（发酵工程专业论文）基于玉米浓醪酒糟基质的l乳酸菌株的选育与发酵研究.pdf

摘要 摘要 随着能源危机日益加剧，化石燃料日益减少，导致了国际原油价格的不断上涨，2 0 0 6 年4 月更是突破了7 5 美元，桶。燃料酒精作为一种清洁能源来替代化石燃料，是目前国 际上的一个研究热点。对于燃料酒精生产而言，如何降低生产成本是目前亟需解决的一 个重点。论文以此为出发点，对于酒精发酵联产l 乳酸的工艺进行了研究，以达到既解 决酒精生产中酒糟的污染问题，同时降低酒精及l 一乳酸生产成本的目的，为后续放大生 产奠定基础。 通过采样分离，自主筛选获得了一株l 哥l 酸细菌，光学纯度检测表明，其乳酸产物 中l 乳酸的含量达到了9 4 8 。进步对该菌株进行了初步碳源、氮源的发酵性能试验， 通过菌株的表型、生理生化特性结合1 6 sr d n a 序列比对，确定该菌株为夏威夷肠球菌 ( 办把r o c o c c 搬 口w 口f f e 珊担) ，哲命名为e 口w 口f f e 凇括w x s ，目前暂时未见利用夏威夷 肠球菌进行l 乳酸发酵生产的公开文献报道。 利用化学诱变剂n t g 对e _ l z 佣懈f 招船如w x s 进行反复诱变处理，得到一株良好产 酸的菌株e 细w 口妇邶捃w x s 5 8 。进一步考察了e 幻伽妇珊括w x s 5 8 在葡萄糖为碳源 的培养基中的发酵性能，确定了最佳发酵温度为3 4 。c ，适宜种龄为1 4 1 8h ，最佳接种 量3 ，培养基的最佳初始p h6 0 ，在发酵初期，适量通气培养对l 一乳酸的产生有较好 的促进作用。对发酵培养基进行了优化，通过正交试验确定了最佳的发酵培养基组成为： 蛋白胨1 ，酵母膏1 ，n a 2 h p 0 4 0 1 5 ，m g s 0 4 0 0 2 ，在该培养基中发酵4 8 h 后， 发酵液中l 乳酸产量达到5 6g ，l 。 对e 妇w 口抛脚括w x s 5 8 以酒糟为基质进行了驯化，使菌株能够在玉米浓醪酒糟清 液中良好生长。通过考察酒精浓醪发酵和l 乳酸发酵之间的关系，确定了酒精发酵和 l 乳酸发酵之间的平衡点：将酒精发酵提前至3 6 _ 4 0h 结束，此时醪液酒精度在1 2 左 右，酒糟固液分离后清液含糖在7 0 8 0g l ，适当处理后直接用于l 乳酸发酵。 对玉米浓醪酒糟清液为基质的l 哥l 酸发酵进行7l 发酵罐和1 5l 罐小试试验。7l 罐中，发酵初糖6 7g ，l ，发酵3 6h 后，发酵液中l 乳酸产量达到5 2 9 l ，残糖7 9 ，l ， 糖酸转化率为8 6 7 ；1 5l 罐中，初糖8 7g l ，发酵4 8 h 后，l 一乳酸产量达到6 8 9 l ， 糖酸转化率为8 9 5 。在1 5l 罐中，l l 酸最大生成速率在1 2h 时，达到了2 8 6g ，l h ， 酒糟中糖的最大消耗速率在1 7 7h ，达到了3 5 5g l _ h 。 对经济成本进行了初步的核算，与单独进行酒精发酵相比，酒精浓醪发酵联产l 一 乳酸工艺可增加利润8 1 4 元吨酒糟清液。 关键词：l 哥l 酸：夏威夷肠球菌；浓醪酒精发酵；玉米酒糟 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a se n e 唱yr e s o u r c e sc r i s i si n c r e a s i n g l ys p e e d i n gu pi nr e c e n td a y sa 1 1 df u e lr e s o u r c e s f a d i n ga w a y ，t h er a wo i lp r i c eh a se x c e e d e d7 5u s $ p e rb a r r e li na p r i l ，2 0 0 6 f u e la l c o h o l ， w h i c hh a sb e e nt h i n k i n ga sac l e a ne n e r g yt 0r e p l a c et h ef o s s i l 如e l ，b e c o m e sah o t s p o tt 0 r e s e a r c h e r sa l lo v e rt h e 、v o r l d t bt h ef u e la l c o h o ld r o d u c t i o n ，h o wt or e d u c et h ec o s to f e t h a n o lf b n e n t a t i o ni so n eo f l em o s ti i l l p o n