（遗传学专业论文）小鼠嗅鞘细胞的免疫组化和分类鉴定.pdf

- l 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：狃 e t 期：卫! 翌：6 ：口 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签 日1 , 0 1 0 、l ，i 弓 电话： 邮编： 1 j 摘要 脊髓损伤即使是局部的损伤也会造成严重的后果，可能造成局部永久性的瘫痪，严 重影响患者的生活质量，也会给患者的家庭和社会带来严重的负担和损失。研究人员发 现脊髓神经损伤后有可能通过细胞移植、基因治疗或者转基因细胞移植来修复。研究表 明，在众多的移植修复中枢神经损伤的细胞候选者中，o e c s 被列为最为理想的一种细 胞。 o e c s 细胞膜上有与细胞黏附和促进神经再生有关的分子，这些分子可以为神经轴 突的再生建立良好的内在环境，有助于受损轴突的伸长、生长，促进轴突向靶区延伸， 帮助神经功能恢复。目前，有数据显示o e c s 可以促进小鼠坐骨神经再生，可以促进小 鼠脊髓束半切模型的轴突延长生长等。 现在，应用比较成熟的嗅鞘细胞体外培养方法是n a s h 差速贴壁法。n a s h 差速 贴壁法主要是利用成纤维细胞、星形胶质细胞和成鞘细胞的贴壁时间不同而将它们分离 开来。培养的o e c s 可表现出多种细胞形态和细胞表面标志。最常见的主要有两种，一 种是类神经膜细胞型，表达p 7 5 m r 受体。主要分布于外周嗅神经系统内，呈纺锤形。一 种就是类星形胶质细胞型，主要分布在小鼠嗅球内，多数扁平。缺乏p 7 5 n 1 r 受体，但 g f a p 成免疫阳性。我们利用g f a p 免疫组化鉴定体外培养的嗅鞘细胞的纯化能力。 本实验采用改良的n a s h 法差速贴壁和阿糖胞苷纯化培养小鼠嗅球原代嗅鞘细胞， 利用g f a p 鉴定了体外培养的细胞纯度。利用抗p s a - n c 蝴和抗l n g f r 两种抗体将 培养的细胞分类，尝试研究o e c s 不同表型的关系，希望进一步发现不同株系o e c s 在 细胞表达和物质分泌上的不同功能，最终应用于移植修复脊髓损伤和促进轴突再生的作 用。 关键词：脊髓损伤；o e c s ；原代培养；g f a p a b s t r a c t s p i n a lc o r di n j u r y , e v e nap a r t i a ls p i n a lc o r di n j u r ym a yr e s u l ti np e r m a n e n tp a r t i a l p a r a l y s i sw h i c hw i l ls e r i o u s l ya f f e c tp a t i e n t s q u a l i t yo fl i f ea n db r i n gh e a v yb u r d e nt ot h e i r f a m i l i e sa n ds o c i e t y s o m er e s e a r c h e r sf o u n dt h a ts p i n a lc o r di n j u r yc a nb er e p a i r e db yc e l l t r a n s p l a n t a t i o n , g e n et h e r a p yo rg e n e t i c a l l ym o d i f i e dc e l lt r a n s p l a n t a t i o n m a n yr e s e a r c h s u g g e s tt h a to e c si st h em o s to u t s t a n d i n gc e l la m o n ga l lt h ec a n d i d a t e sf o rc e l li n j u r y r e p a i r e db yt r a n s p l a n t a t i o ni nc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m o nt h ec e l lm e m b r a n eo fo e c st h e r ea r em a n ym o l e c l u e sr e l a t e dt oc e l la d h e s i o na n d p r o m o t i o no fn e r v er e g e r a t i o n t h e yc a np r o v i d eag o o di n t e r n a le n v i r o n m e n tf o ra x o n a l r e g e n e r a t i o na n dh e l pt h eg r o w