（生物医学工程专业论文）一种新phya基因的克隆、表达及其生物活性测定.pdf

重庆大学硕士学位论文中文摘要 表达主要形式为胞内表达、最佳诱导表达时间为3 h 、i p t g 诱导浓度o 3 0 9 l 、 最适表达温度为3 0 。 5 、采用n i - n t a 亲和层析进行表达产物的分离纯化，s d s p a g e 和w e s t e r n b l o t i n g 验证纯化的目标蛋白。得到电泳纯的重组植酸酶，其分子量约为5 0 k d a ，表达 蛋白占大肠杆菌总蛋白的3 6 6 2 ；免疫学检测这一特异蛋白带即是带有6 个 组氨酸的p h y a 蛋白。 6 、进行重组植酸酶部分酶学特性研究。实验结果表明：檀酸酶的最适温度温度为 6 5 c 、最适p h 为4 5 ，金属离子对植酸酶活性存在不同程度的影响；重组植 酸酶酶活较天然植酸酶活性提高了1 6 9 倍。 本研究中，b l 2 1 - p e t 3 0 a 十_ p 盘州和m g l 3 6 3 一p m g 3 6 e - p h y a 基因工程菌的构建， 为实现生物反应器大量、高效生产耐温性好的植酸酶提供了优良的菌种。同时开 展e c o l i p h y a 表达的研究，将为今后研究和开发多功能微生态制剂，实现畜牧业 综合化、环保化发展等应用研究奠定坚实的基础。 关键词：植酸酶，克隆，表达，纯化，酶学特性 i i 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t p h y t a s cw a sg a n e f i cn a m e f o rak i n do f e n z y m e s w h i c hc a nc a t a l y z et h eh y d r o l y s i s o fp h y t a t ei n t om y o - i n o s i t o la n dp h o s p h a t e i th a dt h es p e c i a la c t i o no f h y d r o l y z i n g t h ep h y t a t e i tc o u l da c c e l e r a t et h em o n o s t o m a c h a b s o r b i n g t h ep h o s p h o r u s ；i tc o u l d i m p r o v e t h eu t i l i z a t i o nr a t eo f n u t r i t i o n a lv a l u eo f a n i m a lf e e da b o u t 5 0 m e a n w h i l e ，i t c o u l dd e g r a d et h ep r o d u c t p h y t a t e ，w h i c hc o u l db i n ds o m em u l t i - m e t a li o n sa n dp r o t e i n s i na d d i t i o n ，i tc o u l dp o s s e st h ea c t i o n so fa c c e l e r a t i n ga n i m a l s g r o w i n g ，p r o t e c t i n g e c o t y p i ce n v i r o m e n t s oi th a dp r a c t i c a li m p o r t a n c ea n dp o t e n t i a la p p l i c a t i o nv a l u ei n f e e d 、f o o d s 、m e d i c i n ei n d u s t r ya n da n v i r o m a n tc o n s e r v a t i o n s t u d yi n t e n t i o n s ：u t i l i z i n g t h e t e c h o n o l o g y o f g e n e t i ce n g i n e e r i n g f o r m a n u f a c t u r i n gt h ep h y m s e , n o to n l yc o u l d r i s et h ep r o d u c t i o na tb i gr a n g e ，b u ta l s o c o u l da c c o r d i n gt ot h ed e m a n da l t e r a t i n gt h e s p r o p e r to fp h y t a s e a tp r e s e n t ，o n l y d e v e l o p e de u r o p ea n da m e r i c ah a dt h ec o m m o d i t yo fr e c o m b i n a n tp h y t a s e b u ta l lo f t h ep h y t a s ew a s e x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i