（生物医学工程专业论文）单分散多色荧光微球的研究.pdf

a b s t r a c t t h ef l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sw e r es y n t h e s i z e db yd r y i n gm e t h o di nl i q u i da n d p o l y m e r i z a t i o nm e t h o d , r e s p e c t i v e l y f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y m m t e ( f r r ol o a d e d m i c r o s p h e r e sw e r ep r e p a r e db yi m p r o v e dd r y i n gm e t h o d 证l i q u i d ( o i l i n - w a t e r ， o w ) u s i n gp o l y s t y r e n e ( p s ) 鹄c a r d e r , f - 6 8 鹪e m u l s i f i e r t h ef l u o r e s c e n t m i c r o s p h e r e sw e r ec h a r a c t e r i z e df o ry i e l d , p a r t i c l es i z e ，c o e 伍d e n to fv a r i a t i o n ( c v ) a n df l u o r e s c e n ti n t e n s i t y t h ei n f l u e n c ef a c t o r s ，i n c l u d i n gp r e p a r a t i o nm e t h o d , o i la n d w a t e rp h a s e ，t h ec o n c e n l r a f i o no ff i t c ，w e r ed i s c u s s e d w i t ham a t h e m a t i cm o d e l , t h ee f f i c i e n c yo f w 锄1 l i n gp r o c e s sw 懿a n a l y z e d t h eh i g h e re f f i c i e n c yo f w a s h i n gw a s g a m e dw h e nu s i n g3 0 m ll i q u i di ne v e r yw a s h i n gp r o c e s s t h ep o l y m e r i z a t i o nm e t h o dd i v i d e di n t om o n o d i s p e r s ep o l y m e r i z a t i o na n ds e e d p o l y m e r i z a t i o nw e r ep r e p a r e d 鹊f o l l o w s ：f i r s t l y , t h eh i g h l yu n i f o r m e dp o l y s t y r e n e ( p s ) s e e dp a r t i c l e s w e l e p r o d u c e db ym o n o d i s p e r s i o np o l y m e r i z a t i o nu s i n g a n i n i t i a t o r , 2 , 2 - a z o b i s - ( i s o b u t y r o n i t r i l e ) ( a i b n ) i na l c o h o lm e d i a t h e 弘l i t i c l es i z eo f s e e d s 砌3 12 岬w i t ht h ec vl e s st h a n2 s e c o n d l y , m o n o d i s p e r s ep o l y s t y r e n e s e e dp a r t i c l e sw e l er e d i s p e r s e d 试s o d i u md o d e c y lm l f a t e ( o 2 5 w t ，s l s ) a q u e o u s s o l u t i o nb ys o n i c a t i o n , s w o l l e nw i t hp h t h a l i ca c i dd i b u t y le s t e r ( d b p ) a n dc h l o r o f o r m ( t o t a l l y0 0 5 9 ) p r e e m u l s i f i e db yu l t r a s o n i cf o rl o ha t2 0 c t h e n , t h em i x t l 】r eo f b p o ( 锄i n i t i a t o r , 1 w t r e h t i v et os t y r e n e ) a n ds t