t ha n de l o n g a t i o no fa x o n i tw i l lh e l pp r o m o t i n ga x o n e x t e n d e dt ot h et a r g e tr e g i o nw h i c hw i l ll e a dt ot h er e c o v e r yo fn e u r o l o g i c a lf u n c t i o nm a n y s t u d i e sh a sp r o v e dt h a to e c sc a np r o m o t es c i a t i cn e r v er e g e n e r a t i o na n dt h ea x o n se x t e n s i o n i nt h eh a l f - c u tm o d e lf o rt h eg r o w t hi nm i c e n o w , n a s hd i f f e r e n t i a la d h e s i o na n da r a b i n o s y l c y t o s i na r et h em o s tw e l l - e s t a b l i s h e d m e t h o df o rc u l t u r eo fo l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l si nv i t r o n a s hd i f f e r e n t i a la d h e s i o na n d a r a b i n o s y l c y t o s i nm e t h o d su t i l i z e st h ed i f f e r e n ta d h e n s i o nt i m eo ff i b r o b l a s t s ，a s t r o c y t e sa n d e n s h e a t h i n gc e l l s o e c sc a l ld i s p l a ym a n yc e l lm o r p h o l o g ya n dc e l ls u r f a c em a r k e rw h e n t h e ya r ec u l t u r e d t h e r ea r eu s u a l l yt w ok i n d so ft h e m o n eo ft h e mi ss p e c i e so fn e u r o l e m m a l c e l l u l a rt y p ei nw h i c ht h e p 79 mr e c e p t o rw i l le x p r e s s t h e ya r em a i n l yl o c a t e da tt h e p e r i p h e r a lo l f a c t o r yn e r v o u ss y s t e m ，i nas p i n d l es h a p e t h eo t h e ro n ei ss p e c i e so fh o r i z o n t a l c e l l u l a rt y p e ，m a i n l yd i s t r i b u t i n gi nm o u s eo l f a c t o r yb u l b ，i ti sa l w a y si naf l a ts h a p e t h e ya r e l a c ko fp 7 5 mr e c e p t o rb u tp o s i t i v ei ng f a p w eu s eg f a pi m m u n o h i s t 0 c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o nt om e a s u r et h e q u a l i t yo fp u r i f i c a t i o na n dc h a n g e sb e t w e e no f o l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l si nv i t r o i nt h i ss t u d y , w eu s e dam o d i f i e dd i f f e r e n t i a lm e t h o do fn a s h ，a n da m - c p u r i f i c a t i o no f a d h e r e n tt oi s o l a t ea n dc u l t u r et h eo l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l