，a l lt h e s ea s p e c t sm a k et h ed i a g n o s i sa n d t r e a t m e n to fd i s e a s e sm o r ea c c u r a t e ，r a p i da n dc o n v e n i e n t w h i l es t u d y i n gas e c u r i t y a n dv i a b l ec e l ld e t e c t i n gt e c h n o l o g ya n dt h es e g m e n t a t i o nm e t h o di nc e l lc l o n i n g s p o t si m a g e ，i ti su s e f u lt oo b s e r v et h ec e l lg r o w t hm o r p h o l o g y , s i z ea n dc o n d i t i o n so f i t sg r o w t hc u r v e ，i ti sa l s oc o n d u c i v et og e tt h eh i 曲s p e c i f i c i t ya n t i b o d y i ti sv e r y i m p o r t a n ti ns c i e n t i f i cr e s e a r c ha sw e l la st h ea p p l i e dy i e l d w ed e v e l o p e dar e p e a t a b l ed e v i c ea n dm e t h o do nc e l lc u l t i v a t i o np l a t ef o r a u t o s c a no b s e r v a t i o na n dd e t e c t i o n c o m p a r e dt ot h em i c r o s c o p eo b s e r v a t i o n ，w e a v o i dt h e t i m e c o n s u m i n ga n dw a s t ei ne f f o r t ，a n dw ec o u l dr e d u c ep o l l u t i o n o p p o r t u n i t i e sc a u s e db yf r e q u e n tc o n t a c t s w i t ht h i sm e t h o d ，w ec o u l do b s e r v et h e c e l li m a g e sa u t o m a t i c a l l y , w ec o u l dd e t e c tt h ec e l l sa n dt h ec e l lc l o n i n gs p o t si nt h e p l a t ew i t h9 6h o l e sq u i c k l ya n da c c u r a t e l y , a n dw ec o u l dc a p t u r et h ec l o n i n gs p o r t s i m a g e ，s a v et h ei m a g e si n t ot h ec o m p u t e rf o rp o s t - p r o c e s s i n g w i t ht h ea u t o d e t e c tc e l lg r o w t ha p p a r a t u s ，w ec o u l dg e tt h ec e l l si m a g e t om e e t t h er e s e a r c hd e m a n d ，t h er e s e a r c h e r sn e e dc a r r yo u tas e r i e so fi m a g ep r o c e s s i n gf o r t h ec e l l si m a g e s ，f o re x a m p l e ，t h e yw a n tt od e t e c tt h ei m a g ee d g e ，g e tt h er e g i o n so f i n t e r e s tb ys e g m e n t a t i o n ，c a l c u l a t et h es i z eo ft h er e g i o no fi n t e r e s t ，c o m p a r et h e p r o c e s s i n gr e s u l tw i t l lt h es t a n d a r do n e ，p r o c e s st h ei m a g e si nd i f f e r e n tc o l o rs p a c e ， g e tt h eh