（环境科学专业论文）苯并（a）芘对褐菖鲉（Sebastiscus+marmoratus）免疫机能的影响.pdf

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暴污1 d 后即有显著的变化，提示褐菖鳓脾 脏淋巴细胞增殖可能作为易感性生物标志物；褐菖鲇血液吞噬细胞呼吸爆发的 抑制程度与b a p 浓度有较好的相关性，且随着暴污时间的延长抑制不断加强，表 现出良好的剂量一效应和时间一效应关系，揭示褐菖鳓血液吞噬细胞呼吸爆发可能 作为效应生物标志物。实验结果显示，b a p 暴露抑制褐菖鲇血液红细胞数目， 而对血液白细胞数目表现为先诱导后抑制，表明b a p 暴露能在较短时间内诱导 白细胞数目，但较长时间暴露损伤了褐菖蚰造血组织，进而对免疫功能产生抑制。 3 、研究了b a p 暴露对褐菖鲇免疫相关酶活性的影响。b a p 暴露对褐菖鱼由肝 脏s o d 酶影响较为复杂，但最终表现为抑制作用；b a p 暴露对褐菖鲇肝脏a k p 酶和a c p 酶都表现为较强的诱导作用。s o d 酶活性被抑制，表明褐菖鱼由抗氧化 系统功能受到损伤；a k p 和a c p 酶活性增加，可能是褐菖鼬机体发生癌变的前 兆。 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐莒鲇免疫机能的影响 综上所述，b a p 暴露总体上抑制褐菖鱼由的免疫机能；脾脏淋巴细胞增殖和血 液吞噬细胞h t , n 爆发可作为敏感的免疫毒理生物标志物；肝脏a k p 酶和a c p 酶 活性的强烈诱导可能是褐菖鱼由机体癌变的前兆。 关键词：褐菖鳓：免疫毒性：苯并( a ) 芘 2 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐菖鲇免疫机能的影响 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y ，t h ei m m u n er e a c t i o n so fs e b a s t i s c u sm a r m o r a t u sw e r ee x a m i n e d ， a f t e re x p o s u r et oo 1 ，1 0a n d1 0 0 m g k gb wo fb a pf o r1 ，4 ，7a n d1 4d a y s e x p o s u r e sw e r ec o n d u c t e dw i t hp e r i t o n e a li n j e c t i o n t h ei m m u n ep a r a m e t e r so ft h i s s t u d yi n c l u d i n gi m m u n eo r g a n s ，i m m u n ec e l l sa n di m m u n em o l e c u l a r s t h eo b je c t i v e o ft h i ss t u d yw a st oi n v e s t i g a t et h ei m m u n ef u n c t i o n so fs e b a s t i s c u sm a r m o r a t u sa f t e r e x p o s u r et ob a p , t oi n v e s t i g a t ew h e t h e rs u b l e t h a lc o n c e n t r a t i o no fb a pe x p o s u r ec a n i n j u r yt h ei m m u n ef u n c t i o n so fs e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s ，t of i n ds e n s i t i v eb i o m a r k e r s i nt h ei m m u n ep a r a m e t e r sa n dw h e t h e rt h ei m m u n es y s t e mo fs e b a s t i s c u s m a r m o r a t u sc a nb eas e n s i t i v em o d e lt om o n i t o r et h ee x p o s u r eo fb a p 1 、e f f e c t so fb a pe x p o s u r eo ni m m u n i t yo r g a n si ns e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s w e r e d e t e c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb a ps t r o n g l yi n d u c e ds p l e e nw e i g h t b o d yw e i g h t a f t e re x