（微电子学与固体电子学专业论文）集成多通道spr生物传感芯片生物敏感膜研究.pdf

摘要 摘要 本文的研究工作是国家自然科学基金项目“集成多通道s p r 生物传感芯片 及其对 g e 的检测分析”的一部分工作。集成多通道s p r 生物传感器是对原有 s p r 生物传感器的进一步改进，它克服了原有单通道的s p r 传感器实验周期过 长、仪器体积庞大等缺陷。通过使用多组二元光学器件，为多个通道提供了各 个角度的入射光，利用电控平移台在两个坐标方向上的扫描，获得了各个通道 的共振角度信息。大大提高了实验的检测通量，缩短了实验周期，同时也体现 了系统集成化的特点。 本文重点研究了传感器前端的生物敏感膜。首先比较研究了固定蛋白质探 针分子的方法，一种是以葡聚糖凝胶为媒介的方法，另一种是以组氨酸侧链和 金属离子为媒介的方法。提出了使用多种巯基烷酸的混合溶液固定蛋白质分子 的方法。分析了以上固定方法各自的优缺点以及敏感膜重复利用的方法，即使 用甘氨酸缓冲液、咪唑缓冲液、酸、碱等解离探针分子。之后提出了在金膜上 固定蛋白质分子方法的有效性的验证方法，即利用酶作为标记的方法。由于酶 的本质是蛋白质，所以首先用待验证的方法固定酶，洗净之后加入酶催化反应 的底物溶液，如果金膜上成功固定了酶，底物就会发生反应，造成光学性质的 改变，通过测量溶液在特定波长下的吸收性质来确定酶的存在与否，进而确定 蛋白质固定方法的有效性。由于酶量与反应产物的量直接相关，这一方法甚至 可以定量比较各种固定方法的优劣。本文分析了待测物浓度测量的原理与方法， 对实验中可能产生的误差做了细致的分析。之后使用经过验证的蛋白质固定方 法固定了抗抗体探针分子，测量了抗体分子加入之后的响应。最后提出了系统 改进的方向。 关键字：表面等离子共振传感器蛋白质固定验证蛋白质固定方法酶催化反应 a b s t r a c t a b s t r a c t i n t e g r a t e ds p rb i o - s e n s o r 、析t hm u l t i - c h a n n e lo v e r c o m e st h ed i s a d v a n t a g e so f t r a d i t i o n a ls p rs e n s o rw i t h s i n g l e c h a n n e l ，s i n c ei tc a ns h o r t e nt h ee x p e r i m e n t a l p e r i o da n ds i m p l i f yt h ei n s t r u m e n t s b yu s i n gt h eb i n a r yo p t i c a le l e m e n t ，i n c i d e n t l i g h tb e a mw i t hv a r i o u sa n g l e si sp r o v i d e df o re a c hc h a n n e lt oe x c i t et h es p w s c a n n i n gt h ec h a n n e l si nt w od i m e n s i o n s ，t h er e s o n a n ta n g l ef o re a c hc h a n n e lc a nb e o b t a i n e d t h u si tc a l li n c r e a s et h et h r o u g h p u to ft h es y s t e ms i g n i f i c a n t l ya n di n t e g r a t e t h es y s t e m t h i st h e s i sf o c u s e do nt h es e n s i n gf i l mo ft h es e n s o r a tf i r s t ，t w oi m m o b i l i z i n g m e t h o d sw e r ei n t r o d u c e d ：o n ew i t hd e x t r a na sm e d i u ma n da n o t h e rw i t hh i s t i d i n e a n dm e t a li o na sm e d i u m t h ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so ft h et w om e t h o d s ， t o g e t h e rw i t ht h er e u s eo ft h ef i l ma r ea n a l y z e d t h e nas i m p l ew a yt ov a l i d a t et h e e f f i c i e n c yo fi m m o b i l i