y r e n em o n o m e r ( 1 0 8 ) w a bp o u r e di n t ot h e r e a c t o r t h es w e l l i n gw 8 8c o n t i n u e df o ra n o t h e r6ha t2 0 a f t e rd e a e r a t e dw i t h n i t r o g e ng a s ，t h ep o l y m e r i z a t i o nw a sc a r r i e do u ta t6 0 cf o r1 0h t h e 妇eo f p s r t i c l e s p r o d u c e db ys e e dp o l y m e r i z a t i o nw a s9 9 1 皿- nw i t ht h ec vl e s st h a n4 f i n a l l y , t h e p sb e a d s l r e r es 吼r e l l e nb yc h l o r o f o r ma n d1 - p r o p a n o la tr o o mt e m p e r a t u r ef o r2 4 h w i t hl i g h ts h a d i n ge q u i p m e n t , m e a n w h i l e ，h b e l e db yf l u o r e s c e i n s ( r h o d a m i n ea n d a c r i d i n eo r a n g e ) t h el a b e l e db e a d sw e r ew a s h e dw i t ha l c o h o lf o rt h r e et i m e st o r e m o v et h er e m a i n d e r t h ei r l n b e n c e f a c t o r s ，s u c h p o l y m e r i z a t i o nm e t h o d , p o l y m e r i z a t i o nt e m p e r a t u r e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs t y r e n e ，f l u o r e s c e i n sa n dp o l y ( v i n y l p y r r o l i d o n e ) ( p v p k - 3 0 ) ，w e r ed i s c u s s e d u s i n gd y n a m i cb a l a n c em o d e l , t h ep r o c e s so ft h ef o r m i n go fp r i m a r yp a r t i c l ea n d m e c h a r d s mo f m o n o d i s p e r s ep o l y m e r i z a t i o nw a se l u c i d a t e d c h o o s i n gt h eb e s tg r o u p s o fp a r a l l e l e de x p e r i m e n td a t a ，u s i n gg e n e t i ca l g o r i f l u n s ( g a ) m e t h o d , t h eo p t i n l a l s w e l l e np a r m u e t e r s ，w h i c hw 饿l o ( v v ) p e r c e n t so fc h l o r o f o r m ，3 0 m m o l f l u o r e s e e i n , 3 3p e r c e n t so fa oa n ds w e l l e nf b f2 4 h 憾o b t a i n e d i ns i x t hg e n e r a t i o n f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c 扛o s c o p y 伊n r ) a n a l y s i si n d i c a t e dt h ef l u o r e s e e i n s w e r e 曲s o r b e dt ot h ei n n e ro ft h ep sp a r t i c l e s ，a n dt h eb 删b c ed i d n td e t e c t e da n y o b v i o u s l yr e s i d u a lf l u o r e s c e i n s t h em o r p h o l o g yo ff l u o r e s c e n t b e a d sd i d n th a v ea n y v i s i b l ed j 岱期限n c ef r o mf i l eu n l a b e l e dp sp a r t i c l e s t h ep r o d u c t sw e r et c i m t e da t 4 9 0 n mt ov a