（遗传学专业论文）人类基因sec15l3和sec14l3的克隆与功能研究.pdf

复旦大学硕士论文人类基因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 英文缩写简表 a a ：锄i n oa c i d ，氨基酸 q t ：q t o c o p h e l ，q 生育酚； q 1 q ：q - t o c o p h e r y l q u i i l o n e ，q 生育醌； b l a s t ：b a s i cl o c a la l i 鄹m e n ts e a r c ht o o l ，同源性检索工具； e s t ：e x p r e s s e ds e q u e n c e1 矩，表达序列标签 g e f ：g u a m n en u c l e o t i d ee x c h a n g ef a c b d r ，鸟苷酸交换因子 g o l d ：g o l 酉d y n 锄i c sd o m a i f l ，高尔基体动力学结构域； f l u o r e s c e n c eq u a m i t i v ep c r ：荧光定量p c r i p t g ：i s o p r o p y l b - d m i o g a l a c t o p y r a l l o s i ，异丙基硫代一b - d 一半乳糖 苷； m i p a i l e l ：m u h i p l et i s s u ec d n ap a i l e l ，多组织c d n a 模板； o i 心：o p e nr e a d i n g 胁n e ，开放阅读框。 r - p c r ：r e v e r s et l 独s c r i p tp o l y m e r a s ec h a i 芏lr e a c t i o n ，：逆转录p c r ： s e c ：s e c r e t i o ng e n e s ，与细胞分泌相关的基因 s d s - p a g e ：s d s p o l y a c 】哆l a m i d eg e le l e c 仃o p h o r e s i s ，s d s 聚丙烯酰胺 凝胶电泳； 1 a p s p f ： q t o c o p h e la s s o c i a t e dp r o t e m u p e m a t 觚tp r o t e i i lf a c t o r ， 生育酚关联蛋白上清蛋白因子； 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名 槲嘿学 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内 ：摊新签名躯哆噍掣p 复旦大学硕士论文 人类摹因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 基底的膜蛋白合成，而不影响顶端的膜蛋白( l i p s c h u t zj h ，2 0 0 0 ) 。s e c 8 还被发现能够通过与不同的接头蛋白( a d 印t o r p f o t e i n ) 如p s d 9 5 ( p o s t s y n a _ p 廿c d e 璐i t y 9 5 ) ，s a p l 0 2 ( s y n 印s e 一雒s o c i 如dp 眦e i no f1 0 2k d a ) 和c a s k ( c a 2 + ，c a l n l o d u l n d e p e n 妇ts e 血ep r o c e i i lh n a ) 等结合，从而与囊泡上的 受体蛋白产生联系( 础e n c rgm ，2 0 0 3 ；s a 璐n ，2 0 0 3 ；“t c im ，2 0 0 6 ) 。这也 提示我们：e x o c y s t 可能在细胞膜的特定结构对不同蛋白的分拣和定位中起作用。 2 对囊泡转运过程的作用。e x o c y s t 通过与囊泡的结合( 类似于酵母中的情况) ， 将囊泡转运至细胞膜附近的特定区域。根据不同的实验结果，有两个模型来描述 这种作用过程。第一个，e x o c y s t 在从t r a n s - c 沁l g i 网络( n e t w o r k ) 转运到质膜附近 并定位，最终与质膜融合的整个过程中都起作用。m d c k 细胞中s e c 6 和s e c 8 蛋白 在高尔基体和质膜上都存在，而在经过低温和布雷菲德菌素处理的细胞中，这两 种蛋白的循环过程( 舱c y c l i n g ) 受到抑制，同时这种处理也阻断了囊泡的转运过 程。当注射抗s e c 6 和抗s e c 8 抗体到m d c k 细胞中之后，发现分泌蛋白在t r a n s g o l g i 网络和质膜附近积聚( y e a m 柚c ，2 0 0 1 ) 。 第二个模型中，c x o c y s t 仅仅在囊泡定位于质膜上的过程中起作用。