（生物医学工程专业论文）小粒野生稻可转化人工染色体文库的构建及筛选.pdf

国防科学技术大学研究生院学位论文 a b s t r a c t c o n s m 枷o no ft h et r a n s f o c m a t i o n a b l em t i f i c i a lc 1 1 r o m o s o m el i b r a r i e sh a sb e e n s i g n i f i c a n t l yi m p r o v e da n da d v a n c e dt e c h n i c a l l ys i n c et h ey a c a n dp a cs y s t e m sw e r e e s t a b l i s h e d l a r g eg e n o m i cd n af i a g m e n t sc l o n e di nt a cv e c t o r sc a nb em a i n t a i n e d s t a b l yi nb o t he s c k r i c h 8c o l ia n da g r o b a c t e r i u mt u m e f a d e n s , a n dt r a n s f e r r e de f f i c i e n t l y i n t oh o s tg e n o m e s ，f a i t h f u l l yt r a n s m i t t e dt ot r a n s g e n i cp m g e n y o n c eag e n o m el i b r a r yo f p l a n ti nt h et a cv c g t o ri se s t a b l i s h e d , t h et a r g e tc a nb ec l o n e db ys c r e e n i n gt h el i b r a r y , a n dt h el i b r a r ys h o u l db ea p p l i c a b l ei np o s i t i o n a lc l o n i n g t h e s et a cc l o n e sa r ca v a i l a b l e f o rd i r e c ti n t r o d u c t i o ni n t o p l a n t sw i t ha g r o b a c t e r i u mt r a n s f o r m a t i o ns y s t e ma n d c o n d u c t e df u n c t i o n a le x p e r i m e n ti nr e v e r t a n tm u t a n t s ，s oa st oa c c e l e r a t et h ep r o c e s s i o no f m o l e c u l a rb r e e d i n g o r y z a m i r a t t a ( 4 n = 4 3 ，b b c c ) d c r i v e sf r o ma s i a ri saw i l dr i c ew i t hk i n d so f r e s i s t a n c e sa n daf m em a t e r i a lf o rt h ei m p r o v e m e n to f o s a t i v a b yn o wt a k i n go m i n u t a a sm a t e r i a lt ot h eo s a t i v ai m p r o v e m e n t , r e s e a r c h e r sh a sg e tf i l er i c ep l a n t sw h i c hh a v e r e s i s t e n c 2 st ol l l eb l a n d 、b bd i s e a s e s 。 t h i sr e s e a r c hh a sr e f e r r e dt ot h ep r e d e c e s s o ri nt a c ，b i b a ca n di nt h eb a cm e t h o d , e s t a b l i s h e da l lo w ns e tt ob ep o s s i b l et ot r a n s f o r mt h eb i gf r a g m e n tl i b r a r yt oc o n s t r u c tt h e t e c h n i c a ls y s t e m i n c l u d i n gt h ec a r r i e rp r e p a r a t i o n , m a c r o m o l e c u l a rw e i g h td n aw i t h d r a w , t h ee n z y m ec u t st h ec o n d i t i o nt h ed e t e r m i n a t i o n , t h ef r a g m e n ts