r i o u sc o l o r s ，s u c h 豳r e d , g r e e n , b l u ee ta l ，w i t ht h er a n g eo fe m i s s i o n w a v e l e n g t hb e t w e e n5 10a n d5 0 0 知m ，q u a l i f i e d 嬲a b s o l u t ec o u n tr e a g e n tf o rf l o w c y t o m e t r ya n 蛐 k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n tm i e r o s p h e r e ，p o l y s t y r e n e ，m o n o d i s p e r s ep o l y m e r i z a t i o n , d y l 删cb a l a n c em o d e l , g e n e t i ca l g o r i t h m ，s e e dp o l y m e r i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丕鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了黜意。 学位论文作者签名：否伏坼 签字日期：加7 年2 月f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 警位论文作者签名：张畸 签字日期：2 e 口存z 月 日 导师签名： 库：奉 签字日期：扣节7 年。月 日 第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 t 淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的群细胞，正常机体内各淋巴细 胞亚群共同作用，维持着机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能 发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱，引起一系列病变；艾滋病( 甜d s ) 就 是一类由人类免疫缺陷病毒( 卸) 引起的免疫功能紊乱综合症，h i v 主要侵犯 人c d 4 + t 淋巴细胞，导致其数量减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破，造 成免疫功能低下，最终导致各种感染和肿瘤。据联合国艾滋病规划署和世界卫生 组织2 0 0 6 年1 2 月公布的 2 0 0 6a i d se p i d e m i cu p d a 皿统计数字显示，全 世界的艾滋病感染人数突破3 9 5 0 万人，新增感染者4 3 0 万名，另有2 9 0 多万患 者在2 0 0 6 年死亡，截至2 0 0 6 年，中国现存艾滋病感染者和病人约6 5 万( 3 9 万 1 1 0 万) ，截至2 0 0 4 年9 月底，累计报告的艾滋病病毒感染者8 9 ，0 6 7 例，其中艾 滋病病例2 0 ，7 8 6 例，历年报告疫情数字增加明显。我国对于艾滋的防治非常重 视，已经制定了中国预防与控制艾滋病中长期规划( 1 9 9 8 2 0 1 0 年) ，规划中 明确提出到2 0 1 0 年，做到艾滋病病毒抗原、免疫和临床诊断试剂国产化，力争 达到国际同等水平。 由于h i v 主要侵犯人c d 4 + t 淋巴细胞，对h i v a i d s 病人定期进行c d 4 + t 淋巴细胞检测，具有十分重要的意义。长期监测c d 4 + t 淋巴细胞绝对数的变化， 可以有助于了解机体的免疫状态以进行疾病分期，了解患者的病情发展，决定正 确的治疗方案，观察对治疗的反应以及预防机会性感染发生等。c d 4 + t 淋巴细 胞绝对计数已成为临床检验的一项重要指标。在1 9 9 2 年，美国疾病预防控制中 心( c d c ) 已将此指标已列入i - i i v a i d s 病人的诊断和分类标准。 1 1 1 流式细胞分析 流式细胞分析( f l o we y t o m e t r i ca n a l y s i s ) 是近代分析细胞学的重要成就，已 被广泛应用子高通量分析，代谢过程分析，疾病诊断，药物发明等许多领域1 ：引。 流式细胞仪( f m ) 分析可应用于特殊的淋巴细胞分化簇( c d ) 的计数，而c d 3 与c d 4 细胞的比值可表征人体的健康状态【4 垲】。 经过近三十年中的发展和完菩，f c m 测量参数由单参数向多参数发展，仪 器的灵敏度、分辨率、和检测速度等指标进一步改菩提高。目前f c m 的商业生 产向两个方向发展。一个方向是发展小型的操作简便、性能指标稳定的临床常规 第一章绪论 型f c m 仪器。这种仪器使用方便，价格较低，能满足大部分临床医学工作的要 求，但一般不附加有细胞分选功能，目前国内多数医院配备的就是临床常规型 f c m 仪器。另一个方向是发展科研型f c m 。这种仪器各种功能较强，并且配各 各种分选装置，可以满足各种研究的众多要求。但一般价格昂贵，操作调试较复 杂，一般多用子科研单位。 