（材料学专业论文）糖化温敏水凝胶的合成及其生物相容性研究.pdf

摘要 聚n 异丙基丙烯酰胺( p n i p a a m ) 具有良好的温度响应性，但其生物相容 性欠缺。本研究在保持p n i p a a m 温度敏感性的前提下，通过自由基聚合对 p n i p a a m 进行糖化修饰，糖类化合物选用葡聚糖和半乳糖，从而制得既具有温 度敏感性，又具有预期的生物相容性的凝胶支架。通过控制温度的变化，实现凝 胶材料对细胞层的自然脱附，避免酶解法对细胞功能的损伤。 本文首先用葡聚糖对p n i p a a m 进行了糖化修饰：用甲基丙烯酸缩水甘油 酯( g m a ) 对葡聚糖( d e x t r a n4 0 0 0 0 ) 进行化学改性，合成了葡聚糖衍生物 ( g m a d e x ) ，使g m a d e x 与n i p a a m 聚合，合成了质量比r 分别为0 2 、0 4 、 0 5 、0 6 、0 8 的p ( n i p a c o g m a d e x ) 共聚水凝胶。利用红外光谱( i r ) 和核磁共 振( h n m r ) 表征了g m a d e x 和p ( n i p a c o g m a d e x ) f 1 0 结构和组成，并研究了 分别在水中和细胞培养基中的凝胶的最低临界溶解温度( l c s t ) 、溶胀性能。结 果表明，p ( n i p a a m c o g m a d e x ) 凝胶在水中和细胞培养基中均具有良好的温度 敏感性。p ( n i p a a m c o g m a d e x ) 凝胶在培养基中的l c s t 低于之离子水中的 l c s t ，退溶胀速率和再溶胀速率在培养中较去离子水中快。 同时本文用半乳糖对p n i p a a m 进行了糖化修饰：首先，合成出半乳糖单 体g a c ，然后使g a c 与n i p a a m 进行自由基聚合合成出p ( n i p a a m c o g a c ) 共聚凝胶。用红外光谱( f t i r ) 和核磁共振波谱( 1 h n m r ) 对凝胶的结构和组 成进行了表征。分别对不同配比凝胶的l c s t 、溶胀性能进行了研究。结果表明， p ( n i p a a m c o g a c ) 凝胶在水中和细胞培养基中均具有良好的温度敏感性。 p ( n i p a a m c o g a c ) 凝胶在培养基中的l c s t ( 3 2 5 0 c ) 低于去离子水中的l c s t ( 3 5o c ) ，退溶胀速率和再溶胀速率在培养中较玄离子水中快。 将合成的水凝胶用于细胞培养研究。在葡聚糖共聚凝胶上种植成纤维细胞 l 9 2 9 ，通过光学倒置显微镜和扫描电子显微镜对细胞进行形态学观察，发现在 p c n i p a a m c o g m a d e x ) 其聚凝胶上l 9 2 9 细胞表现出较好的生长形态；通过细 胞增殖曲线和m t t 法对葡聚糖其聚凝胶材料毒性的研究发现，葡聚糖的加入有 助于细胞的生长，结果表明，p ( n i p a a m c o g m a d e x ) 共聚凝胶相对于聚n 异 丙基丙烯酰胺均聚凝胶具有更好的细胞相容性。细胞脱附研究表明，通过降低温 度，可以使细胞自然脱附，保护了细胞的功能完整性，避免了使用酶解法使细胞 受到的损伤。 对p ( n i p a a m c o g a c ) 凝胶进行体外肝肿瘤细胞h e p g 2 的培养研究表明， 半乳糖的加入有助于h e p g 2 细胞的生长，我们制备的半乳糖共聚凝胶具有很好 的细胞相容性。随着半乳糖含量的增加，半乳糖对h e p g 2 细胞有生长促进作用。 关键词：水凝胶；n 异丙基丙烯酰胺；葡聚糖；半乳糖；温度敏感；细胞培养； 细胞脱附；成纤维细胞；肝肿瘤细胞 a b s t r a c t d u et op n i p a a mw i t h g o o dt e m p e r a t u r e s e n s i t i v e p r o p e r t y b u tf e w b i o c o m p a t i b i l i t y ，b yu s i n gf r e er a d i c a lp o l y m e r i z a t i o n ，p n i p a a mw e r es a c c h a r i f i e d s a c c h a r i d ec o m p o u di n c l u d i n gd e x t r a na n dg a l a c t o s ew e r e s e l e c e d ，a n dt h e n t e m p e r a t u r e s e n s i t i v ea n db i o c o m p a t i b i l i t yh y d r o g e l ss c a f f o l dw e r ep r e p a r e d b y c o n t r o l l i n gt h ec h a n g eo ft e m p e r a t u r e ，t h et a r g e to fd e t