（纺织化学与染整工程专业论文）己内酰胺及尼龙6的生物降解探讨.pdf

天津工业大学2 0 0 2 级硕士研究生学位论文 摘要 尼龙6 既是重要的纤维材料又是用途广泛的工程塑料，随着其用量日益增 加，一方面大量的废弃尼龙6 会形成白色垃圾，污染环境，另一方面其生产单体 己内酰胺也是有毒化合物，可导致动物的基因突变。因而有必要采取措施，防止 尼龙6 及己内酰胺对环境的污染。 本研究选取四个菌种：z y 菌、黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ，p e h ) 、f 4 菌和f l o w e r 菌，采用生物方法对己内酰胺等废弃物进 行处理，研究己内酰胺生物降解的动力学，探讨尼龙6 膜及纤维生物降解的可行 性。 通过测试4 2 0 n m 处的吸光度o d 4 2 0 研究z y 菌株的生长特性，研究结果表明 z y 菌是好氧菌，以m 1 为基础培养基，培养基p h 近中性，在3 0 ，1 4 0 r m i n 条件下z y 菌生长状况良好，能够将初始浓度不高于5 9 l 的己内酰胺在7 2 小时 内完全降解，证实z y 菌是己内酰胺的高效降解菌株。 研究过程中对z y 菌株进行了粗酶液的提取，提取的胞内酶和胞外酶对己内 酰胺都有较好的降解效果。对胞外酶降解己内酰胺动力学的研究得出z y 菌胞外 酶液的k m 值为6 2 5 1 0 1 m o l l ，k m 值较小，说明z y 菌提取酶对己内酰胺的 亲和力强。 课题对p c h 降解己内酰胺进行了初步研究，以m 2 为基础培养基，以磷酸盐 作缓冲液，在中性或偏酸性环境中p c h 生长情况较好，p c h 也是好氧菌，对己内 酰胺具有较好的降解效果。p c h 主要有两大酶系：木质素过氧化物酶和锰过氧化 物酶，其中对己内酰胺的生物降解起主要作用的是木质素过氧化物酶，而锰过氧 化物酶表现出了抑制作用。此外，p 拍的菌球本身对己内酰胺的降解效果也很显 著。经适当剂量的紫外辐射诱变后的p c h 对己内酰胺的降解效果得到提高。 用盐酸水解法制备了尼龙6 的低聚物，此低聚物可以作为微生物唯一的碳 源，但是需经过较长时间的适应过程。用相转化法制备了尼龙6 膜，虽然尼龙6 膜不能作为微生物唯一的碳源，但在己内酰胺存在的情况下，f 4 和p c h 可以吸 附到尼龙6 薄膜的表面并对尼龙6 薄膜进行刻蚀，使尼龙6 薄膜表面出现许多均 匀的刻蚀斑痕或孔洞。p c h 对尼龙6 纤维也有刻蚀作用。 己内酰胺及尼龙6 的生物降解为尼龙6 废弃物的处理及尼龙6 纤维的生物改 性奠定了基础。 关键词：己内酰胺，尼龙6 ，微生物，酶，降解 天津工业大学2 0 0 2 缓硕士研究生学位论文 a b s t r a c t n y l o n - 6i sak i n do fi m p o r t a n tf i b e rm a r t i a la n dw i d e l yu s e da se n g i n e e r i n g p l a s t i c s w i t ht h ea p p l i c a t i o ni n c r e a s i n g ，o nt h eo n eh a n d ，a l o to f n y l o n - 6w a s t eb r i n g i n t ol a r g ew h i t eg a r b a g ea n dp o l l u t et h ee n v i r o n m e n to fo u rl i f e ，a n do nt h eo t h e rh a n d ， c a p r o l a c t a r n ，t h em o n o m e ro fn y l o n - 6 ，i sn o x i o u s ，w h i c h c a ni n d u c et h eg e n e m u t a t i o no f p l a n t sa n da n i m a l s s ot h a ts o m em e a s u r e ss l i o l l l db et a k e nt or e d u c et h e p o l l u t i o n & t h ew a s t eo f n y l o n - 6a n dc a p r o l a c t a m i nt h i sp a p e r , f o u rs t r a i n sw e r es e l e c t e d ：z y , p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ( p c h ) ， f 4a n df l o w e r c a p r o l a c t a mw a st r e a t e dw i t hb i o l o g i c a lm e t h o d ，t h ek i n e t i c so f c a p r o l a c t a mb i o d e g r a d a t i o nw b ss t u d i e da n dt h ef e a s i b