（环境科学专业论文）厦门西海域超微型真核浮游生物遗传多样性研究.pdf

a b s t r a c t a f i n g e r p r i n tt e c h n i q u ep c r - d g g ew h i c hw a sb a s e do nt h et h e o r yo fs m a l l s u b u n i tr i b o s o m a lr n a ( s s ur n a , 18 sr r n a ) g e n ea n a l y s i sw a sd e v e l o p e db y u s i n gm o l e c u l a rt e c h n i q u e sw h i c hi n c l u d ed n ae x t r a c t i o n , p c ra m p l i f i c a t i o n ， d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) ，c l o n e s e q u e n c i n ga n ds o m e o t h e r t e c h n i q u e s t o e x p l o r et h eg e n e t i cd i v e r s i t y o fe u k a r y o t i c u l t r a p l a n k t o n a s s e m b l a g e si nw e s t e r nx i a m e nw a t e r s t h ep r e l i m i n a r ys t u d yw a sc a r r i e do u to n g e n e t i cd i v e r s i t y , t e m p o r a la n ds p a t i a ld i s t r i b u t i o n so fe u k a r y o t i cu l t r a p l a n k t o n a s s e m b l a g e si nf o u rt y p i c a ls t a t i o n so fw e s t e r nx i a m e nw a t e r s ，r e l a t i o n s h i pb e t w e e n g e n e t i cs t r u c t u r ea n de n v i r o n m e n t a lf a c t o r sw o u l db ed i s c u s s e d ，m a i nc o n c l u s i o n s w e r ea sf o l l o w i n g ： 1 t h eg e n e t i cd i v e r s i t i e so ft h ee u k a r y o t i cu l t r a p l a n k t o na s s e m b l a g e si nw e s t e r n x i a m e nw a t e r sw e r e v e r yh i 曲a n dt h e m a i n g r o u p s w e r e c h l o r o p h y t a , s t r a m e n o p i l e s ，h a p t o p h y t e s ，d i n o p h y c e a e ，n o v e la l v e o l a t e sa n du n i d e n t i f i e dg r o u p s c h l o r o p h y t a , n o v e ls t r a m e n o p i l e s ，n o v e la l v e o l a t e sa n du n i d e n t i f i e dg r o u p sw h i c h w e r et h em o s te x t e n s i v e l yd i s t r i b u t e da n dr e l a t i v e l ya b u n d a n th a v ep l a y e dv e r y i m p o r t a n tr o l e si nd y n a m i c sa n do t h e ra s p e c t s o fe u k a r y o t i c u l t r a p l a n k t o n a s s e m b l a g e si nt h es t u d ya r e a 2 t h eg e n e t i cs t r u c t u r e so fe u k a r y o t i cu l t r a p l a n k t o na s s e m b l a g e sh a v es h o w e da s e a s o n a lv a r i a t i o n si ns o m ed e g r e ei nw e s t e r nx i a m e nw a t e r s ，a n dt h es e a s o n a l c h a n g i n gp a t t e r n so fg e n e t i cs t r u c t u r e si ns t u2 3w a st h em o s tp r o m i n e n to n ea m i d t h a to ft h o s eo t h e rt h r e es t a t i o n sa n di ti n d i c a t e dt h a tt h eg e n e t i cs t r u c t u r e so ft h e m o n t h l ys a m