a mp m b l e m st ob es 0 1 v e d t h et l l e s i s ，b a s e d o nt h i sp o i n t ，w a st or e s e a r c hv e r yh i 曲g r a v i t y ( v h g ) e t h a n 0 1f e 加e m a t i o na 1 1 dl l a c t i ca c i d f b n l l e n t a t i o n ，n o to n l yt os o l v et h ep o l l u t i o n so fd i s t i l l a t eo fv h g e t l l a l l o lf 色n n e n t a t i o n ，b u t a l s ot or e d u c et h ec o s to fv h ge t h a n o lf 苦r n l e n t a t i o na 1 1 dl - l a c t i ca c i df b 眦e n t a t i o n ，l a y i n ga f b u n d a t i o nf b r 锄p l i f i e dp r o d u c t i o n t l l r o u g l lm e t h o d so fm i c r o o 唱柚i s ms e p a r a t i o n s ，a nl l a c t i ca c i db a c t e r i aw a ss c r e e n e d f 如mv a r i e ss 锄p l e s ，a l l dt 1 1 】o u 曲o p t i c a lp u r i t ya j l a l y s i s ，t l l ec o n t e n to fl l a c t i ca c i di nl a c t i c a c i dp r o d u c t i o nw a s9 4 8 w i t l li t sf b h n e n 诅t i o no fc a r b o na 1 1 dn i t r o g e ns o u r c e s ，a 1 1 d t h m u 曲p h e n o t y p e ，p h y s i 0 1 0 9 i c a la n db i o c h e i i l i s 仃yc h a r a c t e r i s t i c sa 1 1 d16 sr d n as e q u e n c e b l a s t ，t h eb a c t e r i 啪w a si d e n t m e dt ob e 勘蛔一0 c c 淞 删日f 耙脚括，n a m e da s 三h 把加c d c c 淞 觑m 口f f p 瑚括w x st e m p o r a r i l y n o r e p o r t h a sb e e ns e e nt ou s ei tf o rl l a c t i ca c i d f 色r n l e n t a t i o ni np u b l i s h e dl i t e r a t l l r c s a r e rr e p e a t e dt r e 椭e n t st oe m 矿口f f p 门5 括w x s 、i t t ln t go n eb a c t e r i u m ，e 矗口w 口f f p ，坫曲w x s 5 8 ，、v a sg o tf o ri t sl l i g hp m d u c t i o no fl l a c t i ca c i d t h ee m v 口f f p 以5 捃 w x s 5 8 sp e r f o f i i l a n c ei nf b m e n t a t i o nw a sc h e c k e di nm e d i 啪、v i t l lg l u c o s ea sc a r b o n s o u r c e s ，a 1 1 di t so p t i m a lf e 珊e n t a t i o nt e m p e r a t i l r ew a s3 4 。