i s t o g r a mi n f o r m a t i o na n ds oo n ，s oa sw e l la st h ea u t o - d e t e c tc e l lg r o w t h a p p a r a t u s ，t h ei m a g ep r o c e s s i n gs y s t e mw e r ed e v e l o p e dt om e e tt h e s en e e d s an e wm e t h o df o ri m a g es e g m e n t a t i o ni si n t r o d u c e di nt h ep a p e r , t h i sn e w m e t h o di su s e di n t h ei m a g ep r o c e s s i n gs y s t e mf o rt h ea u t o - d e t e c tc e l lg r o w t h v i i 上海大学硕士学位论文 a p p a r a t u s b ye f f e c t i v ec o m b i n a t i o nw i t hk - m e a n s ，w a t e r s h e d ，e r o s i o na n dd i l a t i o n ， t h et r a d i t i o n a lg r a p hc u tm e t h o dw a si m p r o v e di nt h ei m a g es y s t e m w i t ht h ea c t u a ld e m a n d ，w et o o kt h em u l t i p l em y e l o m ac l o n i n gs p o t sa st h e r e s e a r c ho b j e c t ，a n di n t r o d u c e dt h es y s t e mi n t e r f a c ea n dt h eo p e r a t i o ns t e p s f i r s t l y , w eg o tt h ec l o n i n gs p o t si m a g eb yt h ea u t o - d e t e c tc e l lg r o w t ha p p a r a t u s ，t h e nc a r r i e d o u ti m a g ep r o c e s s i n gi nt h es y s t e m ，f o re x a m p l e ，w eg o tt h er e g i o n so fi n t e r e s tb y c l o n i n gs p o t si m a g e ss e g m e n t a t i o na n dd i di n d e e ps t u d yi nt h er e s u l t s l a s t l y , b o t h t h ee v a l u a t i o nc r i t e r i ae s t a b l i s h e db yi n t u i t i o na n dt h ee v a l u a t i o nc r i t e r i ao fu l t i m a t e m e a s u r e m e n ta c c u r a c yw e r e u s e dt oe v a l u a t et h em e t h o d ，a n dt h ee x p e r i m e n tr e s u l t s s h o wt h ee f f e c t i v e n e s so ft h ea u t o - d e t e c tc e l lg r o w t ha p p a r a t u sa n dt h ei m a g e p r o c e s s i n gs y s t e m ，t h e ya r ev e r yi m p o r t a n ti ns c i e n t i f i cr e s e a r c ha sw e l la st h ea p p l i e d y i e l d k e y w o r d s ：a u t o - d e t e c tc e l l g r o w t ha p p a r a t u s ，i m a g e p r o c e s s i n g ， m u l t i p l em y e l o m ac l o n i n gs p o t s 上海大学硕士学位论文 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发 表或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的 任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：尘雌日期：j 虹罗 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学 校可以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) i i 魅期： 一一h y j 。 