i z ec h o i c e ，t h eg o a lb i g f r a g m e n tr e c y c l i n g t h ec o n n e c t i o na n dt h et r a n s f o r m e ds y s t e m , f i n a l l yo b t a i n e dh a s n e e d e dt h es i z et h ei n s e r t i o nf r a g m e n t , t h er e o r g a n i z a t i o nr a t eh i g ht a c l i b r a r yc o n s t r u c t s t h es y s t e m w ed e s i g np r o b ea c c o r d i n gt ot h es e q u e n c e so f c l o n e dr e s i s t a n c eg e n e u s i n gt h et a cl i b r a r yw h i c he s t a b l i s h e sc o n s t r u c t st h es y s t e m ，t a k ep y l t a c 2 7a s t h ec a l - t i e r , c o n s t r u c t st h eo m i n u t at a ch b r a r y ，t h ec h o i c ew i l dr i c ey o u n gt e n d e rl e a f b l a d e ，w i t h d r a w sm a c r o m o l e c u l a rw e i g h td n a ，c h o o s e st h ea p p r o p r i a t ee 1 1 z y m eq u a n t i t y ， s e l e c t sa b o u t5 0 1 0 0k bt h es c o p ef r a g m e n t s of a rw eh a v eo b t a i n e d70 0 0r e c o m b i n a n t c l o n e s w es e l e c tr a n o m d l y3 6c l o n e sa n de x t r a c t sr e c o m b i n a n tp l a s r n i dt h r o u g ha l k a l i n e l y s i s t h er e s u l to fp f g ei n d i c a t e st h ec l o n er e o r g a n i z a t i o nr a t ei s9 7 3 a v e r a g e s i n s e r t i o n sf i a g m c n ti s4 5k b t h et e s to f s t a b l et ot h el i b r a r y , f i n a l l yt h er e s u l t si n d i c a t e st h e o m i n u t ag e n o m ec a ns t a b i l i z ei np y l t a c 2 7 w i mt h ec o l o n yh y b r i d i z a t i o nm e t h o d t h e g e n o m el i b r a r yw a ss c r e e n e da n dt w oc a n d i d a t ec l o n e sw 哪o b t a i n e d t h er e s u l to fp c r t e s ts h o w st h a tt h e s ec l o n e sh a v et h es 剐f n ec o n s e r v e dp o s i t i o n sa st h ec l o n e dr c s i s t e n c 2 g c n c k e yw o s ：t r a n s f o r m a t i o n - c o m p e t e n ta 嘶c i a lc h r o m o s o m e ，g e n o m i cl i b r a r y o r y z a m i n u t a 第n 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 表1 1 五种t a c 载体的比较 表1 2 主要作物的t a c 文库 表3 1 连接测试结果 表3 2 阳性克隆分析 表目录 1 0 1 2 2 7 表3 3 插入片段大小。 3 0 3 1 第页 国防科学技术大学研究生院学位论文 图目录 图1 1b m a c 2 的物理图谱9 图1 2p y l t a c 7 的物理图谱1 1 图1 3p y l t a c l 7 的物理图谱l l 图1 4p y l t a c 2 7 的物理图谱。1 l 图1 5p y l t a c 7 4 h 的物理图谱1 2 图3 1p y l t a c 2 7 的限制性酶切分析。