c ，o p t i m a ls e e da g ew a sf 如m1 4t o 18h ，t h ei n o c u l a t i o n 锄o u n tw a s3 ，a n dt l l ep r i m a r ym e d i 啪p hw a s6 0 ，i nm ei n i t i a l s t a g e so ff 色肌e n t a t i o n ，p r o p e ro x y g e nc a l lp r o m o t el l a c t i ca c i dp m d u c t i o n w 油t h e o p t i m i z a t i o no ft h e f e r m e n t a t i o nm e d i u m ，t h eo p t i m a lm e d i u mw a sd e t e n “n e d 血r o u g h o n h o g o n a le x p e r i m e n t ：p e p t o n e1 ，y e a s te x t m c t1 ，n a 2 h p 0 4o 1 5 ，m g s 0 40 0 2 a r e r4 8h o u r sc u l t u r e si nt l l i sm e d i u m ，l l a c t i ca c i dp m d u c t i o nr e a c h e dt ob e5 6g l d o m e s t i c a t i o no fe 向m p 口f f p s 括w x s 5 8i nd i s t i l l a t eo fv h ge t h a n o lf e r m e n t a t i o nw a s c a r r i e do u t ，t h er e s u l t ss h o w e dv e r yg o o db a c t e r i ag r o w 山a r e rr e s e a r c ho ft h ev h g e t h a n o lf e r i t l e n t a t i o na n dl - l a c t i ca c i df e n n e n t a t i o n ，m eb a l a n c ep o i n tw a sc h e c k e dt ob eg o o d f b rb o t hf 色n 1 1 e n t a t i o n ：t h ee t h a n o lf 毫m e n t a t i o nw a se n d e db e t w e e n3 6a n d4 0h o u r s ，i nw h i c h t h ee t h a i l o ic o n c e n t r a t i o nw a sa r o u n dl2 ，a f t e rs o l i dp a n sw a sc e n t r i 如g e df r o mb r o t h ，t h e t o t a ls u g a r ss u p e m a t a n tc o n t a i n i n gw a sb e t w e e n7 0a n d8 0g l ，w h i c hw a su s e df o rl - l a c t i c a c i df b r m e n t a t j o n i i a b s h a c t - _ - _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ ，_ - _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - t h el l a c t i ca c i df e m e n t a t i o no f d i s t i l l a t eo f v h g e m a l l o lf e 舢e n t a t i o nw a sc 枷e do u t i n7la i l d1 5lf e 肿e n t o r s ，f e s p e c t i v e ly i n7lf e n l l e m o r 谢t t li l l i t i a ls u g a r s6 7g l ，t 1 1 e l l a c t i ca c i dp r o d u c t i o nr e a c h e dt ob e5 2g ，li n3 6h o l l r s ，a 1 1 d 也er e s i d u a ls u g a r sw a so n l y7 g ，l ，8 6 7 o fc o n s 啪e ds u g 盯sw a sc o n v e n e dt ob el l a c t i ca c i d i nl5lf 醯m 印 o r ，诵t l l i r i i d a ls u g a r s8 7g ，i 。