（生物医学工程专业论文）金阵列电化学免疫传感器检测大肠杆菌的研究.pdf

塑垩查兰堡主塑笙奎 a b s t r a c t an o v e ie l c c h o c i l e 1 i c 矾i 瑚i m u n b i o s c n s o rw a sd e v e l o p c df o rr a p i dd e t cc t _ i o no f e j c 矗e ，耙a 缸j f0 1 5 7 ：h 7b a s c do ng o l de l e c 仃0 d e 拥y t h ej 衄o b i l i z a t i o no f 姐t i b o d i e s o n t ot h ee l e c t r o d e sw a sc a r r i c do u t b y a m 仰o l a y e f o f 1 6 一m e r c a p t o h e x a d e c a o i ca c i d ( m h d a ) ，a1 0 n g c h a i c a r b o x y l i ca c i d t e 咖i n a t c d a l k a i i e t l l i o l ，s e l f - a s s e m b l e do ng o l de l e c t r o d c s t h em o n 0 1 a y e rw a sa c t h a t c db y l - e t h y l 一3 - ( 3 一d i 1 c t h y l 锄i n o p m p y l ) c 矗b o d i i l i d e 饵d c ) a n dn - h y d r o x y s u c c i i l i m i d e ( n h s ) t og e n c r a t e as t a b l ca c y l 锄i oe s t e ri n t e 珊c d i a t e a n “b o d j e sw c f em e i 删o b i l i z e da f t e ra l n i n o l y s i so ft l i en h sa d d u c t j i kb i n d i n go ft a r g e tb a c t c r i ao n t o t h ci m m o b i l i z e d 蛆t i b o d i c sc h 卸g c dt h es u 血c ec h 缸a c t 翻s t i c so f9 0 l dc l e 咖d c s ， w l l i c hc a nb ed e t e c t e db yc l e c t l o c h c l n i c a lm e a s u r e m e n t s t h ee l e c t 眦h e m i c a li m p c d a n c cs p e c 仃0 s c o p y 姐dc y c l i cv o l t 黜e t r i cm e t h o d w e r ce m p l o y e da 舭rc a c hs t c po fs u r f a c em o d i f i c a t i o ni np h7 4p b sb u 施rc o n t a i n i n g ar e d o xp r o b co ff f e ( a 】3 * t h ee 五陆c to fs e l f - a s s e m b i e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) 姐d t l l cb a c t c f i a i a y e r s o nt h ee l c c 仃i ) c h e m i c a lp r c l p e n i c so ft h ee l e c t r o d e sw e r c q u a n t i t a t i v e l ya 1 1 a l y z e di nt c 珊so fc o n s t a n tp h a s ee l e m e n t ( c i _ 巳) 勰de l e c 昀nt r 柚s f c r r c s i s t a n c eu s i n gp r o p e fe q u i v a l c n tc 函：u i t nw 嬲d e m o n s 妇t c dt h a tt l l c s el a y e r sa c ta s b a r t i e r sf o rt h ed e c t 咖t r 柚s f e rb c t w e e nt h ec l a 。