i l i t y o fb i o d e g r a d a t i o no f c a p r o l a c t a ma n dn y l o n - 6w a sd i s c u s s e d t h eg r o w t hc h a r a c t e ro f s t a i no f z yv c a 8s t u d i e db yt e s t i n gt h ea b s o r b e n c yo f t h e c u l t u r em e d i u mi n4 2 0 n m i ti si n d i c a t e dt h a ts t a i no fz yi sa e r o b i o s i s i nt h e c o n d i t i o no fm 1 锯t h eb a s i cc u l t u r em e d i u m ，m e d i u mp h ，3 0 ( 2 ，1 4 0 r m i n ，s t a i no f z yc a np r o p e r l yg r o w t ha n dc a r l c o m p l e t e l yd e g r a d ec a p m l a c t a mw h o s eo d g m a i c o n c e n t r a t i o nl e s st h a n5 e e li n7 2 h r c r u d ee n z y m ew a se x t r a c t e df r o ms t a i no fz y e i t h e rt h ee n d o e n z y m eo rt h e e x o e n z y m eh a sa ne x c e l l e n te f f e c to nd e g r a d a t i o no fc a p r o l a c t a m b ys t u d y i n gt h e k i n e t i c so fc r u d ee n z y m ed e g r a d i n gc a p r o l a c t a m ，i ti si n d u c e dt h a tt h ek mo fc r u d e e n z y m ee x t r a c t e df r o ms t a i no fz yw a s6 2 5x1 0 - s m o l l t h ek mi sl i t t l e ，a n d e x p l m n st h a tc r u d ee n z y m ee x t r a c t e df r o ms t a i no fz yh a ss t r a n g e ra p p e t e n c yt o c a p r o l a c t a r na f t e rs t a i no f z yw a sd o m e s t i c a t e db ye a p r o l a c t a m t h eb i o d e g r a d a t i o no fe a p r o l a c t a mw i t hp c hw a ss t u d i e di nt h i sr e s e a r c h p c h c a np e r f e c t l yg r o w t hi nt h eb a s i cc u l t u r em e d i u mm 2 ，p h o s p h a t ea st h eb u f f e r ( m e d i u mo rl i t t l ea c i ds i t u a t i o n ) j u s ta st h es t a i no f z y , p c hi sa l s oa e r o b i o s i sa n dc a n d e g r a d ec a p r o l a c t a mg r e a t l y t h e r e a r et w oe n z y m e s y s t e m si np c h ：l i g n i n p e r o x i d a s e s ( l i p ) a n dm a n g a n e s ep e r o x i d a s e s ( m n p ) l i pc a ni m p r o v et h e d e g r a d a t i o n o fc a p r o l a c t a mw i t hp c h ，o t h e r w i s e ，m 1 l p r e s t r a i ni t m o r e o v e r m y c e l i u mp e l l e to fp c hh a san o t a b l ee f f e c to nd e g r a d i n go fc a p r o l a c t a m t h e 墨兰三些查兰! 竺! 