a c h i n gc e l ln a t u r a l l yi sl o o k e d f o r w a r dt oa c h i e v ew i t h o u te n z y m e a n dt h ef u n c t i o no fe e l lw i l lb e p r o t e c t e d p e r f e c t l y i nt h i sp a p e r ，p n i p a a mw e r es a c c h a r i f i e d b yu s i n gd e x t r a nf i r s t l y ：g l y c i d y l m e t h a c r y l a t e ( g m a ) d e r i v a t i z e dd e x t r a n ( g m a d e x ) w a ss y n t h e s i z e db ym o d i f y i n g d e x t r a nc h e m i c a l l yb yu s i n gg m a ，t h r o u g hc o p o l y m e r i z a t i o no fg m a d e xw i t h n i p a a mi na q u e o u ss o l u t i o n as e r i e so fn o v e lh y d r o g e l sp f n i p a a m - c o g m a d e x ) w i t hd i f f e r e n tw e i g h tr a t i o ( 0 2 ，0 4 ，0 5 ，0 6 ，0 8 ) w e r e p r e p a r e d b o t hg m a d e x m o n o m e ra n dp ( n i p a a m c o - g m a d e x ) w e r ec h a r a c t e r i z e du s i n gf t i rs p e c t r aa n d 1 h n m r ，t h ei n f l u e c eo fro nt h el c s ta n ds w e l l i n gr a t i ow e r es t u d i e d t h es t u d y r e s u l t ss h o wt h a tp f n i p a a m c o g m a - d e x ) g e l sa r et e m p e r a t u r e s e n s i t i v ei na q u e o u s a n di nd m e m t h el o w e rc r i t i c a ls o l u t i o nt e m p e r a t u r e ( l c s t ) i nd m e ml o w e rt h a n i na q u e o u s ，t h ed e s w e l l i n gs p e e da n dr e s w e l l i n gs p e e dh i g h e ri nd m e mt h a ni n a q u e o u s h y d r o g e l sw e r ea p p l i e di n c e l lc u l t u r e f i b r o b l a s tl 9 2 9w e r ec u l t u r e do n p ( n i p a a m - c o - g m a d e x ) g e l s ，c e l lm o r p h o l o g yw e r eo b s e r v e db yp h a s e c o n t r a s t i n v e r t e dl i g h tm i c r o s c o p ya n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，l 9 2 9e x h i b i t e d g o o dm o r p h o l o g y ；c e l lp r o l i f e r a t i o nc u r v ea n dm t ti n d i c a t et h a td e x r a np r o m o t e d c e l l g o w t h t h e r e s u l t ss h o wp ( n i p a a m c o - g m a d e x ) g e l sa r eb e t t e rt h a n p n i p a a mg e l si nb i o e o m p a t i b i l i t y c e l ld e t a c h m e n tr e s u l t ss h o wt h a t c e l lc a nb e d e t a c h e dn a t u r a l l yb yr e d u c i n gt e m p a r a t u r ew h i l ea v o i d