这个模型 被以下实验支持：在敲除( 1 m o c h m ) s e c 5 的果蝇突变体中，蛋白从高尔基体转 运到轴突的途径未受影响，而蛋白插入质膜的过程却被抑制了( m u n h vm ， 2 0 0 3 ) 。 e x o c y s t 对囊泡的募集和定位作用方式也有两种可能的机制。第一种是 e x o c y s t 可能由两个“亚复合体”形成，一个“亚复合体”与囊泡连接，而另一个 起识别并定位于质膜特殊结构上的功能。这两个“亚复合体”的相互作用使得囊 泡定位于质膜上。这个模型类似于上文提到的酵母中的模型。确实也有实验发现 s e c l o p 与s c c l 5 p 形成了一个“亚复合体”，这个“亚复合体”广泛存在于e x o c y s t 复合体存在的所有位置( g w ，1 9 9 9 ) 。 而另一个机制认为e x o c y s t 复合体作为整体起识别和定位作用。因为在对 p c l 2 细胞和小鼠的脑组织免疫共沉淀和密度梯度离心实验都得到了完整的 c x o c y s t 复合体( h 叭sc ，1 9 9 6 ；k e ey ，1 9 9 7 ) 。 3 在囊泡锚定过程中的作用。e x o c y s t 通过与微管蛋白上的摩托蛋白 ( 蚵c r o t i l b u l e - a s s o c i a t e dm o 自d r s ) 结合，引导囊泡从微管的组织中心和高尔基体 向质膜运动，当靠近质膜时，e x o c y s t 会介导囊泡从微管上脱落并将其锚定在质膜 上。有若干实验支持了这个模型。如e x o c y s t 与有丝分裂中的纺锤体丝共定位 ( w 抽gs ，2 0 0 4 ) ，免疫荧光显微方法也显示e x c o y s t 所有亚基的定位与微管的定 位方式相似( w a i l gs ，2 0 0 4 ) ，而且能与微管蛋白免疫共沉淀( v e g a ie ，2 0 0 1 ) 。 还有实验发现，e x o c y s t 通过使微管蛋白定向排布从而促进神经细胞轴突的生长 8 复旦大学硕士论文人类皋因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 位点恰好也是y p t 3 2 p 在s e c 2 p 上的结合位点，所以s e c l 5 p 与y p t 3 2 p 竞争结合 s e c 2 p 。y m 3 2 p 是s e c 2 p 的重要结合蛋白，只有通过它，s e c 2 p 才能定位于囊 泡附近并激活结合于囊泡上的s e c 4 p ：而只有被激活的s e 0 4 p 才能结合s e c l 5 p ， 最终引导e x o c y s t 结合于囊泡上并引导囊泡在质膜上的定位。s c c l 5 p 与y p t 3 2 p 的竞争关系形成了很好的调控机制( 图3 ) ，具体方式是： 在y p _ t 3 2 p 募集s e c 2 p 到达囊泡上之后，s c c 2 p 激活了s e c 4 p ，活化状态的s e “p 进而结合s e c l 5 p ，把s c c l 5 p 也募集到囊泡膜上。因为s c c l 5 p 与s c c 2 p 的结合 力高于y p t 3 2 p 大约3 倍( m e d k o 豫m ，2 0 0 6 ) ，y l 焰2 p 就被s e c l 5 p 替换下来， s e c l 5 p s e c 4 p s e c 2 p 三者形成一个稳定的复合体( n o v i c kp ，2 0 0 6 ) ；而且 s e c 2 p 有g a p 活性，所以可能会失活y p t 3 2 p ( o r t i zd ，2 0 0 2 ) ，从而更加稳定 了与s e c l 5 p 的结合，维持活化状态。而细胞质中的s e c l 5 p 可与y p t 3 2 p 竞争结 合s e c 2 p ，抑制s e c 2 p 结合到囊泡上，负调控s c c 2 p s e c 4 p s e c l 5 p 的作用。可 见，s e c l 5 p 不仅是被激活的下游底物，还可以通过正反馈和负反馈双重作用， 调控自身的被激活程度。s 2 pc 端的部分序列a a 4 5 1 5 0 8 对s e c l 5 p 与s e c 2 p 的结合也有负调控的作用( n o v i c kp ，2 0 0 6 ；m e d k o v am ，2 0 0 6 ) ，因为缺失 了这一段的s e c 2 p 蛋白与s e c l 5 p 的结合更加牢固了，这说明 s e c 2 p s e “p s e c l 5 p 这一激活途径是受到精细调控的。s e c l 5 p 与s e c 2 p 的结 合通过正调控和负调控的双重机制保证e x o c y s t 功能的正常。 鞠8 枷 一 ，一、 s e c l 5 p ) 一一， 图3s e c l 5 p 与y p t 3 2 p 竞争结合s c c 2 p 示意图( 修改自n 0 v i c k p 2 0 0 6 ) 。 l o 复旦大学硕士论文 人类基因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 第二节人类t a p ，s p f 蛋白研究进展 q 一生育酚关联蛋白( t a p s p f ) 是c r a l u 0 蛋白家族的一个重要成员。 