，t h el l a c t i ca c i dp r o d u c t i o nr e a c h e dt ob e6 8 班证4 8h o u r s ，a n dm e r e s i d u a ls u g a r sw a so 珂y1 0g l ，8 9 5 o f c o l l s 啪e ds u g a r s 、a sc o n v e r t e dt ob el l a c t i ca c i d a n di n1 5lf e n n e n t o r ，t h e1 1 i g h e s tp r o d u c t i o nr a t ew a s2 8 6g l h ，o nt 1 1 e 1 2h o l l ro f f e 咖e n 诅t i o n ，m eh i 曲e s ts u g a rc o n s 啪em t ew a s3 5 5g l h ，o nm e 1 7 7h o i l ro f f c 锄e n t a t i o n e c o n o m i c a lc o s tr e c k o i l i n gw e r ee s t i m a t e dt ot h i st e c h n o l o g i c a lp r o c e s s c o m p a r e d t 0 t h ee 也狃0 lf e m e n t a t i o nu s i i l gd i s t i i l a t eo f v h ge t h a n o lf c m e m a t i o n ，l i a c t i ca c i dc o m b i i i e d c t h a n o lf e 肋e n t a t i o nc 肌i i l c r e a s ep m f i tw i t l l8 1 4 ￥r m bp e rt o no fd i s t i a t eo fv h g e t b a n 0 1f 毫瑚e n 蜥o n k 盯w o r d ：l 1 a c t i ca c i d ，勘纪r d 卵淞j z 删口f 把邶打w x s ，v h ge t l l a l l o lf b l l n e n t a t i o n ， d i s t i u a t eo f v h g 劬a n o lf 音r m 既恤正o n 矗o mc o m i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材科。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：- = 圣型k日期：扩2 年 易月，p 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：二继导师签名：! 逊 日期：护荔年z 月f 归 第一章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论 能源已经成为制约我国经济发展的瓶颈，2 0 0 3 年我国已经成为仅次于美国的世界第 二大能源消费国。进口原油1 1 2 亿吨，原油进口已成为我国能源安全的重大隐患。我国 已经探明的石油储量只够开采3 0 年，煤储量只能开采l o o 年左右。因此，新型能源的 开发不仅对我国国民经济的发展有重要推动作用，而且已经成为我国国家安全必须考虑 的问题【l 】a 酒精作为燃料已经有很长的历史。早在1 2 世纪，c l a “c u l a 在他的记述中就谈到酒 精可以用作燃料和溶剂的情况。1 8 9 7 年，o 仰发明的内燃机就使用酒精作为燃料1 2 1 。但 是直到1 9 7 3 年第一次石油危机以前人们对以酒精作为燃料并没有太大兴趣。1 9 7 3 年 发生了第一次石油危机，巴西、美国等国家为了减少对进口原油的依赖，开发可再生新 能源，都大力推行燃料酒精计划。从此，发酵法燃料酒精生产进入了大发展时期f 3 】a 1 1 1 国内外燃料酒精概况 目前世界上的酒精生产主要采用发酵法，我国的酒精产量仅次于巴西和美国，是世 界上四大酒精生产国之一1 4 j 。巴西拥有世界上最大的燃料酒精工业，很大程度上得益于 该国政府1 9 7 1 年制定的国家甘蔗糖业改革计划以及1 9 7 5 年制定的发展生物能源计划即 “国家乙醇计划”。目前巴西的乙醇产量在1 2 0 0 万吨左右，主要用于汽油醇的配置上， 巴西国内的汽车约接近三分之一已经采用了无水乙醇直接作为燃料替代了汽油。