i n gd e s t r o y i n gt h ef u n c t i o no f c e l la n dp r o t e c t i n gt h ec e l lp e r f e c t l y i nv i t r oh e p g 一2w e r ec u l t u r e dp f n i p a a m - c o g a c ) h y d r o g e l s ，t h er e s u l t si n d i c a t e t h a tg a l a c t o s ep r o m o t eh e p g - 2p r o l i f e r a t i o nr a p i d l y , p ( n i p a a m c o - g a c l h y d r o g e l s a r ea l s ob i o c o m p a b i l i t y t h em o r eg a l a c t o s ea r e ，t h eb e t t e rt h ec e l lp r o l i f e r a t e k e yw o r d s ：h y d r o g e l s ；n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ；d e x t r a n ；g a l a c t o s e ；t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e ；c e l lc u l t u r e ；c e l ld e t a c h m e n t ；l 9 2 9 ；h e p g 一2 细胞脱附；成纤维细胞；肝肿瘤细胞 a b s t r a c t d u et op n i p a a mw i t h g o o dt e m p e r a t u r e s e n s i t i v e p r o p e r t y b u tf e w b i o c o m p a t i b i l i t y ，b yu s i n gf r e er a d i c a lp o l y m e r i z a t i o n ，p n i p a a mw e r es a c c h a r i f i e d s a c c h a r i d ec o m p o u di n c l u d i n gd e x t r a na n dg a l a c t o s ew e r e s e l e c e d ，a n dt h e n t e m p e r a t u r e s e n s i t i v ea n db i o c o m p a t i b i l i t yh y d r o g e l ss c a f f o l dw e r ep r e p a r e d b y c o n t r o l l i n gt h ec h a n g eo ft e m p e r a t u r e ，t h et a r g e to fd e t a c h i n gc e l ln a t u r a l l yi sl o o k e d f o r w a r dt oa c h i e v ew i t h o u te n z y m e a n dt h ef u n c t i o no fe e l lw i l lb e p r o t e c t e d p e r f e c t l y i nt h i sp a p e r ，p n i p a a mw e r es a c c h a r i f i e d b yu s i n gd e x t r a nf i r s t l y ：g l y c i d y l m e t h a c r y l a t e ( g m a ) d e r i v a t i z e dd e x t r a n ( g m a d e x ) w a ss y n t h e s i z e db ym o d i f y i n g d e x t r a nc h e m i c a l l yb yu s i n gg m a ，t h r o u g hc o p o l y m e r i z a t i o no fg m a d e xw i t h n i p a a mi na q u e o u ss o l u t i o n as e r i e so fn o v e lh y d r o g e l sp f n i p a a m - c o g m a d e x ) w i t hd i f f e r e n tw e i g h tr a t i o ( 0 2 ，0 4 ，0 5 ，0 6 ，0 8 ) w e r e p r e p a r e d b o t hg m a d e x m o n o m e ra n dp ( n i p a a m c o - g m a d e x ) w e r ec h a r