2 5 图3 2 限制性酶切区分p y l t a c 2 7p y l t a c l 7 2 6 图3 3p y l t a c 2 7 的浓度。2 6 图3 4 p y l t a c 2 7 去磷酸化的浓度2 7 图3 5 小粒野生稻基因组d n a 质量检测2 8 图3 6 脉冲电泳分析部分酶切图2 8 图3 7 大片段的第一次分离一2 9 图3 8 大片段的第二次分离。2 9 图3 9 回收的大片段浓度的测定。3 0 图3 1 0 文库的限制性酶切分析3 1 图3 11 第0 代和第1 0 0 代质粒酶切图3 2 图3 1 2 穿梭前后质粒酶切图。3 2 图3 1 3 膜杂交结果。3 3 第v 页 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表和撰写过的研究成果，也不包含为获得国防科学技术大学或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材科与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意 学位论文题目：蚓缕丝堑亟丝出睦趔净弛煎蝉 学位论文作者签名：骂 雄 日期：弘口年，1 月哕目 学位论文版权使用授权书 本人完全了解国防科学技术大学有关保留，使用学位论文的规定本人授权国 防科学技术大学可以保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允 许论文被查阅和借阅；可以梅学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位论文 ( 保密学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文题目 学位论文作者 作者指导教师 国防科学技术大学研究生院学位论文 第一章文献综述 1 1 野生稻重要基因的挖掘与利用 1 1 1 野生稻蕴含的丰富的有利基因是水稻育种的未来 野生稻是栽培稻的近缘种，已鉴定的稻属( o r y z a 上) 野生种有2 5 个以上i “，它们含 有l o 种基因组，构成1 0 种染色体组型( 从，b b ，b b c c ，c c ，c c d d ，e e ，f f ，g g ，h h j j , r - m k k ) 。野生稻由于长期处于野生状况，靠自然繁殖生长，经受了各种自然灾害和 逆境的选择，由此形成了对各种生物因子( 如病虫害) 和非生物因子( 如干旱、酸性 土壤、寒冷等) 的抗性和耐性，保存有栽培稻少有或没有的有利性状。如抗病、抗虫、 耐寒、耐旱、耐盐碱、耐淹、耐荫以及高产、优质、雄性不育、磷钾高效利用等。从 野生稻鉴定出来的特异性状达几十种。万年前古人类就开始将野生稻逐步培育成现代 栽培稻，当时看似无用的基因也在不断的选育中逐步丧失。可是这些看似无用的基因 正是解决当前水稻生产的宝藏。野生稻中蕴藏有栽培稻所没有的重要基因和丰富的遗 传多样性，是进行重要基因克隆、并开展功能基因组学研究的理想材料对于几十种 重要的水稻病虫害，在野生稻中均可找到理想的抗源。新的研究结果表明：农艺产量 性状很差的野生种可以作为作物育种中重要农艺和产量性状的基因供体。应用现代遗 传学手段，已经鉴定出了野生稻中一些与产量有关的数量性状位点，发现野生稻中的 基因能明显提高水稻的杂种优势口】。由于水稻的现代育种操作方式与片面推广单一优 良品种而发生的遗传侵蚀造成大量基因的流失，导致栽培稻的遗传基础日益狭窄。由 于野生稻资源的优势及迎接水稻生产所面临的各种挑战的需要，国内外科学家都十分 重视野生稻基因的发掘和利用，希望从野生稻资源中发掘鉴定和分离具有重要经济价 值和生物学意义的基因，培育出创新性的育种材料和产量高、品质好、抗性强、适应 性广的栽培品种。 现代水稻遗传育种研究的许多重大成果和进步都是与野生稻基因的发掘和利用 联系在一起的。例如，被称为第二次绿色革命的杂交水稻，其成功的关键是我国科学 家发现并转育了野生稻的细胞质雄性不育基因【3 】；一度在菲律宾等东南亚国家严重发 生的东格鲁病( t u n g r o ) i 扫- t 在i r 2 4 及以后品种中导入了野生稻的抗病基因而得以克 t l a t 4 3 ；对自叶枯病具有广谱抗性的基因x a 2 1 是水稻中应用图位克隆法( m a p - b a s e d c l o n i n g ) 克隆出来的第一个抗病基因，其来源也是野生稻嘲。 1 1 2 现有的野生稻利用技术存在诸多局限 尽管人们充分认识到野生稻的重要性，收集保存了大量的野生稻资源，并进行了 第l 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 系统的特性鉴定和评价，然而，将野生稻应用于栽培稻改良是一个耗时、费力，而且 常常毫无结果的过程。常规育种技术在野生稻的利用中存在着局限性。对于从染色 体组野生稻，栽培稻与之可交配力较高，f l 的减数分裂基本正常，直接用常规杂交 和回交技术便可实现目标基因的转移而对于非从染色体组野生稻，由于与栽培稻 杂种的染色体间不能正常配对，会遇到杂交不实、杂种不育以及遗传重组率低等生殖 障碍和连锁累赘、后代选择效率低等问题，杂交转育后代长期疯狂分离，稳定慢，并 且育种周期长 6 1 。