r o d es u r f 砬ea n dt h cr e d o xs d e c i e si n t h es 0 1 u t i o n ，r c s u l t i n gi nm o s ts i g n j f j c a n tj n c r e 够ei 丑m ee l e c 扛o nt r a s f e rr e s i s t 锄c c c o m p a r e dt oc p e t h ei m m u n o b i o s e 璐甜c o u l dd e t e c tt l l et a r g e tb a 曲 r i aw i t i ld e t e c t i o n 1 i m i to f2 ox1 0 c f u ，m 1 a1 m e a rr c s p o n s ei nt h ed e c t nt r 姐s f e rr e x 浙江大学硕士学位论文 图1 ，2r n a 生物传感器检测原理 器。经生物素修饰的纳米颗粒可与大肠杆菌s d n a 特异性的结合，从而高效的放 大s d n a 目标信号。通过对q c m 频率奁留测量，可得到较大的频移，实现对大肠 杆菌0 1 5 7 ：h 7 的低量检测2 6 7x1 0 2a 砌恤l 。该检测限比普通q c md n a 生物 传感器低了4 个数量级。 分子生物学方法方法特异、快速且灵敏度高。但该法技术要求高，并且由于 标记物的限制，商品化困难。p c r 等分子生物学技术需要专业的人员，知识和仪 器，不利于该项技术在广大基层医疗卫生机构的推广。 1 3 3 免疫学检测 免疫生物传感器是一种结合抗原抗体和物理或化学换能器的分析仪器，可以 有特异性的、定量的检溯给定外界环境下的特定化合物。最近的几十年里，免疫 生物传感器被广泛用来对样品进行敏感、快速和实时的检测。免疫生物传感器检 测手段可大致分为四类：1 ) 比色法；2 ) 视械的方法：3 ) 光学方法； x 浙江大学硕士学位论文 里面可包埋从荧光染色剂到电活化成分的各种不同标志物。由于脂质体外壳由化 学反应性元素构成，因此，可以结合多种表面标签，包括抗体、抗原。硫酵化的 抗体( 抗大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 ) 与阳标的脂质体结合，使标记染料( 硫罗丹明b ) 形 成胶囊。在毛细反应物的毛细管移动过程中，表面结合了免疫脂质体的大肠杆菌 在测量区被俘获。该测量区固定了抗大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的抗体。测量区颜色的深 度与样品中大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的数量成正比。血清纯培养分析得到的检测限约为 1 0 4c f l i m l o 这一分析法，不需要洗涤和温育步骤，可在8 分钟内完成。 ( 2 ) 机械学检测 机械学的检测方法可以分为两种模式：压力传感和质量传感。 压电免疫传感器以石英晶体微量天平( q c m ) 为信号转换元件。将抗原抗体 结合产生的质量变化转换成频率信号【1 3 t 1 4 1 。s u 等人 1 3 】将石英晶体两面镀金，经预 处理后在金电极上形成巯基自组装膜( s a m s ) 层，以固定抗体。通过检测石英 晶振的频率变化，可以得到目标大肠杆菌的浓度。用该方法检测大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 可在3 0 5 0m i n 内完成，检测范围为1 0 3 1 0 8c 兀j i l 。q c m 的检测过程加入到 流动型系统中( 图1 3 ) ，可加快检测速度【州。 图1 3 基于0 c m 分析的流动抗体传感器设备方框图。( a ) 缓冲液；( b ) 蠕动泵；( c ) 注射器； ( d ) 流动室：( d 1 ) 压克力支持物；( d 2 ) o 环；( d 3 ) 石英晶体；( d ) 连接头；( c ) 废液池：( d 振荡电路；( g ) 石英晶振分析仪：( i ) 稳压器：( i ) p c 。 石英晶体也可以制成声表面波器件( s a w ) 。e h o w e 等人1 1 5 j 在实验中在加 入抗体前在传感器表面上覆盖细菌，附在s a w 器件表面细菌的浓度与特异地固定 于器件表面的抗体有关，因此也与由剂量决定的频率有关。用这种方法，大肠杆 菌可以在3 小时内获得下限为1 0 6c e l l s m l 的检测。