（材料物理与化学专业论文）磁性纳米粒子在癌细胞分离与诊断领域应用的初步研究.pdf

中国科学技术大学硕士学位论文 摘要 本文主要围绕磁性纳米粒子在癌症诊断领域应用展开研究。论文首先简要综 述了磁性纳米粒子在癌症诊断与治疗中的应用研究现状。完成了磁性纳米粒子在 癌症诊断领域应用的初步研究，研究了磁性纳米粒子在针吸细胞学临床标本细胞 的磁分离与细胞学分析。利用原代培养肿瘤细胞获得的具有荚膜结构的表皮葡萄 球菌菌株，研究了表皮葡萄球菌的分形结构。通过p v p 与细菌共同协同作用形成 模板，合成了链状、环状的特殊钻纳米结构。 选择对癌细胞具有亲和结合作用，含有丰富活性功能基团的p v p f e 3 0 4 纳米 粒子，研究了其与临床针吸细胞学标本不同类型细胞亲和结合和磁分离条件，通 过与常规细胞学方法对比研究，发现p v p f e 3 0 4 磁性纳米粒子在生理盐水和抗凝 剂体系下，能与鳞癌、转移性腺癌、乳腺癌，增生的上皮细胞和间皮细胞结合， 并能够从标本中富集、分选出细胞。p v p f e 3 0 4 磁性纳米复合体不能与正常细胞、 淋巴细胞、血细胞、脂肪细胞结合。 利用液体培养基培养的具有荚膜结构的表皮葡萄球菌菌株在玻璃基底上集聚 形成分形结构。通过多重分形谱的分析表明，表皮葡萄球菌分形结构形成机理不 同于常规菌落分形结构的扩散限制聚集模型，而符合团簇团簇聚集模型。细菌密 度不能显著影响分形结构的特征，不同密度的细菌形成的分形结构具有相似性。 细菌与p v p 间的相互作用主要是p v p 链与细菌胞外酰基化的荚膜多糖通过氢 键和范德华力等非化学键结合的相互作用。本文利用表皮葡萄球菌和p v p 相互协 同作为生物模板合成出了链状和环状钴纳米结构，这些纳米结构是由颗粒尺寸为 5 0 n m 左右的无定形钴纳米粒子组成。不同形态的钴纳米结构是由于细菌与p v p 不同的相互作用形成。当p v p 链两端与细菌表面结合，p v p 链被细菌拉直形成模 板时，钴纳米粒子沿着p v p 链沉积形成链状钴纳米结构。当先合成钴p v p 配合物， 再与细菌结合形成模板时，被隔离的钴纳米粒子通过磁相互作用镶嵌在细菌周围 形成环状钴纳米结构。经氧化的钻纳米链样品制成的锂离子电池电极，在充放电 过程中，因颗粒较大和在电极表面形成固体电解质中间相，充、放电性能表现不 可逆的、大幅度的衰减。 m 中国科学技术大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nw a sc a r r i e do u tf o c u s i n go nt h e a p p l i c a t i o no fr n a g n e t i e n a n o p a r t i c l e s i nt h ef i e l do fc a n c e r d i a g n o s i s t h ea p p l i c a t i o n s o fm a g n e t i c n a n o p a r t i c l e sf o rc a n c e rd i a g n o s i sa n dt h e r a p yw e r er e v i e w e d t h ea p p l i c a t i o no f p v p f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e s i nf m en e e d l e a s p i r a t i o nc y t o l o g yc l i n i c a ls p e c i m e n m a g n e t i cs e p a r a t i o n a n dc y t o l o g y a n a l y s i s w a si n v e s t i g a t e d a n e n c a p s u l a t e d s t a p h y l o c o c c u se p i d e r m i d i ss t r a i nh a sb e e no b t a i n e df r o mac l i n i c a li n f e c t e ds p e c i m e n w h e nw ec u l t u r e dp r i m a r yc a n c e rc e l l t h ef o r m a t i o no ff r a e t a ls t r u c t u r e si n s t a p h y l o c o c c u se p i d e r m i d i sw a si n v e s t i g a t e d r i n ga n dc h a i nc o b a l tn a n o s t r u c t u r e s h a v e b e e ns y n t h e s i z e dr e s p e c t i v e l yu t i l i z i n gs e p i d e r m i d i si nc o m b i n a t i o n 、i t hp v pa s t h eb i o t e m p l a t e n 圮a p p l i c a