堡堡主堕塞兰兰垒望塞 c a p r o l a c t a md e g r a d a t i o ni si m p r o v e dw h e np c hw a s i n d u c e db ys u i t a b l eu l t r a v i o l e t r a d i a t i o n t h eo l i g o m e ro fn y l o n - 6p r e p a i r e db yh y d r o l y z i n gn y l o n 6w i t hh y d r o c h l o r i c a c i dc a l lb eu t i l i z e d 勰t h eo n l yc a r b o ns o u r c eo fm i c r o o r g a n i s m sa f t e rd o m e s t i c a t e d f o ral o n gt i m e a l t h o u g ht h em e m b r a n eo fn y l o n 一6p r e p a i r e db yp h a s ei n v e r s i o n m e t h o dc a n n o tb eu t i l i z e da st h eo n l yc a r b o ns o b r c e ，t h et h i nm e m b r a n ew a sg r e a t l y e t c h e db yp c ha n df 4w h e nc a p r o l a c t a mw a su s e da st h ec a r b o ns o u r c e f u r t h e r m o r e ， p c hc 锄s l i g h t l ye t c h e dn y l o n - 6f i b e r t h eb i o d e g r a d a t i o no fc a p r o l a c t a ma n dn y l o n 一6 l a y s af o u n d a t i o nf o rt h e b i o l o g i ct r e a t m e n to f w a s t eo f n y l o n - 6a n dt h eb i o l o g i cm o d i f i c a t i o no f n y l o n - 6f i b e r k e y w o r d s ：c a p r o l a c t a m ，n y l o n 6 ，m i c r o o r g a n i s m ，e n z y m e ，d e g r a d a t i o n i l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼三些盍堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：砀甲设身 签字日期：却说：眸) 月2 7 日 i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼王些盍堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞洼王些盍堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：即效青 导师签名： z 仍盘移 签字日期： t , - el t 年，胡7 e l 签字日期：) c 留牛年以月j 罔 学位论文的主要创新点 、从印染废水中提取了己内酰胺的活性降解菌株z y 。研究了温 度、振荡速率、底物浓度、p h 、接种量等对z y 菌株生长及对 z y 菌株降解己内酰胺的影响。 二、首次研究了微生物及其提取酶降解己内酰胺的动力学。 三、研究了紫外线对p c h 降解己内酰胺的影响。 四、以相转换法制备了尼龙6 膜，控制尼龙6 膜的厚度，并对微生 物降解厚度不同的尼龙6 膜进行了研究，其中f 4 和p c h 对尼 龙6 膜的降解效果最好。经过f 4 生物处理后，尼龙6 薄膜表面 出现大的刻蚀斑痕，而经过p c h 生物处理的尼龙6 薄膜表面形 成透明的网状结构。 五、在国内首次实现了微生物对尼龙6 纤维的刻蚀，虽然以己内酰 胺和葡萄糖为共代谢基质时，p c h 对尼龙6 纤维的刻蚀斑痕的 形状不同，但都实现了对尼龙6 纤维的部分刻蚀，为进一步研 究微生物刻蚀尼龙6 纤维的机理及尼龙6 纤维的生物改性奠定 了基础。 天津工业大学2 0 0 2 级硕士研寇生学位论文 第一章前言 1 1 尼龙及己内酰胺的发展现状 聚酰胺( p a ，即尼龙) 既是重要的纤维材料。又是用途广泛的工程塑料。 其纤维用途占到尼龙聚合物的7 5 ，被制成纺织品、工业丝和地毯用丝等，其中 运动服装、休闲装和针织品( 袜子) 等占尼龙纤维用途的4 7 ，地毯用占3 0 ，工 业纺织品如轮胎芯、绳索、渔网和防水帆布等占2 3 。作为工程塑料，聚酰胺在 世界各国生产能力和产量都占居首位，广泛应用于汽车、电器仪表、邮电通讯、 办公自动化设备、包装、合成纤维等行业。 己内酰胺是用于生产尼龙6 纤维和树脂的单体。