此外，经改进后使用绵羊的i g g 作为阻抗剂，大肠杆菌的测量下限可达1 0 5c e l l s i n l 。这种表面波器件被制成双通 浙江大学硕士学位论文 道结构( 图1 4 ) ，一个通道用作传感通道，另一个用作参考通道。每个通道连接 发射和接受m t s 以及它们之间空隙。一般来说，传感通道上的质量变化通过检测 频差( 在1 0k 比数量级上) 来确定。对于一个给定浓度的细菌，与s a w 传感器表 面结合的细菌总数目跟可利用的液体的体积成正比。因此可以预见，用更大的槽 和或用流动槽至少可以使这两种细菌的检测限改进一个数量级。 改进后的s a w 器件通过抗原抗体反应在声波期间表面产生质量负载和频移， 传感器输出由r f 频谱分析仪检铡( 见图1 5 ) 。检测太肠杆菌下限为4 1 0 2 c e u s m l 。 图1 4 双槽s a w 结构图( 顶视图和横截面图 图1 5 检测溶液中e “的声表面波器件示意图 ( 3 ) 光学检测 光学检测技术由于它们在生物和生命科学中的普遍应用而成为最常用的方 法。它可以基于荧光或化学发光。光学的检测方法虽然具有较高的灵敏度，但庞 大的光学测量系统及激光的精密校准限制了其广泛的应用。 浙江大学硕士学位论文 荧光检测技术跟免疫磁性分离技术结合m 可大大提高细菌检测的灵敏度和 特异性。该技术可应用在食物的大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 检测中，检测下限可达到1 0 c 刚m l 。但是这种方法需要经过1 0 h 的富集过程。该技术也可与纳米颗粒结合应 用。t a n 等人【1 8 】提出了一项新的生物纳米技术，该技术是采用生物修饰的纳米颗 粒，通过荧光信号为基础的免疫试验，快速、准确地检测出单个细菌。纳米颗粒 起到极强的信号放大作用，细菌众多的表面抗原可供抗体修饰的纳米颗粒识别与 结合，所以每一个细菌表面将结合数以千计的纳米颗粒，从而提供极强的荧光信 号( 图1 6 ) 。这种方法可在1 5m i n 内检测到1 个大肠杆菌。 b q e 强荧光信号 图1 6 单个细菌检测示意图 化学发光技术一般也是与其他相关技术结合应用的。在基于多孔硅的生物传 感器中，将发光物质通过扩散吸收到多孔硅表面，大肠杆菌上的一种酶可与这种 物质反应，产生特定波长的光，用流明计就可以检测到f 1 9 】。检测下限为1 0 。1 0 2 c f u ，检测时间在3 0 m i 以内。应用多孔硅可以增加传感器的接触面积，从而提 高灵敏度。这种放大作用也可以通过酶实现。m a i h e w 等人通过酶，放大检测信 号，检测下限为1 0 2 1 0 3 c f u ，检测时间为6 0 m i n 。 ( 4 ) 电化学检测 电学或电化学检测技术在生物芯片和生物传感器中也相当普遍。与光学检测 技术比较，这些技术的应用有助与实现小型化。电化学生物传感器根据产生的电 信号类别，可将其分为电流型和电位型两大类。 电流型传感器主要基于探测生物识别或化学反应中的电活性物质，通过固定 工作电极的电位给电活性的电子转移反应提供驱动力，探钡4 电流随时间的变化， 该电流直接测量了电子转移反应的速度，反映了生物分子识别的速度，即该电流 浙江大学硕士学位论文 正比于待测物质的浓度。应用最普遍的电流型生物传感器利用酶催化的氧化还原 反应，氧化还原电子流可在工作电极上测得。j g a u 等人刚设计了一种基于 m e m s 检测大肠杆菌的电流计，结合了自组装单分子层( s 舢订s ) 、d n a 杂交和 酶扩增技术。这样制作的金电极检测阵列如图1 7 所示。利用m e m s 技术，使多 电极电镀在硅片上形成个检测阵列。阵列集合了1 6 组三电极( 工作电极、对电 极和参考电极) ，可同时进行1 6 组数据测量。电极表面的构成如图1 8 所示。传感 器检测过程可在4 0 分钟内完成，并可达到1 0 0 0c e l l s 的检测下限( 不需p c r ) 。 基于细菌培养的电流计测量法可用来快速检测水中的活大肠杆菌1 2 l 】。在细菌 酶b d 牛乳糖的作用下，斗氨基苯8 d ，吡喃半乳糖蕾( 4 a p g a l ) 底物水解成电 化学活性分子4 氨基酸( 4 a p ) 。在一定的大肠杆菌浓度下，用电流计测量4 a p 的量，电流的强度与4 a p 量成正比。到达特定浓度所需的时间与大肠杆菌样品 的初始浓度成反比。样品的大肠杆菌初始浓度为1 o 和2 0 1 0 3a u 佃l 时，分别 在1 0 和6 6 小时后得到4 - a p 的检测结果。 生 卜1 ：耐 图1 7 微型化的多电极检测阵列 ( 曲 图1 8 电极表面的s a m 层结构( a ) 及信号检测结构图( b ) 8 浙江大学硕士学位论文 电流计测量通过带有电化学检测单元的流动注射分析系统实现。