z a t i o no fp r o t e i n so ng o l ds u r f a c ei ns p rs e n s o ri si n t r o d u c e d t h i sm e t h o du s e dt h ee n z y m ea saf l a g ，i fam e t h o dc a ni m m o b i l i z ep r o t e i n s ，i tc a n a l s oi m m o b i l i z ee n z y m e t h eh r pw a su s e di nt h i sc a s e ，a n di ti sac a t a l y s to ft h e r e a c t i o no ft h et m ba n dh 2 0 2 t h eh r pl i n k e dg o l ds u r f a c ei st r e a t e dw i t ht h e s o l u t i o no ft m ba n di - 1 2 0 2 t h es p e c t r u mo ft h es o l u t i o nc a nt e l lw h e t h e rt h ee n z y m e i ss u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e da n dw h e t h e rt h a tm e t h o dc a ne f f e c t i v e l yi m m o b i l i z e p r o t e i n s t e r m i n a t et h er e a c t i o nw i t hh c i ，t h e r ew i l lb eap e a ka t4 5 0 n mi ft h eh r pi s i n d e e di m m o b i l i z e d t h i sv a l i d a t i o nm e t h o dc a l le v e n c o m p a r eq u a n t i t a t i v e l y b e t w e e nt h ei m m o b i l i z i n gm e t h o d s o n ei m m o b i l i z i n gm e t h o dw a st e s t e di nt h i sw a y a n t i i g gw a si m m o b i l i z e dw i t ht h i st e s t e dm e t h o d ，a n dt h er e s u l tw a ss a t i s f i e da f t e r t h ei g gw a sc o m b i n e d k e yw o r d s ：s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c es e n s o r ，i m m o b i l i z i n gp r o t e i n s ，v a l i d a t i o nf o r i m m o b i l i z i n gp r o t e i n s ，e n z y m er e a c t i o n i i 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月 日 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 2 0 年月日 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 第一章前言 第一章前言 第一节s p r 技术的发展与现状 2 0 世纪早期，w o o d 观测到了偏振光照射到金属光栅上时激发的表面等离子 共振现象【l j ，这一现象被认为是偏振光的光子与金属中的自由电子发生了谐振耦 合而引起的，在这个过程中，金属与其他介质接触面的电磁性质决定了表面等 离子体波( s u r f a c ep l a s m o nw a v e ，s p w ) 的产生，表面等离子体波沿着金属表面 传播并逐渐消散。这一现象立即被广泛用于金属薄膜的研究中，大量的先驱工 作致力于描述表面等离子共振现象，r i t c h i e 等人【2 】( 1 9 6 8 ) 、r a e t h e r 3 j ( 1 9 8 8 ) 、 n y l a n d e r 等人1 4 j ( 1 9 8 2 ) 首先将其应用于传感器领域。这一技术被用于确定特异 性结合的分子间的亲合力、反应的动力学性 质、浓度分析【5 j 等方面，可以实时地定性、定 量分析待测物，省去了荧光标记的麻烦。