己内配胺的生产方法有多 种：如法国d s m h p o 工艺、b a s f _ n 0 还原工艺、i n v e n l n - - n o 还原工艺、 a 1 l i e ds i n g n a l 异丙苯苯酚法、c p r o p o 工艺、东丽p n c ( 光亚硝化) 工艺、意 大利s n i a 甲苯工艺等。目前，为了提高聚酰胺与聚酯、聚丙烯的竞争能力，国 内外积极开发生产己内酰胺的新技术，如意大利e n i c h e m 公司开发了双氧水酮氨 氧化酯化新技术；d s m 公司和d up o n t 公司合作开发用丁二烯和一氧化碳生产 己内酰胺；日本住友化学公司将与意大利e n i c h e m 公司联合推出气态己内酰胺 生产工艺路线等。这些新技术特点是：生产成本较低且不产生硫酸铵副产品。 己内酰胺在一定条件下发生缩聚反应生成聚己内酰胺即尼龙6 ，存在于聚己 内酰胺中的少量单体及低聚物用热水萃取出来以用于后加工，萃取水含单体及低 聚物约4 。尼龙6 生产过程中产生大量废水，尼龙6 厂废水来源主要包括三效 冷凝水、精馏釜清洗水、其它设备清洗水以及后加工过程中产生的含纺丝油剂废 水。三效冷凝水中只含有己内酰胺，精馏釜清洗水含己内酰胺约8 0 ，含己内酰 胺低聚物约2 0 。水质分析结果见表i 1 ： 表1 - 1 己内酰胺废水分析结果 c o d c rb o d s s s 废水种类ph ( m l ) ( m g l ) ( m g l ) 三效冷凝水 6 91 10 0 0 - i 80 0 0 40 0 0 - - 65 0 0 0 精馏清洗水 6 9 其它废水 6 9 3 0 00 0 0 20 0 0 9 00 0 0 10 0 0 7 00 0 0 1 5 0 壁鱼堕查! 二! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 塑 其中s s 为悬浮固体 近年来，己内酰胺生产量呈上升趋势。世界己内酰胺年均需求增长率为 天津工业大学2 0 0 2 级硕士研究生学位论文 2 5 3 o ：亚洲地区( 除日本外) 因合成纤维工业的快速发展及尼龙6 纤维等 的原料需求旺盛，使己内酰胺出现大幅度的供不应求，己内酰胺年均需求增长率 为4 ，5 。 然而。己内酰胺却是有毒化合物。 徐贻萍等对己内酰胺的毒性研究表明，己内酰胺属低毒类化合物，主要作用 于中枢神经，特别是脑干，可引起实质性脏器的损害【2 】。即使其浓度低于5 6 m g m 3 ( 低于国家最高容许浓度1 0 m g m ，) ，仍能导致头昏、头痛、乏力、失眠、记忆 力减退、食欲下降、皮肤瘙痒、牙龈出血等症状。国外也早在2 0 世纪8 0 年代就 对其进行了深入研究。g r o s s 和s h a m a 等报道了己内酰胺对动物、植物、人及微 生物的毒性研究【3 “。s h e l d o n 和v o g e l 也指出己内酰胺可以导致基因突变，进而 对染色体进行破坏 5 - 6 1 。因而有必要采取有效措施，减少或防止己内酰胺对环境 造成的污染。 1 2 己内酰胺等废弃物的处理方法 目前对己内酰胺等废弃物的处理主要有三种途径：回收利用、化学萃取和生 物降解。 1 2 1 己内酰胺废弃物的回收利用 在尼龙6 生产过程中，由于己内酰胺开环聚合是可逆反应，因此聚合反应最 终产物中仍含有1 0 左右的己内酰胺单体和2 5 左右的低聚物【7 】。这些物质的 存在，会使纺丝等后加工难以进行，因此生产中，大都通过热水萃取，将切片中 大部分的已内酰胺单体和低聚物萃取出来1 8j 。由于萃取水中已内酰胺单体和低聚 物含量较高，因此生产过程中为节约成本和保护环境一般要将其回收利用。 目前大都是将萃取液蒸发浓缩，然后在真空状态下，将浓缩液进行蒸馏，回 收已内酰胺，回收的己内酰胺直接用于聚合生产。所用回收工艺有两效蒸发蒸馏 回收工艺和三效蒸发蒸馏回收工艺【9 j 。 另外，a 1 1 i e ds i n g n a l 公司、d s m 公司等开发从废聚酰胺产品( 如地毯等) 中回收己内酰胺技术，如美国佐治亚州奥古斯塔的e v e r p e n 尼龙6 循环厂每年能 将9 0 ，0 0 0 吨尼龙6 地毯废料转化为4 5 ，0 0 0 吨己内酰胺。用此再生的己内酰胺制 造的尼龙6 与新的尼龙6 质量相同。 由于蒸馏装置和蒸汽种类不断得到改进，己内酰胺的回收率也不断提高，已 经由最初的3 0 4 0 上升到了7 0 9 0 i l ，极大地节约了原料成本。但是，回收装 置复杂，且需要大量的热源来驱动，节约原料成本的同时也消耗了大量能源。生 产中蒸发器易发生结垢现象，一旦结垢，生产就无法进行，而拆开设备去除垢物 天津工业大学2 0 0 2 级硕士研究生学位论文 既费时费力，又影响了生产的连续性】。而且单体回收不完全，残渣内仍有部分 己内酰胺。残留的己内酰胺只能通过降解的方式彻底去除。 1 2 2 己内酰胺废弃物的化学萃取 化学方法处理有机废弃物是一种简洁易行的废弃物处理方法，其中萃取法在 有机废水处理中广为应用。一般的萃取法是依据“相似相溶”原则来进行的，用 该法进行有机物废水处理所需能耗较小，且不改变化学物质的结构。但这种方法 对极性有机物稀溶液的分离常常不理想，因为若选用极性大的物质作溶剂，在萃 取有机物的同时，溶剂又溶解到水中，从而导致较大溶剂流失以及二次污染。