上海大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 课题研究的目的和意义 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。 在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究 和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但是从基因组到 蛋白质存在转录水平、翻译水平以及翻译后水平三种调控机制，基因组学中得 到的信息，并不能全面代表蛋白质表达水平。蛋白质是生理功能的执行者，是 生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或 病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、 蛋白质问相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解 决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核 酸技术要复杂和困难得多，但正是这些可变性与多样性参与和影响着整个生命 过程。 传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这 是因为：( 1 ) 生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。( 2 ) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。( 3 ) 在执行生 理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不像基因组那样基本固定不变。 因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的 水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪9 0 年代中期，国际上产生了一门新兴 学科一蛋白质组学，它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。 可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑， 也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。 抗体是研究蛋白质性质和功能及其与疾病的关系的重要工具。抗体是分析 细胞蛋白质组的理想工具，不仅特异性高，而且能非常灵敏地解读出细胞裂解 液标本中蛋白质的相对丰度，用针对不同细胞蛋白的各种抗体，通过定量可以 监测蛋白表达谱的变化；利用抗体芯片或用同一抗体对不同组织和不同状况的 上海大学硕士学位论文 同一组织进行平行筛选，可以确定差异表达蛋白，甚至是新的未知蛋白或疾病 相关的蛋白。抗体工程技术随着现代生物技术的发展而不断完善，并且是生物 技术产业化的主力军。 目前在单克隆抗体的制备过程中，传统的方法是使用蛋白或抗原免疫小鼠， 通过e l i s a 方法测定出抗体产生多的杂交瘤，进行克隆建株，然后进一步对纯 化的单抗进行鉴定，如需要再检测其抗原表位。在实际工作中，融合率高时往 往获得大量的产生抗体的杂交瘤，在一次次的细胞克隆筛选过程中，细胞检测 需要实验人员长时间地在显微镜下进行细胞观测。工作人员面临大量的工作量， 现有的观察手段成为工作的限速步骤，工作效率无法得到保障。例如，在检测 9 6 孔细胞培养皿的细胞，需要由具备专业知识的专业人员对整个培养皿逐个进 行观察，对感兴趣的细胞进行记录。整个检测过程需要花费相当长的时间，而 且强度相当大。因此，检测人员容易疲劳，从而影响检测的结果。另外由于花 费相当长的时间，对细胞的生长不利。 多发性骨髓瘤是缘于浆细胞的恶性肿瘤，是常见的血液系统疾病，最突出 的病变是骨髓浆细胞大量增生，可占骨髓内细胞总数的1 5 9 0 ，常引起多处 骨组织坏死，可累及骨骼系统的任何部位。疾病晚期，瘤细胞可浸润软组织， 以至侵犯脾、肝和淋巴结等 1 1 。 在生物医药筛选和临床治疗中，特别是在研究单克隆抗体方面，研究人员 首先将瘤细胞与抗原免疫细胞融合，然后筛选出稳定分泌特异抗体的杂交瘤细 胞，最终培养出高特异性、高亲和力、高产量的单克隆抗体( 单抗) ，使疾病的 诊断和治疗更加准确，快速，便捷【2 1 。