s ，i th a dt h eb e h a v i o r s ：c o s tp r i c eo f p r o d u c e w a ss oh i g h ，t h ec y c l eo f p r o d u c ew a ss o l o n g ，t h et e c h n i q u ew a ss oc o m p l i c a t e d s ot h e s p r e a d i n ga n da p p l i c a t i o no fp h y t a s ew a sl i m i t e d i no u rc o u n t r y , t h ea p p l i c a t i o na n d b a c k g r o u n di n v e s t i g a t i o nf o rg e n e t i ce n g i n e e r i n go fp h y ag e n ew a sn om o r e s o m e s c i e n t i s t ss t u d yo n p h y t a s eg e n eb ya d o p t i n gf i x e dp o i n t m u t a t i o n 、r a n d o m l ym u t a t i o n a n dc o n s t r u c t i n gan e wt y p ee x p r e s s i o n s y s t e m b u tt h ee f f e c t i o no fe x p r e s s i o n a l p h y t a s ef o rb e a r i n gh i g ht e m p e r a t u r ea n ds t a n d i n gt h ea c i dv 船n o ts i g n i f i c a n t n o w n o r e a l l yp r o d u c t i o no f r e c o m b i n a n tp h y t a s ew a ss a l ei nt h em a r k e t p h y t a s e w a sa b i o l o g yc o m p r e h e n s i v e n u t r i e nf a c t o r i n p r a c t i s e a n d a p p l i c a t i o n , p e o p l ev e r y w i s h e dt h ep h y t a s ec o u l dp o s s e s e n z y m o l o g yp r o p e r tf o r i n d u s t r i a l i z e dm a n u f a c t u r i n g w i t ht h ed e v e l o p m en to f p h y t a s eg e n e t i ce n g i n e e r i n g ，t h e e x p r e s s i o no f r e c o m b i n a n tp h y t a s ep r o t e i nw a san e wh o ts p o tb yd i f f e r e n te x p r e s s i o n a l v e c t o r s t h i sr e s e a r c hs e l e c t e dt h e s t r o n gf u n c t i o n a lp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r p e t 3 0 a + a n dp m g 3 6 e s ou s i n gt h ee x p r e s s i o nv e c t o r ，s u c c e s s f u l l yc o n s t u c t e dt h e g a n ee n g i n e e r i n g s t r a i n s e c o l i b l 2 1 - p e t 3 0 a + - p h y a a n dl a c t o b a c i l l u s m g l 3 6 3 。p m g 3 6 e 。p h y a t h e n w e w i s h e d t o o b t a i n t h e p h y t a s e o f m a s s h i g ha c t i v i t y 、 o b e a r i n ga c i d sa n dg o o ds t a b i l i t y a n dp r o v i d e db a s i cd a t a sa n ds c i e n c ea c c o r d i n g s f o rd e v e l o p i n gan e wt y p eo f m u l t i - f u n c t i o n a l e c o l o g i c a la g e n t ，w h i c hh a dm u c h p h y t a s e