之后 一段时间内各种结构的s p r 传感器陆续出现 删，如耦连到棱镜的k r e t c h m a n n 结构( 图1 1 ) 等。最近的研究致力于发展集成度高、低成本、 可重复利用、灵敏度高的传感器。表面等离子 援缱 金曩蒜 样液 图1 1k r e t c h m a n n 结构 体共振传感器正在越来越广泛地被应用于生命科学的基础研究、保健科学研究、 药物研制、临床诊断、环境和农业监测等方面1 9 】。制造工艺的飞速发展使得更多 的光电器件被应用于s p r 研究中，而纳米技术的进步也促进了传感器敏感膜的 更新换代。这些最新的研究工作正在逐步将s p r 技术推进到片上实验室 ( 1 a b o n a - c h i p ) 的新阶段。 s p r 传感器的检测原理基于共振角度的改变，目标分析物与敏感膜表面上 的生物受体结合时，光耦合产生表面等离子体波的条件发生了改变，造成了共 振角度的改变( 图1 2 ) 。目前市售的s p r 仪器可以检测到1p g m m 2 的目标分析 物吸附量，灵敏度一般被表示为折射率的变化量( r e f r a c t i v ei n d e xu n i t ，u ) ， 这样表示的仪器的灵敏度为l x l 0 s lx 1 0 一r i u 。当今s p r 传感器发展的重要方 向之一就在于灵敏度的提高。 s p r 技术最近的三项重大突破是光纤s p r 和波导s p r ( f i b e r - a n d 第一章前言 w a v e g u i d e s p r ) 、硅材料的s p r ( s p ro ns i l i c o nm a t e r i a l ) 、多分析物s p r 系统 ( m u l t i a n a l y t es p rs y s t e m ) 。 光曩 表面 钧质 金羹 棱镶 入射亮麦 反射先柬 图1 2 受体- 配体结合后共振角改变 1 1 1 光纤s p r 和波导s p r 传统的棱镜耦合结构的传感系统在过去几年中应用非常广泛，但它存在不 易小型化和集成化的缺点。光纤和波导s p r 被认为是棱镜耦合结构的替代品。 光纤是激发表面等离子体波的理想介质，它由一个高折射率的芯和覆盖层组成。 早期的光纤s p r 传感器由抛光的光纤尖端外包金属层构成( 如图1 3 ( a ) ) 。这样 的传感器可以检测气体或者生物分子【l 州2 1 ，可以从光纤反射回来的光或者从金 属另- n 衍射的光中测量共振角等信息。k u r i h a r a 等人【1 3 j 证实使用微制造工艺将 光纤的尖端蚀刻成圆锥状( 如图1 3 ( b ) ) 可以增强光耦合作用，并达到8 1 0 4 r u 的灵敏度。当使用不同波长的激光作为光源时，圆锥的最佳角度也不一样，使 用近红外区的激光可以获得1 0 巧r i u 级别的灵敏度【1 4 】。p i l i a r i k 等人【1 5 j 的研究工 作则将注意力放在使用可以维持光的偏振性的光纤来进行更精确的测量，并且 获得了4 1 0 击r i u 的灵敏度。 2 第一章前言 曲光纤 样液l 沁 检潮鼍 图1 3 三种光纤s p r 光纤s p r 的替代品是波导s p r ( 图1 4 ) 。c t y r o k y 等人在这方面做了大量的 理论工作1 6 , 1 7 】。最近的研究工作聚焦于设计多模式波导【1 8 】，用两种t m 偏振模 式的光来激发表面等离子体波，可以获得膜厚度、敏感膜折射率等方面的信息， 并取得4 x 1 0 3r i u 的灵敏度。w a n g 等人【1 9 j 使用脊状波导、双偏振光进行了研究。 首先通过热离子交换在玻璃基质上形成一层通道，这一层的折射率比玻璃基质 高，然后玻璃基质被蚀刻掉一部分，形成脊状 波导。在脊的上表面和侧面镀上金属薄膜，使? 鲁金属层 用t m 模式的偏振光在上表面激发表面等离子r 汹_ _ o - _ 体波，而使用t e 偏振光在侧面激发表面等离一 子体波，利用这两个正交的偏振光就可以从两图1 4 波导s p r 个表面上得到许多有用的信息。波导s p r 的优 势在于它能通过微操作技术将多个敏感单元集中在一个基片上，并呈阵列分布。 使用波分复用光通信技术( w a v e l e n g t hd i v i s i o nm u l t i p l e x i n go p t i c a l c o m m u n i c a t i o n ) 可以从不同的敏感单元中提取各自的信息【2 0 1 。如果将信号叠加 到统一的基准信号，可以消除测量环境的微弱改变带来的影响，如温度改变、 噪声的影响【2 l 】。波导s p r 不仅可以阵列化，而且可以做成多层结构，例如在两 层波导间设置绝缘层，做成对称结构【2 2 1 ，可以进行更高通量的检测。这种结构 激发的表面等离子体波传播得更远，共振角波形更加尖锐【2 五2 4 】，被称为l r s p r ( 1 0 n g - r a n g es u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ) 。 