c r a l 聊o 蛋白家族主要包括q 生育酚关联蛋白( a t o c o p h e l 船s o c i a t c d p r 0 晒n s u p e m 雏m tp r o t e i i l t o r ，1 a p s p f ) 、酵母磷脂酰肌醇转运蛋白( y e a s t p h 叩h a 吐d y l i s 硒l 仃a n s f c rp r o t c i n ，s e c l 4 p ) 、细胞内视黄醛结合蛋白( c e l l u l a r r e t i l l a l d e h y d eb i n d i n gp r m i n ，c m 址b p ) 、a 一生育酚转运蛋白( d t o c o p h e lt r a n s 衙 p r o t e i n ，a 丌p ) 及其它一些具有较高同源性和结构相似性但生物学功能还没有 定论的蛋白成员( c m b bj w ，1 9 8 8 ；“t a m ，1 9 9 5 ：z i m m e r s ，2 0 0 0 ) 。c 黜地n u 0 蛋白家族成员一个最大的特征就是都含有一个疏水性分子结合结构域 c 融扎i 0 ( p 加n 0 0 6 5 0 ) ，能够与多种疏水性分子如磷脂，维生素e ( 生育酚) 等结合。 1 m ，s p f 蛋白主要由两个结构域组成，分别是c m 乜t 砒o 结构域和g o l d 结构域。c 黜地一1 刚o 结构域的功能和序列最早是在c i 认l b p 和具有多重功能域 的t r i o 蛋白序列的基础上被定性的：c r a l b p 以1 1 顺式视黄醇或1 1 顺式视 黄醛作为内源性配体，以转运蛋白的形式参与调整这些类视黄醇与视觉周期相关 酶的相互作用。而t r i o 蛋白为具有多种功能结构域的r h o 样g t p 结合蛋白，参 与l a r 跨膜性酪氨酸磷酸酶结合反应，因其存在一个与c 黜虬b p 高度同源的结 构域，从结构上分析其可能参与疏水性配体的结合反应，以此将该结构域定名为 c r a l t r j o 。g o l d 结构域是c 黜也t o 家族中t a p s p f 特有的，这是一个 长度范围在9 0 1 5 0 个氨基酸之间的结构域，由觚r 砌l 等人确定并将之命名为 g o l d 结构域一一高尔基体动力学结构域( g o l g id y 雌m i c sd o m a i n ) ( a n a n t h a 瑚m a nv ，2 0 0 2 ) 。该结构域被认为能够介导不同的蛋白之间的相互作 用，在高尔基体动力学稳定和分泌过程中起重要的作用。 t a p s p f 蛋白的晶体结构己由s t o c k c ra 等人解析( s t o c k 盯a ，2 0 0 2 ) 。从结 构上看1 ：a p ，s p f 由1 3 个bs n 锄d s 、1 1 个a 螺旋和8 个3 l o 螺旋组成，空间上折叠 成两个主要的结构区：n 端2 7 5 个氨基酸组成了包含c r a l u o 结构域的空间构 象，而c 端1 1 5 个氨基酸组成了卷曲状的8 个s 恤n d s 的构象，该结构区为g o l d 结构域区。在n 端结构域区可以发现由5 个b 折叠通过b a 9 的连接方式与三 个螺旋形成底物结合域的一边，而螺旋6 1 0 则面对这些折叠组成结合域的另外 一侧，螺旋9 和螺旋l o 则覆盖在结合域的入口之处，被认为是参与维持结合底 物的疏水结合域的稳定性。整个疏水结构域呈马蹄形结构，中间被t v r l 5 3 和 t y r l 7 l 的侧链所占据( 两者本身通过氢键连接) ，空间的外围主要为疏水氨基酸 的侧链所围绕( 图5 ) 。 复旦大学硕士论文人类基因s e c l 5 l 3 和s e c l 钆3 的克隆与功能研究 图5t a p s p f 的空间结构。图示为蛋白质二级结构和两个独立结构域的示意，灰色部 分代表结合的底物与所处的疏水结构域构造。 t a p s p f 蛋白与d 生育醌( a t q ， d t o c o p l l e r y l q u i n o n e ) 的共结晶结构也 已经被成功解析( s t o c k e r a ，2 0 0 3 ) 。从 结构分析中发现a t q 头部第5 和6 位 的甲基与a l a l 6 7 、a l a l 0 8 和l e u l 2 0 形 成范德华力作用，而3 位的甲基则与 l e u l 0 6 、1 1 e 1 0 3 和t y r l 7 1 形成范德华力。 底物醌的侧链埋入t y r l 5 3 和p h e l 9 8 之 间同时其尾部埋入l e u l 8 9 和p h e l 7 8 之 间。另外l y s l 2 4 的一侧与g l u l 2 7 形成 盐键而另一侧与醌4 位羰基氧形成氢键， 醌1 位的第二个羰基氧原子则经由一个 水分子和h i s l 6 2 形成氢键同时h i s l 6 2 主链羰基氧与醌c 3 羟基形成氢键，而 后者与前面的水分子形成第二个氢键结 构( 图6 ) 图6t a p s p f 疏水结构域及底物示意图。 