sf r o mm o u s eo l f a c t o r yb u l b t h e a n t i - p s a - n c a ma n da n t i - l - n g f ra r e ac l a s s i f i c a t i o n t y p ea s t r o c y t e so e c sa n dc l a s s s c h w a n nc e l lo e c s ，a r ea l s ou s e d , i no r d e rt oi d e n t i f i c a to e c s 晰廿ld i f f e r e n tt y p e so f e x p r e s s i o na n ds e c r e t i o n i tc a nb eb e t t e rt o 伊mf o rr e p a i ro fs p i n a lc o r di n j u r y , t h e p r o m o t i o no fa x o n a lr e g e n e r a t i o ni nt h er o l e k e yw o r d s ：s p i n a lc o r dm j u r y ；o e c s ；p r i m a r yc u l t u r e ：g f a p n 目录 中文摘要：i 英文摘要i i 目j 5 ：i i i 1 弓i言 1 1 嗅鞘细胞的形态特点1 1 2 嗅鞘细胞的发现2 1 3 嗅鞘细胞的移植修复功能：2 1 4 嗅鞘细胞的体外培养和纯化方法3 1 5 嗅鞘细胞的免疫特性和抗体标记。4 1 6 实验目的和意义。4 2 材料与方法j 6 2 1 嗅鞘细胞的体外培养6 2 2 1 材料的选择：。6 2 1 2 溶液的配制7 2 1 3 嗅鞘细胞的培养工程以8 2 2 嗅鞘细胞的鉴定。8 2 2 1 实验材料。8 2 2 2g f a p 免疫组织化学鉴定9 2 2 3o e c s 的流式分析9 3 结果。 3 1 嗅鞘细胞的培养10 3 2 细胞免疫鉴定1 2 3 3 细胞流式分析13 4 讨论 4 1 抗体材料的选择1 4 4 2 结论和展望1 5 参考文献 ! 改谢1 9 摘要 脊髓损伤即使是局部的损伤也会造成严重的后果，可能造成局部永久性的瘫痪，严 重影响患者的生活质量，也会给患者的家庭和社会带来严重的负担和损失。研究人员发 现脊髓神经损伤后有可能通过细胞移植、基因治疗或者转基因细胞移植来修复。研究表 明，在众多的移植修复中枢神经损伤的细胞候选者中，o e c s 被列为最为理想的一种细 胞。 o e c s 细胞膜上有与细胞黏附和促进神经再生有关的分子，这些分子可以为神经轴 突的再生建立良好的内在环境，有助于受损轴突的伸长、生长，促进轴突向靶区延伸， 帮助神经功能恢复。目前，有数据显示o e c s 可以促进小鼠坐骨神经再生，可以促进小 鼠脊髓束半切模型的轴突延长生长等。 现在，应用比较成熟的嗅鞘细胞体外培养方法是n a s h 差速贴壁法。n a s h 差速 贴壁法主要是利用成纤维细胞、星形胶质细胞和成鞘细胞的贴壁时间不同而将它们分离 开来。培养的o e c s 可表现出多种细胞形态和细胞表面标志。最常见的主要有两种，一 种是类神经膜细胞型，表达p 7 5 n o r 受体。主要分布于外周嗅神经系统内，呈纺锤形。一 种就是类星形胶质细胞型，主要分布在小鼠嗅球内，多数扁平。缺乏p 7 5 n 1 r 受体，但 g f a p 成免疫阳性。我们利用g f a p 免疫组化鉴定体外培养的嗅鞘细胞的纯化能力。 本实验采用改良的n a s h 法差速贴壁和阿糖胞苷纯化培养小鼠嗅球原代嗅鞘细胞， 利用g f a p 鉴定了体外培养的细胞纯度。利用抗p s a - n c a m 和抗l - n g f r 两种抗体将 培养的细胞分类，尝试研究o e c s 不同表型的关系，希望进一步发现不同株系o e c s 在 细胞表达和物质分泌上的不同功能，最终应用于移植修复脊髓损伤和促进轴突再生的作 用。 关键词：脊髓损伤：o e c s ：原代培养；g f a p a b s t r a c t s p i n a lc o r di n j u r y , e v e nap a r t i a ls p i n a lc o r di n j u r ym a yr e s u l ti np e r m a n e n tp a r t i a l ) p a r a l y s i sw h i c hw i l ls e r i o u s l ya f f e c tp a t i e n t s q u a l i t yo fl i f ea n db r i n gh e a v yb u r d e nt ot h e i r f a m i l i e sa n ds o