美国的 酒精行业主要采用的是玉米原料，从1 9 0 8 年美国f o r d 汽车公司制造出第一台使用纯乙 醇作为燃料的汽车开始，1 9 3 0 年美国汽油醇在美国面世，1 9 7 8 年，使用汽油醇作为燃 料的汽车在美国内不拉斯加卅l 已经广泛使用。目前美国1 0 以上的酒精都是用来生产燃 料酒精。在巴西，美国和欧洲国家建立燃料酒精计划不断深入开展的同时，其他一些国 家也有较快的发展。包括中国、泰国、印度等在内的一些发展中国家也制定了规模巨大 的燃料酒精计划。泰国2 0 0 4 年底宣布在2 0 0 5 年开始用甘蔗来生产酒精，并且将投放到 国际市场，与巴西展开竞争。 美洲是世界酒精生产的领头羊，2 0 0 1 年美洲的酒精产量占世界酒精产量的6 5 5 。 其中巴西的酒精的优势主要体现在原料的利用和成本控制方面，该国的酒精生产主要采 用以甘蔗、糖蜜为原料，几乎可以全部用来代替石油。美国的酒精主要以玉米为原料， 目前美国的酒精行业在免税和财政补贴的基础上，投入了大量的人力物力从事利用纤维 素质原料转化生产燃料乙醇的研究。欧洲的酒精生产主要以小麦等农作物产品为原料， 产量较低，但是其酒精生产的发展势头猛烈。图1 1 表示了目前国际上的酒精生产分布 情况。 江南大学硕士学位论文 一洲 图1 i 全球2 0 0 1 年产量分布 f i g 1 1d i s t r i b u t i n go f 劬肌o ly i e l di n9 1 0 b ei n 2 0 0 l 我国是主要采用发酵法生产酒精的国家。目前在酒精生产中面临的问题主要有：( 1 ) 发酵成本高；( 2 ) 生产过程中能耗大；( 3 ) 酒精发酵强度相对低；( 4 ) 酒糟综合利用程 度低，酒糟造成的污染情况比较严重【5 j 。我国的酒精生产原料主要有玉米、木薯、瓜干 等淀粉质原料为主，有极少数厂家使用糖蜜原料l l j 。2 0 0 2 年我国酒精产量为2 1 3 万吨， 到2 0 0 5 年，我国酒精产量在3 0 0 4 0 0 万吨之间，其中玉米酒精产量为1 3 0 万吨，与巴 西美国相比较，我国的酒精产量还较少，在生产上有较大差距1 6 】。而且，我国的酒精产 量虽然在增加，但是酒精企业整体经济效益并不景气，如何降低生产成本，提高酒精生 产企业的经济效益乃是当务之急。 我国政府对于酒精工业的发展给予了高度的支持，并且给发展燃料酒精提供了一系 列的优惠政策。2 0 0 1 年，河南天冠集团公司和黑龙江华润金玉实业有限公司老厂变性燃 料酒精改扩建项目已相继投产【7 j 。2 0 0 0 年以来，国家计委会同国务院有关部门、单位和 试点地区就推广使用车用醇汽油开展了大量细致的工作，目前我国推广使用车用醇汽油 工作已经取得了阶段性成果。 1 1 2 酒精浓醪发酵研究概况 传统酒精工业中存在着许多问题，近年来研究人员对酒精发酵工艺路线进行了不断 研究，浓醪发酵酒精就是其中之一，并且浓醪发酵正日益成为酒精发酵领域中的研究热 点。 本研究室在浓醪发酵酒精研究中，提出了淀粉质原料的酒精浓醪发酵方法，以玉米 为原料，在3 4 。c 下发酵，得到发酵醪中酒精度高于1 6 ，淀粉利用率达到9 0 ；以瓜 干为原料，发酵后酒精浓度达到1 3 8 ，淀粉利用率达到9 4 【89 1 。 在浓醪发酵中，随着酒精度的提高，酒糟中的营养成分也提高，相应的可利用成分 的增加为利用浓醪酒糟生产附加值高的产品奠定了基础。目前的酒糟常见处理方法有： 酒糟干燥生产饲料d d g s 、酒糟滤液生产单细胞蛋白( s c p ) 、酒糟滤液全回流及生产其 他的生物活性物质。江南大学生物资源研究室在浓醪综合利用方面进行了一定的研究， 第一章绪论 例如利用其生产乳酸州、单细胞蛋白【l 】、生产乳酸链球菌素i 、以及用于饲料方面等等。 1 2 乳酸的国内外研究概况 1 2 1 乳酸的性质和用途 乳酸，学名2 羟基丙酸，是一种由化学合成和生物代谢产生的有机酸，最早于l7 8 0 年由瑞典科学家s c h e e l e 首先从废乳中发现【“j 。乳酸为无色或者淡黄色饴糖状的粘稠状 液体，相对密度为1 2 4 8 5 ( 1 5o c ) ，熔点1 6 8 。c ，沸点1 2 2o c ( 1 9 9 5 1 0 3 帕) ，吸水性 强，易溶于水、乙醇、乙醚以及甘油中，不溶于苯和氯仿，高浓度的乳酸不稳定，易脱 水和缩合，具有弱酸性和弱腐蚀性，无毒。 乳酸分子中含有一个不对称碳原子，表现出旋光性。由于动物体内只含有l 一乳酸脱 氢酶，d 一乳酸在动物体内则不能够被分解，因而高光学纯度的l 一乳酸生产研究已经受到 了科研工作者的极大关注。l 一乳酸是一种重要的中间体，广泛应用于酿造、医药、皮革、 卷烟、化工、食品、印染等多种领域，可以作为防腐剂、酸味剂、风味剂、灭菌剂等1 2 】。 