p o s u r ef o r1d a y , a n dt h e nr e s t o r e dt ot h ec o n t r o ll e v e l a n db a pi n d u c e dt h e l i v e rw e i g h t b o d yw e i g h ts i g n i f i c a n t l ya f t e re x p o s u r ef o r4d a y s ，b u ti tw a si n h i b i t e d a f t e re x p o s u r ef o r14d a y s t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tas h o r tt i m eb a pe x p o s u r e i n d u c e dt h ei m m u n eo r g a nh y p e r p l a s i a ，b u tal o n gt i m eb a pe x p o s u r ew i l ll e a dt o i m m u n eo r g a nd a m a g ea n da t r o p h yo fs e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s s p l e e na p p e a r e dt o h a v eas t r o n go r g a n i z a t i o n a lr e p a i rc a p a c i t y 2 、e f f e c t so fb a pe x p o s u r eo ni m m u n i t yc e l l si ns e b a s t i s c u sm a r m o r a t u sw e r e d e t e c t e d t h es p l e e nl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o no fs e b a s t i s c u sm a r m o r a t u sw a sv e r y s e n s i t i v et ob a pe x p o s u r e ，w h i c hr e v e a l e dt h a ts p l e e nl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o nw a sa s u s c e p t i b i l i t yb i o m a r k e r ；t h e r ew e r eg o o dd o s e - - e f f e c ta n dt i m e e f e c tr e l a t i o n s h i p b e t w e e ns e b a s t i s c u sm a r r n o r a l u s sb l o o dp h a g o c y t i cc e l l sr e s p i r a t o r yb u r s ta n db a p c o n c e n t r a t i o n s ，w h i c hr e v e a l e dt h a tb l o o dp h a g o c y t i cc e l l sr e s p i r a t o r yb u r s tw a sa e f f e c t i v e b i o m a r k e r e x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a tb a pe x p o s u r ei n h i b i t e d s e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s sb l o o dr e dc e l l sn u m b e ra n dt h en u m b e ro fb l o o d w h i t ec e l l s w e r ei n d u c e dt h e nt u r n e dt ob ei n h i b i t e d ，w h i c hs h o w e dt h a tb a pe x p o s u r ei na r e l a t i v e l ys h o r tp e r i o do ft i m e - i n d u c e dl e u k o c y t en u m b e r , h o w e v e r , al o n g e re x p o s u r e t i m ew i l li m p a i rt h es e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s sh e m a t o p o i e t i ct i s s u e ，a n dt h e nt o s u p p r e s si m m u