近 年来开发的基于可逆络合反应的络合萃取方法因具有高效性和高选择性，尤其是 对极性有机物稀溶液的分离具有高效性及高选择性而成功应用于极性有机废水 的处理，如含酚废水处理、苯胺废水及含醋酸废水的处理等。蔡锐等将这一方法 应用于己内酰胺废水的处理，取得了良好效果【1 2 】。 为使络合反应具有良好的可逆性，就要选择合适的络合剂和稀释剂。目前常 用的络合剂有磷类有机化合物和胺类有机化合物。稀释剂应不仅是络合剂的良好 溶剂，而且能够调节混合萃取剂的粘度、密度及界面张力等参数。基于上述原则， 结合己内酰胺一般呈中性( 有时也呈弱酸性或弱碱性) ，可发生水解、氯化、卤 化等反应的特点，络合萃取法处理己内酰胺废水时一般选择中强碱磷酸三丁酯作 为络合剂，三氯乙烯为稀释剂。络合萃取方法处理己内酰胺废水，既可以降低废 水中己内酰胺等废弃物的含量，而且络合萃取后的己内酰胺还可以进行回收利 用。 1 2 3 己内酰胺废弃物的生物降解 生物反应过程通常在常温、常压下进行，与常常需要高温、高压条件的化工 过程相比，反应条件大大简化，因而投资少、费用少、消耗低。由于生物酶对底 物有高度的特异性，因此生物转化的效率高，副产物少，其最终产物大都是无毒 无害、稳定的物质，如二氧化碳、水、氮气和甲烷等。利用微生物方法处理污染 物通常能一步到位，避免了污染物的多次转移，因此它是一种消除污染的安全而 彻底的方法。美国环保局( e p ：a ) 在评价环境生物工程时也指出“生物处理技术 优于其他新技术的显著特点，在于其是污染物消除技术而不是污染物分离技术” 【1 3 】。 采用微生物技术对己内酰胺进行降解是消除己内酰胺污染最有效的方法。 天津工业大学2 0 0 2 级硕士研究生学位论文 1 3 己内酰胺及尼龙的生物降解 生物过程是以酶促反应为基础的作为催化剂的酶是一种活性蛋白质，因此 生物反应过程通常是在常温、常压下进行的。另外。酶对底物有高度的特异性， 因此生物转化的效率高，副产物少，反应条件大大简化，因而投资少、费用少、 消耗低，而且效果好、过程稳定、操作简便；同时在多数情况下它可以和其他技 术结合使用。生物处理技术还易于进行大规模操作，一些生化曝气池、生物滤池 的容积之大，也是其他工艺过程所望尘莫及的。生物方法还可以因陋就简地利用 天然水塘或土壤层作为污染物处理场所，可大大降低处理费用。 用生物过程代替化学过程可以降低生产活动的污染水平，有利于实现工艺过 程生态化或无废生产，真正实现清洁生产的目标。据美国环保局估算，美国现有 的化学工业若有5 为生物过程取代，污染防治费用可降低约l 亿美元。 1 3 1 己内酰胺等废弃物生物降解的国外研究概况 国内很少有人研究己内酰胺的生物降解行为，但国外早在1 9 8 1 年。s h a m a w a s e 用多种微生物共同作用于己内酰胺废弃物，初步实现了微生物对己内酰胺、 6 氨基己酸( 6 - a c a ) 及其低聚物的降解i l “。而b a x i & s h a h 则不仅研究了混合 菌对己内酰胺废弃物的生物降解，而且从混合菌中分离出单株优势菌( 此优势菌 对己内酰胺、6 - a c a 及其链状低聚物降解效果显著) ，对己内酰胺的生物降解进 行了全面的研究”。 该研究以尼龙6 生产厂的活性淤泥菌为菌源，通过培养基( g l ) ：k 2 h p 0 40 2 ， k h 2 p 0 40 6 ，n a c l0 3 ，n h 4 c 10 4 ，m g s o a 7 h 2 00 2 ，c a c i 2 h 2 00 1 ，f e c l 3 0 1 ，p h 值为7 2 ，培养混合菌，然后分离出四种单一菌：a l c a l i g e n e s f a e c a l m ( 产 碱杆菌属) ，a r t h r o b a c t e rc i t r e u s ( 节细菌属) ，b a c i l l u s s p h a e r i c u s ( 芽孢杆菌属) 和r h o d o c o s s g sr h o d o c h r o s 做红球菌属) 。分别以混合菌和单一菌作用于己内酰 胺废弃物( 降解基与培养基相同) ，在3 0 。c ( 2 。c ) ，1 8 0 f f m 的振荡箱中进行培 养和降解。 以己内酰胺作为唯一的碳源和能源，四种菌中a l c a t i g e n e s 如e c a l i s 与 a r t h r o b a c t e rc i t r e u s 在2 4 h 对己内酰胺的降解效果较好，降解率分别为9 0 和 8 0 。其中a l c a l i g e n e s f a e c a l i s 降解速率较快，l o h 即可达到稳定期，而a r t h r o b a c t e r c i t r e u s 达到稳定期则需4 0 h 。因此可选择a l c a l i g e t i e s f a e c a l 括作为单株优势菌。 一般来说混合菌比单一菌对污染物的降解效果要好，但该研究中四种菌的混 合菌对己内酰胺废弃物的降解效果并不优于单一菌a l c a l i g e n e s f a e c a l i s ，如表1 2 所示： 蒌望三些盔兰! ! 