c i e t y s o m er e s e a r c h e r sf o u n dt h a ts p i n a lc o r di n j u r yc a nb er e p a i r e db yc e l l t r a n s p l a n t a t i o n ，g e n et h e r a p yo rg e n e t i c a l l ym o d i f i e d c e l lt r a n s p l a n t a t i o n m a n yr e s e a r c h s u g g e s tt h a to e c si st h em o s to u t s t a n d i n gc e l la m o n ga l l t h ec a n d i d a t e sf o rc e l li n j u r y r e p a i r e db yt r a n s p l a n t a t i o ni nc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m o nt h ec e l lm e m b r a n eo fo e c st h e r ea r em a n ym o l e c l u e sr e l a t e dt oc e l la d h e s i o na n d p r o m o t i o no fn e r v er e g e r a t i o n t h e yc a np r o v i d eag o o di n t e r n a l e n v i r o n m e n tf o ra x o n a l r e g e n e r a t i o na n dh e l pt h eg r o w t ha n de l o n g a t i o no fa x o n i tw i l lh e l pp r o m o t i n g a x o n e x t e n d e dt ot h et a r g e tr e g i o nw h i c hw i l ll e a dt ot h er e c o v e r yo fn e u r o l o g i c a lf u n c t i o nm a n y s t u d i e sh a sp r o v e dt h a to e c sc a np r o m o t es c i a t i cn e r v er e g e n e r a t i o na n dt h ea x o n se x t e n s i o n i nt h eh a l f - c u tm o d e lf o rt h eg r o w t hi nm i c e 。 n o w , n a s hd i f f e r e n t i a la d h e s i o na n da r a b i n o s y l c y t o s i na r et h em o s tw e l l e s t a b l i s h e d m e t h o df o rc u l t u r eo fo l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l si nv i t r o n a s hd i f f e r e n t i a la d h e s i o na n d a r a b i n o s y l c y t o s i nm e t h o d su t i l i z e st h ed i f f e r e n ta d h e n s i o nt i m eo ff i b r o b l a s t s ，a s t r o c y t e sa n d e n s h e a t h i n gc e l l s o e c sc a nd i s p l a ym a n yc e l lm o r p h o l o g ya n dc e l ls u r f a c em a r k e rw h e n t h e ya r ec u l t u r e d t h e r ea r eu s u a l l yt w ok i n d so ft h e m o n eo ft h e mi ss p e c i e so fn e u r o l e m m a l ， c e l l u l a rt y p ei nw h i c ht h ep 7 5 n t rr e c e p t o rw i l le x p r e s s t h e ya r em a i n l yl o c a t e da tt h e p e r i p h e r a lo l f