n ef u n c t i o n s 3 、e f f e c to fb a pe x p o s u r eo ni m m u n i t ye n z y m e si ns e b a s t i s c u sm a r m o r a t u sw e r e d e t e c t e d b a pe x p o s u r eo nl i v e rs o da c t i v i t yo fs e b a s t i s c u sm a r m o r a t u sf i n a l l y r e p r e s e n t e di n h i b i t i o n ；a n db a pe x p o s u r eo nl i v e ra k pa n da c p a l lr e p r e s e n t e d 3 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐菖鲇免疫机能的影响 s t r o n g i n d u c e m e n t s o da c t i v i t yd e c r e a s e ds h o w e dt h ed a m a g eo fs e b a s t i s c u s m a r m o r a t u s sa n t i o x i d a n t ；a n da k pa n da c pa c t i v i t yi n c r e a s e dm i g h ti m p l yt h e c a r c i n o g e n e s i so f s e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s i ns u m m a r y , t h ei m m u n ef u n c t i o n so fs e b a s t i s c u sm a r m o r a l u si n h i b i t e da f t e r b a pe x p o s u r e ；s p l e e nl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o na n dp h a g o c y t i cb l o o dc e l l sr e s p i r a t o r y b u r s to fs e b a s t i s c u sm a r m o r a t u sw e r ep o s s i b l ea ss e n s i t i v eb i o m a r k e r st om o n i t o r b a pe x p o s u r e ；l i v e ra k pa n da c pa c t i v i t yi n c r e a s e dm a yb et h ep r e c u r s o ro ft h e c a r c i n o g e n e s i si ns e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s k e yw o r d s ：s e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s ；i m m u n i t yt o x i c ；b e n z o ( a ) p y r e n e 4 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐菖白由免疫机能的影响 一、鱼类免疫研究进展 第一章前言弟一早刖石 免疫组织是免疫细胞发生、分化、成熟、定居和增贿以及产生免疫应答的场 所。鱼类与哺乳动物在免疫器官组成上的主要区别在于前者没有骨髓和淋巴结。 胸腺、肾脏和脾脏是鱼类最主要的免疫器官；粘膜淋巴组织( m u c o s a a s s o c i a t e d l y m p h o i dt i s s u e ，m a l t ) 同样是其免疫系统的重要组分。 1 免疫组织和器官 鱼类的免疫器官与组织主要指肾、脾脏、胸腺、消化道的淋巴组织、血液和 淋巴等。 鱼类胸腺起源于胚胎发育的咽囊，在免疫组织的发生过程中最先获得成熟淋 巴细胞，一般认为是鱼类的中枢免疫器官。鱼类胸腺在发育过程中与头肾逐渐靠 拢，并伴随有明显的细胞迁移发生心1 。鱼类胸腺是由淋巴细胞、淋巴母细胞、浆 母细胞、分泌样细胞以及其它游离间充质细胞( 巨噬细胞、肌样细胞和肥大细胞 等) 组成，它们分布于由网状上皮细胞形成的基质网孔中嘲1 。胸腺在鱼类免疫 应答中的作用可能是参与t 淋巴细胞的成熟，主要承担细胞免疫的功能。 鱼类肾脏分为头f f ( p r o n e p h r o s ) 、中。f f ( m e s o n e p h r o s ) 、后。f f ( o p i s t h o n e p h r o s ) 三部分。在肾脏的发育过程中，头肾失去排泄功能而成为免疫器官和造血器官； 后肾作为排泄器官，其管间区在造血和免疫方面也具有一定作用畸1 。