在环境保护方面，l 乳酸可以被聚合生产为聚乳酸，而后者所制成的产品可以为自然界 中的微生物有效的降解；在医药工业方面，l 一乳酸除了可以直接作为消毒剂，还可以制 成l 一乳酸钠、l 乳酸与葡萄糖、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒及高假血病1 3 】。 1 2 2 国内外翼酸研究进展 1 2 - 2 1 国内外乳酸市场需求 由于l 乳酸在环保和医疗方面的广泛应用，世界l 乳酸需求量增长很快。目前世 界上生产乳酸的厂家主要是美国的a d m 、a e s 、嘉吉公司、荷兰p l | m “比利时g a l a c t i c 等公司，l 哥l 酸总产量约在2 0 万吨。由于环境保护问题受到国际上越来越多的重视， 作为引起白色污染的p v c 、p p 塑料被越来越多地国家禁止或限量销售，而生物可降解 塑料聚l 一乳酸则在全球范围内得到更为广泛的推广。随着国际上聚l 乳酸生产工艺的 开发和改进，西欧、北美、中东、东南亚等地区l 乳酸的需求量以每年1 6 的速度在增 长，预计在2 0 2 0 年，l 一乳酸的需求量将会达到l o o o 万吨年以上，具有十分广阔的市场 前景。 我国的乳酸生产厂家多数为生产d l l 酸，生产l 一乳酸的厂家的规模仅限于1 0 0 0 吨，年。与国外相比，我国细菌发酵l 哥l 酸起步晚，生产规模和水平与国外存在较大的 差距，安徽丰原集团引进了比利时g a l a c t i c 公司的l 一乳酸生产线，在国内l 一乳酸生产中 有较大影响。当前我国的乳酸需求量在1 0 万吨，并且呈现逐年增长趋势，l 哥l 酸的市 场前景十分广泛。 1 2 2 2i 广乳酸研究进展 乳酸生产有化学合成法和微生物发酵法，目前国际上都采用微生物发酵方法来生产 江南大学硕士学位论文 高光学纯度的l 一乳酸。2 0 0 0 年，在全世界生产的8 万吨乳酸中，有9 0 以上来于微生 物发酵，只有1 0 以下的乳酸是通过化学合成生产【1 4 l 。 目前用于发酵生产乳酸的主要有细菌和真菌，但是由于细菌发酵具有更高的得率和 转化率，而被实验室或者工厂更为广泛采用【1 5 】。表1 1 列出了常用的一些乳酸细菌的发 酵产物及副产物等。 表1 1 乳杆菌属发酵生产乳酸的主要和次要产物 t a b 1 1m a j o ra 1 1 ds e c o n d a r yp r o d u c t i o no f 三口c ，0 6 口c 删琊s p e c i e s 乳酸细菌是当前乳酸生产中使用较多的微生物，不仅仅因为它们能产生高光学纯度 的l 一乳酸，还因为细菌生长快速，可以在较短的时间内产生大量的乳酸，得到高生产效 率，但是由于发酵产生乳酸的一类细菌对于营养需求很高，在很大程度上提高了乳酸的 生产成本。目前发酵细菌生产乳酸的主要问题集中在复杂的营养需求的成本消耗占到了 3 5 【1 6 】，以及终端产物抑制1 1 7 l 两个关键问题上。为了解决乳酸发酵过程中的终端产物抑 制作用，国内外的学者纷纷对发酵过程中产物乳酸的提取进行研究，目前进行该方面研 究的方法主要有以下几种：细胞回用的错流过滤发酵方式，电渗析发酵，采用阴离子交 换树脂，以及萃取发酵等方式。而对于乳酸生产中的成本问题，国内外的学者纷纷研究 采用更加廉价的原料( 主要采用是农林业的生产废弃物) 来发酵生产乳酸，这样不仅解 决了废弃物的处理问题，减少它们对环境的污染，还降低了乳酸生产的成本。 米根霉是较早应用于工业化生产l 一乳酸的微生物之一，由于其能够直接利用淀粉质 原料以及产生较高光学纯度l 一乳酸等优点，得到了国际范围广泛研究l i “】。目前我国虽 然已经有企业引进了国外l 一乳酸细菌发酵工艺，但是国内厂家的l 一乳酸生产主要还是 采用米根霉发酵生产，根霉发酵的产酸水平与国外普遍采用的细菌发酵还存在的较大的 差距，发展细菌生产单一l 乳酸是当务之急。近年来，在我国一些高等院校和研究机构 的不断努力下，我国利用细菌发酵生产l 乳酸已经取得了长足进步，如山东大学对于细 菌l 一乳酸发酵已经进行了5m 3 发酵罐的中试生产，最终产量达到了2 0 ，达到了国际 先进水平，为工业化生产奠定了基础( h n p ：，w w w c h k j g o u c i 眺j c l 酬s a s p ? i d = 1 0 4 7 ) 。 第一章绪论 1 2 2 3 农林业废弃原料的乳酸生产 由于葡萄糖、淀粉等原料来源丰富，使发酵法生产l 一乳酸得到了广泛的推广。但是 利用这些原料的成本依然较高，严重限制了l 乳酸生产聚乳酸，从而在环境保护方面的 应用田j 。