a c t o r yn e r v o u ss y s t e m ，i nas p i n d l es h a p e t h eo t h e ro n ei ss p e c i e so fh o r i z o n t a l c e l l u l a rt y p e ，m a i n l yd i s t r i b u t i n gi nm o u s eo l f a c t o r yb u l b ，i ti sa l w a y si naf l a ts h a p e t h e ya r e l a c ko fp 75 n 1 rr e c e p t o rb u tp o s i t i v ei ng f a p w eu s eg f a pi m m u n o h i s t o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o nt om e a s u r et h e q u a l i t yo fp u r i f i c a t i o n a n dc h a n g e sb e t w e e no f o l f a c t o r ye n s h e a t h i n g c e l l si nv i t r o i nt h i ss t u d y , w eu s e dam o d i f i e dd i f f e r e n t i a lm e t h o do fn a s h ，a n da r a cp u r i f i c a t i o no f a d h e r e n tt oi s o l a t ea n dc u l t u r et h eo l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l sf r o mm o u s eo l f a c t o r yb u l b t h e a n t i p s a - n c a ma n da n t i l - n g f ra r e ac l a s s i f i c a t i o nt y p ea s t r o c y t e so e c sa n dc l a s s s c h w a n nc e l lo e c s ，a r ea l s ou s e d ，i no r d e rt oi d e n t i f i c a to e c s 谢t l ld i f f e r e n tt y p e so f e x p r e s s i o na n ds e c r e t i o n i tc a nb eb e t t e rt og r a f t f o rr e p a i ro fs p i n a lc o r di n ju r y , t h e p r o m o t i o no fa x o n a lr e g e n e r a t i o ni nt h er o l e 。 k e yw o r d s ：s p i n a lc o r di n j u r y ；o e c s ；p r i m a r yc u l t u r e ；g f a p n 东北师范大学硕士学位论文 1引言 脊髓是人体中枢神经系统中的重要组成部分。脊髓传导人体所有部位的各种感觉 冲动，自身完成许多反射活动，并且受脑部的控制。脊髓损伤( s p i n a lc o r di n j u r y ，s c i ) 即使是局部的损伤也会造成严重的后果。损伤平面以下的机体部位上下行神经纤维传导 束中断，可能造成局部永久性的瘫痪，严重影响了患者的生活质量，也会给患者的家庭 和社会带来严重的负担和损失。 传统观点认为，成年哺乳动物的中枢神经细胞由于高度分化以及内环境的抑制， 已经失去了分裂的能力，轴突不能再生，所以中枢神经损伤的修复一直是神经科学研究 领域的一大难题。随着现代技术的发展，发现中枢神经损伤后神经再生和功能恢复很难 发生的主要原因是，损伤后远程轴突发生瓦勒溃变，近端轴突发出的轴芽增多，可从间 充质细胞间隙出向损伤处生长，巨噬细胞向损伤处迁徙。但轴突的延伸是不能穿过损伤 处的，从而无法形成功能性衔接，轴突生成的新芽很快夭折，神经元胞体最终死亡( i 】。 研究人员发现脊髓神经损伤后可通过细胞移植、基因治疗或者转基因细胞移植来 修复。现在采用细胞移植方法治疗取得一定效果的细胞主要有胚胎肝细胞、间充质细胞、 施旺细胞( s c h w a n nc e l l s ，s c s ) 以及嗅鞘细胞( o l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l s ，o e c s ) 等。