电流计方法 适合低浓度( 1 0 2 c f u 1 0 0 m 1 ) 的活大肠杆菌的快速检测( 小于1 0 h ) ，如环境水。 但是如果要检测更低的细菌数量( 如饮用水) ，化验条件需进行优化。 电位型传感器将生物识别反应转换为电信号，该信号与生物识别反应过程中 产生或消耗的活性物质浓度对数成正比，从而与待测物质浓度的对数成正比。 光寻址电位传感器( l a p s ) 的基本原理及其构造类似于离子敏场效应管 ( 1 s 肿) f 嬲。与i s 刚行不同的是，l 廿s 利用调制光从正面或背面对e i s 结构 进行光照寻址，通过检测绝缘体表面不同光照部位的电势变化而实现对溶液中特 定离子的浓度的检测。一种新型的l 盼s 快速检测大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的传感器件如 图1 9 【矧。菌液样品与免疫物混合后被涡动，混合液通过在真空部件里过滤棒过 滤，并被固定在硝化纤维膜上，然后把膜安置到系统中作l 谨s 检测。褥到的检测 限为7 1 1 0 2c c l l s m i ，测定时间分别为约4 5 分钟。 图1 9l p s 示意图 e r c o l e 等人i z 4 j 用基于抗体的生物传感器检测蔬菜中的大肠杆菌细菌。用交流 电位生物传感器( p a b ) 系统测量大肠杆菌，该系统是基于l 址s 换能元件，检 测由尿素酶一大肠杆菌抗体结合而产生的n h 3 所导致的p h 变化。与常规方法相 比，p a b 系统表现非常灵敏和快速：在约1 5h 内检测浓度为1 0c c l l s m l 的溶液。 用电阻抗生物传感器检测大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 是基于亲和纯化了的抗体可固 定在氧化锡铟( r r o ) 电极表面上l 矧。抗体可被固定在r r o 的单层环氧硅烷模片 上。a g 与a b 结合后，以碱性磷酸酶为示踪酶与二抗结合，从而达到放大电极上 9 浙江大学硕士学位论文 a g a b 对的目的。在含有o 1 m m g c l 2 p h l o 的p b s 缓冲液中，因碱性磷酸酶的 生物催化作用，底物5 溴一4 氯3 碘磷酸盐反应产生沉淀，沉积在电极表面上，使 电极阻抗增加。 由于生物催化反应( 通过二抗标记酶) 在电极表面产生的沉淀会使传导表面 电绝缘。在电极上的沉积量跟酶标记的抗体与酶基质在一定反应时间下的反应量 有关，也就与通过一抗吸附在电极表面上的目标细菌浓度有关。通过电化学测量， p t 电极和a a g a 电极分别作为对电极和参比电极，夹心结构的r r o 作为工作电 极，可以得到电极阻抗的变化曲线，从而得到细菌的浓度。该生物传感器的检测 下限为6x 1 0 3c e l l 咖l 。大肠杆菌检测的线性范围为6 x 1 0 4 6 x 1 0 7c e l l 咖1 。 阻抗测量方法同样可以应用在叉指微电极( i m e ) 中i 圳。在硅酸硼玻璃基底 上喷上一层r r o 叉指电极，每个叉指微电极有5 0 个电极对。通过测量电极阻抗在 1 0 k 下的突变点时间，得到时间与细菌浓度对数的线性关系。细菌浓度越高， 检测时间越短。该传感器的检测下限可到1c c l l 。这种检测方法的优点是检测限低， 无需对样本进行预处理( 磁分离、离心、膜过滤等) 。检测系统见图1 1 0 。 r a d k e 等人在叉指金电极阵列上引入特异性抗体，通过抗原抗体的结合反 应，将太肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 固定到电极上，然后测量叉指电极间的阻抗变化( 图 1 1 1 ) 。可区别细菌浓度范围为1 0 4 1 0 7c f u m l 。但是对微电极来说，样本中的 其他杂质会影响电极的灵敏度，在检测时需对被铡样本进行预处理。 电化学检测技术的发展趋势在于微型化和集成化。这些技术将主要依托于微 机电系统的微米，纳米镱4 造技术和微电子i c 卷造技术，具有体积小、重量轻、功耗 低、性能稳定等优点。因而它在生化传感器研发及商业化领域中处于重要地位。 图1 1 0 用叉指电极进行阻抗测量的装置 图1 1 1 叉指电极上测细菌阻抗的等效电路 1 0 渐江大学硕士学位论文 综上所述，常规的分离培养方法，作为金标准不容忽视；多种方法联合应用 才是提高检测速度和准确度的出路。对于免疫学检测方法，抗体抗原对的结合率 有限并且不稳定，这也是影响免疫学检测灵敏度的重要因素之一。