t a p ，n 生育酚关联蛋白，顾名思义就是能与a 生育酚( a t ) 结合的蛋 白。s t o c k e ra 等人在用生物素标记的a t 筛选与之作用的蛋白的过程中在牛的 1 4 复旦大学硕士论文人类摹因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 肝脏中发现了一个分子量约4 6 k d a 的蛋白b l m ( b o v i 舱栅o p h e l 孙s o c i a t e d p r o t e i n ) ( s t o c k e ra ，1 9 9 9 ) ，后来z i m m 盯s 等人也利用标记的d t 筛选得到了 人的相关蛋白h t a p ( z i 姗e rs ，2 0 0 0 ) ，并发现他们找到的这个“新”蛋白早在 7 0 年代就已经被b i o c hk 等人发现并被命名为s p f ，上清蛋白因子( s i i p e m a t a m p r o t c i nf 扯t o f ) ，故将该蛋白简称为 s p f ( a 勘c o p h c l 嚣s o c i 砷e d p r o t e i n s u p e m a 协mp r o t e i n 舭t o r ，t a p s p f ) 。b l o c hk 等人在研究鲨烯单加氧酶 ( s q u a l e n em 0 0 】【y g e n a ) 功能的时候发现该酶的作用能够被肝组织微粒经高 速离心后上清中的某个因子所强化( y a 吼柚t os ，1 9 7 0 ；1 越删，1 9 7 2 ) 。后来 发现这个因子是一个4 7 k d a 的热敏感蛋白，并将其命名为s p f ( p e m a t a n tp r o t e i n f i 埘o r ) 。从上清中去除该蛋白后鲨烯单加氧酶( s q u a l e n em o n o o 巧g c n a ) 即表现 出极低的催化活性，而且t a p ，s p f 对于被纯化后的鲨烯单加氧酶没有作用，推 测1 ：a p s p f 只对与膜相连的胞内自然状态的酶起作用( o n 0t ，1 9 7 5 ：s a a t y a ， 1 9 7 6 ) ，后来的研究显示1 - a p s p f 在细胞内能够促进鲨烯分子的跨膜转运。 t a p ，s p f 同时还能激活氧化型鲨烯环化酶( o x i g o s q u a l e n cc y c l a s e ) 的作用( 图7 ) ， 该酶是鲨烯合成固醇途径中的第二个反应酶，且被认为是与微粒体表面相连接而 不与细胞质组成相互接触的，更重要的是t a p s p f 与鲨烯或者氧化型鲨烯分子 的结合还未见报道。这些结果从另一个方面提示t a p s p f 可能并不直接与上述 两种酶及其底物分子相互作用，而是通过某种方式促进鲨烯和氧化型鲨烯在膜组 分之间转运( s 商【鲥l a i a hm v ，1 9 7 6 ：c a r 鹊iw ，1 9 7 9 ；t d ，2 0 0 3 ) 。 s 1 1 i b a t an 等人利用”c 标记的醋酸盐作为细胞培养添加物来研究其被吸收后 进入细胞内是否参与合成胆固醇，以此来判断t a p s p f 与胆固醇合成的关系。在 研究中发现将外源性表达t a p s p f 的真核载体转入本身不表达内源性t a p s p f 的 肝癌细胞 i e p g2 中，胆固醇的合成提高了几倍，同时发现胞内鲨烯本身的含量 也提高了，证实了1 m s p f 能够促进体内胆固醇的合成，且提示删p f 不但促 进鲨烯转运到合成代谢的活性位置，很有可能还促进经鲨烯转运到体内某个不活 动的位置维持一个鲨烯库参与可能的代谢过程( s l l i b a l a n ，2 0 0 1 ) 。 m o k 嬲h iv 等人通过“c 标记的甲羟戊酸盐代替“c 标记的醋酸盐进行细胞实 验发现1 ：a p ，s p f 的表达提高了甲羟戊酸盐的合成，而甲羟戊酸盐是羟甲基戊二酰 辅酶a 还原酶( h m g c o ar e d u c t a s e ) 的重要作用底物，在该酶的作用下合成甲 羟戊酸盐的反应被认为是直接影响胆固醇合成的限速反应之一( g i lg ，1 9 8 6 ) ， 推测t a p s p f 很有可能影响该酶的催化活性。由此推测t a p s p f 可能在胆固醇合 成的三个步骤中起作用，但是具体的机制是什么尚不清楚( 图7 ) 。 复旦大学硕士论文 人类基因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 a c e l 矗t e l l a n o 甜e l o l i c h o l e s t 以o l 图7t a p s p f 参与合成胆固醇途径示意图 y a m a u c l l ij 等人用体外表达的组氨酸融合蛋白进行结合实验发现 h i s - t a p s p f 能够与生物素标记的q t 结合，而与维生素e 的其它几种亚型之间 的结合能力却很低( z i m m c rs ，2 0 0 0 ：y a m a u c l l ij ，2 0 0 1 ) 。