鞠l 懈 d k 妇m h 巧柚啊- ) k 哪印b t 时( 九田 厂、蝴，l o ( 卜口口 u f o r w a r ds 瞰晴 【k 目自嚏 图1 - 1 流式细胞仪结构图 f i 9 1 - 1t h e5 l l c t l l r eo f f c m f c m 原理上是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲 分光光度仪口】。流式细胞仪有细胞流动室和流速控制系统，激光器和光束成型装 置，荧光和散射光的接受和检测设备，信号处理装置构成。其主要原理如图卜l 所示：当染色细胞在恒速的载液携带下通过5 0 1 0 0 m n 的毛细管时，由于毛细管 的束缚，细胞只能排队，恒速依次通过激光束的椭圆聚焦区，荧光染色的细胞被 激发，荧光被收集棱镜汇聚后，通过一系列的分光棱镜，形成几种不同波长的单 色光，被不同的硅光二极管或光电倍增管接受后，经过计算机处理，就可得到细 胞体积、d n a 、r n a 等多方面的信息。信号的幅度和宽度只与细胞体积、d n a 和r n a 含量有关，同群体的细胞形状可能有区别，但是同一子群细胞的信号相 同，其荧光信号只随激光焦斑区中光强分布而变化，而不同子群的细胞信号不同。 流式细胞分析具有如下几个特点：1 ) 标本只要是单细胞即可用于分析，如 血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织只要经处理后制成单细胞悬 2 攀 门u 第一童绪论 液也能分析，因此，实际上所有组织细胞均可用于分析。2 ) 极短时间内可分析 大量细胞。3 ) 可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不 同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获 得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数等更为准确。4 ) 定性或定量分 析细胞，通过荧光染色对单细胞的某些成分如d n a 含量、抗原或受体表达量、 c a 2 + 浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。目前，临床流式细胞分析主 要应用在以下几个方面：1 ) 绝对细胞计数，2 ) 绝对定量分析，3 ) 多色荧光分析， 同时分析一个样品的多个特征，4 ) 细胞内成分分析，5 ) 液体中可溶性成分的流 式细胞分析，回流式分子表型分析弘j 。 1 1 2 绝对计数原理 流式细胞仪一般测量颗粒的五个参数：前向角散射光( f s c ) 、侧向角散射光 ( s s 回、绿色荧光( f l 一1 ) 、黄色荧光( f l 一2 ) 和红色荧光( f l - 3 ) 。f s c 和s s c 是激光 通过颗粒后的散射信号，f s c 反映颗粒的大小，s s c 反映颗粒的粒度，颗粒越大， f s c 越强；细胞内颗粒越多，颗粒结构越复杂，则s s c 越强。例如在外周血中， 粒细胞和淋巴细胞、单核细胞的结构不同，粒细胞内有较多的颗粒，细胞直径也 比淋巴细胞大，因而其f s c 和s s c 数值均比淋巴细胞强。f l 1 、f l 2 和f l 一3 分别表示颗粒发射的绿、黄、红三种颜色荧光，代表这三种荧光标记的细胞参数。 流式细胞仪通过测量这些参数对细胞进行分类计数和统计分析，并可同时测出细 胞群体中各细胞亚群的比例及其各项指标的大小陟w j 。 流式细胞仪在进行绝对细胞计数、绝对定量分析时，需要利用已知数量的微 球作为内参，得到细胞的绝对数量，例如c d 4 + t 淋巴细胞的绝对计数；其原理 是利用收集的微球数量和试管中所包含的全部微球数量之比得到实际收集的样 本( 血液) 体积，使用参考微球的荧光强度值来定位淋巴细胞群的荧光强度，确 立淋巴细胞群的位置、计数，再结合检测过程中收集到的细胞数量，计算出样品 中每i i l 含( 如：c d 4 、c d 8 、c d 3 阳性细胞) 细胞的绝对数值( 个微升) 以及 不同细胞间的比值，计算公式如下： 单位体积中的细胞绝对数= 型弓毳裂墨墨器篙丢凳券圣薹器1 卜1 ) c a r o lt s c h n i z l e i n - b i c k 等研究者【1 l 】使用b d 公司的三色绝对计数盒检测了 h i v 阳性成年人的c d 4 和c d 8 细胞的个数，对比了与二色检测试剂盒的区别， 同时进行了不同研究单位的相同和不同感染者的细胞检测结果对比，数据表明不 同检测结果差异较小，可重复性好。袁家颖等1 1z j 使用流式细胞术三色绝对计数了 传染性非典型肺炎( s 吣璐) 患者急性期和康复期t 淋巴细胞亚群的改变，数据表 第一章绪论 明急性期s a r s 患者的细胞免疫功能严重受损，早期患者的总t 细胞、t h 细胞 和t s 细胞的绝对计数值均明显减低，可作为s a r s 早期诊断的辅助指标；而康 复期患者总t 细胞、，n i 细胞和t s 细胞的百分率和绝对数值逐渐恢复正常。 1 2 绝对计数荧光微球 绝对计数微球是一种荧光微球( f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e ) 。