t i o no fn a n o p a r t i c l e si nm a g n e t i cs e p a r a t i o nf i n en e e d l ea s p i r a t i o n c y t o l o g yc l i n i c a ls p e c i m e nw a si n v e s t i g a t e d p v p r e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sw i t lr i c h a c e t y l a t e df u n c t i o n a lg r o u p sw h i c hp r e f e rb i n dt h ec a n c e rc e l l sw e r ec h o s e n c o m p a r e d w i t hn o r m a l c y t o l o g ya n a l y s i s ，p r e l i m i n a r y r e s u l t ss h o w e dt h a t p v p f e 3 0 4 n a n o p a r t i c l e s c a l le n r i c ha n d s e p a r a t es q u a m o u s c a r c i n o m a c e l l s ，m e t a s t a t i c a d e n o c a r c i n o m a sc e l l s ，b r e a s tc a n c e rc e l l sa n db e n i g ne p i t h e l i aa n dm e s o t h e l i a lc e l l s o nt h ec o n t r a r y , p v p f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sc a nn o tb i n dt h en o r m a lc e l l s ，l y m p h o c y t e ， b l o o dc o r p u s c l ea n d l i p o c y t e t h ef o r m a t i o no ff r a c t a ls t r u c t u r e si np o p u l a t i o n so fe n c a p s u l a t e ds e p i d e r m i d i s s t r a i nb a s e do nt h ep r i n c i p l eo fc l u s t e r - c l u s t e ra g g r e g a t i o nm o d e lu n d e rt h eg l a s s s u b s t r a t e s t u d yo fse p i d e r m i d i sf r a c t a ls t r u c t u r e si sh e l p f u lt ok n o wm o r ea b o u tt h e f i a c t a ls h u c t i l r e sp a t t e r n - f o r m i n gi n v o l v e dn o n - e x l u i l i b f i u mp h y s i t sa n dc h e m i s t r y p r o c e s s e s ，a n d e n r i c ht h ef r a c t a ls t r u c t u r e sr e s e a r c hi nb i o l o g i c a l s y s t e m t h e m u t i f r a c t a ls p e c t r aa n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h es e p i d e r m i d i sf r a c t a ls t r u c t u r e sf o r m a t i o n h a sc l o s e dc o r r e l a t i o nt ot h eb i o f i l mf o r m a t i o n , t h eb a c t e r i a ld e n s i t yc a l l td r a s t i c a l t e r a t i o nt h es t r u c t u r e sa n dd i f f e r e n td e n s i t i e se v o l v e dt h es i m i l a rf r a c t a ls t r u c t u r e s r i n ga n dc h a i nc o b a l tn a n o s t r u c t u r e sh a v eb e e ns y n t h e s i z e dr e s p e c t i v e l yu t i l i z i n gs e p i d e r r n i d i s i