随着新型材料 和分离检测技术的不断发展，相信免疫学检测方法将会得到更多的关注。 1 4 本课题的研究目的 对于食物和水所增加的微生物学关注意味着现在更需要快速的、敏感的、特 异的及定量的方法。这些方法也必需低成本、可靠、耐用，并且操作简单。对微 生物学测试在尽可能短时间内完成细菌识别的要求在不断增加。这些可靠的微生 物学方法的缺点是测试结果需要好几天。因此，通过一种快速、敏感并且便宜的 方法来测定食物中细菌的浓度和医学的、环境的样品将带来很大的优势。大量的 时间已经投入在缩短测试时间，同时又能维持其特异性和灵敏度。免疫分析技术 灵敏度高、特异性好、便宣，并且适合多种溶液样品的同时分析。本论文以大肠 杆菌0 1 5 7 ：h 7 为例，进行有关研究和实验。 大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 在食品和环境中分雍广泛，感染裁量低，这给我 f 3 检溺方 法盼灵敏度、准确性和检测速度都提出了相当高的要求。目前的常规检测技术还 不铯很好的满足实际的需求，因此研究快速准确实时的检测大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的 新技术和新设备都具有重要的意义。 我们开发的新型检测体系，利用了金电极的自组装膜特性、抗原抗体的特异 性结合和电化学交流阻抗谱( e 1 s ) 检钡9 溶液中的大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的含量。同 时，以电化学等效电路来分析三电极测量系统中的电极电解质界面。并用经典的 等效电路拟合所得的阻抗数据，得到系统中每个元件的数值，用来优化检测参数 并对病菌的检测进行有效的评估。目前已有用金表面形成自组装膜的方法检测细 菌的方法检测石英晶振频率的变化，但还没有入研究甩瓠s 来分析这些过程以及 细菌浓度变化中等效电路参数的改变，这也是本论文研究的一个创新点。 本论文第二章讲述了免疫传感器的原理。第三章分析了电化学检测技术，第 四章描述了用免疫传感器和交流阻抗谱检测大肠杆菌0 1 5 x 浙扛大学硕士学位论文 第二章免疫传感器 2 1 免疫传感器的原理 免疫传感器是利用抗原与抗体之间存在特异性互补结构的特性而制得的新 型生物传感器，由细胞识别( 即传感感受器表面抗原抗体的特异性反应) 和信 号转换( 感受由特异性结合导致的光学的、分光镜的或电的参数变化) 这两个部 分组成。由于免疫传感器具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便等优点，目前 它己广泛应用到临床诊断、微生物检测、环境监测及食品分析等诸多领域i “。b 矧。 免疫传感器的基本原理是免疫反应。它与酶反应一样是生物体中一个重要反 应。它利用固定化抗原( 或抗体) 与其相应的抗体( 或抗原) 的特异反应，使生 化敏感膜的特性发生变化【3 0 j 。 抗体是指能与抗原特异性结合的免疫球蛋白( h m u 班o b u l 氓i g ) 。它是由 上百个氨基酸分子高度有序排列而成的高分子，当免疫系统细胞暴露在抗原物质 或分子( 如病菌) 时，抗体中有对抗原结构进行特殊识别、结合的部位，根据“匙 一锁”模型，抗体可与其独特的抗原高度专一地可逆结合，其间有静电力、氢键、 疏水作用和范德华力。将抗体固定在固相载体上，可从复杂的基质中富集抗原， 达到铡定抗原浓度的目的。按理化性质和生物学功能，培可分五类，即i g g 、i g a 、 i g m 、培d 和i g e 。与免疫测定有关的i g 主要为i g g 和i g m 。i g g 的结构如图2 1 它的基本结构是一“y ”形的四肽链结构。有两条完全相同的重链( h c a v vc h a m ， y ) 和两条完全相同的轻链( 1 i g h tc h a i n ，l ) 以二硫键连接而成。重链和轻链的n 端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区。两者构成抗体的抗原结合部 位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合，是抗体专一性结合抗原的结 构基础。 抗原、抗体反应的一般规律： ( 1 ) 特异性 抗原决定簇和抗体分子v 区间的各对分子引力是它们间特异性的物质基础。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原与抗体的结合具有高度 的特异性。这种高度特异性是各种血清学反应及其应用的理论依据。 浙江大学硕士学位论文 抗原 ， ， ， p 抗体 舀3 1 抗体结构匿 ( 2 ) 可邀性 抗原抗体间的结合仅是一种物理结合，故在一定条件下是可逆的。