y a m a u c h ij 还发现 ，i m v s p f 除了能够特异结合a t 之外，还具有d t 依赖性的进核效应。1 s p f 本身为胞质蛋白，但是在细胞培养物中添加5 0 肛m 的a t 能够导致其绿荧光融 合蛋白大部分显示表达在细胞核内。而利用g a l 4 d n a 结合结构域融合表达 d ，s p f 发现在5 0 p md - t 的存在下能够激发g a l 依赖性的荧光素酶基因的表 达量增加( y a m a u c l l ij ，2 0 0 1 ) ，提示我们私驯s p f 可能具有a t 依赖型蛋白转 录调控因子的活性。结合其在胆固醇合成中的作用，t a p s p f 可能通过a t 介 导了某种调控蛋白表达的机制来影响胆固醇合成代谢，但是很多机制和机理还没 有研究清楚，现在下定论还为时过早。 1 6 复旦大学硕士论文人类基因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 第二章材料和方法 第一节材料和试剂 1 1 实验材料 m u m p l en 鹞i l ec d n ap 锄e l ，美国c l o 蛐巴c h 公司产品 l i p o f e c t a i n i l l e 2 0 0 0 真核转染试剂盒，i n “仃o g e n 公司产品 a m p l e x r e d c h o l e s t e r o l 舡s a y 鼬t ( 购自m o l e c l l l a r p r o b e s 公司) r e a l t i l i l e p c r m a g t e f m i ) 【购自t o y o b o 公司 p v d f 膜( h y b o n d - p ) ，美国a m e r s l 姗p h 锄m c i ab i o t e c h 公司产品 成人肝组织，上海联合基因科技( 集团) 有限公司 人胎脑c d n a 文库：取1 8 周胎儿的全脑组织，用一步法提取总r n a 分离得到 m r n a 。在p b l u e s c r i p ti is k ( + ) ( s n 砒l g e n e ) 的卿d 倒立点之间插入与甜 a ( g g c c a t b t g g c c ) 和匈材b ( g g c c g c c t c g g c c ) 的识别序列构建成建库载体 p b s - s f i i ，以人胎脑p o l y a + r n a ( c l o n t e c h ) 为材料，采用建库载体p b s s f i i 构建c d n a 文库。用s m a r tc d n a 文库构建试剂盒( c l o m e c h ) 合成双链 c d n a ，够酶切后过s e p h a d e xg - 2 5 ( p h a r 埘i a c i a ) 柱层析以去除长度小于5 0 0 b p 的c d n a 片段。载体酶切后大片段与上述c d n a 用t 4d n a 连接酶连接并转 化大肠杆菌d h 5 0 c 感受态细胞，得到人胎脑c d n a 文库。 1 2 主要实验试剂及酶类 v i t a g es p i i l m i l l i p r 印硒t ，中国t a g e 公司产品 v i t a g e 雠p c r p 试丘c a t i o n k i t ，中国t a ；昏e n e 公司产品 t a 喀e i l eg e ie x 咄吐o n 瞄t ，中国、，i t a g e n e 公司产品 t g 美国p r o m e g a 公司产品 t r i s 碱，分析纯，美国b o e 蛐g e rm a 肋h e i i i l 公司产品 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺( 1 1 m e d ) ，美国f l u k a 公司产品 丙烯酰胺和n ，n 亚甲双丙烯酰胺，美国b b i 公司产品 过硫酸胺，美国s i 舯a 公司产品 6 一巯基乙醇，华舜生物工程技术有限公司产品 乙二胺二乙酸二钠( e d t a ) ，上海菲达工贸有限公司和桥分公司 十二烷基硫酸钠( s d s ) ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 苯甲基磺酰氟( p m s f ) ，上海生工生物工程技术有限公司 考马斯亮蓝r 2 5 0 ，美国a m r e s c 0 公司产品 1 7 复旦大学硕士论文人类摹囡s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 n i n t as u p e m o w h i s 蛋白纯化介质，美国q i a g e n 公司产品 咪唑，上海生工生物工程技术有限公司 r b l i ，上海生工生物工程技术有限公司 m o p s ，美国b b i 公司产品 g l m a l l l i e ，上海生工生物工程技术有限公司 