p l e sw h i c hh a v eh i g h - t e m p e r a t u r ef e a t u r e sa r er e l a t i v e l ys i m i l a ri ns o m e d e g r e e ，w h i l e t h e g e n e t i c s t r u c t u r e so ft h e m o n t h l ys a m p l e s w h i c hh a v e l o w - t e m p e r a t u r ef e a t u r e sa l s os h o w e da s i m i l a rp a r e mi ns t n2 3 ，t h e s et r e n d sc a na l s o b ea p p l i e dt oo t h e rt h r e es t a t i o n si nd i f f e r e n td e g r e e s s o m eo t u s ( o p e r a t i o n a l t a x o n o m i cu n i t s )c a nb ec o r r e l a t e dw i t ht h eh i g h - t e m p e r a t u r ef e a t u r e dm o n t h l y s a m p l e s ，a n dt h el o w - t e m p e r a t u r ef e a t u r e dm o n t h l ys a m p l e ss e p a r a t e l y i n s i d e d i f f e r e n tc o r r e s p o n d i n gs t a t i o n s v a r i a t i o n so fa s s e m b l a g e s g e n e t i cs t r u c t u r e sa m o n gd i f f e r e n tg e o g r a p h i c a l s t a t i o n si n d i c a t e dt h a tt h ep a t t e r n so fa s s e m b l a g e ss t a b i l i t ya m o n gt h ef o u rs t a t i o n sa r e d i f f e r e n t , t h ea s s e m b l a g e s s t r u c t u r ea l er e l a t i v e l y s t a b l ei ns t n2 6 ，w h i l et h e a s s e m b l a g e s s t r u c t u r e so fs t n2 7a l ev e r yu n s t e a d y ；d i f f e r e n tg r o u p so f o t u sw e r e s p e c i f i cc o r r e l a t e dw i t l ld i f f e r e n ts t a t i o n sa n dt h e s t a t i o n sw h i c hs h a r e st h es a m e g e n e t i cs t r u c t u r ep a t t e r n s 3 r e l a t i v i t ya n a l y s i sb e t w e e ne n v i r o n m e n t a lf a c t o r sa n da s s e m b l a g e s s t r u c t u r e s i n d i c a t e dt h a td i f f e r e n to t u s 陀f e s i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e dw i t hd i f f e r e n t e n v i r o n m e n t a lf a c t o r s ( s u c ha s t e m p e r a t u r e ，s a l i n i t y a n dn u t r i e n t s ) ，a n dt h e t e m p e r a t u r em i g h tb eo n eo ft h em o s ti m p o r t a n te n v i r o n m e n t a l f a c t o r sw h i c h i n f l u e n c e dt h eg e n e t i cs t r u c t u r e so fe u k a l y o t i cu l t r a p l a n k t o na s s e m b l a g e si nw e s t e r n k e yw o r d s ：e u k a r y o t i cu l t r a p l a n k t o n ，g e n e t i cd i v e r s i t y , p c r - d g g e ， w e s t e r nx i a m e n 侈白t e r s a m p a p s b l a s t b p c a c t a b d g g e d m s o d n a d n t p e d t a f c m f i s h h p l c i p t g i s i u i t s i ( b l b a m p i c i l i n a m m o n i u mp e r s u l f a t e 缩略词表 氨苄青霉素 过硫酸铵 