1 i 2 硅材料的s p r 另项有效促进了s p r 系统集成化的技术是使用半导体作为s p r 的基质。 3 第一章前言 传统的光栅型的s p r 系统比较精简，但要求激 光和反射光从样品中透过( 图1 5 ) ，这就给系 统带来了噪声【2 5 ，2 6 1 。如果在肖特基半导体器件 上设计银栅，同样可以激发表面等离子体波。 表面等离子体波产生了电子空穴对，可以通过 测量肖特基势垒两侧的电势差来定性甚至定 量电子空穴对。利用这一原理，系统可以达到 样液 金鱼展 先鼍 图1 5 光栅结构的s p r 1 2 x 1 0 。5r i u 的灵敏度。波长在红外波段的光源能够在硅棱镜表面激发表面等离 子体波，并且比玻璃棱镜条件下穿透深度更大，共振角度更集中。由于硅可以 很方便地被微加工，因此对于s p r 系统的小型化非常有利。t s u i j i u c h i 等人睇，j 利用各向异性湿蚀刻技术在硅上蚀刻了微棱镜阵列，并且安装在微型机械臂上， 通过电力控制机械臂使得入射的激光能从各个角度扫描棱镜。虽然这一设计的 灵敏度还不够高，但它对实现大规模集成化非常有意义。 1 1 3 多分析物s p r 高通量的分析要求系统能够同时分析多个靶分析物。许多情况下，待测对 象的浓度非常低，再加上遗传因素和个体差异，同时检测多种待测物的技术对 精确诊断就显得相当重要。如在药物发现过程中，成千上万的分子需要被筛选； 而快速诊断过程同样要求识别多个标记物，这些应用都是这一需求的实际体现。 虽然波导技术也可以构造并行的通道和敏感单元【2 8 j ，但使用微图案技术可以替 代它实现更大规模的多分析物检测。目前存在多种微图案技术，如微流通道印 迹【聊( m i c r o f l u i d i cc h a n n e ls t a m p s ) 、微接触印刷【刈( m i c r o c o n t a c tp r i n t i n g ) 、紫 外解吸【3 1 3 2 1 ( u vd e s o r p t i o n ) 、光氧化( p h o t o o x i d a t i o n ) 、光分解【3 3 l ( p h o t o l y s i s ) 、 电聚合p 4 j ( e l e c t r o c o p o l y m e r i z a t i o n ) 等。 综上所述，高效的光源和光电检测设备、波导、喷射模塑法、自组装技术p 文 3 6 1 、微流系统鲫、纳米制造技术等一系列技术手段的发展推动了s p r 生物传感 器的集成，加上数学建模工具的出现、数据分析算法的改进 3 9 - 4 2 、可以激发表 面等离子体波的新材料的应用，可以预见s p r 生物传感器在未来几年的飞速进 步。纳米技术的发展使敏感膜等呈现新的特性，推动了l s p r 的发展。在不久的 将来，可以实现由用户订制功能的专用传感器。s p r 传感器越来越成为生物分 4 第一章前言 子分析和医学诊断的重要工具。 第二节多通道s p r 系统构成 本实验所使用的多通道s p r 系统具有以下几个基本部分：光学器件、电路 系统、桌面软件。完全可以使用模块化的设计方法来实现各个部分。 1 2 1 光学器件 这部分的基本结构如图1 6 所示，它由光源、三棱镜、四个小凸透镜组成。 四个小凸透镜被粘在图中虚线标出的焦点正下方的三棱镜表面，分别用0 1 、0 2 代表。0 1 、0 2 的焦距不同，图中标出的是两组透镜形成的双通道光路，如果将 光源沿着垂直于纸面的方向平移，则可以实现阵列形式的检测，大大提高检测 的通量。光线入射以后，在三棱镜的左肩上被反射回来，聚焦于n 1 、n 2 处，由 于光线是聚集形式入射，所以可以提供各个角度的入射光，省去了传统s p r 系 统中需要移动单光源来实现各个角度入射的麻烦。n 1 、n 2 处的反射光经三棱镜 右肩反射，再经0 1 、0 2 修正为平行光，提供给电路系统中的光敏元件检测。 1 2 2 电路系统 图1 6 多通道s p r 系统的光路原理 电路系统由电控平移台、蠕动泵、光电二极管阵列、m s p 4 3 0 f 1 6 9 ( 单片机) 、 5 on衙。 第一章前言 t m s 3 2 0 c 5 4 1 0 ( d s p ) 、e p m 3 0 3 2 a ( c p l d ) 几大部分构成( 图1 7 ) 。其基本工 作原理是：在电控平移台上固定的光电二极管阵列模块可以检测各个通道的光 学信号，并转换为模拟信号输出给单片机m s p 4 3 0 f 1 6 9 的a d c 模块。单片机将 光电二极管的1 0 2 4 个感应单元的模拟信号转换为数字信号，通过h p i 接口传送 给d s p 芯片t m s 3 2 0 c 5 4 10 ，d s p 完成这10 2 4 个数字信号的三次样条插值计算， 得到共振角度，并通过h p i 接口回传给单片机。