但是胚胎干细胞的使用在理论上还存在许多的争议；间充质细胞来源不统一，分离 培养方式不统一，使得很多实验数据很难进行比较，而且如何诱导使其向脊髓细胞修复 的方向转化或者分化，形成功能性桥接等问题还没有解决【2 1 ，使得这些细胞的应用存在 很大的问题。 现在大量的相关研究表明，在众多的移植修复中枢神经损伤细胞候选者中，o e c s 被列为最为理想的一种细胞。1 9 8 2 年英国生物学家b a r b e r 发现嗅神经施旺细胞类似星 形胶质细胞，是不同于周围其他神经的施旺细胞，可以促进嗅神经的再生。哺乳动物嗅 觉通路细胞具有独一无二的终生持续分化和再生能力，可以不断的生长轴突再次进入中 枢神经系统【3 】。嗅神经元可存活4 8 周，衰老的神经元可以由嗅上皮产生新的神经元取 代，并发出轴突进入中枢的嗅球( o l f a c t o r yb u l b ，o b ) 与靶神经元形成突触，从而维 持了稳定的嗅觉功能。嗅神经元的再生过程中轴突需要穿越神经组织的周围中枢移行 区，在成年动物此区域阻碍了再生的周围神经轴突进入中枢。嗅神经轴突是目前发现的 唯一的能够持续从周围神经系统进入中枢的神经组织【4 】。而动物嗅球中存在的这种特殊 类型的神经胶质细胞，就是可以形成髓鞘的嗅鞘细胞。 1 1 嗅鞘细胞的形态特点 1 9 世纪后叶，g o l g i 和b l a n e s 最先从动物嗅球中发现o e c s l 5 】1 6 】。o e c s 是一种与嗅 东北师范大学硕士学位论文 感觉神经伴行的胶质细胞，直接起源于嗅基板，位于鼻腔的修上皮、嗅神经以及嗅球的 第一二层中【5 】。o e c s 按形态可以分为双极或者梭型、多突起型、扁圆型或称油煎蛋型。 体外培养时因为与供体组织的年龄、培养条件等因素有关，所以常见两种类型的o e c s 细胞。一种是梭形细胞，有细长的突起，形态与未形成髓鞘的施万细胞类似，因其组化 特征偏向于s c s ，也称其为“s ”型细胞；另一种是扁平的、胞质少而且边缘很不规则 的细胞，形态和组化特征类似于星形胶质细胞，因此也称为“a 型细胞1 7 j 。 o e c s 不会卷入嗅球中，因此嗅神经末端轴突是完全暴露的。体内的嗅鞘细胞一般 包围着整束的无链鞘轴突生长，而不是只包裹着一根轴突生长。与其它周围神经不同的 是：嗅神经束外面包裹着一层基底膜，可以把o e c s 与周围的结缔组织分隔开来【6 】。 1 2 嗅鞘细胞的发现 1 9 9 0 年加拿大科学家d o u c e t t e 发现促进神经再生的关键因素是一种介于星形细胞 和施万细胞的胶质成鞘细胞，因其可以形成髓鞘，使背根神经节髓鞘化，故称为髓鞘细 胞。这类细胞可以合成分泌多种神经营养分子，如l a m i n i nl 1 n g c a m 、n c a m 、胶质 衍生微管连接素( g l i a l d e r i v e dn e x i n ) 、脑原神经营养因子( b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i c f a c t o rb d n f ) 、神经肽y 等【8 】。胶质衍生微管连接素是一种轴突生长的促进因子。神经 肽y 有参与引导并促进神经元轴突生长，甚至促进嗅感觉神经元成熟的功能1 9 j 。因此可 以在神经损伤后，加入这种蛋白，可以使被阻断的神经生长因子的逆行运转从新连接， 使神经元达不到靶源性神经营养因子而导致的凋亡基因不能表达，从而使神经元死亡状 况得到缓解。 o e c s 细胞膜上有与细胞黏附和促进神经再生有关的分子，如层黏连蛋白 ( 1 a m i n i n ) 、含唾液酸的分子、神经细胞黏附分子和纤维粘连蛋白( f i b r o n e c t i n ) 、多 聚唾液酸神经细胞粘附因子( p o l y s i a l i ca c i d n e u r a lc e l la d h e s i o nm o l e c u l e ，p s a n c a m ) 等，这些分子可以为神经轴突的再生建立了良好的内在环境，有助于损伤轴突的伸长、 生长，促进轴突向靶区延伸，帮助神经功能恢复【l o 】。比如，受损的上行感觉神经元轴突 对n g f 、b d n f 、神经营养因子一3 ( n e u r o t r o p h i nf a c t o r3 ，n t 3 ) 敏感，受损的红核脊 髓和皮质脊髓的轴突对b d n f 敏感，b d n f 可能通过受体t r k a 和t r k b 影响神经干细胞 的增值分化。n t - 4 可阻止小鼠红核脊髓的神经元萎缩，并促进红核脊髓再生，g d n f 能促进蓝斑的去甲肾上腺素，使神经元存活时间延长以及促进轴突再生i l o l 。