nc o m b i n a t i o nw i t hp v pa st h e b i o t e m p l a t e t h o s e n a n o s t r u c t u r e s 中国科学技术大学硕士学位论文 c o n s i s t e do fa m o r p h o u sc o b a l tn a n o p a r t i c l e s 、 r i t l lt h ea v e r a g es i z eo fa p p r o x i m a t e l y 5 0 n m t h em o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n c eo fn a n o s t r u c t u r e si sd e t e r m i n e db yt h ei n t e r a c t i o n s b e t w e e np v pa n db a c t e r i a , w h i c ha r em e d i a t e db yt h ee x t r a e e l l u l a ra c e t y l a t e dc a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d ev i an o n - c h e m i c a lb o n da t t a c h m e n ts u c ha sh y d r o g e nb o n da n dv a n d c r w a a l sf o r c e s f o rc h a i nn a n o s u u c b u r e s 。c on a n o p a r t i c l c sd e p o s i t e da l o n gt h ep v pc h a i n sw h i c h w e r ea tf i r s td r a w ns t r a i g h tb yt h eb a c t e r i a i nad i s s i m i l a rw a y , w h e nt h ec o p v p c o m p l e x e sw e r el i n k e db ys u b s e q u e n t l ya d d e db a c t e r i a , i s o l a t e dc o b a l ti o na r e a sf o r m e d a r o u n dt h eb a c t e r i a t h u s ，u p o na d d i n gr e d u c i n ga g e n t ，c o b a l tn a n o p a r t i c l e sw o u l db e p r o d u c e d a n da s s e m b l ei n t o r i n g n a n o s t r u c t u r e sv i a m a g n e t i ci n t e r a c t i o n t h e e l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa se l e c t r o d e so fc o b a l to x i d ew h i c ho x i d i z e df r o mt h ec o b a l t c h a i nn a n o s t r u c t a r e ss h o w e dt h a tt h el a r g ei r r e v e r s i b l ec a p a c i t ya n dd e t e r i o r a t es h a r p l y d u r i n gc y c l i n g v - 中国科学技术大学学位论文相关声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究 工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权， 即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：乒班 q 年月j 日 中国科学技术大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章绪论 当前，纳米与生物技术的进步使得材料与生物学科交叉解决医学诊断与治疗 方面的难题成为可能。磁性纳米粒子在结构上与块体材料存在很大差别，表现出 一些特异的磁学性质，特别是铁氧体纳米材料由于纳米尺寸所导致的某些特殊磁 学性质，如：超顺磁性，经表面包覆生物样品后具有相对较好的生物安全性与生 物相容性，在生物医学检测与治疗等领域中的应用得到了广泛的关注，形成了相 对比较独立的领域。目前，纳米医学技术的研究热点是疾病的诊断与治疗等领域。 在癌症研究领域，利用纳米技术与生物医学交叉可望使各种癌症的早期诊断与治 疗成为现实。但这一技术在实用中尚有很多技术难题需要解决。 目前，国际上铁氧体磁性纳米粒子在癌症诊断与治疗中的研究主要包括：癌 细胞分离与净化、医学造影剂、靶向给药、磁滞热疗等方面d - 3 】。