单片机接收到共振角度之后通 过r s 2 3 2 接口向p c 发送数据。d s p 的程序存储在外置f l a s h 芯片中，由c p l d 芯片e p m 3 0 3 2 a 为f l a s h 提供时序实现对f l a s h 的读写操作。单片机m s p 4 3 0 f 1 6 9 同时还具有控制蠕动泵的功能。 1 2 3 桌面软件 图1 7 电路系统结构框图 软件系统由两部分构成：在线工作站和离线工作站。前者负责控制传感芯 片的数据采集处理以及接收传感芯片采集到的数据，离线工作站负责对保存好 的数据进行分析处理。 在线部分( 图1 8 ) 的主要功能包括通道选择、参数设置、采集开始及停止 控制等。用户可以根据实际情况填写实验标题、实验人姓名、实验参数等信息 ( 图1 9 ) 。设置完成后用户可以开始采集数据，根据需要选择“单次采集 、“连 续采集。采集到的数据会以曲线图的形式显示在对话框中。这部分软件需要通 过串口与电路系统通信，按照规定格式给下位机发送命令，并且从串口接收到 的数据中提取需要的信息。为此制订了串行通信协议，包括数据帧、数据握手 帧、命令帧、命令握手帧、消息帧的格式以及通信流程。软件部分使用了m f c 6 第一章前言 的m s c o m m 控件。在数据保存模块中，利用了m f c 的文档串行化机制将数 据保存在计算机硬盘上，这样做的好处是可以省略第三方的数据库软件的支持， 简化了应用程序的结构。 f _ t o 。 黑品。如甚。；，暴。；缸 l 珊f 村mh 椭l i# t * r 一 | 一厂_ ”厂_ _r m - 厂一“* - _ 一 | n n # r 一n “ 0| 一 t 图i8 在线工作站对话框 离线部分对话框结构如图1 1 0 所示。用户可以使用“打开”按钮来选择打 开之前已经保存好的s p r 文件，并且可以绘制多幅图来实现多次实验数据的相 互对比。用户还可以根据需要将图形中的任一区域放大观察之后可以还原图 像。 = 一= 一 薹主：二 第一章前言 图1 9 设置实验参数 图1 1 0 离线工作站对话框 第三节本文的研究内容与创新点 1 3l 本文的研究内容 本文系统地研究了s p r 生物传感系统前端的构成，这是决定传感器性能的 第一章前言 重要部分，它主要包括金属薄膜、生物敏感膜两大部分。金属薄膜固定在传感 系统的光学器件上，它提供了产生表面等离子体共振现象的必要条件。金属薄 膜之上是生物敏感膜，膜上固定着探针分子，可以特异性、选择性地与待测溶 液中的目标分子发生结合。通过观测配体和受体结合过程中的共振角度的变化， 得到待测溶液中的信息，定性、定量目标分子以及获得结合反应本身的一些数 据。 第一章介绍了s p r 技术的发展与现状以及实验中用到的多通道s p r 生物传 感芯片的构成。首先介绍了光纤s p r 和波导s p r 、硅材料的s p r 、多分析物s p r 的技术原理和发展情况。接着介绍了多通道s p r 生物传感芯片的光学器件、电 路系统、桌面软件。按照自顶向下、逐步细化的思路分别实现各个部分的功能， 再组装起来调试，得到了最终的实验系统。 本文第二章首先介绍了金属薄膜的两种制各方法：溅射法和湿化学制备法。 之后详细讲述并比较了生物敏感膜的构造和制各方法，对水凝胶媒介法和金属 离子媒介法的实验具体操作、优缺点进行了深入研究。提出了使用不同长度碳 链的巯基烷酸的混合溶液固定蛋白质分子的方法，巯基端可以使分子自组装在 金膜表面，羧基端可以用于共价固定蛋白质分子。这一方法可以简化实验步骤， 缩短实验周期，节省成本。可以使用第三章介绍的方法测试这一方法固定探针 分子的有效性。之后研究了敏感膜的重复利用问题，这对于提高s p r 传感器的 实用性是非常重要的环节。 第三章详细探讨了在金属薄膜上固定蛋白质分子方法有效性的验证过程。 首先比较了几种蛋白质分子检测的方法，指出了它们各自存在的不足之处。之 后提出了利用酶作为标记物的验证方法，其基本思想是：生物体内的酶是高效 的催化剂，它的本质是蛋白质。如果某种方法确实能在金属薄膜表面固定蛋白 质分子，那么利用这种方法也一定能固定酶。之后将可能固定了酶的金属薄膜 表面置于酶催化反应的底物溶液中。由于极少量的酶就可以催化大量的底物发 生反应，利用反应产物的特殊光学性质进行检测，即可判断是否成功固定了酶， 达到验证固定方法的有效性的目的。这一研究工作已发表在传感技术学报 2 0 0 8 年9 月第2 l 卷第9 期当中。 第四章研究了s p r 系统的定量检测原理。首先分析了配体与受体结合速率 常数与解离速率常数的测量原理和测量方法，得到这两个数据以后就可以用于 计算待测溶液中含有的受体( 或配体) 的浓度。 9 第一章前言 第五章介绍了抗原的性质，抗原、抗体特异性相互作用的原理，抗体的空 间构象、分子构成，单克隆抗体制备的原理，以及利用前述方法定性定量检测 蛋白质( 人埯g ) 的过程。 第六章总结了系统的各项性能，并且提出了系统改进的一些建议。 