鱼类头肾 一般是继胸腺之后第二个发育的免疫器官哺1 ，不依赖抗原刺激可以产生红细胞和 b 淋巴细胞等细胞，是免疫细胞的发源地，相当于哺乳动物的骨髓；另一方面，受 抗原刺激后，头肾和后肾造血实质细胞出现增生，而且存在抗体产生细胞，表明 头肾是硬骨鱼类重要的抗体产生器官，相当于哺乳动物的淋巴结。因此可以说， 硬骨鱼类头肾具有类似哺乳动物中枢免疫器官及外周免疫器官的双重功能口1 。在 鱼类头肾中，b 淋巴细胞总是散布于造血细胞和粒细胞生成细胞群中，并与黑色 素巨噬细胞中一l , ( m e l a n o m a c r o p h a g ec e n t e r ，m m c ) 和血管紧密相连，提示它们 在免疫防御中的协同作用碑1 。 脾脏是鱼类红细胞、中性粒细胞产生、贮存和成熟的主要场所。它由红髓和 7 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐菖蚰免疫机能的影响 白髓组成，包括椭圆形的淋巴小泡，内有大量淋巴细胞、巨噬细胞和黑色素吞噬 细胞。硬骨鱼类脾j j j i 没有分化为明显的红髓和白髓，但同时具有造血和免疫功能。 有研究表明，硬骨鱼类在受到免疫接种后，其脾、肾等免疫器官的黑色素巨噬细 胞增多，可与淋巴细胞和抗体聚集在一起，其作用是：参与体液免疫和炎症反 应；对内源或外源异物进行贮存、破坏和脱毒；作为记忆细胞的原始发生中 心；保护组织免除自由基损伤阳1 。 粘膜淋巴组织( m a l t ) 在鱼类体液和细胞免疫中的作用，目前已引起免疫学 家的重视。当鱼体受到抗原刺激时，巨噬细胞可以对抗原进行处理和呈递，抗体分 泌细胞( a n t i b o d ys e c r e t i n gc e l l ，a s c ) 会分泌特异性抗体，与粘液中溶菌酶和补体 等非特异性的保护物质一道组成抵御病原微生物感染的有效防线n _ 引。 2 免疫细胞 凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞均称为免疫细胞。免疫细胞分为两 大类：一类是淋巴细胞，主要参与特异性免疫反应，在免疫应答中起核心作用， 另一类是吞噬细胞。鱼类免疫细胞主要存在于免疫器官和组织以及血液和淋巴液 中。 2 1 淋巴细胞 在哺乳动物中参与特异性免疫应答的淋巴细胞主要有两类，即t 淋巴细胞 和b 淋巴细胞。t 细胞主要介导细胞免疫并在免疫应答中起调节作用；而b 细 胞在体液免疫中与抗体的合成有关。对于鱼类淋巴细胞的异质性，早在7 0 年代 就提出来了，目前利用半抗原载体效应和单克隆抗体等技术，已经证实鱼类的淋 巴细胞也包括t 淋巴细胞和b 淋巴细胞两个亚群，t 细胞具有直接杀伤细胞的 作用，以及通过分泌细胞因子调节免疫反应的作用，主要参与非特异性免疫反应， b 细胞分泌抗体且在细胞表面有抗体存在，参与特异性免疫反应n 0 1 。 2 2 吞噬细胞 鱼类吞噬细胞除作为辅佐细胞具有特异性免疫功能外，也是组成非特异性防 御系统的关键成分，在抵御微生物感染的各个阶段发挥重要作用：粘膜吞噬细胞 构成抗感染的第一道屏障，单核细胞和粒细胞等血细胞作为第二道防线可以破坏 出现在循环系统中的病原生物，器官和组织中具有吞噬活性的细胞能够摄取和降 解微生物及其产物。受到微生物侵扰时，机体炎症反应的核心细胞是巨噬细胞和 粒细胞，它们能够被微生物的有害产物激活并产生更多更有效的抗微生物因子 8 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐莒鱼由免疫机能的影响 n 1 。鱼类的吞噬细胞主要有单核细胞、巨噬细胞和各种粒细胞。 2 2 1 单核细胞 与哺乳动物的相似，鱼类单核细胞也有较多的胞质突起，细胞内含有较多的 液泡和吞噬物，可进行活跃的变形运动，具有较强的粘附和吞噬能力，能够在血 流中对异物和衰老的细胞进行吞噬消化。单核细胞足在造血组织中产生并进入血 液的分化不完全的终木细胞，它还可以随血流进入各组织并在适宜的条件下发育 成不同的组织巨噬细胞。 2 2 2 巨噬细胞 巨噬细胞在不同组织中有多种类型，在同一组织也有不同亚类。在免疫应答 过程中，当病原微生物表面覆盖有免疫球蛋白和补体成分时，巨噬细胞可以通过 这些因子的特异性受体识别并杀伤微生物。鱼类的巨噬细胞不仅具有杀伤细菌及 寄生虫的作用，还可分泌多种在免疫学上重要的分子，如细胞因子和二十碳四烯 酸等。巨噬细胞接触病原微生物后，会引起呼吸爆发，还能够生成肿瘤坏死因子。 新近研究表明，对鱼类巨噬细胞凝集或黑色素巨噬细胞中心的检测，可成为衡量 鱼体健康水平及环境污染状况的生物标志n 。 2 2 3 粒细胞 粒细胞在鱼类中，根据其来源、形态及功能，可分为三类，即嗜中性、嗜酸 性和嗜碱性粒细胞。软骨鱼类粒细胞生成的主要部位是脾脏和其它淋巴髓样组织， 如薄壁囊器( e p i g o n a lo r g a n ) 和莱狄希器( o r g a no fl e y d i 曲；脾和。肾是硬骨鱼类 粒细胞生成的主要场所。嗜中性粒细胞是硬骨鱼类中最常见的一类粒细胞。鱼类 是否同时具有嗜酸性和嗜碱性粒细胞争议较大，大多数鱼类仅具前者，只有少数 鱼类才有嗜碱性粒细胞。