b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b a s ep a i r 碱基对 c o r r e s p o n d e n c ea n a l y s i s对应分析 c e t y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e溴化十六烷三甲基铵 d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s变性梯度凝胶电泳 d i m e t h y ls u l f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 二甲基硫 脱氧核糖核酸 三磷酸脱氧核苷 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 f l o wc y t o m e t r y 流式细胞仪 f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n 荧光原位杂交 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱 i s o p r o p y i t h i o 一1 3 d g a l a c t o s i d e异丙基硫代一1 3 - d 半乳糖苷 ns t ur e v e r s et r a n s c r i p t i o n i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r k i l ob a s ep a i r l u r i a b e r t a n im e d i u m n e s t - p c rn e s tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n m r n a n m d s n 0 2 - n n 0 3 - n n s n t o t u s m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d 原位反转录 千碱基对 l b 培养基 巢式p c r 信使r n a n o n p a r a m e t e r i cm u l t i d i m e n s i o n a ls c a l i n g非参数多维排序 n i t r i t e n i t r a t e n o v e ls t r a m e n o p i l e s n u c l e o t i d e o p e r a t i o n a lt a x o n o m i cu n i t s 亚硝盐 硝酸盐 核苷 可操作分类单元 p c a p c r p 0 4 - p p r a s p v p r a p d r f l p r i s a r n a r p m r r n a s s c p s d s t a e t e t e m e d x g a l p r i n c i p a lc o m p o n e n t sa n a l y s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h o s p h a t e p r a s i n o x a n t h i n p o l y v i n y lp y r r o l i d o n e 主成分分析 聚合酶链式反应 磷酸盐 青绿藻黄素 聚乙烯吡咯烷酮 r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a随机扩增多态性 r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m限制性片段长度多态性 r d n ai n t e r n a ls e q u e n c ea n a l y s i s r d n a 间隔区序列分析 r i b o n u c l e i ca c i d r o u n dp e rm i n u t e 核糖核酸 转每分 核糖体r n a s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m 单链构象多态性法 s o d i u md o d e c y l s u l f a t e十二烷基磺酸钠 t r i s a c e t i ca c i d e d t ab u f f e r t r i s e d 别b u f f e r n , n ，n ，n , - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 四甲基乙二胺 5 - b r o m o - 4 c h o l o r o 3 i n d o l y l p d - g a l a c t o s i d e 5 - 溴- 4 一氯一3 吲哚- p - d 一半乳糖苷 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以 明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：多也磊 硼年 具卜e t 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( 4 ) ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 壹搋 参“ 日期：加6 年7 月) 日 ， 日期：p 虬年i 月b 日 l 第一章绪论 第一章绪论 第一节超微型浮游生物研究意义 海洋占据地球总表面积的7 0 8 ，总水量的9 6 5 ，与全球气候变化有着密 切的关系，在调节全球各大圈的平衡与变化中起着不可估量的作用。