a c t e r i z e du s i n gf t i rs p e c t r aa n d 1 h n m r ，t h ei n f l u e c eo fro nt h el c s ta n ds w e l l i n gr a t i ow e r es t u d i e d t h es t u d y r e s u l t ss h o wt h a tp f n i p a a m c o g m a - d e x ) g e l sa r et e m p e r a t u r e s e n s i t i v ei na q u e o u s a n di nd m e m t h el o w e rc r i t i c a ls o l u t i o nt e m p e r a t u r e ( l c s t ) i nd m e ml o w e rt h a n i na q u e o u s ，t h ed e s w e l l i n gs p e e da n dr e s w e l l i n gs p e e dh i g h e ri nd m e mt h a ni n a q u e o u s h y d r o g e l sw e r ea p p l i e di n c e l lc u l t u r e f i b r o b l a s tl 9 2 9w e r ec u l t u r e do n p ( n i p a a m - c o - g m a d e x ) g e l s ，c e l lm o r p h o l o g yw e r eo b s e r v e db yp h a s e c o n t r a s t i n v e r t e dl i g h tm i c r o s c o p ya n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，l 9 2 9e x h i b i t e d g o o dm o r p h o l o g y ；c e l lp r o l i f e r a t i o nc u r v ea n dm t ti n d i c a t et h a td e x r a np r o m o t e d c e l l g o w t h t h e r e s u l t ss h o wp ( n i p a a m c o - g m a d e x ) g e l sa r eb e t t e rt h a n p n i p a a mg e l si nb i o e o m p a t i b i l i t y c e l ld e t a c h m e n tr e s u l t ss h o wt h a t c e l lc a nb e d e t a c h e dn a t u r a l l yb yr e d u c i n gt e m p a r a t u r ew h i l ea v o i d i n gd e s t r o y i n gt h ef u n c t i o no f c e l la n dp r o t e c t i n gt h ec e l lp e r f e c t l y i nv i t r oh e p g 一2w e r ec u l t u r e dp f n i p a a m - c o g a c ) h y d r o g e l s ，t h er e s u l t si n d i c a t e t h a tg a l a c t o s ep r o m o t eh e p g - 2p r o l i f e r a t i o nr a p i d l y , p ( n i p a a m c o - g a c l h y d r o g e l s a r ea l s ob i o c o m p a b i l i t y t h em o r eg a l a c t o s ea r e ，t h eb e t t e rt h ec e l lp r o l i f e r a t e k e yw o r d s ：h y d r o g e l s ；n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ；d e x t r a n ；g a l a c t o s e ；t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e ；c e l lc u l t u r e ；c e l ld e t a c h m e n t ；l 9 2 9 ；h e p g 一2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼王些太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：广蔼可 签字目期：挪年弓月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丞洼王些太堂有关保留、使j 1 j 学位论文的规定。 