嗜中性粒细胞具有活跃的吞噬和杀伤功能，但其吞噬能 力一般比单核细胞弱。 3 免疫分子 存在于鱼类血液或粘液中的具有非特异性抵抗作用的分子包括补体、溶菌 酶、蛋白酶抑制剂、c 一反应性蛋白、干扰素、天然溶血素等。这些物质可以直 接分解细菌( 如溶菌酶、补体) 或真菌，抑制细菌( 如转移因子) 或病毒的复制( 如 干扰素) ，或作为调理素增加吞噬细胞的吞噬量( c 一反应性蛋白、补体) ，乃至 中和细菌( 如q 一巨球蛋白) 。 3 1 补体( c o m p l e m e n t ) q 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐菖鲇免疫机能的影响 补体是鱼类抵抗微生物感染的重要成分，存在于血清中，c 3 是补体系统的主 要成分，七鳃鳗的c 3 仅通过旁路激活，而且其补体系统的主要作用不是促使靶 细胞溶解，而是促进吞噬细胞的吞噬作用n 引。鱼类的补体反应，除经典途径外尚 有替代途径，其重要意义在于它不需要抗体的参与而可被革兰阳性菌和阴性菌中 的脂多糖等激活，这样就强化和扩大了补体的非特异性免疫机能。 3 2 干扰素( i n t e r f e lo l l ，i f n ) 干扰素是脊椎动物体内的能诱导细胞产生抗病毒蛋白质的一种可溶性蛋白。 自1 9 6 5 年首次发现鱼类干扰素活性物质以来，陆续在鲦鱼、虹鳟、酯科鱼类、 大麻哈鱼、鲤鱼、草鱼、金鱼、斑马鱼等鱼体和培养细胞系检测到干扰素，它主 要由巨噬细胞分泌，生成速度受温度影响。近年来的研究表明，鱼类干扰素的抗病 毒机制类似于哺乳动物的干扰素，表现出在同种细胞上具有广谱的抗病毒活性， 但在不同种属细胞问具有相对的抗病毒特异性。目前对鱼类干扰素的研究尚处于 起步阶段，由于缺乏与高等脊椎动物干扰素的系统比较和分子生物学方面的深入 研究，冈此有关鱼类干扰素的性质尚无最后定论。 3 3 凝集素( a g g l u t i n i n ) 凝集素是一种对特异糖残基有高度亲合力的蛋白质。目前有关鱼类凝集素 的研究报道很少，仅从草鱼、欧洲鳗鲡和虹鳟的血清以及淡水叉尾鱼的分泌液和 鲶鱼皮肤、粘液中检查出对某些细菌和红血球具有凝集作用的自然凝集素。早在 1 9 7 9 年v o s s 等发现大麻哈鱼( d t s h a w y t s c h a ) 卵中含有母源性凝集素，并进行 了纯化和活性研究，发现此凝集素具有抑制鱼类病原性细菌的生长。关于鱼类卵 中凝集素的功能，据推测与调节碳水化合物代谢、阻止多精入卵、形成受精膜、 促进受精卵的有丝分裂、调理病原体以及杀菌等作用。从进化的角度来看，鱼类 虽然已可产生抗体，但仅有i g m ，且功能也尚未完善，凝集素的存在可能在一定 程度上弥补了这方面的不足，它能有效地识别和凝集异已成分，从而有利于异物 的清除。因此，有可能作为防止感染性微生物侵入的第一道防线，起着防御作用。 3 4 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 溶菌酶存在于鱼类的粘液、血清、吞噬细胞和单核细胞的胞浆内。鱼类溶菌 酶的活性受季节影响，夏季的活性比冬季增加2 3 倍，这可能是鱼类的季节性 疾病发生的原因之一。溶菌酶通过酶解病原体细胞壁的粘多糖将其杀死，因此溶 菌酶的水平和活性直接关系到鱼类的免疫能力和健康。1 9 9 1 年y o u s i f 1 3 1 等首次 1 0 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐菖蚰免疫机能的影响 从大麻哈鱼( o n c o r h y nc h u s k i s u t c h ) 鱼卵中分离纯化到溶菌酶，其分子质量为 1 45 0 0u ，在卵中含量高达19 0 0 9 9 m l 。关于卵中如此高浓度的溶菌酶的来源 尚不清楚。y o u s i f 等推测是由含溶菌酶丰富的组织如。肾合成后经由血液输送到发 育中的卵细胞的。 3 5c 反应蛋白( c r e a c t i v ep r o t e i n ，c r p ) 鱼类血清的正常组分中含有c 反应蛋白，它能使多种真菌、寄生虫及细菌 含有的糖基以及磷脂酶分子产生沉淀，从而有助于降低病原体的毒力，使吞噬细 胞对之易于攻击，同时还能促进吞噬、激活补体、抑制血小板功能。 4 小结 大量鱼类免疫学研究结果证实，几乎所有真骨鱼类都具有非特异性和特异 性免疫应答机制，存在t 、b 细胞样淋巴细胞；具备细胞免疫、体液免疫和局部 粘膜免疫功能。具有抗体活性的免疫球蛋白( i g ) 广泛存在于鱼类的体液循环系 统和局部粘膜免疫系统。国内外许多学者已经对鱼类的细胞免疫和体液免疫进行 了大量的探索性研究，但人们对鱼类免疫系统的了解与其它高等动物相比，仍 然有很大的差距。主要体现在鱼类只有一种免疫球蛋白( i g m ) ，并且不具备典 型的二次免疫应答机制。鱼类是变温动物，其免疫应答受到多种因素的影响，如： 环境温度、季节、光照周期以及溶解于水中的有机物、重金属离子等。此外，鱼 类品种繁多，而且从进化角度考虑，两种形体上相类似的鱼种可能早在远古时 代就己在遗传上分化，因此，某一种鱼类的免疫学研究很难完全替代另一种鱼 类的研究。 