因此研究安全，可行的细胞生长自动检 测技术，并分割出细胞克隆斑有助于观察细胞斑的细胞形态，生长面积大小和 状况，测定其生长曲线，有利于特异性高的抗体制备，具有非常重大的科研意 义以及应用价值。 培养h 瓣鬻警 l 一图像处理l 一结果输出 图i - 1 处理流程 f i g 1 - 1t h ep r o c e s sf l o wc h a r t 2 上海大学硕士学位论文 1 2 国内外研究概况 目前应用于细胞的自动检测方面的技术有流式细胞仪技术，利用显微镜由人 工目测观察细胞形态以及e l i s p o t 技术。e l i s p o t 技术和流式细胞仪价格不菲，如美 国b e c k m a nc o u l t e r ，d e l t a v i s i o n 等公司产品，一般的大型机或小型机价格都在1 0 0 万人民币以上。而利用显微镜人工目测观察细胞形态需要有经验的实验人员长时 间的在显微镜下进行细胞检测，工作人员面临大量的工作量，需要花费大量的时 间和精力，工作效率无法得到保障。例如，在检测9 6 孔细胞培养皿的细胞，需要 由具备专业知识的专业人员对整个培养皿逐个进行观察，对感兴趣的细胞进行记 录。整个检测过程需要花费相当长的时间，而且强度相当大。因此，检测人员容 易疲劳，从而影响检测的结果。另外由于花费相当长的时间，对细胞的生长不利。 同时由于频繁接触细胞试剂会带来可能的污染。 为了克服上述不足，我们研发了一套可重复对细胞培养进行自动扫描观察和 检测装置和方法。可以满足细胞图像的自动观察；可以快速准确的检测9 6 孔细胞 培养皿的细胞以及细胞克隆斑；可以将培养皿中的细胞克隆斑抓拍、存储至计算 机以便后处理【3 】；可以对克隆斑图像进行图像分割、观察克隆斑的生长面积大小 和状况，进而测定其生长曲线，有利于特异性高的抗体制备。同时我们研究培养 中的细胞时，不需要将细胞进行染色或者破坏其生长环境，这样可以保持细胞的 活性以及保证细胞继续成长。可以直接将培养皿放置在载物台，真正减少了人工 与细胞双向污染的概率。结合实际需要，特别研究了骨髓瘤克隆斑的图像处理， 包括新的分割算法应用于克隆斑图像分割；观察克隆斑的生长面积大小；观察克 隆斑图像的边缘情况等。 针对细胞生长分析仪获取的骨髓瘤细胞克隆斑图像是彩色图像，彩色图像 包含的信息远远多于单色图像所包含的信息。对于单色图像的分割来说，仅有 明亮度( 1 i g h t n e s s ) 是可用信息。但是，人的视觉对明亮度的感觉一般只有2 0 级左右，信息量有限。彩色图像不仅提供明亮度信息，还包括色调和饱和度， 所提供的信息量更丰富，分割后的结果也更具有利用价值，因此，彩色图像的 分割越来越引起人们的关注。 上海大学硕士学位论文 彩色图像分割主要有两方面，一是选择合适的彩色空间；二是采用合适的 分割策略和方法。彩色空间是描述色彩的一种方法，它们常是根据不同的应用 场合、不同的目的而提出来的。彩色图像的分割方法，现在已经提出的主要包 括直方图阈值法、边缘检测法、基于区域的方法、聚类方法、形态学方法等。 一、直方图阈值分割方法 直方图阈值方法是最早的、广泛应用的单色图像分割技术之一【4 1 。这种方 法认为不同区域之间的灰度级不同，因此，可以利用灰度直方图中的相邻两个 峰之间的谷作为阈值来进行图像分割。对彩色图像分割而言，可以建立多个二 维直方图，对各个直方图进行阈值分割，再将各个分割结果结合，得到最终分 割结果；或者建立一个多维直方图，对其选取阈值来分割。 二、基于边缘检测的分割方法 图像最基本的特征是边缘，它是图像局部特性不连续( 或突变) 的结果。 边缘检测方法是利用图像一阶倒数的极值或者二阶导数的过零点信息来提供判 断边缘点的基本依据，经典的边缘检测方法是构造对图像灰度阶跃变化敏感的 差分算子来进行图像分割，如r o b e r t 算子、s o b e l 算子、p r e w i t t 算子、l a p l a c i a n 算子等。 根据检测边缘采用方式的不同，边缘检测方法大致包括以下几类：基于局 部图像函数的方法、多尺度方法【5 1 、图像滤波法、基于反应扩散方程的方法、 基于边界曲线拟合方法、状态空间搜索法、动态规划法、边界跟踪法、哈夫变 化法【6 】等。 三、基于区域的分割方法 基于区域的技术主要依赖于图像中区域的连续性。一般包括区域生长、分 裂和合并及它们的混合技术。区域生长的基本思想就是组合邻近的像素或者收 集具有相似特征的像素，从而将具有相似性质的像素集合起来构成区域。首先 对每个需要分割的区域找一个种子像素作为生长的起点，然后将种子像素周围 邻域中与种子像素有相同或相似性质的像素合并到种子像素所在的区域中。分 裂和合并技术的思想上将整个图像分割若干个互不交叠的图像快，对每块进行 分割，然后根据块与块的分割特征进行聚合，甚至可以一开始把每一个像素看 4 上海大学硕士学位论文 成一块即一簇，然后再不断聚合。基于区域的技术既考虑到彩色空间中颜色的 贡献，又考虑到与邻近像素之间的联系。 四、聚类方法 聚类就是按一定的相似性度量准则将数据划分成多组具有同类性质的子 类，使得子类内部的相似性大于类之间的相似性【刀。