在流式细胞分析 中，需要绝对计数微球作为检测的内参比物，要求计数微球粒度均匀，荧光强度 均匀，大小约在8 - 1 0 岬之间，太小则易和细胞碎片混淆无法分离，太大又容易 沉降，不方便使用；目前国内没有相应的产品，专利和研究论文也较少，多数只 停留在实验室研究阶段1 1 3 - 1 7 】。 1 2 1 荧光微球的载体材料 荧光微球的载体分为无机材料和有机材料两种；目前用于吸附抗体而特异性 地检测相应抗原的诊断试剂或试剂盒多为高分子微球，可吸附抗体、荧光素和其 他功能陛微粒，目前主要使用聚苯乙烯微球，其他材料，如二氧化硅、聚多糖类、 聚丙烯酸脂类、聚乙烯基吡啶等也有较多应用，尤其以聚丙烯酸脂类如聚丙烯酰 胺、聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 等近来应用较多。 1 2 1 1 无机材料 无机材料载体一般为二氧化硅，由于其有较大比表面积，拥有良好的吸附性， 易于表面修饰，晶体结构的可控性较好。n y n k eam w 五a e g h 等【l8 】合成了一种 单分散的胶体硅颗粒，有机硅核粒径大约1 0 0 r i m ，被荧光染料异氰酸脂罗丹 明( r 1 t c ) 标记后，核被包覆了一薄层硅，以阻止离子键引起的絮凝作用，硅 球通过物理吸附作用结合荧光素，且染料的存在并没有影响硅的包覆。m t r a u 和b j b a t t e r s b ) j 坶】通过吸附法和包埋法合成了以二氧化硅荧光微球，并使用 f c m 在每一步鉴定了合成的化合物，并将微球应用于高通量的药物分析。邓勇 辉等口0 】发明了一种具有核壳结构的磁性荧光双功能微球；首先以强酸和柠檬酸钠 对无机磁性纳米颗粒进行表面改洼，然后以正硅酸烷基酯作前驱体，采用凝胶 溶胶法制各具有核壳结构的二氧化硅磁性微球，最后通过正硅酸烷基酯与键合荧 光素的硅烷偶联剂共缩聚的方法制各具有磁性的二氧化硅荧光微球；该微球具有 磁响应性并且在紫外、可见光激发下即能发出荧光，粒径分布均匀，粒径小至 2 0 r i m 、大到2 0 0 - 4 0 0 r i m 均可控得到。高明远等【1 叫使用聚合物诱导相变的机理， 发明了一种荧光微球的制各方法，首先将热敏性聚合物微球与表面修饰有官能团 4 第一童绪论 的水溶性无机荧光纳米微粒进行复合；将所得复合物进行诱导相变后，分离得到 荧光微球；制得的荧光微球粒径均一，发光强度高，在水中分散稳定，大小在纳 米尺寸范围，适用于生物医学检测。 1 2 1 2 高分子材料 目前多数载体材料都基于高分子材料，常用的有p m m a 8 , 2 0 - 2 1 、p s 及其共 聚物等；高分子材料作为功能化微球的载体有许多优势，具有易加工、易成形等 优势，诸多的合成加工方式，很容易制各各种大小和形态的高分子载体微球，而 且可以根据不同需要对基体材料进行官能化处理，使其携带各种官能团，不仅可 以吸附各种功能分子，还可以对其化学键，增加结合的牢固程度，增加载体的适 用性。g i l l e sb o e m a 等【2 1 】合成了单分散的聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 胶体颗粒， 荧光染料通过一步简单的反应结合到高分子网络中。首先，他们合成了两种荧光 单体分子：r 1 t c ( 异氰酸脂罗丹名) r a s ( 氨基苯乙烯) ，和 4 - m e t h y l a m i n o e t h y l m e t h a c r y l a t e - 7 - n i t r o b e n z o - 2 - o x a - i ，3 - d i a z o l ( n b d - m a e m ) ，这 两种单体染料分别与甲基丙烯酸甲酯在氮气氛围，6 0 c 油浴中，磁力搅拌下聚合， 最后的混合物回流两个多小时，得到的微粒粒径是2 1 2 瑚 n 。d o n g l a iq i i z 副等使用 两步法蒸馏沉淀聚合法聚合法制各了核壳结构的交联的p s 微球，表面可键合各 种官能团，可携带一种荧光索咔唑，发出明亮的蓝色荧光。j i a n gi - i l 等b 纠使用一 种荧光二元酸c e 蹦, p 一( e a r b o x y e t h y l f o r m a m i d o ) b e n z o i ca c i d ) 与癸二酸或者 n - t r i m e n i t y l i m i d o g l y e i n e ( t m a g 妫熔融共缩聚合成了一种新型的荧光共聚酸酐， 共聚物用4 7 0 r i m 的可见光激发时，发出绿色( 5 2 0 h m ) 荧光；共聚物被制成球形， 能在荧光显微镜下被观察到，可用于观测药物传递过程。崔亚丽等【1 4 】等发明了一 种磁性荧光微球和使用该磁性荧光微球进行生物分子检测的方法；在合成高分子 微球时引入磁性纳米粒子，同时掺入荧光染料，制得磁性荧光微球，并能被流式 细胞计数仪识别分析。磁性荧光微球表面可结合各种生物分子，这些生物分子与 样品中相应的靶物分子反应，以荧光标记的测定底物等作为检测生物学反应的报 告基团，通过荧光信号的测定值对靶物分子进行定性和定量分析；应用这种磁性 荧光微球，既能快速分离和纯化反应物，又能同时对待检样品的多个靶分子进行 检测。 