磁性纳米粒子在 癌症诊断与治疗中应用最为关键的问题是靶向性即：磁性纳米粒子对癌细胞的特 异性识别。若靶向问题得到解决，同一磁性纳米粒子可在癌症诊断和治疗两方面 中同时应用，而不仅仅局限于某个方面。我们的研究立足点是磁性纳米粒子在针 吸细胞学诊断中的应用。 1 2 生物分离( b i o s e p a r a t i o n ) 与检测 磁性粒子在生物分离与净化领域具有广阔的应用前景。磁性生物分离 ( m a g n e t i cb i o s c p a r a t i o n ) 是以磁性粒子作为载体工具，将配基( 抗体、蛋白质、 酶) 偶联在载体表面，运用生物分子特异性亲和作用原理，借助于磁性分离装置， 对目标生物分子进行识别、负载、运载和卸载等分离操作，从而实现目标生物分 子的磁性分离过程。磁性载体通常由无机磁性内核和表面包覆的有机高分子外壳 两部分组成，磁性生物分离兼具磁性载体的磁性和亲和配基的生物特异性特点， 在生物分离和生物医学工程应用中具有独特的优势，在细胞、蛋白质、核酸( d n a 。 r n a ) 等生物物质的分离与检测领域具有广泛的应用前景【4 l 。 在生物医学领域，因分离的目标生物分子和其所附存的生物体系不同，对磁 分离载体的要求和评价标准不一样，一般来说，理想的磁性分离载体因当满足以 下几个方面： 1 中国科学技术大学硕士学位论文 ( 1 ) 粒径适当，具有良好的分散性。一般要求微米或纳米级的微球，粒子的 粒度分布相对较窄。形貌和密度均一，流体力学行为一致，在分散介质中不凝聚。 ( 2 ) 磁性性能优异，要求粒子的饱和磁化强度高、剩磁低。饱和磁化强度高 有利于磁性分离的可操作性，剩磁低可避免使用过程中的磁性团聚。不同的粒子 的磁性能均一，以保持相似的磁分离条件。 ( 3 ) 载体表面带有丰富的活性功能基团如- - o h 、- - c h o 、一n h 2 、- - c o o h 、 - - s h 等。易与各种配基共价结合，且表面配基偶联效率高。 ( 4 ) 物理和化学性能稳定，耐酸碱和微生物降解，表面配基不易脱落，易于 保存。 ( 5 ) 制备工艺简单，价格便宜，宜于推广应用。 1 2 1 细胞分离与检测 图1 1 临床细胞自动分离系统c l i i l i m a c s 细胞分离是细胞生物学和生物医学疾病诊断与治疗研究中的一种十分重要的 技术，例如在放射或化学疗法中的应用。众所周知，放射和化学疗法是治疗肿瘤 的重要方法之一，然而放射线照射既能杀死肿瘤细胞，也能损伤正常细胞，尤其 是对生命极端重要的具有造血功能和免疫功能的骨髓细胞的损害。因此可以从脐 血分离造血祖细胞用于放疗或大剂量化疗后患者的骨髓移植，或者在放疗前将患 2 中国科学技术大学硕士学位论文 者的骨髓液抽出，通过细胞分离去除肿瘤患者骨髓液中的肿瘤细胞，在患者经过 放疗或化疗后重新注入己净化的骨髓来辅助放疗和化疗，实现对肿瘤患者更为有 效的治疗】。b r i s c o e - 等 6 1 利用磁性微球成功地在骨髓移植过程中对骨髓中的t 细胞 进行了提纯，使之应用于进一步的分类、培养、功能研究和流式细胞术等。 a ) 免疫磁株标记细胞模拟图航体只与特定的靶向细胞结合 b ) 免疫磁珠分离细胞原理流程 图1 - 2 免疫磁珠分离细胞原理 细胞免疫分离方法是细胞生物学和生物医学研究中细胞分离的重要方法之 一，利用免疫磁分离( i m m u n o m a g n e t i cs e p a r a t i o n ) 技术进行细胞分离，不仅简便 快速，而且可以在接近细胞正常生活状态的情况下进行。对细胞活性无显著影响， 因此，免疫磁分离技术在细胞分离上得到了广泛应用。图1 1 为德国m i l t e n y ib i o t e c 公司开发的临床细胞自动磁分离系统c l i n i m a c $ 。免疫磁分离细胞方法的原理1 5 】 3 中国科学技术大学硕士学位论文 ( 图1 2 ) 是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性抗体相结合的原理，首先 将磁性纳米粒子或磁株表面功能化，使得表面带有丰富的活性功能基团如一0 h 、 - - c h o 、一n h 2 、- - c o o h 、一s h 等，在经功能化的磁性纳米粒子或磁株的表面 标记上对细胞表面抗原具有特异性识别的抗体，将联结有抗体的磁性纳米粒子或 磁株加入到细胞标本中，在外加磁场下，通过抗体与磁珠相连的目标细胞被吸附 而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性抗体结 合而没有磁性，未标记细胞先行流出，从而使细胞得以分离。 免疫磁分离法分为阳性分离法和阴性分离法。阳性分离法一磁珠结合的细胞 就是所要分离获得的细胞。阴性分离法一磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的 细胞为所需细胞一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离 法用行更多。 免疫磁分离细胞的重要指标是：目标细胞的纯度和得率，这取决于磁珠所联 接抗体的特异性和磁珠大小( 磁性) 。