特授权丞洼王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁枯。 ( 保密的学位论文在解密后适j j 本授权说明) 学位论文作者签名： 薷弋 签字日期：，坊年弓月乡日 导师签名： 签字日期：场1 下朋 学位论文的主要创新点 、本论文首次将我们课题组制备的p ( n i p a a m c o g m a d e x ) 凝胶用于l 9 2 9 成 纤维细胞的培养，发现p ( n i p a a m c o g m a d e x ) 温度敏感共聚凝胶膜具有很好 的生物相容性，通过控制温度变化，可以将种植于p ( n i p a a m c o g m a d e x ) 凝 胶上的l 9 2 9 细胞成功脱附下来，改变了酶解法脱附细胞的传统方法。 二、本论文首次利用合成的半乳糖单体g a c ，与n 异丙基丙烯酰胺n i p a a m 共 聚，制备了p ( n i p a a m c o g a c ) 共聚凝胶，对共聚凝胶的溶胀性能等研究表明， p ( n i p a a m c o g a c ) 凝胶具有很好的温度响应性。 二、首次在p ( n i p a a m c o g a c ) 凝胶上种植h e p g 2 细胞，结果表明，半乳糖的 加入有助于h e p g 2 细胞的生长，我们制备的半乳糖共聚凝胶具有很好的生物相 容一陛。 第一章前言 第一章前言弟一早刖百 1 1 组织工程及其相关生物材料 组织工程( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) - - 词最早是在1 9 8 7 年美国科学基会会在华盛 顿举办的生物工程小组会上提出，1 9 8 8 年正式定义为：应用生命科学与工程学 的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能 关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的 功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、构建组织和器官的 方法和技术以及组织工程的临床应用。目前临床上常用的组织修复途径大致有3 种：即自体组织移植、异体组织移植或应用人工代用品。这三种方法都分别存在 不足，如免疫排斥反应及供体不足等。组织工程的发展将从根本上解决组织和器 官缺损所致的功能障碍或丧失治疗的问题。组织工程的核心是建立由细胞和生物 材料构成的三维空间复合体，这与传统的二维结构( 如细胞培养) 有着本质的区 别，其最大优点是可形成具有生命力的i 舌体组织，对病损组织进行形态、结构和 功能的重建并达到永久性替代；用最少的组织细胞通过在体外培养扩增后，进行 大块组织缺损的修复：可按组织器官缺损情况任意塑形，达到完美的形态修复。 组织工程一般采朋以下三种策略： 细胞和生物材料杂化体系 从原代组织分离组织特异细胞，在体外种植在生物柏容性良好的可生物降解 的多孔支架内，体外培养一定时间后把此细胞支架植入患者体内；随着组织缺 损部位的重建，聚合物逐渐降解而消失。 只有生物降解材料的体系 通过生物过程使细胞长入多孔支架内，经过增贿、分化形成组织，同时与周 围组织整合。如用珊瑚骨架制备的羟基磷灰石陶瓷，其孔隙结构与人体骨结构及 其相似，可作为骨组织工程支架使用。 细胞体系 移植的细胞由生物过程发展成微结构。 组织工程的发展对相关生物材料提出了新的挑战，如何提高生物材料对细胞 的亲和性已经成为组织工程研究的关键问题之一。与天然材料相比，合成材料具 有原料来源丰富、结构和性能可人为修饰和调控等特点。聚乳酸是获得美国f d a 第一章前言 认证，并已广泛应用于临床的一类可生物降解的合成聚合物，但由于表面缺乏细 胞识别位点，阻碍了在组织工程中的应用1 2 】 按照i s o 标准，生物材料的评估有二个标准：【3 】 ( 1 ) 被用来制作基本材料的组分的生物安全性 ( 2 ) 可滤玄的物质或者降解产物的生物安全性 ( 3 ) 最后的生物材料的安全性。 第三代生物材料又迎来了组织工程对其新的挑战，常将种子细胞种植在具有 生物活性的可降解生物材料构筑的二维支架内，使三维支架能提供细胞所需的力 学和化学信号，直到细胞的黏连、增殖与分化，并最终组装成二维组织。如果要 将科技成果转化为治疗产品，币面临着许多技术上的挑战。 首先，大规模生产工稃化组织需要适宜、健康并能扩增的种子细胞，这是对 生物学的挑战。 其次，性能优异的二维支架材料的制各、仿生并能规模化培养细胞的生物反 应器、细胞支架结构物的冻存、建立防止组织排异的方法等【4 1 。 而组织工程中常用水凝胶作为细胞释放的载体，水凝胶的结构与体内的大分 子结构很相似，水凝胶是具有很好的生物相容性的材料。 1 2 水凝胶 水凝胶足由亲水聚合物构成的二维网络结构和溶剂水组成的呈溶胀状态的 高分子材料，在水中溶胀并保持大量水分而又不溶解。