聚类算法已经有很久的历 史，有关聚类的综述性文章可以见文献【8 】【9 1 。不同的出发点和准则通常会导致不 同的聚类算法分类法，一种粗略但是广泛接受的分类法是根据声称聚类的特性 将聚类分为层次方法( h i e r a r c h i c a lc l u s t e r i n g ) 和划分方法( p a r t i t i o n a lc l u s t e r i n g ) 1 1 0 。层次方法通过创建一个层次将数据分解成给定的数据集，而划分方法直接 将数据划分成预先制定类别数的子类，不需要创建层次结构。 临近( 距离或相似性) 度量是大部分聚类算法的基础。度量方法的选择依 赖于具体的聚类问题。主要的聚类方法有：( 1 ) 基于平方误差的聚类，如k 均 值( k m e a n s ) 算法 1 1 】；( 2 ) 基于混合密度的聚类，如期望最大( e m ) 算法【1 2 】 和高斯混合密度分解( g m d d ) 算法 1 3 】；( 3 ) 基于图论的聚类，如基于连通性 核的聚类( c l i c k ) 1 4 1 ；( 4 ) 模糊聚类，如模糊c 均值聚类( f c m ) 1 5 1 ；( 5 ) 基于神经网络的方法，如自组织映射方法( s o m ) 【】。 五、形态学方法 自2 0 世纪6 0 年代法国的gm a t h e r o n 和j s e r r a 以积分几何为基础创立了 数学形态学以来，图像形态学正方兴未艾，已经广泛应用于图像增强、边缘检 测、滤波、细化、图像分割等领域，是图像处理的一个重要的分支。形态学中 的分水岭分割是图像分割中的一种经典有效的方法。 h d i g a b e l 和c h l a n t u 6 j o u l 1 7 】将分水岭变换作为形态学工具来介绍，这篇文 章的数据都是二维图像，是一种成功表示类似于沥青表面的框架结构的开端， 在这方面需要研究的是沥青表面结构的排水能力问题。不久以后，c h l a n t u 6 j o u l 和s b e u c h e r 进行了相关的研究工作【1 8 】【1 9 】，目的是为了扩展这个算法到更广泛 的数字图像处理领域。分水岭算法随之被e m a i s o n n e u v e 2 0 1 理论化，并且应用于 解决数字量化后的图像分割问题。现在，分水岭算法在理论上、实践上和算法 着眼点上被广泛讨论。如果与其它形态学工具联系起来，分水岭方法就是一种 上海大学硕士学位论文 强大的分割工具 2 1 1 。从数字图像中提取分水岭信息并不是一件容易的事。现在 能够解决计算分水岭变换的算法都基本上不是非常慢，就是结果不准确。在众 多现有的顺序分水岭算法中，v i n c e n t 与s o i l l e 在1 9 9 1 年提出的基于浸入模拟 法【捌是最著名的，也是最快的算法。该算法将图像看成是地形表面，想象在图 像的每个区域谷底刺了一个孔，水从刺过孔的海拔最低的谷底开始往上涌，慢 慢地淹没图像的流域。当水面到达其它流域的谷底时，这些刺过孔的谷底开始 渗水，一旦来自不同底谷的水要汇合时，我们筑起一道假想的堤坝来阻止它。 浸没过程结束时，每个流域被水淹没，并被堤坝完全包围。这些筑起的堤坝确 定了对应流域的分水岭，因而对应图像的轮廓也被分割成为不同的区域。这就 是基于浸入模拟的分水岭算法的一般过程。对于一维情况，分水岭对应局部极 大值；对于二维情况，分水岭对应一系列的鞍点和局部极值点。对于二维立三 网格上的数字图像，分水岭构成封闭的单像素轮廓。关于分水岭算法的严格数 学描述参见文献 2 3 】【2 4 】。分水岭方法以快速、准确、有效的分割结果越来越受到 人们的重视，同时它的过分割问题也是一个热门的话题【2 5 1 。 六、图分割技术 基于图论( g r a p ht h e o r y ) 的图像分割技术是近年来国际上图像分割领域的 一个新的研究热点。其主要思想是将图像映射到加权图( w e i g h t e dg r a p h ) ，像 素对应图的节点( v e r t e x ) ，像素之间的相邻关系对应图的边( e d g e ) ，像素特 征之间的差异( d i f f e r e n c e ) 或相似性( s i m i l a r i t y ) 对应边上的权重( w e i g h t ) ， 然后利用图论中的成熟理论如最大流最小切割方法对图像进行切割( c u t 或 p a r t i t i o n ) 和组合( g r o u p ) 2 6 】。该方法本质上将图像分割问题转化为最优化问 题，是一种点对聚类方法，对数据聚类也有很好的应用前景【2 7 】。由于其涉及的 理论知识比较多，应用也还处于初级阶段，因此国内这方面的研究报道并不多 见。 目前的全自动分割技术还不成熟，特定的处理手段针对特定的研究对象【2 引。 为了得到较好的分割效果，需要进行部分的人工交互。例如图分营j ( g r a p hc u t s ) 和g r a b c u t 是近几年已经发展的几种代表性交互式分割方法。