所有的抗 原抗体反应都是可逆的反应的平衡常数七值反映了抗原抗体间结合能力。因此 也被用来表示抗体的亲和力。 a b a g + a b a g 潞蝌【a b 】i a 萄 七一为正反应速度常数，如为逆反应速度常数。 抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素，一是抗体对相应抗原的亲和力； 二是环境因索对复合物的影响。高亲和性抗体的抗原结合点与抗原表位在空间构 型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离。反之，低亲秘性抗体与抗原形成的 复合物较易解离。解离后的抗原或抗体均能保持未结合前的结构、活性及特异性。 在环境因素中，凡是减弱或消除抗原抗体亲和力的因素都会使逆向反应加快，复 合物解离增加。如p h 改变，过商或过低的p h 值均可破坏离子间的静电引力，使 抗原抗体间的结合力下降；增加离子强度也可通过中和带电离子使静电引力消 失。对亲合力本身较弱的反应体系而言，仅增加离子强度即可达到解离抗原抗体 复合物的目的：增加温度可增加分子间的热动能，加速已结合的复合物的解离， 但由于温度变化易致蛋白变性，所以实际工作中极少应用。改变p h 和离子强度 是最常用的促解离方法，免疫技术中的亲和层析就是以此为根据纯化抗原或抗体 的。 浙江大学硕士学位论文 ( 3 ) 定比性 在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一 定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发 现只有在两者分子比例合适时才会出现最强的反应。以沉淀反应为例，若向一排 试管中加入一定量的抗体，然后依次向各管中加入递增量的相应可溶性抗原，根 据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线。从图2 2 可见，曲 线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带。在 此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多。其中有一管反应最快，沉淀 物形成最多，上清液申几乎无游离抗原或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比铆 最为合适，称为最适比。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带，由于抗 原抗体比例不适合，沉淀物量少，上清波中可测出游离的抗原或抗体。如果抗原 或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象。出现在抗体过量时，称 为前带，出现在抗原过剩时，称为后带。因为大多数抗体是两价的，而抗原是多 价的，当抗原抗体处于等价带时，可互相联结成为具有立体结构的巨大网格状聚 集体，形成肉眼可见的沉淀物。但当抗原或抗体过量时，由于其结合价不能相互 饱和，就只能形成较小的沉淀物或可溶性抗原抗体复合物。 键 碘 霉 螋 蟪 抗体量恒定抗原量递增 图2 2 免疫反应的比例性 ( 4 ) 阶段性 抗原与抗体的反应一般有两个胡显的阶段，第一阶段的特点是时间短( 一般 仅数秒) ，不可见；第二阶段的时间长( 从数分钟至数小时或数天) ，可见第二阶 段的出现受多种因子的影响，如抗原抗体的比铡、p h 、温度、电解质和补体等。 两个阶段间并无严格的界限。 浙江大学硕士学位论文 ( 5 ) 条件依赖性 最佳条件一般为p h = 6 8 ，温度为3 7 4 5 。c ，适当振荡，以及用生理盐 水作电解质等。 2 2 免疫传感器的制备 免疫传感器制作过程中一个非常重要的步骤是将抗体或抗原固定在传感器 表面，这样才能检测相应的抗原或抗体。然而传感器表面构造不一，有金属( 如 盒、银、铜、铂、铅、锂、钛、镍或铬) 、碳、玻璃、石英等，它们与抗原或抗 体的结合特性都不同，这就需要不同的固定方法，使得吸附好了的抗原或抗体不 在反应中脱落【3 1 】。 在载体( 金表面) 固定化大分子配基，如抗体，通过化学反应共价结合是最 佳方法。自组装膜的活泼性尾基如：c o o h 、n h 2 、0 h 等在与生物分子偶联 前必须活化尾基。- c 0 0 h 通常用功c 、n ，n - 羰基二睬唑( c d l ) 、对硝基酚磺 酰氯等；n h 2 可以用戊二醛、三氯s 三：嗪( t s t ) 等活化，形成的活泼酯或酰氯 等活泼化合物与生物分子中的氮基反应生成酰氨共价键，从而固定生物分子【3 2 l 。 