二、p a h s 对鱼类免疫系统的影响 多环芳烃 ( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ) p a h s 是一类广泛分布于海洋 环境中的含有两个苯环以上的有机化学污染物，随着苯环数量增加，其疏水性 增大，半衰期增长，毒性增大，致癌性增强。人类的活动是造成这种有毒的化学 物质遍布于海洋环境中的主要因素n 引。p a h s 主要来源于人类活动和能源利用过 程，如石油、煤、木材等的燃烧过程、石油及石油化工产品生产过程、海上石油 开发及石油运输中的溢漏等。表面水中p a h s 的来源主要包括城市生活污水、工 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐莒鲇免疫机能的影响 业废弃物、大气沉降、表面径流，以及土壤浸析等。生活污水和城市径流往往比 工业废弃物含有更高的p a h s 残留物，石油产品中p a h s 含量有差异，荧蒽 ( f l u o r a n t h e n e ，f l u o ) 、芘( p y r e n e ，p y ) 和苯并( a ) 芘 b e n z o ( a ) p y r e n e ，b a p 更普遍存 在于汽油中。p a h s 普遍分布在天然水体中，特别是工业发达地区。靠近油阳和 其他污染源的p a h s 浓度可高达5 0 “g l ，大洋和未污染湖水中p a h s 含量往往低 于1 p g l 引。以往的研究显示，表层沉积物中的b a p 浓度可达到0 1 3 一o 6 9 1 t g g 制。对美国的调查显示，在以下污染地区的沉积物中检测到高浓度的b a p 和 其他p a h s -n e w a r kb a y , n j ( 1 9 6 0p g g 总p a h ) ，t h eb l a c kr i v e r , o h ( 1 0 9 6 1 t g g 总p a h ) ，t h ee l i z a b e t hr i v e r ，v a ( 21 ，2 0 0p g g 总p a h ) n t 博1 引。此外，c a t a l l o 和g a m b r e l l ( 1 9 8 7 ) 瞳帕报道了b a y o ub o n f o u c a ，l a 沉积物中的b a p 含鼍高达6 1 0 i - t g g 。随着经济的发展，有可能导致p a h s 排放量的增加瞳。p a h s 除了已经被 证实是诱导有机体突变的物质和致癌物质的前体心2 | ，近年来有研究报道p a h s 对 鱼类还具有生殖毒性和免疫毒性。 p a h s 对鱼类和哺乳动物的特异和非特异性免疫都有影响。p a h s 污染水域的 鱼由于免疫机能的抑制，外部形态表现异常，包括鳃、皮肤、鱼鳍等的损伤瞳3 | 。 1 对特异性免疫的影响 鱼类的特异性免疫与哺乳动物的类似，包括细胞和体液介导的免疫。p a h s 对哺乳动物b 淋巴细胞功能影响的研究表现出不同的结果，这取决于不同的p a h s 及其剂量的不同。3 - m c 和t c d d 明显抑制用绵羊红细胞免疫的小鼠血清抗 体滴度，但是2 ，2 ，4 ，4 ，5 ，5 - h e x a c h l o r o b i p h e n y l 却增强这一过程乜引。在鱼类的研 究中也产生了相似的结论，t c d d 抑制绵羊红细胞免疫的大鳞大麻哈鱼( o n c o r h y n c h u s 转j l z 口少拈幽以) 抗体的生成心5 。b a p 在15 m g k g 时抑制罗非鱼( o r e o c h r o m i s n i l o t i c u s ) b 细胞介导的免疫，而在2 5 m g k g 时增强这一过程瞳6 | 。c a r l s o n 等研究 表明，单次腹腔注射b a p 于青锵鱼( o r y z i a sl a t i p e s ) ，能显著抑制其淋巴细胞增 殖和抗体形成细胞的数目心7 1 。r e y n a u d 等用3 - m c ( 4 0 m g k g ) 腹腔注射于鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i ol ) 体内，明显的诱导淋巴细胞增殖，表明这一免疫应答可能是p a h s 污染鱼体后的第一免疫生物标志物瞳8 i 。3 - m c 对小鼠淋巴细胞增殖的诱导作 用，与b a p 诱导其暂时的皮肤癌的作用相似乜引。这一现象的根本机制目前还不 完全清楚，但可能原因是，b a p 暴露对小鼠的皮肤以及3 - m c 暴露后鲤鱼淋巴细 胞都会产生突变，导致其快速的增殖。有研究表明暴污后1 d 小鼠皮肤细胞即在 1 2 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐莒鲇免疫机能的影响 细胞分裂s 期产生突变，导致其迅速增殖幽3 。这需要更多的鱼类和哺乳动物方面 的实验的证明。 2 对非特异性免疫的影响 p a h s 对鱼类非特异性免疫的影响主要集中在研究溶菌酶活性、噬菌细胞吞 噬活性、n c c ( 非特异性细胞毒细胞) 等方面。 