亲水的小分子能够在水中 扩散，近年来引起了人们越来越大的兴趣f 5 】。水凝胶具有良好的生物相容性，与 疏水聚合物相比，刚被吲定化的酶或细胞只有弱得多的相互作用，固定在水凝胶 4 中的乍物活，陀能够保持较艮时问。因此，水凝胶在生物化学、医学等领域有许多 用途1 。 1 2 1 水凝胶的分类 1 2 1 i 温度响应凝胶 温敏水凝胶是指对环境的温度变化能产生响应，即当周围环境温度变化而发 生体积相转变的凝胶，当环境温度发生微小变化时，凝胶体积会随之发生数倍或 数十倍的变化，当达到并超过某临界区域时，甚至会发生不连续的突越性变化， 即所渭体积相转变。一般地，温敏性凝胶对温度变化的响应有两种类型：一种是 在温度低于凝胶低临界溶解温度( l c s t ) 时呈收缩状态，当温度升高超过l c s t 第一章前言 时则处于溶胀状态，这种温敏凝胶被称为热胀温敏凝胶；另一种与之相反，在温 度高于l c s t 时呈收缩状态，被称为热缩性温敏凝胶。 聚n 一异丙基丙烯酰胺( p n i p a a m ) 水凝胶是最典型的热缩温敏凝胶【刀。在 3 2 0 c 时，为p n i p a a m 水凝胶的l c s t ，在这个温度以上，凝胶会失水而收缩； 在这个温度以下，凝胶会吸水而发生溶胀，干的p n i p a a m 水凝胶在2 0 0 c 的条 件下通常会吸收数十倍的自身重量的水。 自1 9 8 4 年t a n a k a 等发现聚n 一异丙基丙烯酰胺( p n i p a a m ) 水凝胶具有温 度敏感特性以来，对于p n i p a a m 的研究越来越广泛。但是p n i p a a m 水凝胶具 有很低的机械强度，使其在应用领域的应用受到了限制，与其他单体进行共聚或 者互穿( i p n ) 成为提高水凝胶机械强度的有效途径。甲基丙烯酸乙酯可与 n i p a a m 共聚制得热缩型的温敏凝胶，陈莉等1 8 j 合成了n 异丙基丙烯酰胺 ( n i p a a m ) 与3 丙烯酰胺丙基二甲基胺( d m a p a a ) 的共聚热缩温敏水凝胶， 考察了阳离子单体d m a p a a 含量对凝胶低临界溶解温度( l c s t ) 、溶胀性、溶 胀动力学、再溶胀动力学等的影响。 聚丙烯酸( p a a c ) 和聚n ，n 一二甲基丙烯酰胺( p d m a a m ) 网络互穿形成的 聚合物网络水凝胶，在低温时凝胶网络内形成氢键，体积收缩：高温时氢键解离， 凝胶溶胀。网络中p a a c 是氢键供体，p d m a a m 是氢键受体。这种配合物在6 0 0 c 以下水溶液中很稳定，但高于6 0 0 c 时配合物解离。 丙烯酸钠足阴离予单体，可以通过阴离子单体的加量来调节溶胀和溶胀敏感 温度。另外，还有侧基的甲基丙烯酸钠与n i p a a m 的共聚凝胶也是一种性能优 良的阴离子型水凝胶。 有一种非交联型温敏水凝胶：当温度升高时，溶于水的聚合物会从水中析 出来。可以认为在温度低时，水与聚合物问形成了氢键，使聚合物溶于水，当温 度升高时，已经形成了的氢键被削弱，因而从水中析出。如聚甲基丙烯酸一聚乙 烯醇醋酸乙烯哺共聚体【9 j 、聚乙烯醇醋酸乙烯共聚物【1 0 】、聚氧化乙烯聚n 二异 丙基丙烯酰胺1 1 1 - 1 2 1 等。 1 2 1 2 光晌应凝胶 光响应性凝胶是由于光辐照( 光刺激) 而发生体积变化的凝胶。紫外光辐照 时，凝胶网络中的光敏感基团发生光异构化或光解离，因基团构象和偶极距变化 而使凝胶溶胀。 若将光敏分子引入聚合物分子链上，则可通过发色基团改变聚合物的某些性 第一章前言 质。以少量的无色三苯基甲烷氢氧化物与丙烯酰胺( 或n ，n 亚甲基双丙烯酰 胺) 共聚，可得到光刺激响应聚合物凝胶。 凝胶吸收光子，使热敏大分子网络局部升温。达到体积相转变温度时，凝胶 响应光辐照，发生不连续的相转变。例如，可将能吸收光的分子( 如叶绿酸) 与 温度响应性p n i p a a m 以共价键结合形成凝胶。当叶绿酸1 吸收光时温度上升，诱 发p n i p a a m 出现相转变。这类光响应性凝胶能反复进行溶胀一收缩，应用于光 能转变为机械能的执行元件和流量控制阀等方面。 1 2 1 3 磁场响应凝胶 包埋有磁性微粒子的高吸水性凝胶称为磁场响应凝胶。这种凝胶可用作光开 关和图像显示板等。 当凝胶置于磁场时铁磁材料被加热而使凝胶的局部温度上升，导致凝胶溶胀 或收缩：撤掉磁场，凝胶冷却，恢复至原来大小。 1 2 1 4 电场响应凝胶 聚电解质凝胶在电场刺激下，凝胶产生溶胀和收缩并将电能转变为机械能。 电场响应凝胶在直流电场作用下，会发生电收缩现象。这是由于自由离子在电场 作用下产生定向移动会造成凝胶内外离子浓度不均，形成渗透压变化引起凝胶变 形。再一个原因是自由离子定向移动会造成凝胶内不同部伊p h 值不同、从而影 响凝胶中聚电解质电离状态，使凝胶结构发生变化，造成凝胶彤变。 1 2 1 5p h 响应凝胶 p h 型响应凝胶是体积能随介质p h 值变化而变化的凝胶。这类凝胶大分子 网络中具有离子解离基团，其i 叫络结构和i 乜荷密度随介质p h 变化。 具有p t t 响应性的水凝胶一般郜足通过交联7 髟成的大分子网络，网络中含有 大量的容易水解的或者质予化的酸性、碱性基团，如羧丛或氨基。