b o y k k o v 提出的 图分割方法 2 9 1 ，将图像看成一个图，g = y ，f ) ，v 是所有的节点，占是连接相 6 上海大学硕士学位论文 邻节点的边。该方法将图像分割看作一个二元标记问题，每一个i y ，有唯一 的一个五 前景为1 ，背景为o ) 与之对应。所有的薯集合x 可以通过最小化能 量函数获得。首先手工选定部分像素作为对象和背景。通过求解图的最小分割 问题，得到图像的分割结果。b l a k e 的g r a b c u t 方法【3 0 】，进一步简化了交互。 用户只需要选一个矩形框包含整个前景作为对象，框外的像素作为背景。利用 图分割方法进行多次迭代，就可以得到前景对象和背景的分割。 1 3 论文的主要研究内容 本论文是以作者在攻读硕士学位期间所承担的细胞自动检测仪的图像处理 这一课题的工作为基础，主要对整个自动检测仪的设计、实现、骨髓瘤细胞培 养与骨髓瘤克隆斑图像分割进行论述。主要内容安排如下： 第一章阐述了课题研究的来源、目的、意义以及国内外研究的现状。 第二章介绍了细胞自动检测仪的硬件平台。 第三章介绍了细胞生长自动检测仪中的图像处理系统。系统功能方面包 括：图像的边缘检测；将感兴趣的区域分割出来；计算感兴趣区域的面积大小； 将处理结果与标准进行比较；将图像在不同的颜色空间进行比较等。并详细的 介绍了图像处理系统的用户界面，操作步骤以及处理结果等。 第四章详细介绍了图像处理系统中的一种新的图像分割技术，并集合实 际需求，对骨髓瘤克隆斑图像进行感兴趣的克隆斑部分进行分割，并给出了较 为满意的分割结果，进而说明该细胞生长自动检测仪图像处理系统的有效性。 第五章给出了克隆斑图像的分割结果，评价分割结果的标准以及结论。 第六章总结讨论，并给对后续研究的建议。 7 上海大学硕士学位论文 第二章细胞生长自动检测仪硬件平台 2 1 硬件平台原理及组成 为了对细胞培养进行自动扫描观察和检测；满足细胞图像的自动观察：快 速准确的检测9 6 孔细胞培养皿的细胞以及细胞克隆斑；将培养皿中的细胞克隆 斑抓拍、存储至计算机以便后处理，我们研发了细胞生长自动检测仪平台。该 细胞生长自动检测仪，包括：光源；一个放置细胞培养板的机械平台；对准机 械平台的有一个光学显微镜；连接光学显微镜的是一个c c d 摄像机。摄像机的 输出视频信号经过图像采集卡输入计算机，计算机对视频信号进行a d 转换等 信号处理后，信号输出至显示器显示细胞图像，同时计算机可以经过控制器对 机械平台输入信号，控制平台按照实际需要进行移动。细胞生长自动检测仪的 结构框图如图2 1 所示。 图2 1 细胞生长自动检测仪结构框图 f i g 2 1d i a g r a mo ft h ed e v e l o p e da u t o d e t e c tc e l lg r o w t ha p p a r a t u s 海丈 硕l 学位论女 图2 - 2 硬件平台 f i g2 - 2 t h ep i e r r e o f t h e a u t o d e t e c t c e l l g r o w t h a p p a r a t u s 摄像机采用j v c 彩色摄像机t k c 9 2 1 。明亮，稳定，均匀的光源极其重要， 因此光源采用日本c c s 公司的背光照明光源l d l - t p - 5 1 x 5 1 一s w 。该产品在平 面极板上的l e d 芯片发射出光线光线透过漫射板从被测物体后部照明，形成 轮廓。控制器采用北京科日新工控的q 2 h b 6 8 m g 控制模块。 上述的机械平台的结构可以设计为：在一个基板上固定一条y 导轨与一块 y 向滑动块靖动匹配，y 向滑动块与一个中间层平台固定连接，中间层平台与 一个螵母固定连接，该螺母与一根y 向丝杠旋配，y 向丝杠端部连接一个固定 于基板的电机输出轴连接；中间层平台上方有一个最高层平台，中间层平台上 固定一条x 向导轨，与一块x 向滑动块滑动匹配，x 向滑动块与最高层平台固 定连接，最高层平台与一个螺母固定连接，该螺母与一根x 向丝杠旋配，x 向 丝杠由固定于中阳j 层平台的支承座中的轴承支承，x 向丝杠端部连接一个固定 于中间层平台的电机输出轴连接；所述的基板和中间层平台中央均有透光缺口， 最高层平台中央有配置细胞培养板的缺口。 上述的细胞培养板为多孔细胞培养板，包括9 6 孔细胞培养板，3 8 4 孔细胞 培养板等一系列细胞培养板、或p c r 板( 聚合酶链反应扳) 、或e l i s a 板( 酶 联免疫吸附板) 。 上海大学硕士学位论文 2 2 采集骨髓瘤细胞克隆斑图像 实验所需的骨髓瘤细胞由上海生物芯片公司提供，采用细胞生长自动检测 仪进行检测，其特征在于检测采用自动连续扫描模式，可以记录9 6 孔细胞培养 板的全部9 6 个孔细胞图像，放大倍数约为1 7 倍，步骤如下： 1 ) 初始化：设置机械平台的移动步长为细胞培养板相邻培养孔之间的距 离( 如图2 3 ) ；依据细胞培养板设置系统的坐标系为一离散坐标系( 如 图2 4 ) ；设置平台初始位置：x 轴坐标x = o ，y 轴坐标】，= o ；设置平 台移动方向参数姗一x = l ，d i r y = l ( d i r x = l 时平台沿x 轴正方向 移动，d i rx = 1 时平台沿x 轴反方向移动；d i ry = 1 时平台沿y 轴 正方向移动，加一y = 一1 时平台沿y 轴反方向移动) ；设置平台沿x 轴 每次移动的步长数疗x = l ，平台沿y 轴每次移动的步长数刀y = l 。 