海洋资源是 人类生存和发展的宝贵财富，尤其是在对陆地资源的开发和利用日趋达到极限的 今天，合理的开发和利用海洋资源并保护好海洋资源对未来几个世纪人类的生存 和发展有着至关重要的作用。 海洋浮游生物数量众多，很大程度上影响到整个海洋生态系统的结构和功 能，在海洋生态系统中起着极其重要的作用。有关海洋生物的地球化学过程方面 的研究一直为海洋研究者所热衷，特别是近十几年来，国际上在此方面的研究， 无论在概念上还是技术上都不断有新的发展和突破，进展十分迅速。与此同时， 新生产力( n e wp r o d u c t i o n ，d u g d a l e & g o e r i n g ，1 9 6 9 ) ，微食物网m i c r o b i a lf o o d w e b ，a z a me ta 1 ，19 8 3 ) 以及生物泵( b i o l o g i c a lp u m p ，l o n g h u r s ta n d h a r r i s o n ，1 9 8 9 ) 等概念的提出，也进一步突显了生物过程在海洋碳循环中的研究 意义与重要性。此外，颗粒计数器的应用导致了粒径谱概念的产生( s i e b u r t he ta 1 ， 1 9 7 8 ) ，粒径谱理论的提出不仅为定量研究生态系统能流、物流以及以模式研究 浮游生物动力学提供了极大的方便( m o l o n e y & f i e l d ，1 9 9 1 ) ，并且实现了对浮游 生物的粒径谱划分，目前，学者们一般将海洋超微型浮游生物( u l t r a p l a n k t o n ) ( 包 括白养和异养细菌、古细菌、超微型浮游植物、病毒以及微小鞭毛虫等) 定义为 小于5 微米的浮游生物，包括了粒径在0 2 2 岬之间的所有的微微型浮游生物 ( p i c o p l a n k t o n ) 和2 5 岬的微型浮游生物( n a n o p l a n k t o n ) 。( s i e b u r t he ta 1 ， 1 9 7 8 ；宁修仁等，1 9 9 7 ) 。 对于微型、超微型浮游生物在海洋生物地球化学过程等方面的研究导致了微 型生物食物网( m i c r o b i a lf o o dw e b ) ( a z a m e ta 1 ，1 9 8 3 ) 的重大发现，并使得人 们对微型、超微型浮游生物在海洋初级生产力等方面的重要作用也有了新的认识 ( p l a t t ，1 9 8 6 ) 。很多研究认为，微型生物食物网包括异养细菌和自养生物两条 路径，自养路径的初级生产者主要是微型浮游植物和微微型浮游植物( 包括超微 第一章绪论 型浮游植物) ；异养路径( 即二次生产) 的主要为异养细菌，随后又被较为大型 的微型浮游动物( m i c r o z o o p l a n k t o n ) ( 如，微型的鞭毛虫和纤毛虫) 所摄食。此 外，微型生物食物网中的种类组成个体很小、世代周期短、有很高的营养物质更 新速率；消费者所产生的粪粒等有机碎屑在细菌和微型异养生物作用下矿化，分 解出浮游植物生长需要的营养物质，从而使得生态系统的营养物质可以得到快速 再生、循环( v a u l o te ta 1 。2 0 0 1 ) 。目前，微食物网的存在意义、微食物网和传统 食物链之间的联系已得到共识，研究海洋生态系统的营养动力学机制必须重视这 一点。 近些年来，超微型浮游生物在海洋生态系统中的研究得到了很快的发展 ( d a v i se t a l ，1 9 8 5 ) 。以往人们认为真核藻类，特别是小型硅藻是海洋中主要的 初级生产者，但是近年来的研究工作表明，各类群微型浮游植物和微微型浮游植 物是海洋初级生产中非常重要的贡献者，尤其是在热带寡营养水域，它们可占初 级生产力的8 0 或更多，它们比细胞较大的种类具有明显的优势( l ie t a l ，1 9 8 3 ； t a k a h a s h i & b i e n f a n g ，1 9 8 3 ；w e b e r & e 1 s a y e d ，1 9 8 7 ；高亚辉等，1 9 9 0 ；陈怀清 和钱树本，1 9 9 2 ；黄邦钦等，1 9 9 9 ；黄邦钦等，2 0 0 2 ) 。它们之所以在初级生产占 有较大的比例，主要是由以下几个原因构成：1 ，微型浮游植物在水域中的分布 密度极大，常组成浮游植物数量较高的比例；2 ，具有生长快、数量多、周转速 率高的特点，可维持相当高的生产力；3 ，可被一些异养鞭毛藻和纤毛虫的直接 摄食，或被大型浮游动物间接摄食，进入海洋食物网，最终影响海洋渔业的产量； 4 ，某些种类的微型浮游生物还常常与海洋鱼类等经济动物的病害、污染等方面 有一定的联系( 高亚辉等，1 9 8 9 ) 等。 作为海洋浮游生物生态系统中的重要组分之一，海洋超微型浮游生物已经成 为目前海洋生态学中的一个很重要的研究热点。 第二节超微型浮游生物研究概况 微型浮游生物的研究最早始于英国( k n i g h t - j o n e se ta 1 ，1 9 5 1 ) ，直到近二十 几年来，微型浮游生物的研究才得到重视并且有了较快的发展，海洋微型浮游生 物在生态系统中的地位和作用正越来越被人们所认识与了解。由于海洋微型浮游 生物研究的进展与现代观测技术和实验技术的进步息息相关，因此海洋技术的进 步发展的同时，也推动了海洋超微型浮游生物研究的不断进步。