另外还发现 o e c s 还可以分泌大量不同种类的支持因子，例如可以再血管壁上形成终足，参与形成 胶质结膜的胶质纤维酸性蛋白( g i i mg i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ，g f a p ) ，可表达低亲和力 神经生长因子受体( 1 0 wa f f i n i t yn g f r e c e p t o r ，l n g f r ) 、纤维细胞生长因子f g f l 、血 小板源生长因子以及促进轴突生长的蛋白酶连接素( p r o t e a s en e x i n 1 ，p n 1 ) 【l l j 等。 1 3 嗅鞘细胞的移植修复功能 随着o e c s 功能的不断被发现，研究人员发现在嗅球神经发育过程中，o e c s 可伴 随轴突由嗅上皮向o b 迁移。1 9 9 6 年，英国生物学家f r a n k l i n 证实在活体小鼠中，成年 2 东北师范大学硕士学位论文 中枢神经系统脱髓鞘区域，o e c s 可以在直径合适的轴突周围移植，形成类似周围神经 施旺细胞髓鞘【1 2 】。o e c s 可以促进小鼠脊髓束半切模型的轴突延长生长【1 5 】。l iy 将o e c s 移植n d , 鼠皮质脊髓束的半切模型中，6 天后他们发现这些被切断的皮质脊髓束纤维沿 着轴突中心向外端伸展了1 5 2 5 m m ，经过3 周，延伸的轴突细胞由施万细胞型o e c s 形成束，星形胶质细胞型o e c s 形成髓鞘，最后穿越损伤部分，重新加入尾端的皮质脊 髓束后重新建立，形成功能连接，使小鼠前肢部分功能得到明显恢复【l 引。1 9 9 7 年f r a n k l i n 进一步指出o e c s 在中枢神经系统的移植修复功效应该优于s c s l l 4 l 。随着研究的进展， 不断证实o e c s 可以促进小鼠坐骨神经再生。r a m o n 等在脊髓束横断损伤模型中，发现 o e c s 能促进轴突更长距离的再生，再生轴突穿越了胶质瘢痕区，进入脊髓远端后，生 长3c m 。使后肢部分截瘫的大鼠重新恢复了的活动能力，可以完全伸展并支撑体重，后 肢轻触觉和自体感觉部分得到恢复【i6 1 。o e c s 可以保护外周神经损伤后脊髓前角运动神 经元的死亡和退化性变【1 7 l 。通过电极使皮质脊髓束损伤后通过o e c s 的移植也可以再生 【1 8 】 o o e c s 移植可以促进小鼠受损神经恢复，支持轴突生长。现在小鼠o e c s 移植修复 效果如何，如何应用于人类移植手术中，已经成了近几年科学家研究的重点。s c i 后o e c s 选择不同时机移植、移植纯度和浓度、植入的方法的不同效果也不同。2 0 0 3 年r e s n i c kd k 发现小鼠s c i 后马上移植o e c s 无修复功能【l9 1 。同年k e y v a n f o u l a d in 在小鼠皮质脊髓 束受伤8 周后，移植o e c s ，即使皮质脊髓束只剩下正常水平的1 ，仍然可以观察到神 经动能的恢复【2 0 1 。2 0 0 5 年w o o d h o u s e 对照实验发现s c i 疾病稳定期比急性期o e c s 存 活率更高【2 1 1 。 近几年o e c s 应用于人体s c i 临床移植治疗的研究，开始出现报到。2 0 0 2 年国内 最先公布了人移植o e c s 后出现的临床症状，移植的是人胚胎嗅球o e c s 。术后对患者 几个月的随访中，发现2 3 例患者的s c i 症状有所减轻，脊髓功能均有所改善瞄】。但由 于从o e c s 来源，到移植手术的施行都还存在很大的争议，治疗效果也还不能达到安全 水平，o e c s 应用于人体的s c i 临床治疗还存在着许多难题需要解决。 1 4 嗅鞘细胞的体外培养和纯化方法 o e c s 作为移植的材料，其需求量大，纯度要求高，活性要求好，因此必须通过体 外培养纯化获得。在发现o e c s 的神经修复功能的过程中，嗅鞘细胞的的体外培养方法 也在一直不断地优化。如何获得o e c s ，如何寻求一套好的嗅鞘细胞优化培养方法，一 直是研究o e c s 移植修复s c i 、治疗神经系统脱髓鞘疾病等领域科学家不可忽视的问题。 应用较多的培养方法主要有差速贴壁法、免疫亲和吸附法、免疫磁珠筛选法等【2 3 】【2 4 】【2 5 j 。 2 0 0 1 年n a s hh h 建立的嗅球o e c s 优化纯化培养方法，培养的o e c s 纯度高达9 3 2 1 2 3 】。 现在，已经应用比较成熟的嗅鞘细胞体外培养方法主要是n a s h 差速贴壁法。 n a s h 差速贴壁法主要是利用成纤维细胞、星形胶质细胞和成鞘细胞的贴壁时间 不同而将它们分离开来。其中成纤维细胞的贴壁能力强，在细胞接种的几小时内就可以 3 东北师范大学硕士学位论文 贴壁在未被左旋多聚赖氨酸包被的光滑玻璃平面上，星形胶质细胞一般在接种后的二十 四小时左右贴壁，而o e c s 则需要四到五天的时间贴壁。用此方法得到的嗅球o e c s 分 离率可达9 3 t 博j 。 阿糖胞苷是一种周期特异性抗代谢药，可进一步纯化细胞，可以去除绝大多数的 成纤维细胞，并可以抑制培养基中胶质细胞的过度生长。