固定方法可分为直接法和间接法。前者是用含抗体或抗原的溶液涂覆或浸泡 电极或光极，通过物理或化学吸附作用使其表面生成具有识别功能的生物膜。该 法简单、快速，但易阻碍特异性反应的发生，导致非特异性吸附和脱落。后者则 采用中间连接层( 如戊二醛) 来连接传感表面和抗体或抗原，最常用的是戊二醛 交联法、自组装技术和蛋白a ( s p a ) 法。另外，还有聚合膜连接法、生物素亲 和素体系和l b 膜技术等。间接法提高了固定效率、固定化层的适应性和反应灵 敏度。 2 2 1 戊二醛交联法 晶体金属表面建立一层惰性疏水物质，主要是聚乙烯亚胺、3 氨丙基三乙氧 基硅烷和半胱氨酸，然后再用戊二醛作为交联试剂与抗原，抗体结合。戊二醛是一 个常用的双功能基试剂，很容易使蛋白质交联，这种交联是通过蛋白质中赖氨酸 残基进行的。该法的主要缺点是反应难以控制，形成的酶蛋白质层蓬松、坚固性 差，所需的生物样品多。 浙江大学硕士学位论文 2 2 2 自组装单层膜法( s 舢旺s ) s m s 是分子通过化学键相互作用自发吸附在固液或气液界面，形成热力学 稳定、能量最低的有序膜。其原理是在未被氧化的金电极表面通过烷基化过程形 成强的金属硫醇键，在膜表面引入可反应的基团，后者可以和抗原，抗体相连而不 破坏其活性。可用来生成单分子膜的试剂有很多，常用的如硫醇、有机硅二羟基 硫化物、二硫化物和磺酸盐掣3 3 l 。短链烷基硫醇，比如3 巯基丙酸( m p a ) 可 用来生成羧酸化的单分子膜，在激活后可与蛋白质等物质交联，经常被用作自组 装的基层物质。f 岫g 等p 4 1 人的研究表明1 乙基3 ( 3 二甲基氨丙酸) 碳二亚胺 ( e d c ) 和n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 的联用，可提高活酯的稳定性，生物分子 的固定效率固定抗体的密度与可重复性都较好。其具体过程如图2 3 。 n u i ! ! ! 一u s c c n ，n c 。n 黑十m 。显里 图2 3 自组装膜法在金表面固定抗体的过程 自组装单层膜法虽然在检测的灵敏性和可重复性方面有很大提高。稀溶液中 硫醇可以在1 h 内组装形成单层自组膜，组装时间与硫醇的烷基链链长有关，一 般浓度高则所需的时间短。通常自组膜可以覆盖整个金表面，但针孔或缺陷会导 致硫醇残基的氧化使金j 硫键氧化断裂，成膜分子倒伏或脱落，影响生物分子固定 的效果。吐卜取代的烷基硫醇形成的自组膜有较高的有序性和取向度，对于末端相 对较小的基团如n h 2 、- 0 h ，则自组膜的取向度不会受到影响。但对于较大的末 端基团如一c o o h ，则会降低自组膜堆积的密度，减低末端的有序性，此时可以 与短链硫醇以一定摩尔比混合自组装，形成混合自组膜【3 5 l 。 2 2 3 蛋白a 固定法 蛋白a 是金黄色葡萄球菌的一种胞壁成分，分子中有四个与免疫球蛋白分子 o 一 0 i c hcs 罔嘲昏 a 浙江大学硕士学位论文 始减小，流过的电流也必定减小。总的来说，此变化过程产生一个峰状的电流- 电位响应，如图3 1 ( b ) 【”】。 当扫描速度反向时( 较快的扫描速度下) ，在接近电极处有显著的r 的浓度， 实际上反向扫描时继续生成r ，直到电位再次接近平衡电位。可是，当这电位接 近平衡电位时，在电极近旁存在的r 开始被氧化返回成o ( 为了使表面浓度服从 n c m s t 方程) ，同时产生一个反向电流。伴随电极电位一定变化的r 在表面浓度 最后达到零。与前向扫描同样道理，在反向扫插时电流也显示一个峰响应，虽然 电流方向是相反的。 如果。和r 两者都是稳定的，而且电子转移过程动力学速率是快的，一个可 逆的c v 谱才能被观察到。如果电活性物质可逆性差，则氧化波与还原波的高度 就不同，对称性也较差。循环伏安法中电压扫描速度可从每秒种数毫伏到l 伏。 工作电极可用悬汞电极，或铂、玻碳、石墨等固体电极。 ox2 x e 0 八。 五 e f ( a )( b ) 图3 1 ( a ) 循环伏安法实验的电位时问曲线：( b ) 电位电流曲线 3 2 2 循环伏安法的应用 a 循环伏安法是一种很有用的电化学研究方法。循环伏安图上峰电位、峰电流 的比值以及阴阳极峰电位差是研究电极过程和反应机理、测定电极反应动力学参 数最重要的参数。但该法很少用于定量分析。 ( 1 ) 电极可逆性的判断 循环伏安法中电压的扫描过程包括阴极与阳极两个方向，因此从所得的循环 伏安法图的氧化波和还原波的峰高和对称性中可判断电活性物质在电极表面反 应的可逆程度。若反应是可逆的，则曲线上下对称，若反应不可逆，则曲线上下 浙江大学硕士学位论文 不对称。 ( 2 ) 电极反应机理的判断 循环伏安法还可研究电极吸附现象、电化学反应产物、电化学化学耦联反应 等。对于有机物、金属有机化合物及生物物质的氧化还原机理研究很有用。 3 3 电化学阻抗谱 3 3 1 电化学阻抗谱的特点 当一个电极系统的电位或流经电极系统的电流变化时，对应的电漉或电位也 相应地变化，这种情况正如一个电路受到电压或电流扰动信号作用时有相应的电 流或电压相应样。当用一个角频率为脚的振幅足够小的正弦波电流信号对一个 稳定的电极系统进行扰动时，相应地电极电位就做出角频率为n 构正弦波响应， 从被测电极与参比电极之间输出一个角频率是的电压信号，此时电极系统的频 确函数就是电化学阻抗。在一系列不同角频率下测得的一组这种频响函数值就是 电极系统的电化学阻抗谱( e l e c t m h 锄j c a i 面p e d a n c es p c c t r o s o 叩y ) 。因此电化学 阻抗谱就是电极系统在符合阻纳鸽基本条件对电板系统的陋抗频谮防】， 电化学阻抗谱是指种以小振幅的正弦波电位( 或电流) 为扰动信号的电化 学测量方法。由于以小振幅的电信号对体系扰动，一方面可避免对体系产生大钓 影响，另一方面也可以使得扰动与体系的响应之间近似成线性关系，从而使测量 结果的数学处理变得简单。同时，电化学阻抗谱方法又是一种频率域的测量方法， 它以测量得到的频率范围很宽的阻抗谱来研究电极系统，因而能比其他常规的电 化学方法得到更多的动力学信息及电极界面结构的信息。 3 j 2 阻抗测量的三个基本条件 与线性电学系统不同，电极系统并不髓自然地满足阻纳的基本条件，所以， 在进行电化学阻抗谱测量的时候，电极系统需要满足阻纳的三个基本条件： ( 1 ) 因果性条件 当用一个正弦波的电位信号对电极系统进行扰动，因果性条件要求电极系统 只对该电位信号进彳亍响应。这裁要求控割电极过程欹电极电位以及其他状态变量 都必须随扰动信号正弦渡的电位波动而变化。对于由电学元件组成的电路来 浙江大学硕士学位论文 在电化学中的等效电容与电学元件“纯电容”相同，通常用c 作为等效电容 的标志。在满足电极过程定态稳定性的条件下，测得的电化学阻抗谱的等效电路 中如包含等效电容，其值都为正值。这一等效元件的阻抗与导纳分别为 z c = 一，去 z ：= o z ：- 去 ( 3 3 3 ) y c = ，彬砭= o= 坼 ( 3 3 4 ) 他们只有虚部而没有实部。在阻抗复平面上和导纳复平面上，它以第l 象限中与 纵轴( z ，轴或r 轴) 重合的一条直线表示。它的阻纳和导纳的模值分别为 阮l - 去 限l - 征 ( 3 3 5 ) 虬 在波特图上，如以l o g 阪1 对l o 矿作图，得到的是一条斜率为一1 的直线。等效电 容的相位角9 = 吡，与频率无关。 3 等效电感 在电化学中的等效电感与电学中的“纯电感”相同，用工作为等效电容的标 志。电化学阻抗谱中的等效电感若为负值，则表明测量中没有满足电极过程的 定态稳定性条件。这就是说，在满足阻纳的基本条件时，如电化学阻抗谱的等效 电路中包含等效电感上，电感值总为正值。 4 - 常相位角兀件( c p e ) q 电极与溶液之间界面的双电层，称为双电层电容。但实验中发现，鼠体电 x 浙江大学硬士学位论文 a 、b 分别表示电解池的研究电极和辅助电极两端；如、b 为电极本身的电阻； c a b 代表两电极之间的电容；月。是溶液电阻；c 0 、o 表示研究电极和辅助电极的 双电层电容( 厚度一般1 0 4 c m ) ；z f 、磊代表研究电极和辅助电极的交流阻抗， 或称为法拉第阻抗，其数值决定于电极动力学参数及测量信号的频率。 在电极系统中，r a 、r b 通常很小，可忽略不计：c a b 1 8h ) 。乙 醇和水洗后，加入7 5m m ，1 5m me d c y n h s 水溶液，浸泡1h 。水洗后通n 2 气干 燥。在每个电极上滴加2 0m 的1m g m l 抗大肠杆菌0 1 5 7 单克隆抗体，均匀涂开， 将抗体引入到电极表面上。之后在4 。c 的冰箱里放置过夜( 1 5h ) ，确保抗体充 浙江大学硕士学位论文 第五章实验结果和讨论 5 1a u 电极自组装膜层的形成和特性 5 1 1 自组装膜层( & 气m s ) 的形成 在很多文献报道上都采用各样的s a m s 来处理电极表面1 2 5 以删。其中研究和 应用最为广泛是巯基化合物在金电极表面形成的s a m s 。这种自组装膜层可用来 固定生物活性物质( 抗体、酶、抗原等) ，因为在未被氧化的金电极表面形成强 的金属巯基键，可在膜表面引入可反应的基团，和抗原，抗体相连而不破坏其活性。 并且，这种方法可靠