例如：1 9 7 9 年， 2 第一章绪论 j o h n s o n 和s i e b u r t h 在表面荧光显微镜对热带和温带海洋样品进行研究时，第一 次发现了具有强烈橙色荧光( 与叶绿素明显不同的色素荧光) 、直径约为0 5 1 5 p m 的原核光合生物一聚球藻( s y n e c h o c o c c u s ) ( j o h n s o n & s i e b u r t h ，1 9 7 9 ) ： 19 8 2 年，j o h n s o n 和s i e b u r t h 这两位学者又通过应用透射电子显微镜技术发现了 多种超微型真核浮游植物( j o h n s o n & s i e b u r t h ，1 9 8 2 ) ；1 9 8 8 年，c h i s h o l m 等人 通过流式细胞仪检测到了迄今为止发现的海洋中具有极小细胞特征( 平均直径 0 6 p x n ) 、丰度很高的而且在极弱的光照条件下可以进行高效的光合作用的生物一 原绿球藻( p r o c h l o r o c o c c 甜$ ) ( c h i s h o l me ta l ，1 9 8 8 ) 。 近年来，研究学者对蓝藻以及原绿球藻等微型原核生物的多样性组成等方面 进行了很多的研究，并且已经取得了很大进展。例如，g i o v a n n o n i 等( 1 9 8 8 ) 用 2 9 株蓝藻的部分1 6 sr d n a 序列构建了第一个系统进化树；n u b e l 等( 1 9 9 6 ) 利 用d g g e 和基因文库等技术比较了自然种群蓝藻与人工培养的蓝藻的基因多样 性；s c a n l a n 等( 1 9 9 6 ) 和u r b a e h 等( 1 9 9 8 ) 对原绿球藻培养品系的分子生物 学研究中发现，不同品系间的遗传距离与其来源的地点不相关；相反不同地点分 离的品系之间的遗传距离与深度的关系大于与分离地点的关系等。但是对于超微 型真核浮游生物的研究则要少的多，m a s s a n a 等( 2 0 0 2 ) 认为对超微型真核生物 的研究处于刚刚起步阶段，相对于原核生物的研究滞后约十年时间。 以往对于海洋微型生物的研究主要集中于采用落射荧光显微镜、流式细胞仪 以及高效液相色谱( h p l c ) 等方法所进行的海洋微型生物分布、丰度及初级生 产力的贡献的动态变化，环境影响因素等方面的研究上面。近二十年来，随着海 洋科学技术的发展进步，分子生物学技术方法在海洋微型生物上的应用也越来越 广泛，学者们在世界各个大洋，沿岸海域等地区开展了很多与超微型浮游生物相 关的( 如，海洋微型生物的遗传多样性、分类鉴定和群落动态变化等) 多样性研 究工作( d i e ze ta l ，2 0 0 1 a ；d i e ze ta l ，2 0 0 1 b ；z e i d n e re ta 1 ，2 0 0 3 ；g u i l l o ue ta l ， 2 0 0 4 ；n o te ta l ，2 0 0 4 ；r o m a r ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。例如，在太平洋赤道区( s t a a ye la l ， 2 0 0 1 ) 、地中海( d i e ze ta l ，2 0 0 1 a ) 、南极水域( l 6 p e z g a r c i ae ta l ，2 0 0 1 ) 、西 班牙的f i r e 河流( l i n d ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 、b l a n e s 海湾( m a s s a n ae ta l ，2 0 0 4 ) 以 及英吉利海峡( r o m a r ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 等其它水域的多样性研究，呈现了很高的 超微型浮游生物多样性组成。 第一章绪论 2 0 0 0 年，法、英、德、挪威和西班牙的重点实验室联手创立了p i c o d i v 计 划，主要针对于海洋聚球藻、原绿球藻的生理生态多样性和海洋超微型真核浮游 生物的分子鉴定方面的研究。在2 0 0 1 年，超微型真核浮游生物的遗传多样性研 究出现了新的进展：s t a a y ( 2 0 0 1 ) 和l 6 p e z g a r c i a ( 2 0 0 1 ) 等学者通过构建1 8 s r d n a 克隆文库和分子系统树，分别研究了太平洋赤道区和南极水域超微型真核 浮游生物的多样性，研究结果表明，这些海区中的超微型真核浮游生物包含了许 多以前从未发现过的新的种类。而且，m a s s a n a ( 2 0 0 4 ) 等学者还发现某些属于 s t r a m e n o p i l e s 的新种类在进化树中s t r a m e n o p i l e s 分支内可组成至少1 2 个不同的 小分支，显示了很高的多样性组成等。 目前，国内的研究方向主要集中在微型浮游生物的分类、生长与摄食、多样 性研究和微型食物网中的能量转换效率等方面，开展了不少具有生态学意义的微 型浮游生物在我国各海区的自然分布、季节变动以及影响因子的调查活动( g a o 甜a 1 ，1 9 9 3 ；洪华生等，1 9 9 4 ；j i a oe ta 1 ，1 9 9 4 ；高亚辉等，1 9 9 4 、2 0 0 1 ；刘子 琳等，1 9 9 8 ；孙军等，2 0 0 3 ；黄邦钦等，1 9 9 9 、2 0 0 0 、2 0 0 2 ；陈纪新等，2 0 0 3 ； 刘媛等，2 0 0 5 ；曹振锐等，2 0 0 5 ) ，超微型浮游生物的高多样性组成以及它们在 生态环境中所起到的重要作用已经逐步得到了研究学者们的肯定与重视( 超微型 浮游生物研究进展见表1 1 ) 。 第三节分子生物学方法的应用 在d n a 分子技术出现之前，人们对微生物的认识大多数是靠纯培养，或者 靠直接形态观察来获得部分信息。但是由于微生物形态过于简单，并不能提供太 多的信息，而且自然界中有8 5 9 9 9 的微生物至今还不可纯培养( a m a n ne t a 1 ，1 9 9 5 ) ，这给客观认识环境中的微生物存在状况造成了严重障碍。