目前市场上的磁性细胞分离系统，m a c s 使用的磁性粒子大小在5 0 n m 左右，d y n a l 等公司使用的磁性粒子粒径在1 2 0 0 - - 4 5 0 0 姗。磁性纳米粒子优点：较小的尺寸可以避免对细胞产生机械应力，可以缩短孵 育时间，经修饰的磁性纳米粒子在磁场中可形成稳定的胶体分散体系，不会发生 粒子的聚集和沉淀。缺点：需要很强的磁场来分离细胞，分离速度很慢，得率不 高，需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行，成本昂贵。大磁珠的优点：技 术简单，分离可在试管中完成，易于增减细胞用量，速度快，得率高。然而太大 的磁珠会对细胞产生机械应力，影响细胞活性，由于会影响光散射，也无法直接 上流式细胞仪。 肿瘤细胞细胞膜表面的理化性质与正常细胞比较，发生了改变，主要是其粘 附性降低，因此细胞极易脱落，随组织液进入血流。血行转移是恶性肿瘤的主要 播散途径之一，外周血中出现恶性肿瘤细胞预示着疾病的复发、转移和恶化。因此， 外周血肿瘤细胞的检测对于f 临床诊断、监测病情、发现早期存在的微小转移病变、 等具有重要意义。在正常情况下，胸腹腔分泌少量稀薄液体，具有润滑作用。但 在病理情况下，如发生炎症、肿瘤等，胸腹腔内分泌的液体明显增多，形成积液。 胸腹腔积液是良好的培养基，温度适宜，脱落的良、恶性细胞均可在积液内继续 繁殖。因而，积液内自由漂浮的细胞与直接从组织取出的同源细胞，在形态上可 有明显差异，并且发生不同程度的退化变性。从而使得对胸腹水中的肿瘤细胞进 4 中国科学技术大学硕士学位论文 行鉴别诊断非常困难。对于肿瘤原发灶不明的部分患者，在胸腹水中查见肿瘤细 胞，成为肿瘤最先确诊的依据【7 】。利用免疫磁分离结合其他检测技术对血液和胸腹 水中的癌细胞进行分离和检测很有可能实现癌症的早期诊断与治疗。 1 9 9 7 年d e n i s 等【s j 免疫磁株结合p c r 检测s w 6 2 0 结肠癌细胞，根据细胞 c k l 9 的表达情况，其敏感度可达到在l m l 血中检测出1 个癌细胞。2 0 0 1 年 g a u t h i e r 等 9 1 用免疫磁分离法富集的单核细胞有7 2 可检测到上皮细胞的端粒酶 活性，从而提出这种方法可能成为一种有价值的诊断及评价预后的方法。在肿瘤外 科手术中，因为有重新输入肿瘤细胞引起转移的危险，所以自体血液回输是禁忌的。 k o n g s g a a r d 等i lo 】利用免疫磁分离并滤除肿瘤细胞，然后通过克隆分析检测外周血中 是否还有恶性肿瘤细胞的存留，从而保证了肿瘤外科手术中自体血液回输的安全 性。s a b i l e 等【l l 】比较了分离循环血中肿瘤细胞的方法：免疫磁分离法、密度梯度分 离法、氨基氯化法及蒸馏水介导的红细胞分析法。他们分别用这4 种方法从循环 血液中分离得到了前列腺癌与肝癌的细胞，进行r t p c r 分析，结果显示免疫磁分离 法在体外试验中是分离循环肿瘤最敏感的技术。k u h a r a 等 1 2 】将抗体与从磁性细菌 分离出的磁性纳米粒子表面膜表达的a 型蛋白质结合，应用于从外周血中磁分离 和净化单核细胞。p a r t i n g t o n 等【1 3 】提出了一种新的磁分离细胞方法，该方法先用 5 0 n m 的磁性纳米粒子细胞进行正选择在此基础上不需分离除去小磁性粒子，而直 接用更大粒径的微米级磁珠直接进行正负选择该技术充分利用了不同粒径磁珠在 不同磁场强度下引力的不同从而达到简化实验操作的目的。作者用该技术对多种 淋巴细胞进行了分离并将其用于造血干细胞的分离。 国内范蓉等【h 】利用免疫磁分离法分离腹水中的卵巢癌细胞，结果显示当卵巢癌 细胞数占腹水细胞数的4 1 3 4 时，用磁分离法分离得到的卵巢癌细胞的纯度平均 为6 7 ，用台盼蓝染色检查活细胞数达7 5 。b a r k e r 等 1 5 1 利用磁分离技术从卵巢 腺癌患者腹水中分离出肿瘤细胞，他们得到的肿瘤细胞纯化率为6 3 9 6 。这种 方法可提高有腹水患者癌细胞检出的阳性率，以指导i 临床的治疗及预后的判断。晚 期卵巢癌患者通常有腹水形成，利用免疫磁分离技术可以检测到腹水中少量的卵巢 癌细胞，这对指导临床治疗、监测病情进展等都很重要。s a p i 等【1 6 】利用免疫磁分离 技术阳性选择法从卵巢癌患者手术中抽取的腹水中富集出肿瘤细胞，检测细胞端粒 酶的活性。结果显示，在1 8 个标本中有1 5 个检测出有端粒酶活性的卵巢癌细胞。 免疫磁分离技术在医学领域中的应用越来越广泛，尤其是在肿瘤学中的应用更 s 中国科学技术大学硕士学位论文 是令人瞩目的。如果将其与其他技术相结合，免疫磁分离技术的优越性将能更加充 分地发挥出来。但这项技术也有其自身的缺点，虽然单克隆抗体技术发展突飞猛进， 但肿瘤特异性抗体难以获得，要想分离出纯的细胞必须考虑到应用抗体的数目，用 几种抗体包被的磁珠结合靶细胞可提高细胞分离效率，但其特异性亦可受到影响。 1 2 2d n a 、蛋白质的分离与检测 核酸( d n a 和r n a ) 和蛋白质的分离是生物技术中一项艰巨而繁重的任务，到 目前为止，还没有成熟的可以把任一组分从复杂生物混合体系中分离的方法。 