u pt on o w , t h e r eh a dn or e p o r t sa b o u tu s i n gt h et w oe x p r e s s i o nv e c t o rf o r e x p r e s s i n gp h y t a s e 1 1 1 重塞盔堂亟圭堂垡堡皇 苤塞塑塞 m e t h o d s 、c o n t e n s t 、e x p e r i m e n t r e s u l t s ： 1 t oo b t a i nt h ep r i m i t i v es t a i n sw i t hh i g l la c t i v i t y , w eu t i l i z e d t h eu l t r av i o l e t m y ( u v ) f o ri n d u c i n g t h ea s p e r g i l l u sn i g e rs t r a i n s , w h i c hx m 2 t $ s e p a r a t e da n di d e n t i f i e d b yo u r s e l v e s r e s u l t ：w eg o tt h ea s p e r g i l l u sn i g e rf 2 4 6w i 也t h ea c t i v i t yo fp h y t a s e a b o u t1 3 5 4 8 3 u m l 2 u s i n gt h ep r i m e r 5 0s o f tt od e s i g nt w op a r t so f p r i m e r s d i r e c t l yp c ra m p l i f i e d t h e g e n o m e d n ao ft h ea s p e r g i l l u sn i g e rf 2 4 6 t h ep r o d u c t i o nw a st h em a t u r a t i o np e p t i d e o ft h ep h y a g e n e a f t e rs e q u n c i n gt h ep h y ag e n e ，i t w a sc o n f i r m e dt h a tt h el e n g ho f p h y t a s eg e n e w a s13 4 7 b p t h e s e q u n c ew a s an e wp h y t a s e g e n e i t s a m i n o - a c i d s s e q u e n c es h o w e dt h a t t h i s g e n ee n c o d e dap e p t i d e so f4 6 7a m i n o - a c i d s s e q u e n c e a n a l y s i sd e d u c e d t h a tt h e r ew e r e5p o t e n t i o n a l n - g l y e o s y l a t i o ns i t e sw i t h i np h y ag e n e 3 i nt h i ss t u d yw ec o n s t r u c t e dt w o e x p r e s s i o ns y s t e m s ：e c o l i 、l a c t o b a c i l l u s p h y a g e n ew a si s o l a t e df r o mp m d l 8 t - p h y a 、i t i lr e s t r i c t i o ne n z y m e a n d d i r e c t l ys u b e l o n e d i n t o e x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 0 a + a n dp m 0 3 6 e a n dc o n s t r u c t e d t w on e wt y p eo f e x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 0 a + 一p h y a a n dp m g 3 6 e - p h y a t h et w on e wr e c o m b i n a n tv e c t o r p e t - 3 0 a + - p h y a a n dp m g 3 6 e p h y aw e r et r a n s f o r m e di n t ot h ee c o l is t r a i nb l 2 1 ( d e 3 ) a n dl a c t o b a c i l l u sm g l 3 6 3b ye l e c t r o p o r a t i o nm e t h o d t h e nw eo b t a i n e dt h eg e n e t i c e n g i n e e r i n gs t r a i n s ：b l 2 1 - p e t 3 