2 1 对溶菌酶活性的影响 对于鱼类毒理学研究，主要检测血清或血浆中的溶菌酶活性。实验室和野外 研究了多种毒物混合对溶菌酶活性的影响，如柴油提取物、石油污染沉积物等。 腹腔注射柴油提取物于彩虹真骨鱼( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 体内，0 6 m l k g 组鱼血 清溶菌酶活性下降，但更高剂量组没有相似变化。州。比目鱼( l i m a n d al i m a n d a 三) 暴露于石油污染沉积物后血清溶菌酶活性降低，同样油轮失事地点捕获的比 目鱼血清溶菌酶活性也降低。1 。然而也有研究表明，富含p a h s 沉积物污染的比 目鱼，其溶菌酶活性并无变化2 1 。 2 2 对噬菌细胞的影响 噬菌细胞主要包括巨嗜细胞和嗜中性粒细胞。从p a h s 污染水域捕获的鱼， 其外部形态表现异常，包括腮、皮肤和鳍的损伤口3 l 。很多研究人员集中研究这种 受损伤的鱼的巨噬细胞活性，指出其吞噬活性和趋化性下降口3 3 钆3 5 蚓。r e y n a u d 等研究表明3 - m c 污染的鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i ol ) 其巨噬细胞呼吸爆发活性增加 啪1 。然而，c a r l s o n 等研究指出腹腔注射b a p 会抑制青鲻鱼( o r y z i a sl a t i p e s ) 噬 菌细胞介导的过氧化物的生成量。分离出鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i ol ) 头肾巨噬细 胞，体外暴露于3 - m c 中，结果增强用p m a ( 佛波醇酯) 作刺激剂的呼吸爆发 活性 。结合3 - m c 对鲤鱼巨噬细胞呼吸爆发活性影响的时间一效应曲线，r e y - n a u d 等指出巨噬细胞呼吸爆发活性氧的产生可能作为p a h s 污染的敏感的标志 物。 2 3 对n c c ( 非特异性细胞毒细胞) 的影响 鱼类的n c c 跟哺乳动物的n k ( 自然杀伤) 细胞类似，能本能的杀灭多种 外源物，如特异的鱼类寄生虫和传统的哺乳动物n k 细胞目标物羽。跟n k 细胞 不同的是，鱼类n c c 主要存在于淋巴组织( 如，头肾、脾) ，血液中含量很少。 n c c 活性对酚类和p a h s 污染很敏感。对苯二酚降低体外和体内暴污的鲤鱼( c - y p r i n u sc a r p i ol ) n c c 活性，但是苯酚和邻苯二酚只减少体外暴污的n c c 活性 1 3 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐莒鱼由免疫机能的影响 。州。可能最显著的n c c 活性影响实验是腹腔注射d m b a ( p a h s 的典型代表物) 于羞蟾鱼体内( o p s a n u st a u ) ，所有d m b a 污染组的n c c 活性都几乎消失，n c c 比巨噬细胞噬菌能力更易受损伤0 1 。同样也检测了野外采样的鱼的n c c 活性， p a h s 污染严重的伊丽沙白河中的底鲻( f u n d u l u sh e t e r o c l i t u s ) ，其n c c 活性比 污染程度很轻的约克河中的底鲻要低得多n 。但是，从污染源向下游远处不同地 点的翻车鱼( l e p o m i sm a c r o c h i r u s ) ，其前肾和脾脏n c c 活性的变化并不跟距离 的变化相一致，而巨噬细胞呼吸爆发的变化却足醴距离有基本一致的变化。| 2 3 。虽然 目前实验室和野外的研究表明n c c 活性一般对污染物的暴露变化并不敏感，但是 通过改进和制定更好更标准的检测和评估n c c 活性的方法，应该能够改善n c c 作为细胞免疫标志物的作用n 3 3 。 2 4 小结 鱼类免疫系统对p a h s 污染非常敏感，p a h s 能同时影响鱼类特异和非特异 性免疫。然而，影响依赖于p a h s 的具体种类、污染的途径、浓度和鱼的种类。 相对来说，特异性免疫中的淋巴细胞增殖，非特异性免疫中的吞噬细胞呼吸爆发 对p a h s 的污染更为敏感。与哺乳动物的比较研究表明，p a h s 的免疫毒性从鱼 类剑哺乳动物存在系统发生上的保守性，即作用机理是基本相似的。 实验设计及研究意义 b a p 作为广泛分布的的多环芳烃，在海洋环境中已经不可避免的会对海洋鱼 类造成污染胁迫。然而，对b a p 的免疫毒性效应的研究报道十分匮乏，而且都是 集中于对鱼类免疫毒性某一参数的测定，缺乏整体性研究。本实验以b a p 作为 污染物，较系统的研究其对褐菖鱼由( s e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s ) 免疫系统方面的影 响。具体实验参数如表1 。 