由此寻求廉价原料来生产l 哥l 酸在国际上得到了广泛的研究，美国的c a r g i l l d o w 公司已经成功地利用了玉米渣为原料来生产l 一乳酸，再将l 一乳酸制成生物可降解 的聚l 一乳酸，2 0 0 1 年，该公司成功地投产了年产1 4 万吨聚乳酸的工厂，是目前国际上 最大的聚乳酸生产基地。 许多种不同的基质可以被用来发酵生产乳酸，如果采用单一的碳源来发酵乳酸对于 发酵液中产物的纯度有相当的好处，但是，从经济成本上来讲，这样并不可取，单一碳 源发酵将会大大地提高发酵成本，而产物乳酸相对来说是一种廉价的产物，因此寻找廉 价的农业废弃物或者林业废弃物，使其转化为乳酸生产的主要基质，目前来说是较好的 方法l l 。当前国际上研究的农林业废弃产物原料主要包括以下几种：乳清、糖蜜、淀粉 质原料、木质纤维素等等。除米根霉发酵过程中营养要求相对简单以外，乳酸细菌由于 其苛刻的营养需求，在生产过程中往往需要添加各种不同的营养元素，其中包括有氮源、 微量元素等来促进乳酸细菌的生长。通常情况下乳酸细菌发酵过程中添加酵母膏、蛋白 胨、玉米浆等复合营养以及m 9 2 + 、m n ”、f e ”等一些有利于乳酸细菌生长的金属离子或 者磷元素等可以有效地促进产酸。 1 廉价原料生产l 乳酸的研究 对于利用废弃以及廉价的原料来生产l 乳酸，从而降低l 一乳酸的生产成本，同时 又解决了废弃物的处理及污染问题，目前很多学者和研究机构都对此在进行大量研究。 2 乳清为原料的乳酸发酵 r o u k 雒和k o t z e k i d o u 对利用脱蛋白乳清混合培养游离的和共固定的干酪乳杆菌和 嗜酸乳杆菌细胞的乳酸发酵模式进行了研究，发现补料发酵的乳酸产量达到了4 6g l ， 要明显的高于分批培养的乳酸发酵田】。e l l e nm s i l v a 等人对纤维床生化反应器中连续发 酵乳清液中的乳糖为乳酸进行了研究，并且提出了一个动力学模型。在发酵过程中，他 们发现乳酸的产量在纤维床反应器中要比在分批培养高l o 倍【2 4 】。 3 糖蜜原料的乳酸发酵 j o s e 等对三口c f 0 6 卯f 盯凇如，6 ，船c 舡f 发酵甜菜糖蜜为乳酸的动力学模型进行了研究， 在他们提出的动力学模型下，乳酸细菌停止生长以及停止产酸的时候的乳酸产量分别达 到了4 5g ，l 和5 7g 几让卦。 y e k t a 等将甜菜糖蜜进行预处理后，利用三口c f 0 6 a c 肼淞出场r “p c 解f 进行了分批发酵和 连续发酵的培养。在分批发酵中，最高转化率和产量在4 5 。c ，p h 6 o ，7 8 2g ，l 糖浓度 以及1 0g ，l 酵母提取物，最高产率达到了4 1 7g l h ，采用连续发酵培养时，乳酸的最 高产量为4 1 5 l ，最高的体积产率达到了1 1 2g l h 1 2 ”。 4 淀粉质原料和纤维素原料发酵 江南大学硕士学位论文 v e n k a t e s h 等研究了在不同的p h 值条件下乳酸细菌发酵纤维素，采用z 馏p j p f 产生 的纤维素酶来糖化，用保加利亚乳杆菌发酵生产乳酸。并且他们对在酶动力学和发酵动 力学之间的关系进行了研究，纤维素糖化条件控制在p h5 以上，而发酵则控制在p h5 以下。发酵后葡萄糖浓度比任何p h 下的单糖发酵都要低，乳酸的产量达到o 4 5g l h 【2 7 】。 1 2 2 4 细菌发酵乳酸的机理 乳酸细菌一般不能够直接发酵淀粉质原料，一般需要将淀粉质原料转化成为糖质原 料以后才能够被乳酸细菌利用。乳酸的发酵按照发酵产物的不同，可以分为同型乳酸发 酵和异型乳酸发酵。 1 同型乳酸发酵 该发酵模式是指在发酵过程中，微生物基本上只能产生乳酸，而不产生乙酸等一些 常见的发酵副产物。其生物合成机理如下： 葡萄糖! ! 竺! + 丙酮酸- - 乳酸 在这种途径下，1m o l 葡萄糖可以产生2m o l 乳酸，理论转化率为1 0 0 ，但是由 于发酵过程中微生物生长等因素的存在，实际转化率在8 0 以上一般可以认为是属于 同型乳酸发酵。 2 异型乳酸发酵 该发酵模式除了生成乳酸以外，还可以生成c 0 2 和乙酸( 或者乙醇) ，有两种途径： b i 倒u s 途径，2 m 0 1 葡萄糖可以生成2 m o l 乳酸和3 m o l 乙酸，乳酸对糖 的转化率只有5 0 ： 6 一磷酸葡萄糖酸途径，合成乳酸的理论转化率也只有5 0 ，消耗lm o l 己糖 可以得到1m 0 1 乙酸和lm o l c 0 2 。 可见，异型发酵的乳酸的副产物较多，决定乳酸发酵类型的不仅和所使用的微生物 菌种特性关系密切，还和发酵条件等因素息息相关，条件的变化可以使发酵类型发生转 变。 