氨卞青霉素、氯霉素、卡那霉素等，上海生工生物工程技术有限公司 小鼠m 血m y c 单抗上海康成生物工程有限公司产品 辣根过氧化物酶联羊抗鼠二抗，上海康成生物工程有限公司产品 系列核酸内切酶，美国b i o l a b 公司产品 t 4 l i g a ，n e we n g l 柚db i o l a b s 公司或p r o m e g a 公司产品 盹p i 啮和p f i ld n a 聚合酶，上海生工生物工程技术有限公司 d n a 分子量蛐出rd l 2 0 0 0 ，大连宝生物t a k 撇公司产品 蛋白质分子量m a r k e r ，b i o a s i a 公司产品 栅s ，上海生工及上海赛百盛公司产品 实验所用引物，由上海生工及上海赛百盛公司合成纯化 1 3 实验所用菌种、载体及细胞株 大肠杆菌d h 5d 菌株：基因型s u p e 4 4 ，l u 1 6 9 ，( 由8 0 l a c z m 1 5 ) ，h s d r l 7 ， c a l ，e n d a l ，g y r a 9 6 ，t i l i 1 ，r c n l ，本实验室保存 大肠杆菌r d t t a ， f 叩th s ds b ( r b m 8 ) g a ld c m ( d e 3 ) p ra r e ( c a i i l r ) ，本实验室保存 原核表达载体p e 他8 b 等，购自美国a m e r s h 锄p h a m a c i a 公司 真核表达载体p c d n a 4 m y c h i sa ，购自美国i n v i 仰g 蚰公司 荧光表达载体p e g f p c l ，购自美国c l o m e c h 公司 a d 2 9 3 细胞株，本实验室保存 l 0 2 细胞株，本实验室保存 7 7 2 1 细胞株，本实验室保存 h e p g 2 细胞株，本实验室保存 1 4 主要试剂配制 5 0 x t a e ：称2 4 2 2 9t r i s 加入3 0 0 r n ld d h 2 0 ，加热搅拌溶解，加5 7 m l 冰乙酸， 1 0 0 i l l lo 5 me d l a ( p h 8 o ) ，用冰乙酸调p h8 0 ，然后加d d h 2 0 定容至1 0 0 0 m 1 3m o l ln a a c ( p h 5 6 ) ：无水乙酸钠4 9 2g ，加1 4 0 “重蒸水，加热使溶解， 再用冰乙酸调节p h 至5 6 ，加重蒸水定容至2 0 0l l l l ，灭菌后置4 冰箱贮存 1 5m o l l 嘶s ( p h 8 8 ) ： 称取嘶s 碱1 8 1 6 9 ，加5 0 i i l ld d h 2 0 充分溶解，加浓 复旦大学硕士论文人类基因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 盐酸调节p h 至8 o ，加水定容至1 0 0 r n l ，灭菌 lm o l lt f i s ( p h 6 8 ) ：8 0i n l 水中溶解1 2 1 l gt r i s 碱，加入浓盐酸调p h 至6 8 ， 加水定容至1 0 0 i i l l ，灭菌 o 5m e d t a ( p h = 8 o ) ：二水乙二胺四乙酸二钠1 8 6 1g ，加d d h 2 0 8 0n l l ，磁 力搅拌器上剧烈搅拌，用n a o h 调节溶液的p h 值至8 o ，然后定容至l o oi i l l ， 灭菌 3 0 丙烯酰胺：将2 9g 丙烯酰胺和1g n 。n 一亚甲双丙烯酰胺溶于总体积 为6 0 l i l l 的水中。加热至3 7 溶解，补加水至终体积1 0 0 i n l ，用n a l g e 滤器( 1 0 4 5l 砌孔径) 过滤除菌，查证该溶液p h 值应不大于7 o ，置棕色 瓶中保存于室温。 1 0 过硫酸胺：l g 过硫酸胺溶解于终量为l o i i l i 的水溶体系中，4 保存 1 0 s d s ：在9 0 0 i i l l 水中溶解1 0 0 9 电泳级s d s ，加热助溶，加入几滴浓盐酸 调节p h 值至7 2 ，加水定容至1 l ，分装备用 染色液：乙醇：冰乙酸：灭菌水= 9 ：2 ：9 + o 2 5 考马斯亮兰 脱色液i ：乙醇：冰乙酸：灭菌水= 2 5 ：8 ：6 5 ( 脱色用) 脱色液i i ：乙醇：冰乙酸：灭菌水= l o ：1 5 ：7 5 ( 保存用) 5 x t r i s - 甘氨酸电泳缓冲液：1 5 1 9t r i s 碱，9 4 9 甘氨酸，5 0 i i l l1 0 ( w ，s d s 溶于9 0 0 i i l l 水中，定容至1 l 电转移缓冲液：称取2 9 9 甘氨酸、5 8 9t r i s 碱、0 3 7 9s d s ，加入2 0 0 n l l 甲 醇后加水定容至1 l 2 s d s 凝胶上样缓冲液：1 0 0 i n m o l l 1 协c l ( p h 6 8 ) 、2 0 0 m m o l ld t t 、4 s d s 、o 2 溴酚兰及2 0 甘油，其中d t t 为每次临用前由1 m o i 几母液现 加现用 t f b l ：l o o