对d n a 而苦，通常采用的分离手段包括超速离心和电泳，电泳方法可分为琼脂 糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳。虽然电泳方法在碱基对少于 i k b p ( k i l o b a s ep a i r s ) 的短链d n a 的分析和分离方面已经得到广泛应用，但对于碱基 对大于1 k b p 的长链d n a ，传统方法无法进行分离。传统的蛋白质分离方法如盐析、 有机溶剂沉淀法、膜分离技术、离子交换技术和层析技术等，通过改变p h 值、温 度、离子强度、介电常数等因素来达到分离的目的，分离过程繁杂，而且目标蛋 白质的损失大。而蛋白质的磁分离是通过对磁性微球表面的功能化，共价结合能 被目标蛋白质识别和可逆结合的配基，对目标蛋白质进行分离。在磁分离过程中， 将磁性粒子直接放入含有目标蛋白质的混合溶液中，目标蛋白质与磁性粒子紧密 结合，然后利用外磁场进行分离。整个分离过程不需对混合溶液的p h 值、温度、 离子强度和介电常数进行调整，从而避免了传统分离过程中蛋白质的损失。 近年来，发展了采用磁性纳米粒子与传统的分离纯化方法相结合来分离d n a 和蛋白质的技术。通过在表面功能化的磁性粒子表面偶联一段与目标d n a 具有互补 碱基对的引物链，利用d n a 分子间的碱基互补配对作用，进行d n a 的分离、纯化， 从而达到提纯目标d n a 的目的。以磁分离技术对蛋白质进行提纯是一项新兴的蛋白 分离技术，目前已经成功地对溶胞产物、血浆、原生质和腹水中的各种蛋白质进 行了分离和纯化。与传统分离方法相比较，蛋白质、d n a 的磁分离技术具有快速、 高纯、高收率等优点【4 】。 如何实现对低浓度蛋白质和d n a 的快速检测与分离是生物技术的难题之一，目 前免疫聚合酶链反应( h - n m u n o p c r ) 扩增技术仍是蛋白质和d n a 检测中普遍采用 的重要技术手段之一。对d n a 而言，可直接采用p c r 扩增技术检测，而蛋白质则 先将检测蛋白质固定到基片表面，用带d n a 标记物的抗体对其进行识别，随后通 过p c r 扩增反应对标记在目标蛋白上d n a 进行放大，最终通过对d n a 的检测实现 6 中国科学技术大学硕士学位论文 对蛋白质的定量检测。但这种方法中d n a 在抗体上相对低的偶联比例在一定程度 上限制了检测的灵敏度，与检测目标相对慢的识别过程增加了检测时间也降低了 检测灵敏度，需要p c r 扩增过程的介入，扩增过程中的污染会对检测结果造成非常 大的误差等缺点。在现代分子生物学研究中，对d n a 的高灵敏度分析和d n a 中双 螺旋链上一个碱基对错配缺欠的检测一直是难以解决的课题【4 】。利用表面修饰有抗 体的磁性纳米粒子结合其他检测手段可实现d n a 、蛋白质的分析检测。磁性纳米 粒子作为d n a 的载体不仅可以用于d n a 的高灵敏度检测与分析，还可以用来实现 对d n a 具有剪切功能的限制性内切酶及内切试剂的传感。 w i l s o n 等7 】认为现有的磁性分离技术存在一个缺点即一次操作只能分离一种 目标产物如要在同一溶液中逐个分离多个目标产物不仅昂贵耗时而且往往达不到 最佳效果因此他们发明了具有不同磁距偶联有不同受体的磁性微球这样便可以在 待分离液中通过控制磁场梯度赋予磁性微球不同的运动速率从而达到提高分离效 率的目的。pa _ c o l s k y 等【1 8 】以磁性纳米粒子为d n a 载体及复制放大的模板，结合电化 学方法，利用化学发光技术成功地实现了对目标d n a 分子以及含有一个错配碱基 对d n a 的检测。l i a o 掣”，p h 在3 到5 的p b s 缓冲液中，将p a a 包覆的f e 3 0 4 磁性纳 米粒子吸附溶解酵素蛋白质，然后在n a s c n 中解附蛋白质。他们发现能够在1 分钟 内完成实验操作，并能保持9 5 的溶解酵素活性。 总之，磁性纳米粒子在d n a 和蛋白质的分离与检测等方面有十分重要的应用前 景，利用磁性纳米粒子结合其他检测手段在实现蛋白质和d n a 的快速、实时和高通 量检测方面已经体现出了明显的优势，得到国内外研究者的广泛关注。 1 3 医学造影剂( m e d i c a lc o n t r a s ta g e n t ) 对疾病的正确诊断是有效治疗的基础，现代医学技术进步的重要基础之一是 医学影像技术的快速发展，使得诊断人员可以借助清晰、直观的图像来了解人体 中组织器官形态，以及功能的变化。医学影像技术通常是采用一定的能量束或外 场作用于生命体，通过收集这些与生命体作用后的信号改变来反映生命体的结构 以及其他性质等。很多时候，为了扩大这种信号差别，经常采用一些明显影响信 号大小，以及与不同组织或器官有特异性结合的材料注入体内，或者是欲进行成 像的部位，增加组织之间、组织与病变之间的对比度，帮助获得更好质量的图像。 这种材料一般称为医学对比剂或医学造影剂( c o n 仃a s ta g e n t ) 。 ， 中国科学技术大学硕士学位论文 磁共振成像( m a g n e t i cr e s o n f l l l c ei m a g i n g ，m r j ) 是利用收集磁共振现象所产 生的信号而重建图像的成像技术，是继超声波扫描成像、x c t 等影像检查手段后 又一新的断层成像方法，m r i 可以使c t 显示不出来的病变显影。