堡堑堡主竺塞兰堂壁堕塞一 表卜2 混台菌及单一菌彳，c 口 睁h 如凰对己内酰胺废弃物降解效果比较 堕堡 竺翌萱旦些! 竺型竺兰! 竺里亘里q 里! 竺型竺生! 竺q 旦塑堕堡! 兰! 一 不接种 1 5 5 0 0 1 5 5 0 0 0 混合菌 1 5 5 0 0 a f a e c a l i s 15 8 6 6 5 但是，无论是混合菌还是单一菌a l c a l i g e n e s f a e c a i i s ，己内酰胺、6 - a c a 及 其链状低聚物都得到了大幅度降解。高效液相色谱( h p l c ) 分析结果表明，己 内酰胺的降解率达8 7 6 ，6 a c a 及其链状低聚物则几乎完全被降解。 环状低聚物由于其环的存在导致微生物不易接近，因而就难于被微生物降 解。据f u k u m u r a 等称，c o r y n e b a c t e r i u ma u r a n t i a c u m ( 棒状杆菌属) 的分离株 b 2 能够降解6 - a c a 的环状低聚物，如环状的三聚物、四聚物、五聚物等但不 能降解环状的二聚物1 1 6 1 c o l y n e b a c t e r i u ma u r a n t i a c u m 可以产生两种不同的酶分 别水解环状和链状低聚物，种酶可切断环状低聚物，在p h 为7 6 - 8 i 时，使坏 状低聚物变为链状低聚物，进而由另一种酶在p h 为8 6 时切断链状低聚物，将 链状低聚物转变成小分子，实现6 - a c a 环状低聚物的生物降解。 继此之后。k i n o s h i t a 与k a n a g a w a 以6 - a c a 的环状二聚物为唯一碳源和氮 源培养分离出f l a v o b a c t e r i u ms p ( 产黄菌属) k 1 7 2 ( i f 0 1 4 5 9 0 ) 和p s e u d o m o n a s s p ( 假单胞菌属) n k 8 7 m 。8 1 。k 1 7 2 与n k 8 7 对环状二聚物有较好的降解效果。 k 1 7 2 对环状二聚物的生物降解源于它所产生的三种酶：6 - a c a 环状二聚物水解 酶e i ，6 - a c a 二聚物水解酶e i i 和外部型6 - a c a 低聚物水解酶e i i i 。目前已经 对三种酶e i 、e i i 、e i i i 进行了深入研究【”j ，在此研究基础上，还成功地将对尼 龙6 低聚物不具降解性的f l a v o b a c t e r i u ms p k 1 7 2 5 及p s e u d o m o l l sa e r u g i n o s a p a o l 培养成了尼龙6 低聚物的活性降解菌。 日本的k o s u k et o m i t a 等从土壤中分离出株类似6 e o b a c i l l u s t h e r m o c a e n u l a t u s 的耐热菌株，该菌株在6 0 ，尼龙1 2 含量为5 9 l 的条件下 将尼龙1 2 由分子量4 1o o o 降解到il0 0 0 。此菌株也可在同样条件下将尼龙6 6 由分子量4 30 0 0 降解到1 70 0 0 ，但是却对尼龙6 没有降解效果”。u r s ak 1 u n ， j o z i c af r i e d r i c h 等用一种白腐菌对尼龙6 进行了生物处理，在纤维表面发现 了较为明显的刻蚀痕迹，是生物技术应用于尼龙降解方面的一大进展“”。 1 3 2 己内酰胺等废弃物生物降解的国内研究概况 由于己内酰胺对微生物具有抑制性，微生物只有经过培养驯化才能较好地分 解己内酰胺。尼龙6 生产废水通常与其它废水混合后进行处理，这样己内酰胺的 天津工业大学2 0 0 2 级硕士研究生学位论文 浓度被稀释，对生物处理系统不会造成太大影响。现运行的废水处理设旆必须控 制进水c o d 浓度不能太高，因此国内很多尼龙6 生产厂采用加水稀释的办法以 降低进水浓度拉“。 国内用生物技术处理己内酰胺废水的方法主要有a o 技术法和f o 技术法。 所谓a o 技术，就是由缺氧( a n v o x l c ) 与好氧( o x l c ) 两个生物反应过程 组成的a o 生物脱氮系统。国外七十年代初提出a o 系统处理城市污水的脱氮 工艺技术，到八十年代已有较大规模的应用。a o 法的基本原理是：污水中的氨 态氮在好氧段里，自养型硝酸菌和亚硝酸菌在氧气充足条件下将氨氮氧化为亚硝 酸盐和硝酸盐，此过程称谓硝化过程，简称硝化。经过硝化后的氨氮变成硝酸盐 态氮，将其投入到缺氧池中，在缺氧条件下利用异养型兼性反硝化菌作用，将 n 0 2 与n 0 3 - 作为最终电子受体还原成n 2 排入大气【2 3 l 。 a o 生物处理系统具有能同时去除c o d 和脱氮的特点，按微生物在系统中 所处的状态，分为悬浮污泥法和生物膜法两大类。悬浮污泥法工艺较成熟，应用 较多，而生物膜法应用相对较少，但与悬浮污泥法相比，生物膜法具有剩余污泥 少、生物不易流失等优点 2 4 】。 f o 技术就是即兼氧与好氧两个生物反应过程的简称，它不如a o 技术法常 用，但杨青等的应用实践表明，利用f o 技术处理己内酰胺废水也可达到较好的 效果【2 5 】。 