m m r b c l ，5 0 m m m n c l 2 ，3 0 m m p o t a s s i 岫a c e t a t c ，l o m m c a c l 2 ， 1 5 一y c e r o l ，p h8 5 t f b 2 ：1 0m mm o p s ，1 0m m r b c l ，7 5m mc a c l 2 ，1 5 毋y c c r o l ，用k o h 调p h 至8 o l b 液体培养基( 低盐) ：l 哪p t o n e ，o 5 y e a s t e x t r a c t ，o 5 n a c l l b 固体培养基：在l b 液体培养基中加1 5 a g a r 1 0 0 m 咖l 氨苄青霉素：o 5 9 瓶装氨苄青霉素注入5 i i l l 灭菌水充分溶解，分 装于1 5 1 1 1 l 离心管中 l o m 咖l 溴化乙锭( e b ) ：在l o o i i l ld d h 2 0 中加入1 9 溴化乙锭，磁力搅拌至 完全溶解，然后转移至用铝箔包裹的棕色瓶中，室温保存 h i s 蛋白纯化l s t a nb u 脓r ：5 0 m mn a h 2 p 0 4 ，3 0 0 m mn a c l ，l o m m 咪唑 1 9 复旦大学硕士论文人类摹因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 ( p h 8 o ) h i s 蛋白l 洗脱缓冲液：5 0 i n mn a h 2 p 0 4 ，3 0 0 m mn a c l ，2 5 0 m m 咪唑 ( p h 8 o ) 疏水柱上样缓冲液：5 0 m mn a h 2 p 0 4 ，3 0 0 m mn a c l ，0 8 m ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，1 0 m m b 巯基乙醇( p h 8 o ) 疏水柱洗脱缓冲液：5 0 m m n a h 2 p 0 4 ，3 0 0 m m n a c l ，1 0 m m 8 巯基乙醇 ( p h 8 o ) 真核细胞裂解缓冲液：5 0m mt r i s - h c l ，p h7 5 ，1 5 0m mn a c l ，l n p - 4 0 ， 0 5 脱氧胆酸钠，蛋白酶抑制剂混合物( 美国r o c h e 公司产品) 。 1 5 主要仪器设备 自动高速冷冻离心机2 0 p r 5 2 0 ，h 1 1 a c 碰公司产品 c c n 灯i 堍e5 4 1 5 c ，印p e n d o r f 公司产品 m i i l i p r o t e a n2c e u 电泳及电转移装置，美国b i o m d 公司产品 p o w e rp a c 3 0 0 电泳装置，美国b i o r a d 公司产品 m i t l i s u bc e l lg t 电泳槽，美国b i o r a d 公司产品 7 5 2 wg h t i l l gs p e c 仃o p h o t o m e t e r ，上海第三分析仪器厂 m p l l o o 1 型电子天平，上海第二天平仪器厂 删w 2 1 c u 6 0 0 型电热恒温水温箱，上海医疗器械七厂 g e n e a m p 9 6 0 0p c r 仪，美国p e r k 玳e l m e r 公司产品 m 硒t 即c y c l 盱g m d i e n tp c r 仪，德国e p p e n d o r f 公司产品 g e n e q 岫n ti i 型紫外分光光度计，美国p l l a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 微量进样器( 多头) ，0 5 山- 1 0 山，l o 山1 0 0 山，2 0 0 阻- l 0 0 0 山，德国e p p 朗d o f 公司 出品 z d 9 5 5 6 水平摇床，江苏太仓医疗器械厂产品 自动平衡记录仪，上海大华仪表厂产品 a b l3 7 7 型及a b i3 7 0 0 型d n a 自动序列分析仪，美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司产品 g e n e a m p9 6 0 0p c r 仪，美国p e r ne l m e r 公司产品 n e o c 0 0 l 冷冻真空干燥箱，日本y a m a i o 公司产品 e p p e n d o r f5 4 1 5 c 台式高速离心机，德国e p p e n d o r f 公司产品 h e n i c he b a l 2 r 台式高速冷冻离心机，德国h e t t i c h 公司产品 h i t a c h ih i m a cc r 2 l 型高速冷冻离心机，日本h i t a c h i 公司产品 u l t r o s p e c4 0 0u v m s i b l es p e c t r o p h o t o m e t e r ，美国p h 黝a c i ab i o t e c h 公司产 品 