0 a + - p h y a a n d m g l 3 6 3 - p m g 3 6 e - p h y a 4 u s i n g t h e e c o l i p h y ae x p r e s s i o ns y s t e m ，c o u l de x p r e s st h ep h y t a s e f o r n v e s t i g a t i o n m o r e o v e ro p t i m i z i n g t h e e x p r e s s i o nc o n d i t i o n ，a n dg e t t i n g t h eb e s t e x p r e s s i o nc o n d i t i o n ：t h ep a t t e r n o fe x p r e s s i o nw a si n t e r - c e l l e x p r e s s i o n ，t h e b e s t i n d u c i n gt i m ew a s3 h t h eb e s ti n d u c i n gc o n c e n t r a t i o no f i p t gw a so 3 0 9 l , t h e o p t i m a t i o n a le x p r e s s i o nt e m p e r a t u r e w a s3 0 ( 2 5 t h ee x p r e s s e dp r o t e i nw a sc o n s e q u e n t l yp u r i f i e db yn i - n t ac h r o m a t o g r a p h y c o l u m n t h et a r g e tp r o t e i no fe x p r e s s i o nw a se v e n t u a l l yv e r i f i e db ys d s - p a g ea n d w e s t e r nb l o t i n g s ow eo b t a i n e dt h ee l e c t r o p h o r e s i sg r a d ep h y t a s e ，i t sm o l e c u l a r w e i g h t a r o u n d5 0 0 k da n di t sq u a n t i t ym o u n t i n g u p t o3 6 6 2 o f t h et o t a lc e l lp r o t e i n w i t ht h e d e t e c t i o no f i m m u n o l o g y ；t h e p a r t i c u l a rp r o t e i n c o r dv c a st h e6x h i s t i d i n e s p h y t a s e 6 t h ei n v e s t i g a t i o no fr e c o m b i n a n t p h y t a s ef o re n z y m o l o g yp r o p e r t t h er e s u l t so f e x p e r i m e ms h o w e d ：t h eo p t i m a t i o n a lt e m p e r a t u r eo f p h y t a s ew a s6 5 t h eb e s tp hw a s 4 5 ，t h em e t a l - i o n sh a v ed i f f e r e n te f f e c t i o nf o rt h ea c t i v i t yo f p h y t a s e t h ea c t i v i t yo f r e c o m b i n a n t p h y t a s ew a s 1 9 6t i m e sf o rn a t u r a lp h y t n s e i nt h i s r e s e a r c h ，w e s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e dt h e g e n e t i ce n g i n e e r i n g s t r a i n s ：b l 2 1 - p e t 3 0 a + 一p h y aa n dm g l 3 6 3 - p m g 3 6 e - p h y a i tp r o v i d e dt h ef i n es t r a i n s i v | 夔盔堂堡堂焦垒塞 墓塞塑薹 f o rm a k i n gt h eb i o r e a c t o r q u a n t i t ya n dh i g he f f e c t i v ep r o d u c i n gt h e p h y t a s e i n t o r e a l i z a t i o n ，w h i c hc o u l db e a r i n gt h eh i g ht e m p e r a t u r e a