ll翠舟姥墙培械 1 1 并且d i r 石= 1 ，或者，x 0 并且 d i rx = l ，则对y 进行判断：若y 7 ，则跳至步骤5 ) ；若y 7 ，则平 台沿y 轴移动刀一y 个步长，使y = y + n y 折一y 。 4 ) 如果平台的x 轴坐标0 x 1 l 并且】，小于或等于7 ，则对】，进行奇偶判 断，若】，是奇数，则d i rx = 1 ，平台沿x 轴移动，lx 个步长；若】，是 偶数，则d i rx = l ，平台沿x 轴移动，lx 个步长；返回至步骤2 ) ； 5 ) 机械平台复位：设置，l y = 7 ，d i r y = - 1 ，平台沿y 轴移动，l y 个步 长。 针对9 6 孔细胞培养板，获得的连续的9 6 孔图像如下图2 5 所示： 另一种细胞生长自动检测仪方法，同样采用细胞生长自动检测仪进行检测， 其特征在于根据用户的需要，可以按照要求观察9 6 培养皿中的部分培养皿，如 由用户指定9 6 个空中的第n 行m 列等培养孔，步骤如下： 1 ) 初始化：设置机械平台的移动步长为细胞培养板相邻培养孔之间的距 离( 如图2 3 ) ；依据细胞培养板设置系统的坐标系为一离散坐标系( 如 图2 - 4 ) ：设置平台当前位置：z 轴坐标x = 0 ，y 轴坐标】，= o ；设置平 上海大学硕士学位论文 台移动方向参数d i r x = l ，d i r y = l ( d i r x = l 时平台沿z 轴正方向 移动，d i r x = 1 时平台沿工轴反方向移动；d i r y = 1 时平台沿y 轴 正方向移动，咖一y 一1 时平台沿y 轴反方向移动) ；设置平台沿x 轴 每次移动的步长数胛一x = l ，平台沿y 轴每次移动的步长数，l y = l 。 2 ) 选择操作点：使用鼠标等指示器，直接在系统监视器显示的培养板界 面上选择用户感兴趣的操作点集合。 3 ) 系统计算出所选择操作点集合的坐标位置。x 轴：x s ，y 轴：y s ； 4 ) 系统计算出平台从当前位置移动到下一扫描位置所需要移动的步长： n x = ix j xi ，聆一y = ly s - yi 。如果x s x r g b 。对于不同的应用，有时候需要转化图片的色 彩空间，比如当要求观察亮度信息时，就需要在h i s 空间观察其h 分 量或者其色饱和度信息s 分量。 6 ) s i z e ：可以计算感兴趣区域的面积大小，这对于细胞培养方面是非常重 要的，可以得到细胞的生长速度等信息，有利于测定其生长曲线。 7 ) e x i t ：这个按钮的作用是推出系统。 8 ) h e l p ：提供了系统的一些帮助信息，可以有利于操作者使用该图像系统。 1 4 上海大学硕t 学位论文 壁墨受璺雾慧悫黑! 。茹蹬 幽3 - 1 细胞生长白动检测仪中的图像处理系统 p i g3 - l t h e i m a g e p r o c e s s i n gs y s t e m f o r t h e a u t o d e t e c t c e l l g r o w t h a p p a r a t u s 3 1 2 图像处理系统中的主要功能介绍 在细胞图像研究中，有时候研究人员需要将感兴趣的区域分割出来，且同 时些常用的边缘检测的技术已经比较成熟，如一阶梯度算子和二阶拉普拉斯 算子等也经常作为研究手段来观察细胞图像的边缘信息等。为了研究人员更好 的研究图像的一些特征，本图像处理系统也包括了这些技术。 首先简要的说明一下系统中的边缘检测的具体实现步骤： 1 ) 滤波：边远检测算子主要是基于图像增强的一阶和二阶导数，但导数 的计算对噪声很敏感，因此必须使用滤波器来改善与噪声有关的边缘 检测器的性能。需要说明的是，大多数滤波嚣在降低噪声的同时也导 致了边缘强度的损失，因此我们需要在边缘增强和降低噪声之间进行 综合考虑。 2 ) 增强：增强边缘的基础是确定图像各点邻域强度的变化值，增强算法 可以将邻域( 或局部) 强度有显著变化的点凸现出来。 3 ) 检测：在图像中有许多点的梯度幅度值比较大，而这些店在特定的应 用领域中并不都是边缘，所以应该用某种方法来确定哪些点是边缘点。 梯度对应一阶导数，梯度算于是一阶导数算子。梯度算子在边缘扶度值过 渡比较尖锐且图像中噪声比较小时，梯度算子工作效果较好。我们知道图像函 上海大学硕学位论丈 数，( ，) 在( x ，y ) 电的梯度幅度大小为： v = 睁弩 i 方向为 c 爹 c 参 ( 3 i 1 ) ( 3 12 ) 在图像边缘提取中，经常使用的是小区域模板的卷积，根据模板的不同， 引申出很多种算子下图3 2 是常用的r o b e r t s 、p r e w i t t 和s o b d 算子，图3 - 3 是系统中应用p r e w i t t 的界面图形。