当外界p h 变 化时，这砦丛i j l 的解离程度发生不同的改变。易制备成p h 敏感的水凝胶一般含 有的雄团为c o o 等阴离子恭团，以及n h 3 + 、- n r ”等阳离子基团。 传统的用甲基丙烯酸烷酯( n a m a ) 与二甲基氨乙基丙烯酸酯( d m a ) 交 联形成的p h 响应性凝胶中，含有可质子化的叔胺基团【1 3 j 。 利用戊二醛使壳聚糖( c s n h 2 ) 上的氨基交联，再和聚丙二醇聚醚( p e ) 形成半互穿聚合物网络。由于网络中氢键的形成和解离，使嗍络中大分子链问形 成配合物或者解离，从而使此凝胶网络的溶胀行为对p h 敏感。在碱性p h 值下， 凝胶溶胀度显著降低，这是由于网络问形成氢键，使大分子链缔合。在酸性p h 4 第一章前言 下，壳聚糖结构单元上的氨基n h 2 质子化，氢键被破坏，导致凝胶溶胀度增大。 1 2 1 6 化学物质响应凝胶 有些凝胶的溶胀行为，会因特定物质的刺激( 如糖类) 而发生突变。例如药 物释放凝胶体系可依据病灶引起的化学物质( 或物理信号) 的变化进行自反馈， 通过凝胶的溶胀与收缩控制药物释放的通、断。 除了单一响应的凝胶外，通过在配合物体系中引入交联剂，可以使两种高分 子在缔合的同时分别形成交联网络，构成全互穿聚合物网络( f u l l i p n ) ，也可以 使一种高分子填充在另一种高分子的交联网中，构成互穿聚合物网络( s e m i i p n ) ， 由于i p n 中各聚合物网络具有相对的独立性，因此可以以p h 敏感聚合物网络为 基础，利用i p n 技术引入另一种具有温度敏感的聚合物网络，制得具有温度及 p h 双重敏感的i p n 型水凝胶。h o f f m a n 等1 1 4 】把对胃具有刺激作用的吲哚美辛药 包埋在p h 和温度敏感水凝胶中，在胃液中，只有少量药物释放，但在肠液中， 药物很快释放。因此减少了药物的副作用而又达到了治疗的目的。 1 2 2 水凝胶的制备 单体聚合并交联 单体聚合交联是指在交联剂存在的情况下，单体经自由基均聚或共聚而制得 高分子水凝胶材料的方法。在聚合反应过程中，可以通过加入或改变引发剂、鳌 合剂、链转移剂等来控制聚合动力学，以及所得高分予水凝胶材料的性质。制备 高分子水凝胶材料的单体主要有丙烯酸系列、丙烯酰歧系列和醋酸乙烯酯等，聚 合反应可以借助引发剂引发或辐射引发完成，最主要的交联荆足双乙烯基交联剂 如n ，n 一亚甲基双丙烯酰胺双丙烯酸乙二醇酯等。 聚合物交联 水溶性高分子聚合物如聚乙烯f l 亨z ( p v a ) 、聚丙烯酰胺( p a m ) 、聚丙烯酸( p a a c ) 等通过适度交联，就可制得高分子水凝胶材料。从聚合物出发制备水凝胶有物理 交联和化学交联两种。物理交联通过物理作用力如静电作用、离子相互作用、氢 键、链的缠绕等形成。而化学交联法是此类高分子水凝胶材料制备的主要方法之 一，要求交联剂必须是能与水溶性高分子功能基反应的多官能团化合物或多价金 属离子，如戊二醛和环氧氯丙烷可以使p v a 交联。其它水溶性高分子通过物理 缠结或多价会属离子的络合作用等也可形成高分子水凝胶材料。 载体的接枝共聚 第一章前言 水凝胶的机械强度一般较差，为了改善水凝胶的机械强度，可以把水凝胶接 技到具有一定强度的载体上。在载体表面产生自由基是最为有效的制备接枝水凝 胶的技术，单体可以共价地连接到载体上。研究最多的接枝共聚类单体有丙烯腈、 丙烯酰胺和丙烯酸等，方法足用辐射或引发剂引发，将上述单体与天然高分子进 行接枝共聚得高分子水凝胶材料，为使所得高分子水凝胶材料吸水但不溶于水， 应加入适鼍交联剂在其结构中形成适当交联网络。接枝共聚类高分子水凝胶材料 的平衡溶胀能力主要由原料配比、引发方法及引发剂种类、离子单体及交联剂含 量等条件决定。 自由基聚合法 自由基聚合成n i p a a m 水凝胶是比较常用的方法，可选择不同的方法引发自 由基聚合，主要有引发剂引发和射线辐射引发。引发剂按照分解方式主要分为氧 化还原分解和热分解两类。氧化还原引发是通过引入氧化还原反应来引发体系的 聚合和交联，最常用的氧化还原引发剂是过硫酸钾( a p s ) 和四甲基乙二胺 ( t e m e d ) ，也有学者用a p s 与亚硫酸氢钠( s b s ) 做为氧化还原引发剂。用作合成 n i p a a m 共聚水凝胶的热分解引发剂主要是偶氮二异丁腈( a i b n ) 。 i p n 法 i p n 是指将两个化学组成不同的组分分别形成各自独立的网络，而两网络相 互缠结在一起构成“拓扑键”形成的互穿聚合物网络，主要用于制备双重响应一陀 水凝胶。i p n 有两种：一种是半互穿聚合物网络( s e m i i p n ) ，在交联n i p a a m 时 引入不经交联的共聚单体合成水凝胶，会得到s e m i i p n 水凝胶。另一种足全瓦 穿聚合物网络( f u l l i p n ) ，c a r m e n 等采用先合成p n i p a a m 壳聚糖( c s ) s e m i i p n 水凝胶，然后埘c s 进行后交联的方法，得到p n i p a a m c s f u l l i p n 水凝胶；也 可以先将共聚单体交联，后交联n i p a a m 的方法合成f u l l i p n 水凝胶。 