1 2 2 荧光染料 常用的荧光染料有无机荧光染料和有机荧光染料两种；有机染料众多，根据 用途不同，分为蛋白染料、核酸染料等，蛋白染料如异硫氰酸荧光素( 、考 马斯亮蓝等，核酸染料如溴化乙锭( e b ) ，碘化丙啶( p i ) ，吖啶橙( a 0 ) 、罗丹 第一章绪论 明等；吖啶橙( a o ) 、罗丹明的结构式如图l 2 所示，其分子中的宫能团是n 官 能团，主要用于核酸染色。而无机荧光素多为天然无机矿物染料；近来量子点的 发光机理也引起人们的注意。x l a o h ug a o 等2 4 1 用半导体表面活性剂包覆的量子 点标记了中孔聚苯乙烯微球，这种多孔微球具有更高的荧光亮度和均匀度，这是 由于这些小的孔道为量子点的固定提供了更多 ( c h 3 ) 2nn ( c h 3 ) 2 (a)(” 圈1 2 荧光索的分子结构式( a ) 吖啶橙 罗丹明1 0 1 f i g1 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r e ( a ) a c r i d i n eo r a n g e 嘞r h o d a m i n e10 1 1 2 3 目前的荧光微球产品 目前国内市场没有国产荧光微球的产品，产品均为国外进口，流式细胞分析 常用的荧光微球多数来自i n t e r r a c i a ld y i l a m i c 8c o r p o r a t i o n ( i d c ) ，b a n g s l a b o r a t o r i e s 等公司，其他国外公司如b d 、c o u l t e r 等也有荧光微球计数产品在卖， 华盛顿大学的f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r er e s o u r c ec e n t e r 也在研究荧光微球，国内 晶美公司主要代理b a n g sl a b o r a t o r i e s 公司的产品；我国各级医院及各省市疾病 控制中心所用试剂均为进口。 1 3 荧光微球的制备方法 目前多官能团、高度单分散高聚物微球的研究受到人们关注，并取得诸多的 成果，开发出一系列不同分子量、不同结构、不同表面特性及吸附能力的大粒径 单分散微球。粒径单分散高分子微球因其粒径均一、比表面积大、吸附能力强、 不易沉降以及表面反应能力等特异性能，作为功能高分子材料，在标准计量、流 式细胞分子、生物化学、免疫医学、分析化学、化学工业、情报信息、微电子领 域、液晶电视等一些高新技术领域有着广泛的应用 2 5 - 2 9 3 1 4 1 4 3 4 。 荧光微球可由两种方法制各，其一是加工成型法，即首先合成聚合物基体， 再进行后期加工处理形成聚合物微球，然后染色得到荧光微球；也可在加工处理 形成微球过程中同时染色，可减少反应步骤，提高染色效率。其二是聚合成型法， 6 第一童绪论 即将单体和功能单体引发聚合的同时形成高分子微球，对微球洗涤活化处理后， 溶胀吸附荧光素，得到荧光微球，若同时吸附别的官能分子，即可得到多官能化 高分子微球；也可首先将荧光基团化学键合在高分子单体上，然后与其他单体共 聚，直接得到荧光微球。加工成型法优点是工艺过程简单，聚合物基体很容易合 成或购买，在加工过程中可选择适当的工艺过程避免荧光素失活；由于聚合中的 高温、引发剂分解等因素，如果在聚合中同时染色，则易使荧光素失活，最终微 球的荧光强度不高，聚合成球后再染色，则可避免在制各过程中的荧光素失活的 问题，工艺分步进行，染色效率较高，相比较而言更适合制各高亮的荧光微球。 1 3 1 加工成型法 聚合物微球的加工成型方法主要有相分离法、液中干燥法、喷雾干燥法等， 现分述如下。 1 3 1 1 相分离法 相分离法通过改变体系的物理状态成球，高分子材料如明胶或壳聚糖，可加 入凝聚剂( 降低溶解度或者改变p h 值) 使之凝聚成高粘度、半流动的凝胶；凝 聚过程是可逆的，一旦恢复到凝聚前的条件，就发生解凝聚过程而使微粒消失； 因此在制各时可利用这种可逆性，反复凝聚直至得到满意的微粒后，然后加入固 化剂或者交联剂固化定型。在用单凝聚法或复凝聚法达到符合要求的微粒之前， 有时还需使用升高温度、加水稀释、加入助剂等方法以提高凝聚物的亲水性和界 面张力，降低凝聚物的粘度，改变聚合物在连续相中分子伸展状态，可减少微粒 间的粘连，使其形状满意后再固化。 使用溶剂一非溶剂相分离法制各微球的方法是在聚合物溶液中加入一种对 材料不溶的溶剂( 非溶剂) ，引起相分离成球，同时包裹体系中的药物成囊或成 球。药物可以是固体或液体，但必须不能被溶剂和非溶剂溶解，更不能起化学反 应：使用疏水材料时，可将材料先用有机溶剂溶解，如是疏水性药物，可直接将 药物加入材料溶液中；如果药物是亲水的，不溶子有机溶剂，可悬浮药物在材料 溶液中；然后加入吸收有机溶剂的非溶剂使材料溶解度降低，从溶液中分离，形 成微球，过滤洗涤后除去有机溶剂即得到微球。这种方法常用于聚合物的提纯分 离，因此要仔细设计反应条件，使凝结物以球的形式存在，而不是凝结成团的形 式存在。 1 3 1 2 液中干燥法 将聚合物溶解在一个连续相a 中，然后将相a 均匀的分散在不混溶的相b 中， 7 第一童绪论 接着将相a 挥发以制各微球的方法称为液中干燥法，亦称溶剂挥发法。液中干燥 法的干燥工艺包括两个基本过程：溶剂萃取过程( 两液相之间) 和溶剂蒸发过程 ( 液相和气相之间) 。按操作方式的不同，可分为连续干燥法、间歇干燥法和复 乳法，复乳法包括w o w 型和o w o 型复乳。