目前主要通过胚胎抢救、离体授粉技术、组织培养、原生质体融合 等技术来实现目标基因的转移。但是仍然存在以下困难：( 1 ) 原生质体融合等方法对某 些基因型的野生稻存在难度，同时也不能避免后代的疯狂分离：( 2 ) 野生稻有利基因难 以简便、快速在多个栽培稻品种中导入、重现，这主要是由于采用杂交转育而不是转 基因技术；( 3 ) 控制转移性状的基因难以跟踪，易造成选育后代目标性状的丧失。常规 基因克隆技术不适合于野生稻有利基因的发掘利用。目前，植物基因克隆技术基本有 以下几种【7 】：( 1 ) 序列克隆：根据己知基因的序列克隆植物基因的方法，利用此方法 己经克隆到豌豆外源凝集素基因，酵母超氧化物歧化酶基因、水稻富硫1 0 k d 醇溶 蛋白基因；国表达产物克隆：根据植物基因表达的产物r n a 和蛋白质克隆基因，许 多种于贮藏蛋白基因、激素或环境胁迫诱导表达基阻；( 3 ) 表型差异克隆：根据植物表 型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因，包括转座子标签和t - d n a 标签技术以及“鸟枪”克隆；( 4 ) 定位克隆：根据连锁图谱定位基因并克隆植物基因， 番茄对丁香假单胞菌的抗性基因p 细基因，拟南芥的抗细菌病基因r s p z 基因，水稻 的抗白叶枯病的基因肠2 基因；( 5 ) 测序克隆：通过测定d n a 的序列克隆基因。现 在广泛应用的是转座子标签和t - d n a 标签技术构建突变体库的克隆技术以及定位 克隆技术。野生稻基因组基础研究还刚起步，由于遗传杂合、多为多倍体等原因，都 尚未获得遗传图谱、物理图谱、序列图谱和表达图谱，对野生稻按照常规技术进行基 因克隆和功能基因组研究存在如下缺点：( 1 ) 由于野生稻遗传背景薄弱，大多没有建立 高密度的遗传图谱，因此，利用图位克隆技术分离基因有困难；( 2 ) 标签技术依赖于转 座子系统的建立、高效转基因技术体系的建立以及转基因突变体的筛选等，而野生稻 的组织培养再生体系多不完善，较栽培稻难度大，并且由于野生稻是天然的杂合体， 后代存在分离，也影响对突变体的筛选，因此，尚未见标签技术应用于野生稻进行基 因克隆；( 3 ) 由于目前对野生稻进行大规模的功能基因组研究尚未启动，上述基于表达 产物、序列分析等克隆策略都不适合野生稻功能基因的发掘。 可见，对野生稻有利基因资源的挖掘利用还多限于对从基因组野生稻采用杂交 转育的方式。因此，发掘野生稻基因宝库期待新的技术策略，来增强开发利用野生稻 的能力。 1 1 3 全基因组嵌入突变体库用于挖掘野生稻有利基因的策略 第2 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 曹孟良提出了全基因组嵌入突变体库的策略，用于挖掘野生稻的有利基因p j 全 基因组基因嵌入突变体库是将可转化大片段基因组文库 9 - “，利用转基因技术转化到 受体植物中而获得。它包括构建野生稻可转化大片段基因组文库，通过转基因技术， 将大片段克隆导入栽培稻中，在构建突变体库前也可根据保守序列、分子标记等对大 片段克隆进行筛选，同时，还可利用转化效率高的模式植物如拟南芥作为转化受体植 物，以便提高筛选效率和转化效率，减少工作量。通过田问筛选，鉴定抗虫、抗病等 农艺性状得到改善的突变体，并直接应用到育种中，筛选出的控制突变性状的大片段 克隆再经亚克隆、功能补偿分析和序列分析后，最终克隆控制突变性状的基因。这是 克隆植物基因的一种新的技术策略。 全基因组基因嵌入突变体库与其它基因克隆技术和野生稻转育利用技术相比具 有如下优点：( 1 ) 利用可转化大片段载体b m a c ，r a c ，减少主要鉴定的克隆数量；( 2 ) 筛选的含有野生稻有利基因的突变体可直接用于水稻育种改良，同时克隆控制突变性 状的野生稻有利基因，这种基因克隆技术具有操作简单、周期短的特点，在克隆基因 的同时，伴随着转基因水稻的培育，甚至在克隆到基因之前就已获得了转基因植物； ( 3 ) 筛选获得的有利基因由于来自野生稻，是栽培稻由于进化丢失的有利基因，可用于 拓宽栽培稻的遗传基础，使现有栽培稻品种得到整体升级改良；“) 开展大规模的野生 稻功能基因组研究，发掘野生稻有利基因资源，对我国的基因资源进行抢滩圈地，开 创野生稻的基因产业；( 5 ) 不像野生稻转育利用由于杂交亲和性存在种间差异，导致多 数野生稻种的转育不易成功，这一基因嵌入突变体库技术适用于野生稻的所有种。 1 2 植物基因克隆技术的发展 基因的克隆就是利用d n a 体外重组技术，将特定的基因从染色体上分离出来， 插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整序 列，确定该基因在染色体上的位置，进一步研究该基因的生化功能，明确其对特定形 状的遗传控制关系。由于植物的基因组非常巨大，在遗传背景不是很清楚的情况下， 要从庞大的基因群体中分离出目的基因不是一件容易的事。近年来，由于生物化学、 酶学、分子遗传等学科的迅速发展，我国的生物技术有了较大的进步，为基因的分离 奠定了良好的基础，并提供了有效的手段【1 ”。由于多种植物高密度分子标记、连锁图 谱的构建、大片段d n a 克隆系统的建立、序列测定技术和基因遗传转化技术的发展， 使许多未知基因的克隆都将成为可能。 1 2 1p c r 扩增克隆 p c r 扩增克隆是一种在已知植物基因序列的基础上进行基因序列克隆的方法。 