tt h es a r n et i m e ，t h ee c o l i p h y ae x p r e s s i o nw a st h eb a s eo fs t u d y i n ga n dd e v e l o p i n gn e wm u l t i f u n c t i o n a l e c o l o g i c a la g e n tw i t hp h y t a s e a n d s u p p l i e ds o m em e s s a g et or e a l i z et h e g r e e n e n g e n e f i n go f l i v e s t o c kf a r m i n g k e y w o r d s ：p h y t a s e ，c l o n i n g ，e x p r e s s i o n ，p u r i f i e a t i o n , e n z y m o l o g yp r o p e r t v 重庆大学硕士学位论文缩略词 a m p k a n p l l v a m l g l m i r l m w 0 d p a g e p c r p m s f r p m s d s i p t g x g a l 缩略词 氨苄青霉素 卡那霉素 植酸酶基因 毫升 微升 分钟 分子量 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚和酶链式反应 苯甲基磺酰氟 转速( 转每分钟) 十二烷基黄酸钠 异丙基b d 硫代半乳糖苷 5 - 溴4 氯3 一吲哚b d 半乳糖苷 v l 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 1绪论 1 1 研究意义与背景 植酸酶( p h y t a s e ，p h y a ) 是一种特异水解植物性饲料中的植酸及其盐类物质的磷 酸酶。广泛分布于微生物、植物及部分动物细胞中，其水解能释放出肌醇、无机 磷及一些微量元素，从而可提高植物性食品和饲料的营养价值【。在动物的营养中， 植酸几乎存在于所有植物性饲料源中，是动、植物中磷的主要贮藏形式，其结构 如图所示： 圈1 社豫i 鸯相示意圈( 圈中 皿c 分舅矗t , - t a 啊i 净粗皤啊口翻阳新壹勘憧檀嘲哺瞳附龃) 它具有以下几个重要性质：1 ) 单胃动物的消化道中不分泌或分泌很少的植酸降解 酶，而植酸本身又不能被重吸收，所以猪、鸡饲料中通常需要补充无机磷以满足 其磷需求。而大部分植酸磷则随动物粪便直接排出体外啪。2 ) 植酸是一种强抗营 养因子，其特殊的分子结构使其具有很强的络合作用，能与c a 2 + 、z n 2 + 、f e 2 + 等金 属离子形成难溶性植酸盐络合物【3 】。3 ) 植酸能与带正电荷的蛋白质、维生素等形 成难溶复合物。从而降低许多消化酶类( 淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等) 的活 性，严重影响单胃动物对上述营养物质的吸收和利用，并引发相应的营养缺乏症 及疾病 4 1 。据统计，我国每年从畜禽粪便中排出的有机磷达2 5 0 万吨之多，因而造 成严重的水体富营养化污染，其罪魁祸首之就是动物高磷粪便的直接排放【5 1 。因 此解决饲料中的植酸磷的有效利用成为饲料添加剂研究热点。 我国是一个农业大国，畜牧养殖业在国民经济中占有举足轻重的地位。随着人 们生活水平的提高和科学技术的发展，迫切需要我国养殖业向综合化、环保化方 向发展。据统计，动物利用机体中磷的效率仅为9 7 ，造成大量植酸磷不能被有 效利用，这对严重缺磷的我国而言，既是一种巨大的浪费，也是对我们生态环境的 严重威胁。无机磷作为动物体所必须的重要元素之一，我国每年要生产磷酸氢钙 8 0 1 2 0 万吨用于饲料中无机磷的添加，而生产磷酸氢钙又严重污染自然环境，特 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 别是江、河、湖泊的水体污染1 6 。可是植酸酶能专一分解植酸及其盐类物质，形成 禽、畜可直接利用的磷酸和肌醇磷酸，同时可解除植酸的抗营养作用，从而可提高 饲料中磷的利用率、降低饲料成本、减轻磷污染、保护我们的生态环境，并有效 防止与植酸有关的动物消化系统疾病。因此，研究植酸酶具有极为重要的现实意 义和非常可观的经济、生态效益。 目前，由于微生物代谢的多样性，不同微生物来源植酸酶的性质存在差异，即 使同种微生物菌种，不同培养方式所产生的植酸酶，其生化特性也不一致。因此， 植酸酶的研究主要集中于产植酸酶的微生物发酵生产研究【”。9 0 年代以前，我国 在这方面基本上没有开展研究。1 9 9 0 年6 月，在h o h e n h e i m 大学纪念m e n k j d 教 授退休暨任教2 5 周年的欧洲动物营养论坛会上，原化工部饲料添加剂开发中心的 外派专家同d r l a n t z s e h 交流植酸和植酸酶时，只谈到中国能生产大量的肌醇和 磷酸。现在，我国大部分植酸酶产品主要还是依赖进口，价格昂贵，一般为2 万 美元吨，从而限制了植酸酶在生产和工业上的应用。