包德才等【2 5 】使用一种特殊的 s h i r a s up o r o u sg l a s s ( s p g ) 膜，将分散相在外加压力的作用下，压入连续相中形 成乳状液，通过控制分散压力和膜孔径，从而实现乳状液滴的单分散性；然后采 用液中干燥法挥发掉溶剂，制各出微米级( 2 2 0 r m a ) 、粒径可控的单分散p s 徽球。 工艺条件决定液中干燥法制各微粒的形貌和分布，下面简单探讨一下制各 o w 型乳状液的工艺影响因素。 1 挥发性溶剂 溶剂一般应在水中微溶，且沸点不应高于1 0 0 ，常用的溶剂有二氯甲烷、 三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、四氢呋喃和乙醚等。h e n m a n nj 等【2 6 】 研究了奎尼丁及其硫酸盐的p ( d l ) l a 微球，分别使用c h 2 c h 、苯及c h c h 三种 溶剂都可得到微球，但c h 2 c 1 2 所得微球载药量较大，苯和c h c l 3 的药物几乎都 全进了水相，主要原因是其在水中的溶解度太小，被水萃取缓慢，进而影响挥发 速度，微球不易成型。在液中干燥法中，聚合物析出速度对微球的形貌具有决定 作用，在难溶、难挥发溶剂中加入易溶于水的丙酮、甲醇或酒精等作共溶剂，可 改善复合溶剂的性能，提高载药率。 2 乳化剂 乳化剂是一类能使互不相溶的液体形成稳定乳状液的有机化合物。它们都是 具有表面活性的物质，能降低液体间的界面张力，使互不相溶的液体易于乳化， 维持o w 型乳状液的稳定性。乳化时，分散相是以很小的液珠形式( 直径在o 1 微米至几十微米之间) 均匀地分布在连续相中，乳化剂在这些液珠的表面上形成 薄膜或双电层，以阻止相互凝聚，保持乳状液的稳定。乳状液是一个非均相体系， 最常见的是以水为连续相，以不溶于水的有机液体为分散相的水包油型乳状液， 也有以水为分散相，以不溶于水的有机液体为连续相的油包水乳状液。要配制稳 定的乳状液，可以加入单一组分的乳化剂，也可同时加入几种乳化剂；乳化剂的 选择和用量对于微球的大小和形状相当重要，一般来说，乳化剂浓度对于微球大 小的影响是十分明显的：提高乳化剂浓度，会使微球粒径变小， 乳化剂分子中有亲水和亲油两个部分，据亲水部分的特性，可分以下几类： 1 ) 负离子型乳化剂。即在水中电离生成带有烷基或芳基的负离子亲水基团 的乳化剂，如羧酸盐、硫酸盐和磺酸盐等。这类乳化剂最常用的商品有：肥皂 ( c 3 0 1 7 h 3 1 3 7 c o o n a ) 、硬脂酸钠盐( c 1 7 h 3 5 c o o n a ) 、十二烷基硫酸钠盐 ( c 1 2 h 2 5 0 s 0 3 n a ) 和十二烷基苯磺酸钙盐等。负离子型乳化剂要求在碱性或中 8 第一童绪论 性条件下使用。使用多种乳化剂配制乳液时，负离子型乳化剂可混合使用，也可 与非离子型乳化剂混配使用。负离子型和正离子型乳化剂不能同时使用在一个乳 状液中，混合使用会破坏乳状液的稳定性。 2 ) 正离子型乳化剂。其是在水中电离生成带有烷基或芳基的正离子亲水基 团。这类乳化剂品种较少，都是胺的衍生物，例如n - 十二烷基二甲胺，可用于 聚合反应。 3 ) 非离子型乳化剂。其特点是在水中不电离，亲水部分是各种极性基团， 常见的有聚氧乙烯醚类和聚氧丙烯醚类；亲油部分( 烷基或芳基) 直接与氧乙烯醚 键结合。这类乳化剂典型产品有对辛基苯酚聚氧乙烯醚，非离子型乳化剂的聚醚 链上的氧原子可以与水产生氢键缔合，因而可以溶解在水中。它既可在酸性条件 下使用，也可在碱性条件下使用，而且乳化效果很好，广泛用于化工、纺织、农 药、石油和乳胶等生产。 乳化剂的乳化特性和许多功效通常是由其分子中亲水基的亲水性和亲油基 的憎水眭的相对强度所决定的。良好的乳化剂在它的亲水和疏水基之间必须有相 当的平衡，1 9 4 9 年格尔芬( g r i f f i n ) 首先提出了乳化剂的亲水亲油平衡 ( h y d r o p h i l i cl i p o p h l i cb a l a n c e ) 的概念，并用h l b 值表示乳化剂的亲水性。乳 化剂分子中同时有亲油、亲水两基团，整个分子亲水的倾向，取决于两类基团作 用的对比，是两者亲和力平衡后分子所表现的综合效果。规定亲油性为1 0 0 的 乳化剂，h l b 为0 ( 以石蜡为代表) ，亲水性1 0 0 , 4 者为2 0 ( 以油酸钾为代表) ， 其间分成2 0 等分，以此表示其亲水、亲油性的强弱，绝大部分食用乳化剂是非 离子表面活性剂，h l b 值0 2 0 ；离子型表面浯陛剂的i - i l b 值则为0 - 4 0 。因 此，凡h l b 值 1 1 0 的乳化剂则具有亲 水特征。 混合型乳化剂，h l b 值具有加和性。故两种或两种以上乳化剂混合使用时， 该混合乳化剂的h l b 值可按其组成的各个乳化剂的质量百分比求得： - l b , , = h l b , , a + h l b b b - 。 一 一 ( 1 2 ) 其中h l b 。, b 为乳化剂a 、b 混合后的h l b 值，h l b 。和h l b b 分别为a 和b 两种乳化剂的h l b 值，a 和b 分别为a 和b 在该混合乳化剂中的百分含量( 本 式仅适用于非离子型乳化剂) 。 常用的几种乳化剂有： 1 ) 山梨酵脂肪酸酯 山梨醇脂肪酸酯型乳化剂常称为司班，为山梨醇一失水及二失水物与脂肪酸 形成酯的混和物。