堡塑里堑塑茎垦壁型鱼壁二型呈! 塑：丛堕塑主堡窒型垒堂堑呈堡芏塑：签亘翌芷塑 第3 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 的片段进行纯化并连接到合适的载体上，酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知 的基因序列进行比较鉴定。如小麦上的s s l l a 基因序列【1 1 1 ；玉米上的富含甲硫氨酸的 蛋白及编码基因；王立广等克隆的水稻l o k b 醇溶蛋白基因【”。 1 2 2 表型基因克隆法 1 9 9 5 年j o n s s o n 和w e i s s m a n 提出表型克隆概”】，有些植物目前既不了解它的 基因产物，也没有对它们进行基因定位，但已知植物在表型上存在差异，利用表型差异 或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。s a n 等用表型差异从 拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因。表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因 表达的特征联系起来，从而分离特定表型相关基因，力求不必事先知道基因南芥中克隆 出赤霉素合成酶基因【l4 】。表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特征 联系起表从而分离特定表型相关基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位， 根据基因的表达效应就直接分离该基因【l 习。 1 2 3 转座子标签法和t - d n a 标签技术法( t - d n at a g g i n g ) 转座子标签技术是利用转座子来克隆基因的技术，其显著特点是可以分离预先不 清楚表达产物的基因。基本原理是当转座子插入到植物基因组某个基因或者基因的l 临 近位点时，会破坏该基因的结构，引起基因突变使植物表型发生交易，因此可以用转 座子作为探针从被标记的突变体植物的基因文库中，克隆突变的基因，然后再利用突 变基因作为探针从野生型植物中克隆出野生型基因。如玉米中抗圆斑病菌的h m l 基 因【1 6 1 、烟草抗花叶病毒基因【1 7 1 、番茄抗叶霉素病基因e 1 8 】、亚麻抗锈病基因工6 【怫捌 等。但是转座子标签技术在植物中已多拷贝状态存在，给突变基因的检出造成一定的 困难口n 。 1 2 4 鸟枪克隆法( s h o t g u nc l o n i n g ) 该方法是随机切割供体基因组d n a ，再转化到受体基因组中，根据对转化子的 表型鉴定，然后找出所需克隆的基因，鸟枪克隆战略成功地应用于分离细菌的无毒基 因。s t a s k a w i c a b j 等利用这一策略，从大豆病原菌p s e u d o m o n a s s y r i n g a e l w g l y c i n e a 中克隆到它的无毒基因。 1 2 5m r n a 差异显示技术 m r n a 差异显示技术最早是由p e n gl i a n g 等发展起来的一种克隆哺乳动物正常 细胞和病变细胞之间差异表达基因的p c r 法。基本原理是：所有的m r n a 都有p o l y a 第4 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 尾，其尾前的两个碱基1 2 种组合，与之对应1 、2 合成一组寡核苷酸，同时附加a c , - c 三种核苷酸的任意两种，即可以作为m r n a 锚定引物通过反转录酶合成c d n a 的第 一条链，以此链为模板，以m r n a 锚定引物为3 味端引物，一组随意1 0 寡聚核苷酸 作为另一端引物进行p c r 扩增，由于引物可以随机结合到c d n a 上，因而来自不同 m r n a 扩增产物的大小不同，在p c r 反应中加入同位素标记的核苷酸，电泳后经x 光片曝光，可以发现有差异的m r n a 片段，经n o r t h e r n 杂交确认后，回收差异片段 的e d n a 再经扩增后克隆，或者利用它作为探针从e d n a 库或基因文库中，筛选到 全长的c d n a 或基因。 m r n a 差异显示( 嗍p c r ) 是目前筛选差异表达基因最有效的方法。自1 9 9 2 年l i a n g 和p a r d e e 建立技术以来瞄l ，5 端随机引物、3 端锚定引物的设计及循环参数 的调整都有了较大改进，其主要目的是减少假阳性，增强可重复性与敏感性目前该 技术已被用来分离与研究水稻的抗盐基因、草莓成熟基因、水稻蔗糖调节基因、水稻 赤霉病菌诱导基因、小麦热激蛋白基因、水稻稻瘟病菌诱导基因等l 。 1 2 6 定位克隆 定位克隆技术是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，目标 基因精确定位在染色体特定位置后，用目标基因两侧紧密连锁的标记筛选含有大片段 插入的基因组文库( 如b a c 和y a c ) ，通过染色体步行筛选到含有目标基因的克隆， 最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证定位克隆技术依赖于高密度的分子标记 图谱。