p a c e ( 1 9 8 6 ) 等首先用核酸测序技术研究微生物生态和进化，将分子生物学技术应用于微生物 生态学的研究，开辟了认识环境中微生物的新途径。 随着海洋生态学研究的发展，以浮游生物所拥有的特异性d n a 序列为鉴定 基础的分子生物学方法成为了目前浮游生物研究的新方向。分子生物学方法的应 用使人们了解到使用传统方法难以得到的、在遗传水平上的更加丰富的浮游生 物多样性信息，但浮游生物多样性的研究往往会受到许多方法本身的限制，例如： 4 第一章绪论 表1 - 1 超微型浮游生物研究进展 t a b l e1 1r e s e a r c hp r o g r e s so f u l t r a p l a n k t o n 5 第一章绪论 袁洁等 2 0 0 3 南沙群岛微型与超微型真核藻类遗传多样性 r f l p 测序 陈纪新等2 0 0 3利用光合色素研究厦门海域微微型浮游植物群落结h p l c 构 c l a d e - s p e c i f i c1 6 sr d n ao l i g o n u c l e o t i d e sr e v e a lt h e f u l l e re ta 2 0 0 3d o m i n a n c eo f as i n g l em a r i n es y n e c h o c o c c u sc l a d e f i s h t h r o u g h o u tas t r a t i f i e dw a t e rc o l u m ni nt h er e ds e a d i v e r s i t yo f p i c o p l a n k t o n i cp r a s i n o p h y t e sa s s e s s e db y g u i l l o ue ta 1 2 0 0 4d i r e c tn u c l e a rs s ur d n as e q u e n c i n go f e n v i r o n m e n t a l1 8 sr d n a 文库和测序 s a m p l e sa n dn o v e li s o l a t e sr e t r i e v e df r o mo c e a n i ca n d c o a s t a lm a r i n ee c o s y s t e m s m a s s a n ae ta 2 0 0 4 p h y l o g e n e t i ca n de c o l o g i c a la n a l y s i so f n o v e lm a r i n e 测序 s t r a m e n o p i l e s c o m p o s i t i o na n dt e m p o r a lv a r i a b i l i t yo f p i c o e u k a r y o t c r o m a r ie ta 1 2 0 0 4c o m m u n i t i e sa tac o a s t a ls i t eo f t h ee n g l i s hc h a n n e l1 8 sr d n a 文库和测序 m a s s a n ae ta l j a n s c e t a l s i g l e re ta 1 n i k o l a u s z , e ta 1 p e a r c ee ta 1 f r o m18 sr d n as e q u e n c e s 2 0 0 4 p i c o e u k a r y o t i cd i v e r s i t yi na no l i g o t r o p h i cc o a s t a ls i t e s t u d i e db ym o l e c u l a ra n dc u l t u r i n ga p p r o a c h e s 2 0 0 4a s i m p l er e m e d ya g a i n s ta r t i f a c t u a ld o u b l eb a n d si n d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s 2 0 0 4 d i s t r i b u t i o no f p r o k a r y o t i cg e n e t i cd i v e r s i t yi n a t h a l a s s o h a l i n el a k e so f t h ea t a c a m ad e s e r t , n o r t h e r n c h i l e e l e c t r o p h o r e s i st i m ei m p a c t st h ed e n a t u r i n gg r a d i e n t 2 0 0 4 g e le l e c t r o p h o r e s i s - b a s e da s s e s s m e n to f b a c t e r i a l c o m m u n i t ys t r u c t u r e 2 0 0 5o b s e r v a t i o no fb i a sa s s o c i a t e dw i t hr e - a m p l i f i c a t i o no f d n ai s o l a t e df r o md e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l s 2 0 0 5 t h es t r u c t u r ea n d s t a b i l i t yo f t h eb a c t e r i o p l a n k t o n c o m m u n i t yi na n t a r c t i cf r e s h w a t e rl a k e s ，s u b j e c tt o e x t r e m e l yr a p i de n v i r o n m e n t a lc h a n g e 分子生物学和培养技术 d g g e d g g e d g g e d g g e d g g e 6 第一章绪论 克隆方法的费时和耗费的劳动强度大以及杂交试验方法中所使用的探针往往只 针对某一特定的种群等等。 