据我国饲料工业协会统计： 植酸酶的成本为5 0 0 0 元吨，加上7 0 0 元吨的运输等其它消耗，市场价大概为6 0 0 0 元吨，而市场上的植酸酶的售价在2 万元吨左右。植酸酶市场价值1 9 9 8 年为5 个亿，2 0 0 0 年达1 0 个亿。按中国饲料工业的发展规划，2 0 1 0 年和2 0 2 0 年中国饲 料的需求量分别为1 亿吨和1 7 亿吨，按千分之一的加酶量算，植酸酶的需求量应 为1 0 万吨和1 7 万吨，按2 万元吨来计算，那么其市场应分别为2 0 亿元和3 4 亿 元。正因如此，国内现有一些科研单位已相继完成或正在进行植酸酶的开发和研 究。上海永兴农科生物工程公司用改良的工程菌生产出植酸酶，产酶量是常规菌 的1 0 0 0 倍，但酶的活性不能满足生产要求，难以实现产业化生产。中国农业科学 院姚斌等通过基因工程的方法，利用基因工程酵母高效表达植酸酶，其活性较天 然的植酸酶产生菌高3 0 0 0 倍以上，与国外植酸酶产品相比，生产成本低，并达到同 类产品的酶学性质，但是该酶耐温性有待于进一步提高，难以直接添加饲料，实 现工业化生产1 8 】。因此，获得高产、稳定的产植酸酶基因工程菌，生产出耐高温、 耐酸性好的植酸酶是目前国内外研究的热点和难点，深入研究开发利用植酸酶前 景广阔 9 1 。 在国外，植酸酶的研究较早，而且有一些植酸酶产品已经被广泛应用于欧美 各国的畜牧养殖、工业化生产以及农产品加工等产业。大大推动了发达国家饲料 工业的飞速发展和农业的现代化进程。早在8 0 年代中期，欧洲就致力于寻找全面 解决无机磷污染的方案。而直接的动因是即将在原欧共体成员国实施的环境保护 议会核心内容限制养殖业的磷排泄量。而荷兰首当其冲，直到8 0 年代后期， 荷兰w a p i n g e n 大学克隆植酸酶基因出现突破，才有了商业开发的可能。同时，也 引起德国巴斯夫对饲料添加剂领域的高度重视。巴斯夫和荷兰的g i s t 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 b r o c a d e s s m 的前身) 都意识到了植酸酶的潜力，共同集中研究进行商品化开发植 酸酶，并率先利用基因转移技术，于1 9 8 4 年首次成功使用a s p e r g i l l u s n i g e r 工业化 规模生产商品植酸酶。同年获得欧洲饲料添加剂管理机构的全面批准认可，陆续 在荷兰、德国等欧洲市场以“酶他富”f n a t u p h o s ) 为商品名上市。3 0 年来，以优 质的产品和对营养学深人的研究及认识处于世界领先的地位。也就是从这时起， 各国以大学、研究所和各类商业研究机构为主投入了大量的人力物力资源，开始 了大量的研究【1 0 1 。当前，在欧美国家应用最广泛的植酸酶产品主要是3 种酶制剂： 荷兰公司的“自然磷”，其特点是对热稳定性、碱性和酸性条件下均具活性：美国 公司的“澳吉美”在欧洲已经广泛使用，其热和p n 值稳定性均好；芬兰公司的多 酶系列产品，如多酶s p 、t p 、s f 等，除可节省磷外，还可提高纤维素和植物蛋白的利 用率【l 。 植酸酶因为其特殊的降解作用和广泛的应用。其酶学性质以及产植酸酶的微 生物选育和基因改造研究发展也较快。当前国外使用的植酸酶基因工程菌均是以 n r r l 3 1 3 5 菌株作为出发菌株进行研究和生产。如丹麦n o v o 公司生产的植酸酶就 是用该菌的基因工程菌开发出来的。1 9 9 1 年荷兰的麦斯特布罗b 德有限公司在 中国申请了微生物植酸酶基因的克隆与表达专利，也是以n r r l 3 1 3 5 菌株的基因 克隆，并构建基因工程菌，在黑曲霉中表达植酸酶 1 2 1 , v a ng o r c o m d 等构建了3 株重组a n i g e r 菌株，植酸酶产量高达2 8 1 0 3 u m l ，较天然植酸酶产生菌株酶 活提高了3 0 倍。目前这一菌株已用来工业化生产植酸酶【l3 1 。p e nj 等将带有黑曲 霉植酸酶的基因转入烟草种子中得到转基因种子，实验结果显示：植酸酶蛋白占 成熟种子总蛋白1 ，可作为一种新型饲料添加剂，其效果和添加真菌植酸酶或无 机磷相割川。m a r i s ak c h e 1 i u s 等用紫外照射法对n r r l 3 1 3 5 菌株进行改良，获 得的突变菌株其植酸酶产量为野生型的3 3 倍。而我国对植酸酶的研究起步较晚， 主要以无花果曲霉n r r l 3 1 3 5 开展研究【l “。山西大学生命科学系诸西宁【1 6 l 等首次 分离到一种产植酸酶的青霉菌变灰青霉，此菌产酶效果较好，植酸酶活性可 达3 1 2 0 u m l 。赵允磷【l h 等分离出一黑曲霉菌株( a s p n i g e r 7 0 ) ，并与国际上公认 的无花果曲霉n r r l 3 1 3 5 菌株的产酶特性进行了比较，其黑曲霉培养5 6 d 便可达 到产菌高峰，较n r r l 3 1 3 5 产酶提前3 d 达到高峰。陈红歌1 1 8 l 以黑曲霉( a s p n i g e r m a o 2 1 ) 出发菌株，经紫外线、亚硝基胍单独处理和复合处理，获得一株植酸酶高 产菌株u n - 1 2 1 0 ，其植酸酶活力达到2 9 5 0 u 3 0 1 5 u m l ，是原始出发菌株的3 6 倍。