如水稻已有22 7 5 个分子标记的图谱，覆盖基因组的15 2 1 6e m 。物理图谱的 构建也是定位克隆技术的一个至关重要的环节，目前利用稀有切点内切酶结合p f g e 技术已经成功用于植物基因组的大规模物理作图，从而可以确定连锁标记与目标基因 间实际物理距离的大小。定位克隆的另一个关键是寻找与目标基因紧密连锁的分子标 记，b s a 分析( b u l ks e g r e g a n ta n a l y s i s ) 是较快速有效的方法之一，高质量的基因 组文库也是成功的关键。到目前为止，利用定位克隆策略，发现了番茄抗霜霉病p r o 基因 2 4 1 、e , f 基因嘲、抗叶霉病基因c f _ 2 t 2 6 l 、抗枯萎病拉基因等旧；在拟南芥上的 r p s 2 2 s - 2 9 、r p m l o o 、抗霜霉病r p p 5 基因p 1 1 等；还有水稻中的x a 2 1 基因【5 】、x a l 基因 3 2 1 、水稻的p i - b 基因p ”、水稻控制谷粒硬度基因h a ，还有小麦的抗线虫基因 c r e 3 州、甜菜抗线虫基因h s l p r o - l t 3 5 1 q l 。但是定位克隆需要寻找与目标基因座位连 锁的遗传标记或部分功能信息，有时需连锁作图，较费时费力，而且在植物的基因组 中，大量存在的d n a 重复序列经常是染色体步移难以逾越的障碍。 1 2 7 同源序列克隆 生物的种、属之间编码基因的同源性高于非编码基因区的序列。此方法被应用的 第5 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 前提是其他种属中的同源序列被克隆，构建e d n a 文库或基因组文库，然后以已知的 基因组序列为探针来筛选目的克隆。关于同源序列的克隆抗性基因已有报道，抗性基 因及其家族具有同源性序列这一特点引起了国际上的高度重视。已被成功应用在莴苣 3 6 1 、马铃薯 3 7 i 、大豆p 嘲、水稻【4 0 - 4 ”、水稻的o a r l ，o s r 2 ，o s r 3 基因【4 2 】、小麦【4 4 4 1 等。 1 3 大片段文库研究进展 基因组文库是进行基因作图、定位、分离、克隆及基因组研究的基础和重要工具。 基因组文库的发展得益于脉冲场电泳技术，大片段d n a 制各技术和克隆载体技术的 发展自c o h e n 等( 1 9 7 3 ) 构建第一个质粒载体芦c l o l 作克隆载体以来，随着分子生 物学技术的发展，越来越多的克隆载体相继出现。基于克隆载体技术的进步，基因组 文库的发展经历了c o s m i d s 文库、y a c 文库和b i b a c t a c 文库 1 3 1 噬菌体文库 噬菌体是在构建基因组文库中最早使用的克隆载体，其插入片段为2 0 k b 左右， 虽然插入片段小，但开创性的工作为文库的发展奠定了基础。 1 3 2c o s m i d s 文库 c o s m i d s 文库l 是以柯丝质粒为载体构建文库，是一类有人工构建的含有 d n a 的g o s 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。能够容纳4 5 k b 的外源片段，这比 噬茵体载体的最大克隆能力都要强，所以e o s m i d s 系统已被广泛的应用于植物遗传 研究中。r o y a l 等首先确定了在c o s m i d 载体中克隆大片段的可能性。此后，e o s m i d 克隆用于构建果蝇、小鼠和人的基因组文库，并从数种生物中分离得到基因。不过由 于片段太小了，因此限制了应用。研究者们希望更大容量的载体，来减少克隆的数目 和工作量。 1 3 3 酵母人工染色体( y a c ) m u r r a y 等( 1 9 8 3 ) 构建了第一个酵母人工染色体。y a c 载体的突出特点是容载 能力大，如动物的y a c 文库平均插入长度达9 0 0 1 0 0 0k b 植物y a c 文库平均插入 片段一般为1 0 0 3 5 0k b ，其原因是植物细胞较大，有硬而厚的细胞壁，同时细胞内多糖 和d n a 水解酶类多，难以得到超大分子量的基因组d n a 。由于y a c 插入片段大，构 建基因组文库时，只需要较少的克隆数便可以覆盖整个基因组，使构建高等生物基因组 第6 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 遗传图谱和物理图谱成为可能，基因组计划得以顺利实施。虽然y a c 能容载较大的片 段，但是y a c 克隆的稳定性较差，操作也不方便，具有自身难以克服的缺点： ( 1 ) 存在嵌合现象( c h i m c d s m ) ，即一个y a c 克隆中的插入子可能来自两个或多个 不同的片段； ( 2 ) 嵌合体的比例达到1 0 5 0 ，这种现象使染色体步行( c h r o m o s o m ew a l k i n g ) 和基因分离难度加大； ( 3 ) y a c 克隆的稳定性差，插入片段存在重排和丢失现象，这对染色体物理图谱的 构建和基因分离都十分不利； ( 4 ) 插入片段的分离和纯化困难； ( 5 ) 转化效率低m 。 