应用分子生物学技术进行海洋生态学研究目前还处于早期阶段，所使用到的 分子生物学方法尚需要进一步完善，对于自然生态系统中微型浮游生物的多样性 和群落的动态演变的研究需要将多种分子生物学方法与传统方法结合起来一起 进行，从而可以更适应超微型浮游生物多样性和系统发生学研究的需要。 3 1 超微型真核浮游生物系统发生学研究常用的基因 由于r r n a 基因序列进化变异频率缓慢，通常可以采用r r n a 序列来对海洋 微型生物群落进行系统进化分类。o l s e n 等( 1 9 8 6 ) 研究学者认为r r n a 能作为 “分子钟 即r r n a 之间的关系反映了生物之间的进化关系。p a c e 等( p a c ee t a 1 ，1 9 8 2 ；o l s e n e t a l ，1 9 8 6 ) 研究学者也指出，可以使用较大的r r n a 分子来研究 微生物。提出的方法首次用于海洋微生物样品的特性研究后，在基因文库中发现 了许多未知序列。 近些年来，最常用于生物分类鉴定与系统发生学研究的目标基因是小亚基核 糖体r n a ( s s ur r n a ) ( 图1 1 ) 。相对于其他基因分子，s s ur r n a 具有无可 替代的优势。一方面由于在s s ur r n a 基因两端均具有较为保守的核苷酸序列， 使得设计和应用通用的引物来扩增微型生物群落中绝大多数的物种成为可能，可 以较为全面进行群落遗传多样性组成分析；另外，s s ur r n a 基因序列是核苷酸 数据库数量最为丰富、包含种类最广泛的基因序列，因此在引物的设计、构建物 种亲缘关系等方面都具有独特的优势。尽管s s ur r n a 序列具有高度变异的区 域，但是对于许多亲缘关系较近类群而言，仍然无法提供有效的区分标记，比如 相同属内的种，对蓝藻来说，1 6 sr r n a 可用于鉴定种以上的株系，但对于种以 下水平，分辨率不够。 无论是真核或原核微型生物，s s ur r n a 是目前应用于自然环境微型生物多 样性研究最为常用的目标分子( s t a a ye ta 1 ，2 0 0 1 ) ，另外通过s s ur r n a 基因测序， 鉴定不同分类水平的特异性区域，可以设计出不同分类水平的寡核苷酸探针进行 杂交，识别自然界特异性的类群，目前已经利用s s ur r n a 基因序列设计出从界 到种水平的特异性探针。2 0 0 2 年在我国东海长江口发生了以原甲藻为主的大面 积赤潮，我国学者( 陆斗定等，2 0 0 3 ) 根据藻细胞的形态认为该种原甲藻与1 9 9 5 7 第一章绪论 年在东海海域发生的赤潮种为同一种，即东海原甲藻( p r o r o c e n t r u md o n g h a i e n s e l u ) ，但另一些专家则认为该种应为具齿原甲藻( pd e n t a t u m ) ( 陆斗定等，2 0 0 3 ) 。 后来，通过比较二者的s s ur d n a 序列及i t s 区序列才证实两次赤潮发生原甲 藻是同一种( l ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。a d a c h i 等( 1 9 9 6 ) 以r d n a t t s 区作为多样性指 标对日本海域和中国海域的甲藻链状亚历山大藻( a l e x a n d r i u mc a t e n e l l a ) 与塔玛 亚历山大藻( a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) 不同地理株进行分析，认为这些海域的亚 历山大藻属( a l e x a n d r i u m ) 间不同种间序列存在显著差异，而在种内个体间i t s 序列非常相似。将细胞形态学与分子生物学鉴定技术相结合，解决微藻特别是有 害赤潮藻疑难种的识别，区分种间亲缘关系往往具有较大的应用价值。 3 2 遗传指纹图谱研究方法：p c r - d g g e 方法 遗传指纹图谱技术依据特殊核酸物质的分离提供浮游生物群落多样性的图 案或轮廓。通常浮游生物群落的遗传指纹技术包括3 个步骤，一是核酸的提取， 二是基因扩增，三是通过遗传指纹技术( 女i d g g e 指纹图谱技术) 分析p c r 产物 等。变性梯度凝胶电泳技术( d g g e ，d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h e r s i s ) 是 由f i s h e r l e r m a n ( 1 9 8 3 ) 提出的用于检测d n a 突变的一种电泳技术。最初该技术 和p c r 技术相结合被广泛应用于各种突变分析，近些年来，p c r d g g e 技术方法 ( 图1 - 2 ) 已被广泛的应用于微型生物生态学研究方面( m u y z e r ，1 9 9 9 ) 。 3 2 1d g g e 基本原理 d g g e 不是基于核酸分子量的不同将d n a 片段分开，而是根据序列的不同，将片 段大小相同的d n a 序列分开。双链d n a 分子中a 、t 碱基之间有2 个氢键，而g 、 c 碱基之间有3