1 4 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐菖蚰免疫机能的影响 表1 ：本实验主要检测的免疫参数 t a b l e1 t h ei m m u n i t yp a r a m e t e r so ft h i ss t u d y 器官水平 细胞水平 生化水平 脾脏体重指数、肝脏体重指数 脾脏淋巴细胞增殖、血液红细胞计数、血液白细 胞计数、血液吞噬细胞呼吸爆发 肝脏s o d 酶、a k p 酶、a c p 酶 通过表l 看出，本实验的目的是通过对免疫系统的器官水平、细胞水平及生 化水平的研究，探讨免疫系统各参数之问的有机联系，从整体上分析b a p 暴露对 鱼类免疫系统的影响。通过各参数对毒物暴露而产生的毒性效应，寻找可能的敏 感的生物标志物，并希望构建以褐菖鱼由为免疫毒理的敏感的生物模型。 免疫系统是动物与环境毒物直接接触的系统，它作为环境毒物的监测有独特 的优点。毒物对免疫机能的损害是生态毒理关注的焦点，因为免疫系统的损害可 能导致整个动物个体的健康甚至生命受到危险，另外，绝大多数免疫因子在动物 进化的过程中是非常保守的。这就意味着对同一污染物暴露引起的免疫机能的变 化在不同的动物之间是相似的，这样就可以容易的预言一种毒物对环境的有害影 h 向。 在研究生态毒理和免疫关系方面，鱼类是一类尤为重要的动物。了解免疫功 能的变化对于评估水生环境的变化尤为重要。鱼类是脊椎动物中种类最多的，接 近2 5 ，0 0 0 种，占据了世界绝大对数水体，因此，检测鱼体健康可以反映水生环 境的状况；对鱼类免疫的影响可以作为对人类及其生存环境的影响的一种潜在警 报，因为生态毒物通常首先释放进入水生环境，然后通过一系列的步骤而达到人 类和陆地动物；此外，该项研究还具有重要的经济价值，从渔业来说，经济鱼种 的健康明显是很重要的，同时，其他鱼种的健康也很重要，他们有可能是经济鱼 种的饵料，对于维持渔业的发展起着关键性作用，鱼类的免疫发生故障对于鱼类 经济的影响将是致命的。 褐菖鱼由为卵胎生、体内受精的硬骨鱼h 制，属暖温性底层鱼类，栖息于近岸岩 礁海区，为我国自雷州半岛以东沿海一带习见鱼类，广泛分布于北太平洋西部及 我国南海、东海、黄海和渤海。褐菖鲇以摄食小鱼、虾类、麦秆虫、泥螺、藻类 l5 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐莒鲇免疫机能的影响 等底栖生物为主。因其取材方便、抗病能力强，存活率高，容易采集和饲养的特 点，以褐菖鼬作为实验对象对反映海区的污染程度有一定实际意义。 在本实验中，采用的b a p 浓度为0 1 1 0m g k g 。低浓度( o 1 1m g k g ) 接 近环境的真实浓度，而高浓度( 1 0m g k g ) 则比通常检测到的环境污染浓度要高， 设置高浓度组的目的在于模仿高污染地区的环境，以及海区的突发性污染事故发 生的情况。 1 6 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐菖蚰免疫机能的影响 一、实验材料 第二章实验材料和方法 实验用褐菖鱼由采于福建厦门海域，体重2 8 4 5 9 ，体长7 1 2 c m 。约1 0 尾一 组，先在含3 0 l 清洁沙滤海水的水族箱中暂养7 d ，用充气机连续充气，选取活 泼健康个体进行污染暴露实验。 二、仪器和试剂 1 实验仪器 2 0 2 3 电热式恒温干燥箱 s a r t o r i u s 电子天平 b e c k m a nj 2 - m c 型高速冷冻离心机 v i s 7 2 3 g 分光光度计 l e i c a 显微镜 恒温水浴箱 t h e r m o3 1 1 i c 0 2 培养箱 s w - c j 1 d 型单人净化工作台 2 常用试剂 试剂主要有：b a p ( 苯并( a ) 芘) ，r p m i 1 6 4 0 培养液，c o n a ( 刀豆蛋白) ，m t t ( 噻哗兰) ，辣根过氧化物酶，p m a ( 佛波醇酯) ，s o d ( 超氧化物歧化酶) 试 剂盒，a k p ( 碱性磷酸酶) 试剂盒，a c p ( 酸性磷酸酶) 试剂盒。 三、污染实验 b a p 先用玉米油配制成0 0 5 、0 5 和5m g m l 的储备液，避光于4 。c 保存。 每组6 尾鱼，每尾鱼按2m l 储备液k gg a s ( 相当于0 、0 1 、1 和1 0 m gb a p 1 7 硕士论文：苯并( a ) 芘对褐莒鱼由免疫机能的影响 始体重) 进行腹腔注射。溶剂对照组只注射等量玉米油。每隔3 d 重复注射1 次， 具体见表2 。 表2 ：褐菖鲴染毒时间 t a b l e2 t h ep e r i t o n e a li n j e c t i o nd a y s 每个水族箱投入1 0 条鱼，空白对照、溶剂对照、低浓度组、中浓度组、高 浓度组各两条，各浓度组鱼分别以不同颜色的线穿透背鳍做标记。为减少时间上 的误差，规定每次注射时l 、日j 为当同的8 时、1 0 时、1 3 时、1 5 时、1 8 时，分别注 射空白对照、溶剂对照、低浓度、中浓度和高浓度等不同浓度组的鱼。 每隔1 d 投喂新鲜文蛤( m e r e t r i xm e r e t r i x ) 一次，并于投喂2 h 后清除食物 残渣，更换清洁海水。饲养期间水温1 6 2 0 ，盐度2 2 2 4 。 分别于染毒后l 、4 、7 、1 4 d 取样。取样时先称