1 3 2 本文的创新点 本文的创新之处体现在： 1 提出了利用不同长度烷烃链的巯基烷酸固定蛋白质分子的方法，这一方 法结合了水凝胶媒介法和金属离子媒介法的优点，具有相当突出的优势。 2 提出了在金属薄膜表面固定蛋白质分子方法的有效性的验证途径。验证 方法巧妙地利用了酶反应的快速、准确、微量的特征。使用酶作为标记物，通 过检测酶催化反应产物的性质来间接检测酶的存在与否，达到了预期的目的。 这一技术创新被传感技术学报收录，发表在该刊物2 0 0 8 年9 月第2 l 卷第9 期当中。 3 提出了计算待测溶液中目标受体( 或配体) 分子的浓度的方法。 1 0 第二章蛋白质分子固定 第二章蛋白质分子固定 第一节金膜制备 表面等离子体共振传感器使用的金属薄膜材料可以有许多种，最常用的是 金、银等。银作为金属薄膜时灵敏度最高，但是由于银的稳定性差，容易被氧 化。金的稳定性相当好，因此选择金作为制备金属薄膜的材料。实际操作中既 可以将金直接镀在棱镜底，也可以镀在与棱镜材质一样的薄片上。如果使用薄 片，还需要在薄片和棱镜之间设置折射率匹配液实现二者的耦合。本实验为了 操作方便，将金直接镀在棱镜底上。 制备金属薄膜的方法有溅射、真空热蒸发、湿化学 4 3 j 等方法。溅射法的原 理是用加速后的离子轰击金属靶，离子和金属表面的原子交换能量后，金属就 会从固体表面溅射出来，在目标物表面形成金膜。由于金与玻璃的附着力较差， 如果采用溅射法制各金膜，首先需要在玻璃上附着薄薄的一层铬，以提高金的 附着力。 湿化学法制备金膜：用铬酸洗液浸泡棱镜欲镀金的表面过夜，在7 0 的体 积比为3 ：1 的浓h e s 0 4 3 0 h 2 0 2 混合溶液中浸泡1 0 到3 0 分钟，用去离子水和 光谱纯甲醇漂洗干净，浸入含有0 8m l 氨基丙基三甲氧基硅烷的8n l l 甲醇溶液 中进行玻片硅烷化处理1 2 一1 8 小时，用甲醇洗净，立即浸入柠檬酸钠还原法制 备的平均颗粒直径约为2 到3 纳米的金溶胶中组装1 2 1 8 小时，用水洗净后浸 入和8 血的镀金液中( 含浓度为0 1 lm m 的羟氨和浓度为0 0 5 - - 0 15 的氯金 酸) ，均匀摇动1 0 分钟左右，可获得厚度在4 5 - 4 5 0n i n 间的金膜。 本实验选择了溅射法作为制备金膜的方法，采用磁控溅射的方法先后在柱 面棱镜的底面制备厚度为2n m 的铬膜和厚度为5 0i l r n 的金膜。 第二节固定方法比较研究 如前所述，在日臻完善的生物传感器技术领域中，基于光学原理的表面等 离子体共振传感器在免疫诊断以及探究生物分子性质的研究方面显示出了相当 第二章蛋白质分子固定 巨大的潜力刀。通过固定特异性生物分子对( b i o s p e c i f i cp a i r ) 中的一个组成 部分，例如抗原( a n t i g e n ) 或抗体( a n t i b o d y ) ，然后加入含有另一个组成部分的 待测溶液，观测特异性分子( 如抗原和抗体) 之间结合、分离过程中的光学指 标( 共振角) 的变化，使得这项技术可以用于研究、测量溶液中待测物质的浓 度，以及描述特定反应的动力学性质( 如结合、解离常数，反应的平衡常数等) 、 分子之间特异性结合的亲合力研究等。 固定蛋白质分子到敏感膜上的方法有许多种，其中具有代表性的有： 2 2 1 水凝胶媒介法 s t e f a nl o f a s 和b oj o h n s s o n 等人的研究表明用水凝胶修饰的金膜可以提供 一个活泼的、具有大量活性位点的激活表面，可以用于一系列的生物化学分析 研究过程中。以往描述表面等离子体共振生物传感器固定生物分子方法的文章 中，抗原或抗体在检测之前只是简单地直接被吸附在金属薄膜表面。虽然这一 方法也明显地体现出了表面等离子体共振现象，但是这种最直接简单的方法有 许多局限性： 首先，蛋白质分子与金属直接结合可能发生变性。蛋白质分子变性后，其 分子结构的一级结构( 即肽链中的氨基酸分子顺序) 不会发生变化。但是蛋白 质分子的二级以上结构会发生破坏，这一变化是由于维持蛋白质分子二级结构 的氢键、疏水的相互作用、范德华力、离子键和配位键发生了破坏，使得其分 子中不同的肽链之间的相互作用发生了变化，造成的结果就是整个蛋白质分子 的空间构象发生变化，原来集中在一起的活性中心分子发生偏移，使蛋白质分 子的生物活性丧失。由于抗原、抗体的结合是依靠抗体针对特定抗原的抗原决 定簇来实现二者的特异性结合，如果抗原决定簇的活性中心分子发生了偏移， 就会造成原本会发生特异性结合的抗原抗体不再相互结合，固定上去的蛋白质 分子层( 如抗抗体) 无法吸附抗体，影响了实验的精度，甚至会出现完全错误 的结论。此外，要固定半抗原类型的配体到金属薄膜表面也是一件相当困难的 事情。 第二，既然表面等离子体共振现象是基于金属溶液交接处的介电常数的变 化来实现观测的，分子的非特异性结合必须控制在最小的水平。