阿糖胞苷可以抑制d n a 多聚 酶的活性，从而影响的d n a 合成，干扰d n a 的复制，因此可以杀死培养体系内正在 生长的的胶质细胞或其他可分裂细胞最终达到纯化神经元。但是由于阿糖胞苷在培液中 自身活力的衰减以及其只针对分裂其细胞的特点，往往需要加有阿糖胞苷的培液以及正 常的培液交替使用才能较为彻底的清除胶质细胞。 1 5 嗅鞘细胞的免疫特性和抗体标记 嗅鞘细胞被认为是一种可塑性很高的细胞，它可表现出多种细胞形态和细胞表面 标志。早期实验证明嗅鞘细胞是种可以表现出介于星形细胞和施万细胞之间的，不同寻 常特性的类似星形胶质细胞。可分泌多种神经营养分子，如l a m i n i nl 1 n g c a m 、 n c a m 、b d n f 、神经肽y 掣引。对胶质纤维酸性蛋白g f 船表现出强阳性。后又发现 嗅球粘膜上的嗅神经周围施旺细胞( 也成为嗅鞘细胞) 对对s 1 0 0 成免疫阳性。1 9 9 2 年， t u m e rc p 证实小鼠嗅鞘细胞可以对p 7 5 n t r 免疫阳性。p 7 5n e u r o t r o p h i nr ( n t r ) ：p 7 5 n t r 是神经生长因子n t f 的低亲和力受体，通常p 7 5 n 爪受体主要是在对n t f 家族起反应的 细胞上表达，而且参与和调整t r k 受体对n t 的反应，现在p 7 5 n 限越来越多的被用来作 为o e c s 的特异免疫反应物【2 6 】【2 7 1 。 免疫组化实验发现，o e c s 虽然在不同的物种、年龄、和环境中用不同的形态表现， 但观察和研究中最常说明的主要有两种：一种是类神经膜细胞型，又称施旺细胞样 o e c s ，表达p 7 5 n 1 r 受体；主要分布与外周嗅神经系统内，呈纺锤形。主要负责轴突的 再髓鞘化和促进轴突生长。显微图片观察p 7 5 n 1 r 免疫组化反应物主要散步在嗅球的纤维 层和小球层没，阳性结构不规则，多形成片状的阳性反应区【2 引。一种就是类星形胶质细 胞型o e c s ，主要分布在小鼠嗅球内，多数扁平。缺乏p 7 5 n o r 受体，但g f a p 成免疫阳 性。显微观察g f a p 免疫阳性细胞在小鼠嗅球中分布范围很广，不仅在嗅球的纤维层和 小球层可以观察到，在深层的中心髓层区域也可以观察到很多的g f a p 免疫阳性类星形 胶质细胞，成不规则的阳性反应区【2 9 j 。 可见在嗅觉系统发育过程中，o e c s 就根据其在组织中定位的不同而体现出不同的 抗原表型。另有实验发现在体外培养纯化的o e c s 中，类星形胶质细胞型o e c s ，类似 g f a p ，e - n c a m 高水平表达，成强阳性；施旺细胞型o e c sp 7 5 n m 免疫阳性，部分g f a p 免疫阴性，e - n c a m 阴性。这两种细胞系肯定来自相同的谱系，但并未完全清楚两种细 胞之间的关联1 3 0 j 。 1 6 本研究的目的和意义 哺乳动物嗅觉通路细胞具有独一无二的终生持续分化和再生能力，可以不断地生长 4 东北师范大学硕士学位论文 轴突再次进入中枢神经系统，而且嗅神经轴突是目前发现的唯一的能够持续从周围神经 系统进入中枢神经系统的神经组织。随着o e c s 可以在直径合适的轴突周围移植，形成 类似周围神经施旺细胞髓鞘等功能的发现，使得o e c s 移植成为神经科学研究中解决 s c i 修复、神经再生这一难题的理想材料和方法。根据其特有的神经营养、迁移性、抑 制胶质增生、成鞘、促进轴突形成等功能，为神经科学研究提供了很大的科研空间。 随着o e c s 分泌因子功能的不断发现，为了更好地提取这些因子，如何获取高纯度 的体外培养o e c s ，成了研究者必经的一个过程。近年以来，国内外有大量o e c s 及其 培养方法的相关报道，但培养出的o e c s 细胞，效果不是十分理想，培养方法也都存在 一些不足。本实验室嗅鞘细胞课题中，以小鼠为实验材料，摸索出了一套可靠、快速、 稳定的o e c s 的培养方法【3 1 1 ，即采用改良的n a s h 差速贴壁法与阿糖胞苷抑制法相结合 的方法体外纯化培养o e c s ，并在光镜下观察了细胞的形态学特征，对细胞的生长特性 做了一定的描述，对o e c s 做了初步研究。 继续上述实验，本实验从生物化学本质上对体外纯化培养的o e c s 进行了免疫组化 鉴定，基本确定了此方法培养的细胞纯度。早期实验证明嗅鞘细胞是种可以表现出介于 星形细胞和施万细胞之间的，不同寻常特性的类似星形胶质细胞：g f a p 抗体已经被广 泛证实仅识别星形胶质细胞，而不识别神经细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞以及肿瘤 细胞等其它类型的细胞。因此g f a p 抗体被广泛用于星形胶质细胞的免疫染色鉴定。 之前通过小鼠体内免疫组化实验发现，o e c s 虽然在不同的物种、年龄、和环境中