1 3 4 细菌人工染色体( b a c ) b a c 载体系统是在大肠杆菌f 因子的基础上发展而来的，f 因子具有稳定遗传的 特点，其复制是严谨型的，在每个细胞中仅有l 2 个拷贝，减小了插入片段发生重组的 机率，并且f 因子能够携带1m b 的外源片段。1 9 9 2 年，s h i z u y a 4 8 】等利用f 因子的o t i s ， r e p e 、p a r a 和p a r b 等与复制和调节拷贝数有关的基因，以氯霉素抗性基因为选择标 记，并利用电激穿孔转化大肠杆菌d h l 0 b ，构建了第一个细菌人工染色体载体 p b a c l 0 8 l ，它能够克隆约3 0 0k b 的外源片段。但是它只有转化选择标记而无重组子选 择标记，重组子的选择必需通过杂交进行验证。为了进一步方便b a c 克隆的筛选，将 l a c z 基因引入了p b a c l 0 8 l 的克隆位点中，构建了p b e l o b a c l l 载体，这样重组子可以 通过蓝白斑进行筛选，p b e l o b a c l l 载体是第二代b a c 载体的代表。b a c 载体 p l n d i g o b a c 源自p b c l o b a c l l ，由于l a c z 基因的3 末端的一个点突变，能够 p h d i g o b a c 载体产生比p b c l o b a c l l 更深的蓝色。m o z o 等【4 9 】将卡那霉素抗性基因插 入到p b e l o b a c l l 的氯霉素抗性基因的e c o r ，位点，构建了p b e l o b a c k a n 载体，使 p b c l o b a c k a n 具有了卡那霉素筛选标记。f r e n g e 等啪l 构建了p b a c e 3 1 6 载体，其多克 隆位点位于蔗糖致死基因s a c b 上，这样重组子可以在含有蔗糖的培养基上进行选择。 f u 等( 2 0 0 0 ) 在p b a c e 3 1 6 载体的基础上构建了多克隆位点为m uj r 和n o t ，的b a c 载体p n o b a c l , m u ，和n o t ，是甲基化敏感的内切酶，主要作用于低拷贝序列，使用 这种载体构建文库可以减少筛选相关基因所需的克隆数。 c h o i t s q 等将c r e p l o x p 特异位点重组系统引入b a c 载体p b e l o b a c l1 ，构建了 p b a c w i c h 载体，为基因克隆和鉴定提供了一种新载体。c r e p l o x p 特异位点重组系统 使外源基因可以插入到染色体特定的位点，可以在一定程度上消除由于外源基因随机 整合到染色体而引起的“位置效应”。c h o i 等以p b a c w i c h 载体构建了棉花的b a c 文库，用基因枪法使部分克隆转化烟草，并证明外源d n a 片段整合到染色体的特定位 第7 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 点上。b a c 载体的容载能力一般为1 0 0 3 5 0 k b ，虽然容量没有y a c 载体大但是b a c 具有更多优点：1 ) 以大肠杆菌为寄主，转化率高，构建b a c 文库比y a c 文库更容 易；2 ) b a c 载体以环型超螺旋状态存在，从大肠杆菌中提取质粒较方便，而从酵母中分 离d n a 较困难；3 ) b a c 的复制子来源于f 因子，可稳定遗传，嵌合及重组现象少：4 ) 可 以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便快捷；5 ) b a c 载体在克隆位点的两侧具有 刀和躅砸聚合酶启动予，可以用于转录获得r n a 探针或直接用于插入片段的末端测 序。 基于上述优越性，b a c 载体成为大片段基因组文库的主要载体，成为基因组测序 和基因组的遗传图谱和物理图谱构建的主要工具d 2 j 。但是y a c 、b a c 载体不能直接 进行植物转化，在候选克隆的转化互补实验中需要将外源片段进行亚克隆，因而工作量 大，同时也有漏失目的d n a 片段的可能因此可直接用于植物转化的大片段双元载 体使应运而笔具有代表性的载体系统有b i b a c 和t a c 。 1 3 5p l 克隆系统和源于p 1 的人工染色体( p a c ) 1 9 9 4 匀e , i o a n n o u 等郾j 创建了源于p l 的人工染色体( p a c ) 。p a c 载体以f 因子和噬 菌体p 1 为基础构建，兼有二者的特点，通过电激穿孔转化可将p a c 导入大肠杆菌。其 特点是插入的外源d n a 没有明显的嵌合和缺失现象。p a c 载体可以插入约3 0 0 k b 的 外源片j 瑟，可以稳定遗传及高效扩增。p a c 除具有许多b a c 载体的特征外，它的多克 隆位点位于蔗糖诱导型致死基因s a c b 上，通过加入蔗糖和抗生素的培养基筛选出来的 克隆都是含有插入片段的重组子。但是，p a c 载体自身片段较大( 约1 6k b ) ，构建文库没 有b a c 载体( 约7 8 k b ) 效率高。