常用的有：司班2 0 ( 山梨醇月桂酸酯) 、司班- 4 0 ( 山梨醇棕 9 第一章绪论 榈酸脂) 、司班- 5 0 ( 山梨醇硬脂酸脂) 和司班6 0 ( 山梨醇油酸脂) 等。司班型 乳化剂一般为琥珀色粘稠液体、浅黄色或棕黄色小珠状或片状蜡样固体，有特殊 气味，味柔和；可溶于有机溶剂，不溶于冷水，可分散子热水中；广泛用作乳化 剂、柔软剂、防静电剂、平滑剂、集束剂、分散剂、防雾剂、渗透剂、降失水剂 等。 2 ) 吐温型乳化剂 吐温型乳化剂( e m u l s i f y i n ga g e n t , t w e e n ) ，学名为聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪 酸酯。由斯盘型乳化剂分子中残余的羟基与氧化乙烯缩合而成。有吐温- 2 0 ( 聚 氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯) 、吐温- 5 0 ( 聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯) 和 吐温6 0 ( 聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯) 等；吐温型乳化剂溶子水，且易分散， 能与水杨酸、鞣酸、间苯二酚、百里酚等作用而失去乳化作用。吐温- 6 0 溶于水、 甲酵、乙醇、植物油，不溶于矿物油，常用作乳化剂、分散剂、润湿剂、稳定剂、 增溶剂，用于医药、化妆品、食品等工业。在聚氨酯泡沫塑料生产中用作稳定剂、 助发泡剂；在合成纤维中可作抗静电剂，还是化纤油剂的中间体；在感光材料和 电影胶片中作润湿剂及分散剂；还用作油田乳化剂、防蜡剂、稠油润湿降阻剂、 近井地带处理剂。吐温型乳化剂常与斯盘型乳化剂等共同使用，主要用在农药上， 也用于食品加工等行业。 3 ) 辛基酚聚氧乙烯醚 辛基酚聚氧乙烯醚是一种非离子型乳化剂，常用的有t r i t o nx - 1 0 0 等，拥有 良好的水溶性、卓越的洗涤效果、分散性，能形成o w 体系乳化剂。常用于造 纸和纺织工艺、油漆和涂料、金属加工液、农化助剂、油田化学品、水性蜡乳、 水性木器漆、水肚酚醛树脂等行业。 4 ) 十二烷基硫酸钠 十二烷基硫酸钠是一种阴离子表面活 生剂，分子式为c h 3 ( c h z ) n o s 0 3 n a ， 具有乳化、去垢、分散、湿润、起泡等作用，广泛用于医药，在药剂制造中广泛 用作乳化剂、去污剂、分散剂、润湿剂、起泡剂，用于制版剂、颗粒剂、胶囊剂、 乳膏剂、药物香波、皮肤清洁剂等。 一般单一的乳化剂很难满足悬浮分散要求，化学合成中常常将多种乳化剂共 用，表l 一1 列出了上述几种常用乳化剂的h l b 值。 3 药物性质 应用液中干燥法能将水溶性的药物包埋在微粒中p ，但是，由于水溶性药 物易在水相中富集或者结晶，因而药物的包封率往往不太理想，损失在水相中的 比例太大；影响药物包封率的因素包括单位质量的药物所用的溶解相的体积、在 实验条件下药物在水相中的溶解度、载体材料对药物的吸附能力等。 1 0 第一章绪论 表1 - l 部分乳化剂的h l b 值 t 曲l e1 1t h eh l bv a l u eo fe m u l s i f i e r s 乳化剂h l b 值 山梨醇单月桂酸脂( s 2 0 ) 山梨醇单油酸脂( s - 8 0 ) 聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸脂( 2 0 ) 聚氧乙烯山梨醇酐单油酸脂( t - 8 0 ) 辛基酚聚氧乙烯醚( t r i t o nx 1 0 0 ) 十二烷基硫酸钠( s l s ) 8 6 4 3 1 6 7 3 0 0 1 3 7 4 0 要降低药物在水相中的溶解量，可预先在水相中溶解药物( 甚至使其饱和) ： 可明显提高包封率，但对于价格高且溶解度大的药物，这种方法就变得非常昂贵。 逆向的方法，通过改变水相的构成来降低药物在水相中的溶解度，如丁卡因及地 布卡因等药物，溶解度随水溶液p h 值升高而降低，而p l a 微球的包封率却随水 相p h 值的升高而增大，从而提高包封率。不同的缓冲溶液( 即使溶液p h 值相 同) 对载药率也有不同影响。如奎尼丁硫酸盐的p l a 微球【西j ，都用0 0 5 t w e e n 8 0 作乳化剂，水相p h 值都为1 0 ，分别用硼酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液制各微球， 载药量分别为2 3 0 及1 4 8 ( 理论值为3 0 ) ；也可在水相中加入无机盐( 不 改变水相的p h 值) 来降低药物的溶解度。这几种方法对于价格昂贵的荧光素而 言，预溶在水相中很不经济，而且没有明显提高包封率；即使将分离了微球后含 有大量的荧光素的母液重复使用，也没增加包封率；而使用缓冲液或者无机盐又 容易使得药物失活，使用小分子有机物如蔗糖、葡萄糖等也严重影响了荧光素的 活性，因而最终微球的荧光亮度仍然很低：提高荧光素包封率的方法只能提高载 体材料的吸附能力。 1 3 1 3 喷雾干燥法 流化床喷雾干燥法将材料溶液从流化床的底板孔隙喷出，在达到收集点之前 已在流化室中挥发掉溶剂，完成干燥过程，如未干燥，则形成的微球易发生粘连； 喷口固定在流化室的中心，喷雾方式可采用向上喷