由于吸附是物 理性吸附，没有任何特异性，这就有可能发生不需要的分子结合到金属薄膜表 1 2 第二章蛋白质分子固定 面，或者溶质分子与原本已经结合上去的配体发生交换而将配体置换下来，溶 质却结合在了薄膜表面【4 引。这两种情况的发生会给实验带来极大的误差。 综上所述，理想的解决办法是提供一个稳定的、可以共价结合配体的、可 重复利用的、可以最大程度暴露配体的活性中心给溶液的表面。这样才能实现 配体与特异性分子的可靠结合，保证实验的精确。 以下将要讨论的是一种将水凝胶修饰在金属薄膜表面上的方法，这一方法 克服了上述方法的缺陷，提供了一个适合于快速、简单地共价结合蛋白质或其 他配体并可再生利用的途径。这种经过修饰的敏感膜的应用范围很广泛，特别 适合于生物分子特异性结合反应的分析。 金属表面的修饰层是由层起隔离、屏蔽金属性质作用的分子层和一层可 以共价结合抗原或抗体的羧甲基化的右旋糖苷水凝胶分子层组成。由于用于表 面等离子体共振现象的金、银的化学性质比较稳定，不易发生化学反应，所以 要引进一个分子层来隔离、屏蔽掉金属层的惰性，能够胜任这一工作的分子是 硫醇分子。硫醇分子中的巯基能与金形成金硫键，使硫醇分子吸附在金属薄膜 表面。通过自组装作用，首先在金属薄膜表面自组装一层长链的硫醇【4 9 , 5 0 ( 例如 l ，h y d r o x y a l k y lt h i o l s ) ，形成一层亲水性的分子。长链的硫醇分子有效地屏蔽 掉了金属层对蛋白质分子的作用，同时分子中与巯基相反的一端可以提供迸一 步化学反应的基团。本方法中，利用表氯醇( e p i c h l o r o h y d r i n ) 与硫醇单分子层 中的羟基形成了环氧化物( e p o x i d e ) ，再将右旋糖苷水凝胶共价固定在这个环氧 化物上，通过这一途径，长链的、高分子的右旋糖苷分子层就被固定在了金属 薄膜的表面，可以用于不同的检测目的。 2 2 1 1 实验流程 实验名称：利用水凝胶媒介法固定蛋白质分子。 试剂清单： ( 1 ) 1 6 ，m e r c a p t o h e x a d e c a n 1 o l ，配成溶液的浓度为5 1 0 dm o ld m 。 ( 2 ) 乙醇。 ( 3 ) e p i c h l o r o h y d f i n ( 表氯醇) ，浓度0 6m o l d m 弓。 ( 4 ) d i g l y m e ( 二甘醇二甲醚) 。 ( 5 ) 氢氧化钠。 ( 6 ) d e x t r a n ( 右旋糖苷) 。 1 3 第二章蛋白质分子固定 ( 7 ) b r o m o a c e t i ca c i d ( 溴乙酸) ，浓度1m o lr i m - 3 。 ( 8 ) n 乙基_ n ( 3 二甲氨基丙基) 二亚胺氢氯化钠，浓度0 2m o ld m - 3 。 ( 9 ) n 羟基琥珀酰亚胺，浓度0 0 5m o ld m 弓。 ( 1 0 ) m o n o c l o n a la n t i b o d y ( 单克隆抗体) ，浓度6 0 嵋c n l - j 。 ( 1 1 ) 乙酸钠，浓度1 0 1 0 弓m o ld m d 。 ( 1 2 ) 乙醇胺，浓度1m o ld m 。 ( 1 3 ) g l y c i n e ( 甘氨酸) 。 实验过程： ( 1 ) 自组装。将镀有金膜的棱镜放置于浓度为5 1 0 3m o ld m 3 的1 6 巯基 1 羟基十六烷( 1 6 m e r c a p t o h e x a d e c a n - 1 0 1 ) 的乙醇溶液( 乙醇和水的体积比为 8 0 ：2 0 ) 中，将巯基十六烷醇自组装在金膜表面。 ( 2 ) 形成环氧化物。在2 5 下使用浓度为0 6m o ld m 。的表氯醇 ( e p i c h l o r o h y r d r i n ) 溶液处理表面4 小时，其中溶剂为1 ：1 混合的浓度为0 4m o l d m 。的氢氧化钠溶液和二甘醇二甲醚( d i g l y m e ) 。 ( 3 ) 形成水凝胶层。用水充分洗涤金膜表面，再用乙醇充分洗涤除去可溶 有机物，再用水充分洗涤。之后将金膜置于右旋糖苷( d e x t r a n ) 溶液中2 0 小时， 右旋糖苷溶液配置为3 0g 的t 5 0 0 右旋糖苷溶于1 0c m 3 的浓度为0 1t o o ld m 弓 的氢氧化钠溶液。 ( 4 ) 羧甲基化右旋糖苷。用浓度为1m o ld m 弓的溴乙酸( b r o m o a c e t i ca c i d ) 溶液处理表面1 6 小时来完成羧甲基化糖苷，溴乙酸的溶剂是2t o o ld m - 3 的氢氧 化钠溶液。 循环伏安法测得硫醇化烷烃分子层对金属层的屏蔽作用在这一系列的合成 过程中保持得相当完好。经过傅立叶变换红外光谱仪( f t i r ) 和多孔聚苯乙烯 ( s ) 测试，检测到了右旋糖苷的存在，并且大约在一平方毫米的面积内含有 l 3n g 右旋糖苷，且右旋糖苷聚糖的每个葡萄糖单位上大约有一个羧基基团。 