刘德忠以无花果曲霉2 1 2 3 1 5 为出发菌株，用钻照射诱变，获得两株产植酸酶 活力较高的菌株，在最适液态培养条件下，两株菌产酶活力比出发菌株提高了 1 6 8 5 7 ，发酵时间从9 d 缩短到5 d 。胥传来【1 9 1 等从黑曲霉( a s p n i g e r ) q a 筛选出一 株产植酸酶菌，在3 0 下恒温培养4 d ，其最高酶活可达1 7 9 7 u m l ，酶的热稳定 里盎盔堂堡主兰垡丝塞 ! 堕堕一 性较好，温度提高到5 5 * ( 2 ，菌液仍保持9 3 4 的酶活，温度升到7 0 1 2 ，酶活尚存 8 7 7 。上述植酸酶的研究都是实验室研究结果，综上所述，我国目前还没有真正 商品化的植酸酶，大多数植酸酶产品都不能完全满足工业生产以及应用的要求， 特别是酶的活性和热稳定性还需要深入研究。但植酸酶作为一种新型饲料添加剂， 其发展潜力已引起越来越多研究者的重视，集中研究适合于饲料生产的植酸酶己 成为我国农业现代化的新问题之一。 天然产植酸酶菌株产酶水平一般较低，提取成本太高，无法满足将来的应用， 无商业开发价值。利用基因工程手段不仅可以解决这些问题，还可能通过改变基 因结构，来获得人们所需求的产品。因此，对植酸酶及其基因的深入研究，生产 出高活性植酸酶和开发含植酸酶的微生态制荆，也成为世界各国研究植酸酶的主 要手段，是实现畜牧业环保化、农业综合化的重要保证。 1 2 植酸酶研究进展 1 2 1 植酸酶的分类 植酸酶( p h y t a s e ) l 非肌醇磷酸水解酶，是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸及 磷酸盐的一类酶的总称【2 0 】。它是一种糖蛋白，其糖基组成及比例为甘露糖：半乳 糖：n 乙酰葡萄糖胺= 9 ：l ：3 ，约含有4 7 0 个氨基酸，分予量在5 0 6 0 k d a 左右1 2 1 1 。 它广泛分布于植物、反刍动物、及许多微生物( 酵母、曲霉、细菌) 中。现已知 的植酸酶是一种磷酸酶类。根据p h 值划分，主要分为酸性磷酸酶、中性磷酸酶和 碱性磷酸酶，其中真菌来源的酸性磷酸酶是哺乳类动物肠道和胃需要的磷酸酶， 碱性磷酸酶主要来源于细菌，适合添加到鱼类饲料中，因为该植酸酶的最适p h 与 鱼类的肠道为碱性环境一致【2 2 1 。另外，根据磷酸基团在其分子结构上的位置不同 可分为3 种类型磷酸酶，包括：肌醇六磷酸3 磷酸水解酶、肌醇六磷酸6 磷酸水 解酶和非特征性的正磷酸单酯磷酸水解酶。3 一植酸酶即从3 一位开始将六磷酸肌 醇依次降解为5 、4 、3 、2 、1 一磷酸肌醇及正磷酸，6 一植酸酶是6 一位开始将植 酸降解，最终产物都是单磷酸肌醇( 2 磷酸肌醇) 和正磷酸。植物和大肠杆菌植酸 酶属于6 植酸酶，而真菌和大多数细菌植酸酶则属于3 植酸酶。通常所说的植 酸酶是指肌醇六磷酸3 磷酸水解酶1 2 3 。目前，研究最多的是微生物来源的植酸酶， 特别是真菌产生的植酸酶，因为它具有产量高，p h 值范围广、活性高、耐热性强 等优点，成为生产商品植酸酶的主要来源。 1 2 2 植酸酶的功能 植酸酶现已开始应用于饲料工业、食品工业和医药工业，显示出广阔的应用 前景和潜在的巨大商业价值。其功能主要表现在以下几个方面：第一，植酸酶作 4 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 为新型单胃动物饲料添加剂，通过对猪、肉用仔鸡、火鸡等证明，植酸酶都能提 高磷的利用率，有利于钙的利用，解除了植酸对锌的强烈螯合，大幅度增加铁的 利用率阱】。从而减轻我国富营养化极为严重的水域污染，避免水体中的氮和磷的 过量排放。据报道，植酸酶的使用将使畜、禽粪便中磷的排出量减少4 0 7 5 ， 从而可使我国每年磷的排放量减少约1 8 0 万吨，大大减轻江河、水域等环境的磷 污染1 2 5 1 。第二，缓解我国磷资源匮乏、磷供应不足的局面。我国是一个缺磷大国， 磷的产量不足需求量的1 1 0 ，是仅亚于蛋白质的第二大缺口饲料原料。植酸酶的 使用可代替饲料原料中所添加的无机磷( 主要为磷酸氢钙) ，从雨可关停一批磷酸氢 钙生产企业，具有极为重要的社会效益和生态效益【2 6 】。第三，植酸酶能将植酸盐 分解成肌醇或肌醇磷酸盐，实现工业化生产。其产物中的三磷酸肌醇能消除体内 的自由基以及镉、铝等在体内的副作用；另外它还具有抗血小板凝聚和消炎等作 用【2 ”。第四，国外现已经开始试用食品级植酸酶处理粮食，以分解粮食中的植酸 ( 盐) ，从而减小植酸对微量元素的螯合作用，以提高粮食的营养价值，并开发出高 级保健食品1 2 8 j 。当然，随着酶工业和生物技术的发展，植酸酶的新用途也逐渐被 发现并应用于工农业生产，如开发植酸酶菌肥，循环利用土壤中有机磷；也可以 在谷物淀粉加工中处理废弃物等等。 1 2 3 植酸酶的理化性质 植酸酶的分子量。目前，饲料用植酸酶主要使用微生物曲霉菌株来生产。霉 菌植酸酶分子量一般在6 0 1 0 0 k d a 之间。曲霉植酸酶分子量较大，如土曲霉为 2 1 4 k d a ，无花果曲霉为8 5 1 0 0 k d a 、黑曲霉为2 0 0 k d a 。细菌植酸酶分子一般较 小，如大肠杆菌为4 2 k d a ，枯草杆菌植酸酶的分子量为3 8 k d a 。植物来源的植酸 酶分子量大小不一样，较小的有大豆植酸酶为5 4 k d a ，较大的有绿豆植酸酶达1 5 8 k d a ，一般在3 0 2 5 0k d a 之间【2 9 j 。