在所有医学影像 学手段中，m r j 的软组织对比分辨率最高，它可以清楚地分辨肌肉、肌腱、筋膜、 脂肪等软组织，几乎适用于全身各系统的不同疾病，其临床应用的实现是医学影 像学中的一场革命。图1 3 是医院核磁共振检测系统示意图。 a ) m r j 检测系统b ) m r j 系统流程图 图l - 3 核磁共振检测图 m r i 成像参数多，包含信息量大，以应用最广泛的自旋回波( s p i ne c h o ，s e ) 为例，此技术可获取三种性质不同的图像：t 1 加权像( t 1 w 1 ) 、t 2 加权像( t 2 w 1 ) 和质子密度加权像。m r j 技术利用生物体内不同组织中质子在外加磁场下产生不 同的磁共振信号来成像，m r i 信号强度取决于两类参数：一是代表组织固有特性 的参数；另一类是扫描参数。前者一般是无法改变的，而后者则可以通过选择适 当扫描脉冲序列和参数以提高成像图上组织对比度一然而使用这种方法，对比度 的提高是有一定限度的。瘤的早期诊断( 包括微小肿瘤与肿瘤转移灶) 是有效降 低恶性肿瘤致死的关键。在肿瘤的治疗中，最为常用的方法是外科手术，然而要 降低手术的风险，必须首先对肿瘤组织进行拍照、定位。通常为了增加病变组织 与正常组织的图像之间的对比度以提高病变组织的清晰度，常常借助造影剂 ( c o n t r a s t a g e n t ) 的作用来提高诊断能力，造影剂的引入可以提高对比度和图像的 信噪比，有助于病灶的检出，并且通过病灶增强方式和类型的识别帮助问题定性。 磁共振造影剂的主要工作原理是可以有效地改变病变组织中质子的自旋自旋驰豫 时间，从而达到增强对比度的效果。造影剂的发展相当多地借助纳米尺度的材料 或相关纳米技术。纳米材料应用为m r j 造影剂可能存在以下一些优势： 8 中国科学技术大学硕士学位论文 ( 1 ) 当磁性材料颗粒具有纳米尺度，其单畴存在的比例增加，畴壁间磁损耗减少， 使得有利于获得磁化率等磁学性质更好的造影材料； ( 2 ) 生命体内部不同组织、细胞等对不同尺寸的颗粒具有一定的选择富集性质， 使纳米微粒在特定部位富集而达到被动靶向的目的；若在纳米微粒表面联结特异 性标记，如相应抗体等，则该材料就获得了主动靶向的功能： ( 3 ) 纳米颗粒可相对容易地进入细胞，并且可能特异性地与一些细胞器作用或结 合，为高分辨率的成像研究奠定基础。 目前，m r i 造影剂的开发受到了广泛重视，其中又以纳米铁氧体类型的材料 居多。超顺磁性氧化铁颗粒( s u p e r p a r a m a g e n t i ei r o no x i d e ，s p i o ) ，其作用主要使亿 缩短，在t 2 加权像上是低信号。超顺磁性氧化铁颗粒分布于组织后，呈不均匀分 夼，造成局部磁场的不均匀，从而加速了质子去相位的t 2 弛豫，使组织信号降低， 而对t 1 弛豫影响较小。由于u s p i o s 颗粒较小，血浆半衰期较长，可诱导显著的 t 1 ( 纵向弛豫) 缩短效应，在缩短t 2 ( 横向弛豫) 值的同时引起了明显的t l 值 缩短，在使t i w l 上组织信号增高的同时，使t 2 w i 上组织信号降低。由于s p i o 可以非常有效地缩短t l 和t 2 ，使得成像部位变暗，因此称为负性造影剂。 应用于m r i 造影剂的s p i o 主要是由稳定的铁氧体如三氧化二铁或四氧化三 铁经化学制备而成核心( 磁心) ，外包具有生物相容性的聚合物材料以保持氧化铁 在水溶液中的稳定性和生物相容性的颗粒。不同的s p i o 产品粒度将影响到其体内 分布特异性和磁性特性。一类是普通的超顺磁性氧化铁颗粒( s p i o ) ：一般直径 4 0 - - 4 0 0 n m 不等。另一类是超微型超顺磁性氧化铁颗粒( u l t r a s m a l ls u p e r p a r a m a g n e t i e i r o no x i d e s ，u s p i o s ) ：最大直径不超过3 0 n m t 2 0 1 。目前超顺磁性氧化铁造影剂的研 究比较成熟，已经有许多商品应用于l 临床。常见的s p i o 制剂是s c h e f i n g 公司开发 的s h u 5 5 5 a ( 商品名为r e s o v i s t ) 。它是由f e 3 0 4 和f e 2 0 3 组成，外包碳氧葡聚糖， 氧化铁核心由若干个单晶体构成，每个单一的晶体的直径约为4 2 r i m ，整个亲水性 颗粒的直径约为6 2 r i m 。另外一种是a d v a n c e dm a g n e t i c s 公司开发的 a m i 。2 5 ( f e r u m o x i d e s ，商品名为f e f i d e x ) ，直径为( 5 0 - a ：2 9 ) n m ，其核心氧化铁颗粒 的直径约为2 0 r t m 。u s p i o s 产品方面，有a d v a n c e dm a g n e t i c s 公司开发的平均直 径只有4 6 n m 的a m i 2 2 7 ( f e r u m o x t r a n ) 和n y e o m e d 公司开发的颗粒更小的 f e 0 。b p a 。 超顺磁性氧化铁在体内的分布具有明显的特异性。