如此制得的带负电的水凝胶层可以共价固定多种配体。接下来要进行的是 “活化配对钝化 的过程。从低离子强度的探针分子溶液中提取出带正电的蛋 白质探针分子，依靠静电吸引吸附在水凝胶层附近。这些提纯过的蛋白质分子 与羧甲基的吸引为二者之间共价结合反应的发生提供了高的反应物浓度。 ( 5 ) “活化( a c t i v a t i o n ) 羧基过程。激活水凝胶中的羧基要用浓度为0 ：2m o l d m o 的n 乙基- n ( 3 二甲氨基丙基) 二亚胺氢氯化钠的水溶液( e d c ) 和浓度为 1 4 第二章蛋白质分子固定 0 0 5m o ld m - 3 的n 羟基琥珀酰亚胺的水溶 液( n h s ) 。经过活化后的羧基可以更好的 完成“配对”过程。 量 ( 6 ) 氨基与羧基的“配对( c o u p l i n g ) ” - 过程。用浓度为6 0 嵋c m 3 的单克隆抗体 ( m o n o c l o n a la n t i b o d y ) 溶液与经过激活的 金膜表面羧基反应，溶剂为浓度为1 0 l o o图2 1 固定过程中s p r 系统响应 t o o ld m 七的乙酸钠，p h 值为5 0 。利用抗体 分子中的亲质子基团( 氨基) 与水凝胶中的羧基反应共价固定抗体。 ( 7 ) “钝化( d e a c t i v a t i o n ) 乙酸钠过程。溶液中多余的乙酸钠用p n 为 8 5 的浓度为lm o ld m 3 的乙醇胺溶液( 用氢氧化钠溶液调整p h 值) 来钝化。 这一步骤也可以除去蛋白质分子( 单克隆抗体分子) 中的盐分。 到此为止就完成了探针分子在金属薄膜表面的固定过程。如果在这一过程 中持续关注表面等离子体共振传感器的光学指标的变化，得到图2 1 所示的结 果。 图中纵坐标为共振信号，横坐标为时间。( 1 ) 处表示加入e d c n h s 激活羧基， ( 2 ) 处表示加入单克隆抗体分子探针，( 3 ) 处表示加入乙醇胺钝化，( 4 ) 处表示钝化 过程结束。前后的共振信号发生的变化表明金属薄膜上确实共价固定了一定量 的单克隆抗体分子探针。 2 2 1 2 性能分析 蛋白质分子中各个氨基酸之间通过肽键连接，但由于其分子侧链中含有的 可解离的酚羟基、氨基、羧基、咪唑基等基团的存在，使其成为两性电解质。 既可与酸也可与碱反应。溶液中蛋白质分子的带电情况与溶液的p h 值有关，在 某一p h 值处，蛋白质分子中带正电荷的基团数目与带负电荷的基团数目相等， 静电荷为零，这时蛋白质分子在电场中不发生移动，此时的p h 值称为这一蛋白 质分子的等电点。溶液的p h 值低于蛋白质分子的等电点时，蛋白质分子带正电； 当溶液的p h 值高于蛋白质分子的等电点时，蛋白质分子带负电。只要溶液的p h 值低于蛋白质分子的等电点，就可以利用这一固定方法固定蛋白质分子，与带 负电的水凝胶分子吸引从而引发反应，针对不同的蛋白质分子，溶液的p h 值甚 至可以高达4 。 1 5 第二章蛋白质分子固定 用1 4 c 和3 5 s 标记蛋白质，放射性测试结果表明每1 咖一的水凝胶可以吸引 5 0 n g 的蛋白质分子。对大多数蛋白质分子，这一质量( 5 0 r i g ) 意味着多层蛋白 质分子被吸引到了水凝胶表面，这体现出了水凝胶的分支数量的巨大，以及可 以提供的结合位点的丰富。结果表明聚糖分子的厚度可以达到1 0 0h i l l ，这个厚 度取决于溶液的p h 值和离子强度。由于聚糖分子的亲水性，它可以很好地溶于 水中，分子的支链可以在水中伸展，有利于结合蛋白质探针分子。表面等离子 共振现象对于共振表面以下l 微米范围内的介电常数的变化较为敏感，聚糖层 的厚度较好地满足了这个范围的要求。 图2 2 是按照上述固定方法固定了面密度大约为1 0n g m m 也的铁传递蛋白抗 体的金属薄膜的响应。其中铁传递蛋白溶液的浓度为1 0 0p gc m 。，缓冲液含浓 度为l ox1 0 。t o o ld m d 的h e p e s ( 4 一( 2 一h y d r o x y e t h y l ) p i p e r a z i n e - l e t h a n e s u l p h o n i e a c i d ) 和浓度为o 1 5m o ld m d 的氯化钠， p h 值为7 4 。将这样的待测液加入反应 池，可以观察到铁传递蛋白与固定上去的 铁传递蛋白抗体发生了结合。之后加入了 p h 值为2 5 的甘氨酸( g l y c i n e ) ，解离抗 体( 铁传递蛋白抗体) 与抗原( 铁传递蛋 白) 间的结合，这样敏感膜可以用于下一 次的检测。合适地选择敏感膜再生条件， 可以实现敏感膜的重复利用达5 0 次之 多，而响应能维持得很好。 图2 2 甘氨酸解离过程 图中( i ) 代表铁传递蛋白溶液的加入；( 2 ) 代表铁传递蛋自与抗体的结合 达到了动态平衡；( 3 ) 代表加入甘氨酸解离；( 4 ) 代表解离的结束。 2 2 2 金属