1 4 本课题研究内容 就目前来说，国内外对己内酰胺及尼龙6 生物降解行为的研究仅仅处于起步 阶段，尤其缺少对微生物降解己内酰胺及尼龙6 的动力学研究。而本课题重点研 究己内酰胺的生物降解行为，探讨己内酰胺的生物降解动力学，并对生物降解尼 龙6 低聚物、薄膜和纤维作一尝试。主要内容如下： ( 1 ) 降解菌的收集及富集培养( 驯化) ( 2 ) 高效液相色谱测试条件的探索 ( 3 ) z y 菌对己内酰胺的降解 ( 4 ) z y 菌对己内酰胺的降解动力学 ( 5 ) z y 菌株酶制剂的提取及其对己内酰胺降解 ( 6 ) 黄孢原毛平革菌( 只o h ) 对己内酰胺的降解 ( 7 ) 微生物对尼龙6 低聚物、薄膜和纤维的降解研究 墨堡三些查堂婴! ! 璧堡圭翌塞生堂堡堡塞 一 第二章理论部分 2 1 生物降解的巨大潜力哪! 作为一个整体，微生物分解有机物的能力是惊人的。可以说，凡自然界存在 的有机物几乎都能被微生物所分解。有些种类，如葱头假单胞菌( p s e u d o m o n a s c e p a c j a ) 甚至能降解9 0 种以上的有机物，它能利用其中任何一种有机物作为碳 源和能源进行代谢。有毒的氰化物、酚类化合物等，也能被不少微生物作为营养 物质利用和分解。 半个多世纪以来，人工合成的有机物大量问世，如杀虫剂、除草剂、增塑剂 等，它们一般在短时间内难以被微生物降解，尤其是不少合成的有机物在研制开 发时的目的之一就是要求它们具有化学稳定性，因此，微生物一接触这些陌生物 质，开始时难以降解也是不足为奇的。但由于微生物具有极其多样的代谢类型和 很强的变异性，近年来的研究已经发现很多微生物能够降解人工合成的有机物， 甚至原以为不可生物降解的合成有机物也找到了能降解它们的微生物。因此，通 过研究，有可能使不可降解的或难降解的污染物转变为能降解的，甚至能使它们 迅速、高效地去除。 2 2 生物降解和生物转化的特点1 ( 1 ) 生物降解和生物转化反应迅速。环境污染物形态和结构的改变，可以 通过化学反应或生物作用来实现。通常生物作用迅速，无机物和有机物的转化都 是如此。生物在环境有机物的降解过程中起着重要作用。尽管化学反应也会使有 机污染物的结构发生变化，但这种变化通常是细微的，产物与母体化合物在结构 上和毒性上经常相似。但是生物作用则大不相同，生物作用的实质是在生物酶的 催化作用下进行一系列生化反应。因为酶的催化作用反应迅速，因此生物的作用 也非常迅速，而且通常很彻底，可使许多有机物降解为对人体无害的c o z 和h z o 等小分子。 ( 2 ) 微生物在生物降解和转化中起着重要作用。大量研究表明，能够使环 境污染物降解的生物主要是微生物。微生物体积微小，数量多，种类多，代谢活 动旺盛，代谢类型多样，具有催化污染物转化的各种酶系统。微生物无处不在， 它们栖息于土壤、沉积物、废水、固体废弃物、地表水以及动植物体内。它们在 环境物质转化中发挥着重要作用。每一种天然产物，不管它的构象如何复杂，都 会在特定的环境中被这种或那种微生物降解。如果这些物质不被降解，终将会在 天津工业大学2 0 0 2 级硕士研究生学位论文 地球上大量积累。然而在现在的好氧生态系统中还没有看到天然产物有明显的积 累，这就表明微生物区系对各种天然产物具有惊人的转化作用。一种微生物代谢 有机物的能力是有限的，但在同一环境中有多种微生物同时存在，共同代谢有机 物的能力就会十分强大。 ( 3 ) 生物降解经常与微生物生长联系在一起。生物降解过程是有机物发生 转化的过程，同时也是微生物呼吸与同化的过程。在呼吸过程中，微生物利用有 机物作为能源提供动力；在同化过程中，微生物利用有机物中的碳和呼吸产生的 能量构建细胞自身。同化作用的结果表现为微生物的生长，这样微生物可以有更 多的酶来催化生物化学反应，从而加速污染物转化，如在活性污泥反应器中，有 机物有一部分转化为c o ：和i - t 2 0 ，一部分转化为细胞体，表现为活性污泥数量和 浓度的增长。 ( 4 ) 生物降解过程受各方面因素的影响很大，形成的产物变化也很大。环 境条件( p h 、温度、水分等) 会对生物降解过程产生重要影响，环境中不同的碳 源、营养成分、氧化还原电位以及不同的微生物种群也都会对生物降解过程产生 影响。 2 3 微生物降解原理。8 微生物降解有机物一般有两种方式，一种方式是微生物以某一类有机化合物 作为其生长的唯一碳源，有时还作为唯一的氮源。另一种方式是通过共代谢进行 降解，即微生物从某些其它化合物获得碳源和能源，转化原来不能被利用的一些 有机物，直至完全降解。许多化合物都需要多种微生物的一系列共代谢反应才能 完全降解。 微生物对有机物的代谢过程是通过自身产生的酶的催化作用来完成的，由于 各种微生物产生的酶不同，因此不同微生物对各种有机物的降解能力存在着很大 的差别。微生物对有机物的降解具有特异性和选择性，决定了自然环境中有机物 的生物降解大多是通过混合微生物群落来完成，即些微生物可以利用某一种或 某一类有机物并将其转化为另一种化合物，而另一些微生物则可以利用转化产生 的中间产物作为营养，并使其进一步分解代谢，直至降解为c o ：、h 。o 及其它的无 机物为止。 