复旦大学硕士论文人类基因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 l 啪i n o m e 衙t i ) - 2 0 2 0 荧光计数仪，美国p m m e g a 公司产品 l e i c a 荧光显微镜，德国l e i c a 公司产品 s c a n a m y3 0 0 0 扫描仪：美国g e n e m ls c 卸n i n g 公司产品 m i n i p r o t e a n2c e u 蛋白电泳及电转移装置，美国b i o 鼢d 公司产品 3 0 0 型电子天平，美国d e v e n 仪器公司产品 m m 【- qa c a d e 而c 超纯水仪，美国m i l l i p o 公司产品 s c s 2 4 型温控摇床，上海市离心机械研究所产品 s d j 超净工作台，上海淀山湖净化设备厂产品 s h 6 5 0 型微波炉，上海中华微波炉厂产品 z d 一9 5 5 6 水平摇床，江苏太仓医疗器械厂产品 p y x d h s 型隔水式电热培养箱，上海跃进医疗器械厂产品 d v 5 0 l 型电泳仪，上海精益有机玻璃制品仪器厂 f r 1 8 0 a 型电泳槽，上海复日生物实验技术研制所 f r - 2 0 0 型紫外与可见分析装置，上海复日生物实验技术研制所 p r i r v - l o o b 手提式紫外灯，上海复日生物技术公司 2 1 复旦大学硕士论文 人类摹因s e c l 5 l 3 和s e c l 4 l 3 的克隆与功能研究 第二节实验方法 2 1 生物信息学软件及数据库 n c b i ：h t t p ：f 憎f n c b i i l l m 1 l i h 卫o y e b i ：l i t c d ：仙 n n v e b i a c u k e x l a s y ：n t t p ：，w 、聊n e x p 勰y o r g p d b ：h t t p ：，n m r c s b o r g p d b g e n e a t l a s ： h n p ：s ) r m a t l 髂酊o r s y m a t l 船 p r e d i c tp r o t e i n ：h 仕p ：托u b i c b i o c c o l 啪b i a e d l 卿i r e d i c 肿t e i 咖d i c t p r o t e i l l h t n l l e s p r i p t 2 2 ： h t t p ：e s 研p t i b 印丘但s p r i p 讹g i - b i n e s p r i p t c g i s c r a r c hp r o t e i l lp r c d i c t o r ：h t t p ：f 懈w 【i c s u c i e d u 7 e b a l 击幽c r a t c h 2 2c d n a 文库的构建以及基因序列测定 取水囊法引产之正常1 8 周胎儿的全脑组织，用一步法提取总r n a 后经0 1 i g o ( d t ) 纤维素柱分离纯化得到m r n a ，利用c l o m e c h 公司的s m a r tc d n a 文库 构建试剂盒构建c d n a 文库，具体步骤参照试剂盒的使用说明书。合成的双链 c d n a 经过酶切后插入改建的p b l u e s 商p ts k 质粒载体中，并用电转化法转入大 肠杆菌d h 5 a 菌株中。将转化结果中的阳性克隆挑出并抽提质粒。分别用2 1 m 1 3 和m 1 3 r 删引物以d y et e m i i l a t e 的方法在a b i3 7 7 型d n a 自动序列分析仪上测 定插入的c d n a 片段的5 和3 端序列。再根据己测得的序列设计引物用 p r i i m 一、 ，a l l 【i n g 方法测得全序列。为了保证序列的可靠性，对于测定完全序列并 判断为新基因的克隆，c d n a 插入片段的任何一部分至少双向测序三次进行验 证。将单个克隆所有的测序结果用a c e m b l y ( s 锄g 盱c e n 仃e ) 软件进行基因序列 自动拼接和人工校验。使用n c b i 的b l a s t 工具去除序列中的载体部分并进行 数据库同源分析，挑选我们感兴趣的克隆，作为本文研究的材料。 2 3 生物信息学分析 2 3 1 s e c l 5 l 3 的结构域预测：在两个不同的蛋白结构域分析软件b l a s t p (h t c p ：伽n 州n c b i n l l l l i l i l l g o 佃l a s t )和i m e r p r 0 s c 龇 ( h t t p ：聃w w e b i a c u l 【i 舭m 吣s c a l l ) 上作h s e c l 5 l 3 的结构域预测。 2 3 2s e c l 5 l 3 和s e c l 5 l 1 二级结构的模拟：先用c l u s t a l w 程序 ( h t t p ： w we b i u k c l l l s t a l w ，) 比对分析，再用 p r e d i c tp