1 3 组织工程用水凝胶 组织工程用水凝胶必须首先考虑其生物相容性，特别是炎症反j 畦，在制备水 凝胶时，将患者的自体细胞和二维支架组合在一起，在体外培养得到工程化的组 织，从患者很小的或组织采集的细胞种植于类似组织细胞外基质的三维支架中， 体外扩增得到细胞支架结构物后植入体内，支架将细胞释放至所需部位。组织 工程常采用水凝胶( 即含有亲水性基团的聚合物网络) 作为细胞释放载体。水凝 胶的结构类似于体内的大分子组成物，生物相容性良好。水凝胶所具有的环境响 应性，使其有望成为在特定环境下可使细胞或基因活化的新一代生物活性刺激响 6 第一章前言 应材料【1 5 】。但是天然的聚合物水凝胶有其局限性，这就促使人们对天然聚合物 进行改性，组织工程用水凝胶首先要考虑控制水凝胶的交联密度，但应注意交联 剂的毒性以及交联剂的降解性。 制备的水凝胶必须要有稳定的性能才能给组织一定的生存空问，因此力学性 能是水凝胶的重要一t f 能指标，另外，水凝胶的降解性能也很重要，交联凝胶的降 解速率与力学性能相互关联，而细胞和水凝胶的相互作用将对细胞的黏附、迁移 和分化有重要影响，作用不当可能诱发其他组织的形成【l 6 1 。 凝胶是亲水性的三维高聚物，能吸收充分的水。一般，凝胶拥有好的生物相 容性，它们的亲水表面有低的表面自由能，导致了很少的蛋白质贴附到表面。而 且，凝胶柔软和橡胶化的性质最小化了与周围组织的排斥。疏水链能促进细胞的 贴附。 1 3 1 胶原和明胶 动物皮经蛋白酶消化得到的胶原是水溶性的，常用戊二醛进行交联以制备胶 原基材料。而明胶是胶原的部分变性衍生物，它由胶原的三重螺旋结构解体为单 链分子而形成。明胶的水溶液的温度降至3 5 0 c 下时可以形成热可逆凝胶，此时 大分子链从线团状构象转变成螺旋状，这个过程他们容易恢复到胶原的二重螺旋 结构。 1 3 2 透明质酸 透明质酸足天然细胞外基质( e c m ) 中糖胺聚糖( g a g s ) 的重要组成物， 它在创伤愈合中起着重要作用。甲基丙烯酸缩水甘油酯通过自由基聚合亦可使透 明质酸交联，形成水凝胶。透明质酸的力学强度较低，因此限制了其应用范围。 1 3 3 血纤蛋白 血纤蛋白通常用做外科用密封剂和粘合剂，对伤口愈合起促进作用。血纤蛋 白足体内的天然组成物，因此其降解产物无毒，也不会诱发免疫反应。血纤蛋白 的特点是其降解和对伤口的重建作用与细胞的迁移、创伤愈合过程中细胞相关酶 的活性相关，其降解速率可由蛋白酶控制剂( 如抑蛋白酶肽) 调控【5 1 。 1 3 4 壳聚糖 壳聚糖由于具有c 2 上的活泼氨基和c 6 上的羟基，可以在温和的条件下发生 化学反应，进行改性，形成多种衍生物，大多数的商业化多糖( 如纤维素、葡聚 7 笫一章前言 糖、果糖、海藻酸、透明质酸、肝素、琼脂糖、淀粉等) 不足中性就是酸性，而 壳聚糖是碱性多糖，能溶解于有机酸的水溶液中( p h 值 6 5 ) ，形成粘性溶液，通 过壳聚糖的氨基可将叠氮苯甲酸和乳糖酸缩合引入到壳聚糖分子中，而乳糖酸对 壳聚糖进行修饰可以使其在中性条件下具有水溶性，这可能会提高壳聚糖衍生物 的生物相容性。 壳聚糖是甲壳质脱乙酞化产物，学名( 1 4 ) 2 胺基2 脱氧d 葡聚糖，是甲壳 素的脱乙酞化产物，其结构中n 一乙酰基吡喃与细胞外基质中的糖胺聚糖( g a g s ) 组成类似，此碱性多糖具有独特的分子结构特征、化学性质及生物功能。壳聚糖 生物相容性良好，在正常条件下，植入的壳聚糖基生物材料不引发炎症和过敏反 应。壳聚糖己经被广泛应用于生物医学领域，如透析膜、可吸收缝线、药物释放 载体、固定化酶载体。它可被溶菌酶缓慢降解为无毒的氨基葡糖后被人体完全吸 收。壳聚糖是生物活性聚合物，它具有抗血栓性，能刺激宿主抵御病毒和细菌感 染的免疫系统。因此，壳聚糖可以促进创伤愈合以及软组织和硬组织的重建i ij 。 另外，壳聚糖的高电荷密度使它能与许多水溶性聚阴离子糖胺聚糖( g a g s ) 如 透明质酸、肝素和硫酸软骨素等形成聚电解质配合物而具有多重生物活性：如调 控内皮细胞和平滑肌细胞在体外和体内的黏连、铺展和增殖。 壳聚糖结构独特，在肝细胞贴壁、分化和形态变化过程中起重要作用。因此， 以壳聚糖为主要成分的生物材料在开发人工肝脏的支架材料中具有广阔的应用 前景。对于急性肝功能衰竭的患者来说，唯一有效的治疗途径足肝脏移植，但由 于供体器官缺乏，许多患者凶得不到及时治疗酊死亡。冈此，开发人工刖：脏是解 决器官移植中供体不足的行之有效的方法。近几年，不少学者尝试以壳聚糖为骨 架材料培养肝细胞，开发人工肝脏，并取得初步的进展。 1 3 5 聚n 异丙基丙烯酰胺 图1 1n i p a a m 结构式 聚n 一异丙基丙烯酸酰胺( p n i p a a m ) 在水中的低临界溶解温度( l c s t ) 接近3 2 0 c ，在此温度下会产生相转变。p n i p a a m 在低温时在水中溶胀，大分子 链水合而伸展；温度升至3 2 0 c 时凝胶发生急剧脱水作用，由于疏水异丙基问的 第一章前肓 相互作用，太分予链聚集而收缩，p n i p a a m 经历了从溶胀相至收缩相的体积相 转变。它的l c s t 特性是亲水性