微生物降解机理：首先高分子材料的表面被微生物吸附，微生物黏附表面的 方式受高分子材料表面张力、表面结构、多孔性环境的搅动程度以及可侵占表面 的影响。其次微生物在高分子材料表面分泌酶，酶再作用于高分子，通过水解和 氧化等反应将高分子断裂为低分子量的碎片，然后微生物吸收或消耗低分子量的 碎片，最终形成c 0 2 、心0 及生物量。除上述生物化学作用外，也存在生物物理作 天津工业大学2 0 0 2 级硕士研究生学位论文 用，即微生物侵蚀聚合物后，由于细胞的增大，致使高分子材料发生机械性破坏 进而降解为碎片。 2 4 酶 2 4 1 酶的广泛应用 酶是一种在生物体内具有新陈代谢催化剂作用的蛋白质。它们可以特定地促 成某个反应而它们本身却不参与反应，且具有反应效率高、反应条件温和、反应 产物污染小、能耗低和反应易控制等特点。 酶具有高效，专一和反应条件温和的特点。它的这些特性有助于提高生产效 率，降低成本，避免不必要的副反应，简化分离提纯步骤，为有目的地开发特定 产品提供良好的途径：减少设备投资，提高安全系数；减少环境污染。 酶可以改变被作用对象的物理化学性质或赋予作用对象新的功能，如对象的 溶解性、乳化性、持水性、粘度等等。解决产品沉淀。提高原材料利用率或提高 产品的可溶性，调整产品生产过程中粘度或生产出粘度适当的产品，去除杂质。 结合适当的调控手段，酶可以改变原副材料选定部位的性质、溶解原副材料中特 定部位，也可开发特定物化特性的产品；这些作用有助于改善最终产品的加工过 程，提高产品性能和开发新的功能性产品。 酶可以有选择，有控制地通过特定方式改变对象的化学结构，这些方式包括 水解、氧化还原、裂解、合成、异构、转移基团等，使被作用对象按预定设想发 生化学反应。生产出特定产品。 2 4 2 酶的提取“” 酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂来处理含酶原料，使酶充分溶解 到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。大多数酶能溶 解于水，可以用水、稀酸、稀碱或稀盐溶液进行提取。有些酶与脂质结合在一起 或具有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并防止酶 的变性失活，在提取过程中，要注意控制好温度、p h 等各种条件。 根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有赫溶液提 取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。 天律工业大学2 2 轻硕士研究生学位沧文 2 5 微生物及酶降解有机物的动力学原理 2 5 1 微生物降解有机物的动力学 在微生物降解有机物的动力学方面，目前有两种最基本的经验模型1 ：幂 指数模型和双曲线模型。 在基质降解过程中，如果不考虑微生物生长这一因素，可以用幂指数模型来 描述基质降解速率与基质浓度的关系。然而这是一种理想的情况，微生物在降解 过程中不可能停止生长，所以不可能忽略不计。所以本实验采用考虑微生物生长 的双曲线模型来描述基质降解速率与基质浓度的关系。双曲线模型是m o n o d 于 1 9 4 9 年提出的，故又称为m o n o d 方程。其公式为： s “2 p “瓦丙 式中“为微生物比生长速率，即单位量的微生物的生长速率；um a x 为微生物的 最大比生长速度：s 为基质的浓度：k s 为半饱和常数，即当p = 口皿8 x 2 对的基质 的浓度，k s 代表微生物与支持其生长的有机营养物质的亲和力，数值越小，微生 物对营养物质分子的亲和力越丈。 在m o n o d 方程中，基质的减少与微生物的生长的关系如下 凼! 矗妊 d t yd t 其中m 为基质的量，y 为生长比率系数，上式表示单位微生物生长速度与单 位微生物生长所消耗的基质呈现线形关系。又由 d m d l p 2 了 l l m n s u 2 三k s + s d sm 。“ s i 。一下。蕊 在 o n o d 模型中，u m “只与细胞本身及其生长介质的成分有关。而与生长介 质的浓度无关。所以，可令k m “= 岩，则上式可以化为： 争面m 熹 在高浓度基质条件下，s 远远大于船这时与s 相比，k s 可以忽略，所以 一d z 芷。肘 一 m f j 盘 在这种条件下，降解速度与基质浓度无关。 在低浓度条件下，s 远远小于岛，这肘与缸相比s 可以忽略，所以 1 0 天津工业大学2 0 0 2 级硕士研究生学位论文 一d s = - k 。肘羔 田缸 若这时微生物数量和微生物的活性保持恒定或相对不变，即过程处于相对稳 定阶段时，可假定 t = 警 这样就得到一个一级动力学方程： d s ：舾 田 其中k 为降解速率常数。对上式进行积分，可得： 即： 亡塑：c - k d t 矗os旬 l n s = - k t + i n s o 其中s o 为基质的初始浓度。 相应的基质降解的半寿期为： t a = l n 2 k 2 5 2 酶促反应动力学 描述酶促反映动力学最经典的模型是米氏方程： v = s v m a x ( k i n + s ) 其中s 为基质的浓度：v