国3 - 4 和图3 5 是应用p r e w i t t 算子处理结果 以及应用于骨髓瘤细胞克隆斑图像的结果。 田翌圈匪曜 唑一詈产! 一些翌一翌堕一l ll l 向1 图3 - 3 系统中应用p r e w i u 的界面例形 f i g3 - 3 t h e i n t e r f a c eo f t h ep r e w i t t p r o c e s s i n g o f t h es y s t e m ，l训10 l ； 海￥士 位论i ( a ) 骨髓瘤克隆斑图像 ( b ) p r e w i t _ t 检测结果 剀3 - 5 骨髓瘤克隆斑图像以及p r e w i t t 处理结果 f i g3 4 t h e m y e l o m a c l o n i n gs p o t s i m a g ea n d t h e p r e w i t t r e s u l t 对于彩色图像而言，有时候需要将r g b 变换为h s i 坐标，以便反映人类 观察彩色的方式，便于在研究中观察图片的亮度或者色饱和度信息。将r g b 转 化为h s i 坐标的公式如下： 每一个r gb 像素和h 分量用下面的公式得到： h ：j 9 “g ( 3 1 3 ) h 2 13 6 0 一目b g “ 此处 上海大学硕士学位论文 s 害篙- g ) ( 刍g - b ) ， i ( 尺一g ) 2 + ( r尼i l j 色饱和度信息由下式给出： s = 1 一志【m i n ( r ，g 】(314g ) = 一二一l ，曰) l ( 3 ) ( 尺+ b ) 。 ，j 最后，强度分量由下式给出： ，= 三( r + g + 曰) 同时，简要描述从h i s 空间转换为r g b 的方法： ( 1 ) 当0 。h 1 2 0 。时： ( 3 1 5 ) r = 古【1 + 面s c 丽o s 面( h ) 】，g = 届一r 一曰，b 2 古( 1 一s ) ；( 3 1 6 ) ( 2 ) 当1 2 0 。h 2 4 0 。时： r = 古”观g = 古【1 + 鬻”= 西小g ( 3 1 7 ) ( 3 ) 当2 4 0 。h 3 0 0 。时： r - g - b , g = _ 卸l ( 咽舻妒+ 鬻】( 3 1 8 ) 其中h 处于3 0 0 。一3 6 0 。之间为非可见光谱色，没有定义。 图3 - 6 显示系统将一个骨髓瘤克隆斑图像由r g b 空间转换为h i s 空间的 效果对比。直方图信息也是观察图片的一个有用信息，图3 7 是系统显示的图 像r 分量的直方图信息。 倒3 - 6r g b 和h i s 空问显吓图片 f i g3 - 6 t h e i m a g e s i nr g ba n d h i s _i。i1l 1 幽3 7r 仆量直 图信息 f i g3 - 7 t h e h i s t o g r a mo f t h e r c h a r m | c 3 2 应用实例及操作步骤 利用由l ：海生物芯”公司提供的胥髓瘤细胞克隆斑为研究对象，由细胞生 长自动检测仪获取罔彤后结合本图像处理系统，以分割感兴趣的克隆斑部分 为例，详细说明术应片 事例以及操作步骤，如i - n 的图3 8 所示。 瑚 哺 鼬 咖 珊 瑚 。 上海大学硕士学位论文 细胞生长 自动检测仪 获取图像读取图像分割 存储 至计算机 图像处理 系统 图3 8 流程图 f i g 3 - 8t h ep r o c e s s i n gf l o wc h a r t 输出 结果 实际操作步骤如下： 1 ) 如第二章所述，利用细胞生长自动检测仪对9 6 孔培养皿进行扫描，获 取细胞克隆斑图像，并保存至本地计算机。 2 ) 利用本图像处理系用，打开待研究的克隆斑图像，并调用交互图像分 割程序s e g m e n t ，如图3 - 9 所示。 3 ) 在分割s e g m e n t 这个子程序界面中有三个按钮，分别是前景、背景和 开始分割。分别表示人机交互过程中由人工选择部分区域作为前景( 红 色) 、背景( 蓝色) 种子，然后点击开始分割按钮，应用第三章介绍的 改进的分割算法对感性的克隆斑区域进行分割，操作界面如图3 1 0 所 示。 4 ) 分割结果如第五章中5 1 节所述，可以参见图5 1 、图5 2 、图5 3 以及 图5 4 。 5 ) 如果存在分割不满意的区域，可以由人工重新选定部分区域重新作为 前景或者背景种子点，再次进行分割，知道结果满意为止。 2 0 海大学硕学位论文 鼍_ 要璺鼍毫爰璺蚤詈著量! ! ，晨曼煦。掣j 舅一 囹 囹 s e g m e n tp r o g r a m ! u ! u ! 墅到 图3 一l o 变互分割程序界面 f i g3 - 1 0 t h e i n t e r f a c e o f d i e s e g _ | n e n t p r o g r a m 上海大