总之，植酸酶的分子量因来源不同差异很大， 其差异主要由于糖基化之故，真菌植酸酶都是糖基化蛋白，随糖基化程度不同， 分子量差异很大。有人对植酸酶非糖基化蛋白等进行了研究，发现真菌植酸酶糖 基化模式多种多样，且各不相同。因为植酸酶基因在不同的表达系统中，糖基化 程度不一样，即使在同一表达载体时，糖基化程度也不一样，主要是由于潜在的 n - 端糖基化位点个数不一样。同时发现耱基化对酶的专一性、酶的活性没有太大 的影响，而对酶的分子量和热稳定性影响较显著，对酶的等电点有不同程度的影 响p o 】。 植酸酶的最适p h 值。植酸酶最适p h 值一般在2 6 之间。植物来源的植酸 酶最适p h 为4 o 7 5 ，大多数在5 0 6 0 ，不适合在单胃畜、禽胃中酸性环境起 作用，且在植物中含量太低。细菌来源的植酸酶最适p h 一般为中性或偏碱性。真 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 菌植酸酶为2 5 7 0 。黑曲霉n r r l 3 1 3 5 能产生两种不同的植酸酶，一株最适p h 值为5 5 和2 5 ( p h y a ) ，另一株最适p h 为2 o ( p h y b ) ，两种菌株发酵和生产的植酸 酶，经体外试验发现：在p h 值为2 5 和5 5 时活性最强，可能是因为p h 为2 5 时， 与胃中的酸碱度相接近；p h 为5 5 时属于肠道p h 值变化范围内p ”。n e w m a n t 捌 等人在1 9 9 1 年发现由a s p e r g i l l u sn i g e r 生产的植酸酶在p h 为5 0 6 5 时，具有最 强的活性，也有碱性植酸酶最适p h 值为8 0 的报道。不同来源的植酸酶的最适p h 值也存在差异。 植酸酶的最适温度。植酸酶最适温度在4 0 6 0 范围内，不同来源植酸酶 的最适温度相差也较大。由于饲料加工的制粒工艺中有一个短暂的高温过程，温 度在7 5 c 9 3 c 之间，一般的植酸酶活性在此高温下不可避免的发生失活。从嗜 温微生物中分离到的高温植酸酶其最适温度在7 0 8 0 ，虽然有很好的耐温性， 但它在3 7 c 下的酶活性极低，没有使用价值；而来源于黑曲霉等的植酸酶在3 7 下具有较高酶活性，但它又不能经受制粒时的高温。所以能在饲料中真正得到推 广利用的植酸酶必须是具有良好热稳定性的田j 。目前，在酶的耐热性方面已有许 多富有成效的研究，一种较简单有效的方法就是采用酶的包被技术，使酶包裹在 包衣中而免受制粒高温的破坏，包衣在动物胃中可被消化而释放出酶。欧洲的一 种常用方法是把液态植酸酶制剂洒在制成的颗粒料上，或使用冷压制粒。s i m o n s 3 4 1 等研究了制粒时温度对植酸酶影响后发现，样品在制粒前蒸汽加热至5 0 。制粒 过程达到8 l ，其酶活性下降1 6 ；样品如蒸气加热至6 5 ，制粒达8 4 或8 7 时，则酶活性分别降至原来的8 3 和4 6 。s w i c k r a 瞰j 用a n i g e r 生产的植酸 酶作试验，结果表明：将其置于9 0 环境3 0 r a i n ，其活性不超过1 6 ，因此认为 植酸酶在正常制粒条件下是比较稳定的，只要在生产和研究中严格控制温度、时 间等条件变化，完全可使酶免受破坏。现有酶的包被、缓释技术，可以同时解决 酶的耐高温以及保持高酶活，但是加工成本较高，难以大批量的生产和推广应用。 所以，如何使得酶既能短暂耐高温又能在动物体中具有高酶活性，是目前饲用植 酸酶酶制剂急需解决的一个问题，通过基因工程、蛋白质技术等使植酸酶本身就 具有良好的热稳定性无疑是很有意义的。 植酸酶的激活因子与抑制因子。多数二价阳离子( c a 2 + 、f e 2 + 、z n 2 + 、m 9 2 十、 c u 2 + 等) 因与底物( 植酸) 发生强烈的络合作用而抑制酶的活力。另外，草酸、柠檬酸 等化合物也可能因与酶活性中心关键氨基酸的侧链基团反应而降低酶活，常见的 底物竞争性抑制剂等的出现也会对酶的作用效果产生不利的影响。对于些植酸 酶，则存在某种特定的金属离子可以作为电子转移载体起到酶激活剂的作用，如 f c 2 + 能激活酿酒酵母植酸酶、c a 2 + 可以激活枯草杆菌植酸酶等等。对于a n , g e r n r r l 3 1 3 5 产生的植酸酶，c a 2 + 、f j + 对酶活无显著影响；m n 2 + 、c 0 2 + 有激活作用， 6 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 能使酶的活性分别提高3 0 和1 3 ，c u 2 + 、z n 2 + 、f e 2 + 对酶活性则具有明显的抑制 作用。另外对一些来源于动物、植物的酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如l ( + 卜 酒石酸、磷霉素对它却没有抑制作用1 3 7 1 。络合作用如下图： n 枉t 一 子 圈i 植酸及站台韵蛄鞫示意瞳( l d 为聚合阳膏子) 1 2 4 植酸酶的作用机理 植酸酶能将肌醇六磷酸( 植酸) 分解成为肌醇和磷酸。它是将植酸分子上的磷酸 基团逐个切下，形成中间产物肌醇一磷酸脂、肌醇二磷酸