p a c 载体在基因分离和序列分析当中，可作为y a c 连续克隆群的重要补充，日本水稻基因组计划( r g p ) 把水稻的p a c 文库用于物理图谱 的构建 1 3 6 双元细菌人工染色体( b i b a c ) 1 9 9 6 年，h a m i l t o n 等驯结合b a c 载体和t i 质粒的特点。构建了双元b a c 载体 b i b a c 2 ，该载体在结构上具有b a c 的复制系统，又加入在农杆菌中起作用的砧复制 子和抗卡那霉索筛选标记及t - d n a 的左右边界，因此b i b a c 能在大肠杆菌和根癌农 杆菌中穿梭复制。h a m i l t o n 等唧】已用其将一段3 0 k b 的酵母d n a 和一段1 5 2 k b 的人 类基因组d n a 通过农杆菌介导成功地导入烟草核基因组，并证明能够稳定遗传。 b a n c r o f t 等瞄l 构建了p c l d 0 4 5 4 1 双元载体，在t - d n a 左右边界之间有一个d b s 多位 点接头，使重组子克隆产生更深的蓝色，这在低拷贝的双元载体中具有一定的优势。 第8 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 图1 1b i b a c 2 的物理图谱 f i g1 ip y h s i c a lm a po f b i b a c 2 1 4t a c 文库研究进展 1 4 1t a c 载体研究进展 华南农业大学的刘耀光等i ”】结合p a c 和双元载体的特点，构建了t a c 载体 p y l t a c 7 , t a c 载体具有p l 复制子和础质粒p r i a 4 复制子，能在大肠杆菌和农杆菌 中穿梭复制。p y l t a c 7 在其t - d n a 右边界处插入了植物选择标记潮霉素磷酸转移 酶基因( h p t ) 和p n o s 启动子。在t a c 载体中重组筛选标记是卡那霉素抗性基因和 s a c b 基因。l i u 等以p y l t a c 7 为载体构建了拟南芥的基因组文库，并把部分克隆通过 农杆菌介导转化拟南芥。获得了转化植株并能稳定遗传为了证明t a c 载体系统在图 位克隆中的可利用性，用与拟南芥重力感应基因s g r l 紧密连锁的标记筛选文库，构建了 s g r l 的跨叠克隆群，并把含有s g r l 基因的2 个t a c 克隆转化到s g r l 突变体中，使其恢 复了重力感应。 由于p n o s 启动子在单子叶植物中的启动能力较弱，l i u 等 s 6 1 对p y l t a c 7 进行了 改造，选用水稻肌动蛋白a c t ，强启动子，把植物选择标记基因 替换为b a r 基因，构建 了t a c 载体p y l t a c l 7 。b a r 基因编码对磷化麦黄酮( p p t ) 和双丙胺类( b i a l a p h o s ) 除 草剂的抗性，适合用作禾本科作物转化体的选择。l i u 等用p y l t a c l 7 载体构建了普通 六倍体小麦的基因组文库，对部分较大插入片段0 5 0 k b ) 克隆的遗传稳定性分析表明 t a c 也存在插入子重组现象。用b a r 基因作为筛选标记基因，在候选克隆的功能互补 转化实验中发现存在筛选困难假阳性率高，有基因型限青4 等问题。为了提高外源基因 的表达及利于筛选，针对不同的受体材料对t a c 载体进行改进，构建了载体 p y l t a c 2 7 ，并构建了水稻“明恢6 3 ”的基因组文库。该载体以a c ti 为启动子，枷 为筛选标记基因，该载体系统可以高效应用于单子叶植物的基因图位克隆及功能分 析。t a c 载体与b i b a c 载体一样具有克隆大片段d n a 和借助于农杆菌直接转化植 第9 页 国防科学技术大学研究生院学位论文 物的功能。t a c 和b i b a c 载体除具有b a c 载体的优点外还具有以下优越性：1 ) 具 有大肠杆菌和农杆菌的复制子，是一个穿梭质粒，在大肠杆菌和农杆菌中均保持稳定； 2 ) 可通过农杆菌介导直接进行基因功能互补实验。t a c 载体与b i b a c 载体相比，首 先大肠杆菌中的复制起点不同，t a c 源于p 1 噬菌体：而b i b a c 源于f 因子。其次，t a c 载体中具有p 1 裂解子o y t i cr e p l i c o n ) ，可以在i p t g 的诱导下产生5 2 0 个拷贝，提高 了质粒产量。目前已经构建了水稻n o 】、小麦【5 6 】、拟南芥网、大豆【铷、金鱼草d 9 1 等植 物的t a c 基因组文库，并从拟南芥中分 丑 j f i l a m e n t o u s f l o w e r 基因、k o r l 基因。 表1 1 五种t a c 载体的比较 t a b l ei it h ec o m p a r a t i o no f f i v et a cv e c t o t s c l o n i n gw e i g ho f v e e t o r p l a n ts e l e c a b l e r e p f i c o n s e l e c t i o nt h ev e c t o r s y s t e m m a r k e rg e n e s y s t e m s p n o s - h p tp l