这主要是由于人体的网状 9 中国科学技术大学硕士学位论文 内皮系统( p e s ) 具有十分丰富的吞噬细胞，这些吞噬细胞是人体细胞免疫系统的组 成部分，但超顺磁性氧化铁纳米颗粒通过静脉注射进人体后，与血浆蛋白结合， 并在调理素作用下被网状内皮系统识别，吞噬细胞就会把超顺磁性氧化铁纳米颗 粒作为异物而摄取，使得相应区域信号减低，而肿瘤组织因不含正常的吞噬细胞 而保持信号不变。 超顺磁性氧化铁的颗粒大小对其进入网状内皮系统的部位有较大影响，一般 直径较大的s p i o s 主要为肝、脾的网状内皮系统所摄入。由于u s p i o s 颗粒小，与 血浆蛋白和调理素的作用减弱，影响了吞噬细胞对其的摄入，血循环半衰期长， 在血管中停留较长时间主要进入淋巴结组织及骨髓组织中。无论s p i o s 还是 u s p i o s 除了粒子自身尺寸外，氧化铁的表面修饰物及其表面电荷对其在体内的分 布也有重要的影响。例如，小尺寸的中性m i o n 主要分布于淋巴结中，而同样尺 寸带部分正电荷的m i o n 却很容易被肝脏吸收，半乳糖修饰的m i o n 主要被肝细 胞通过a s g 受体吞噬，而葡聚糖修饰的m i o n 则被巨噬细胞吞噬。 n a s o n g k l a 等1 2 1 把亚德里亚酶素( d o x o r u b i c i n ) 和超顺磁氧化铁( s p i o ) 纳米微 粒团簇成功地载入一种多功能团聚合物乳胶束的核中，乳胶束表面的c r g d 可以 实现对口扔表达肿瘤细胞的靶向输送。研究表明这些多官能团聚合物胶束具有极 其灵敏的m r i 成像和生物毒素特异性响应，可以充当靶向性药物输运的多功能纳 米药物平台。s m i r n o v 等 2 2 1 通过内化作用使用阴离子超顺磁氧化铁纳米微粒 ( t - f e 2 0 3 ) 标定杂化瘤细胞，然后注入小鼠腹膜内，经1 5 t m r i 检测，2 4 小时后 瘤细胞已在脾脏内安家。这种含纳米微粒的肿瘤细胞在分裂时仍然含有微粒。他 们还发现脾脏内标定的杂化瘤细胞的数量与m r j 信号强度相关。s m i m o v 等【2 3 】的 研究还证明在体内对用阴离子超顺磁氧化铁纳米微粒( y - f c 2 c 3 ) 标定的淋巴细胞 的进行强磁场m 砒跟踪是方便可行的。这种高分辨成像方法可以使对免疫细胞治 疗方法的监测得到改善。最近，s e o 等 2 4 1 用一种升级的化学气象沉积法合成出 f e c o , 单晶石墨壳纳米晶体，可以克服f c c o 材料的毒性和易被氧化的缺点。这种 纳米微粒可以溶解在水溶液中并稳定存在，而且能够被间叶干细胞吞噬，并在磁 共振成像上表现出较高负对比增益。初级的兔子体内实验表明它对血管m 融有持 久的正对比增益效应，显示这种纳米微粒在全身诊断和治疗上具有潜在的应用。 z h a n g 等【2 5 】成功地合成出了1 0 纳米左右二氧化硅和烷氧基硅烷包覆的极小超顺磁 氧化铁( u s p i o ) 微粒。这种二氧化硅包覆的u s p i o 微粒具有高乃弛豫度，并且 1 0 中国科学技术大学硕士学位论文 在内化作用后能有效地降低永生化前体细胞的乃弛豫度，适用于m r 的细胞标定。 中国科学院化学研究所胶体、界面与化学热力学院重点实验室高明远研究员 领导的课题组 2 6 】以早期鉴别诊断为切入点，深入开展了表面带有功能基团的生物 相容性磁性纳米晶体的制备及其在肿瘤早期检测中的应用研究。他们采用具有自 主知识产权的生物相容性磁性纳米晶体的“一锅”反应制备技术，通过选用双羧基聚 乙二醇( p e g ) 做稳定剂，成功地利用一步反应制备出表面带有羧基基团的生物相容 性的f e 3 0 4 磁性纳米晶体。利用f e 3 0 4 晶体表面的羧基与抗肿瘤抗体进行共价耦联 所得到的耦联物在动物活体内，表现出明显的肿瘤靶向功能及辅助4 , i 中瘤鉴别诊 断的磁共振造影功能。 钆基造影剂是一种广泛应用的医学造影剂。但是e d 3 + 有一定的毒性，因此需 要预先螯合或封装以降低其毒性。目前临床上广泛使用的g d d t p a 是顺磁性阳性 造影剂，其作用主要是使t 1 缩短，在t l 加权像上呈高信号。随着磁共振血管成 像( m a g n e t i cr e s o n a m c e a n g i o g r a p h y ，m r a ) 的应用与发展，g d d t p a 成为了增 强m r 血管成像的主要对比剂，它能有效地提高磁共振成像的诊断水平。但随着 使用的增加，发现g d d t p a 有一些明显的不足之处，如；体内消除太快( 如血后 可迅速通过细胞间隙，并经肾脏排泄) ；而且体内分布没有特异性，使m r 图象对 比不能明显改善，同时也需要响应的设备能够快速扫描，其价格也较贵。近来采 用纳米尺度的g d d t p a 结合脂质体技术已经引起人们重视，如将g d d t p a 类的 颗粒包裹在脂质体内或与脂质体结合，形成平均直径5 0 n m 的微粒作为造影剂。 g d ”基的脂质体造影剂用于血管期相当于血池对比剂，然后由肝、脾巨噬细胞吞噬， 脂质体在溶酶体作用下降解，g d d t p a 颗粒被释放出来产生弛豫作用。w i l s o n 等 b 1 用超短单壁碳管( u l t r a - s h o r ts i n g l