1 3 立题意义 乙醇作为一种无污染的优质生物能源，有望取代日益减少的矿物原料( 石油、煤炭) ， 国际上对于酒精的生产给予了广泛的研究1 2 。当前全球范围内能源问题严重加剧，开发 燃料乙醇作为石油等的优质替代品，既有当前利益，也有长远利益。 发酵工业副产物的利用和污水处理是环境保护工作中的一个难题，酒精行业的污染 物处理已成为其持续发展的一个关键。浓醪酒精发酵在提高料水比的同时，酒糟中的残 留物质也随之增加，对发酵副产物的处理提出了更高的要求，同时酒糟中有机物质的增 加也为酒糟的综合利用提供了条件。如何最大限度的利用酒糟中的有用成分，将其可用 的物质全部资源化，转化成为用价值的产品，既可以解决酒糟对环境的污染问题，又相 6 第一章绪论 应的降低酒精生产成本，这对于燃料酒精计划的实现和环境保护具有重要的现实意义。 乳酸作为三大有机酸之一，在国民经济的各个部门发挥着重要的作用。世界上对乳 酸的需求量增长很快，尤其是对l 一乳酸的需求量不断增加，将可能达到1 0 0 0 万吨，目 前的产量仅为2 0 万吨，市场前景巨大。目前，国际上对于研究利用废弃物生产乳酸越 来越多，研究废弃物中生产l 一乳酸不仅可以有效的节省经济成本，而且处理了废弃物， 减少了环境污染。本课题研究利用浓醪酒糟发酵生产l 乳酸，一方面解决酒糟的污染问 题，使酒糟可以得到综合利用，同时也为乳酸发酵生产找到一个廉价的原料，相应降低 乳酸的生产成本。可以有效地降低燃料酒精的生产成本。另外，酒精生产与乳酸生产相 结合，创造更多的经济利益。 1 4 本课题的主要研究内容 作为生物可降解塑料聚l 乳酸的原料，l 一乳酸在全球范围内的需求迅速增长，降低 细菌发酵生产乳酸的成本，开发利用酒精工业废弃物发酵生产l - 乳酸具有重要的现实意 义。同时，优化酒精生产和酒糟综合利用的生产工艺，以求得到能量投入最低，综合效 益最高。 本课题属于国家科技部“十五”攻关资助项目( 2 0 0 l b a 5 们a 0 1 ) ，是玉米酒精深加工研 究与开发项目中利用玉米浓醪酒糟为原料，发酵生产l 乳酸。课题的主要研究内容如下： ( 1 ) 从土壤、酸乳中筛选得到l 一乳酸细菌，确定一株l - 乳酸光学纯度高、产酸 量高的细菌作为实验出发菌株；并且通过对细菌的生理生化特性和1 6 sr d l n a 试验对细 菌进行鉴定； ( 2 ) 采用n t g 化学诱变剂对于l 乳酸细菌进行诱变处理，选育一株高产的l 乳 酸细菌，并对于l 一乳酸细菌在葡萄糖基质中的发酵工艺条件进行研究，确定一种最佳的 发酵工艺路线。 ( 3 ) 对于诱变高产菌株在以玉米浓醪酒糟清液的基质中进行驯化培养。通过考察 酒精发酵工艺和乳酸细菌发酵工艺，考虑适当提前结束酒精发酵，让位乳酸发酵，将酒 精生产工艺和乳酸生产工艺达到最优化效果。 ( 4 ) 工艺路线的经济成本估算。 江南大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章l 广乳酸细菌的筛选及鉴定 乳酸细菌是一类广泛分布于自然界，在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的 重要领域的应用价值很高。此外这类细菌中有许多是对人体有益的益生菌，有些又是人 畜的致病菌，因此受到人们极大的重视1 2 w 。 乳酸细菌属于化能异养型微生物，自身缺乏对许多有机化合物的合成能力，需要从 外界摄取多种营养物质和生长因子方能正常生长发育。在合成培养基中，乳酸细菌需要 氨基酸( l e u 、i l e 、v a l 、h i s 、m e t 、a 唱和p r o ) 以及维生素类( 烟酸、泛酸、生物素 等) 物质作为其生长因子。通常情况下，乳酸菌适合在低氧或厌氧环境中生长，由于厌 氧细菌在生产和应用中设备要求相对较高，拟筛选能够在低氧下生长的l 乳酸细菌。 2 - 2 实验材料 2 2 1 样品来源 从江苏、浙江、河南、河北、黑龙江、山东等地采集的土样2 1 个、市售泡菜样品5 个、酸奶样品6 个，用于菌种的筛选。 2 2 2 培养基 1 增殖培养基：酵母膏0 5g ，葡萄糖o 5g ，水l o o m l ，o 1m p a 灭菌1 5 m i n 2 m r s 培养基( g l ) ：蛋白胨1 0 ，牛肉膏l o ，酵母膏5 ，k 2 h p 0 42 ，柠檬酸三铵2 ， 乙酸钠5 ，葡萄糖2 0 ，吐温8 01 ( m l ) ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 8 ，m n s 0 4 4 h 2 00 2 5 ，p h 6 2 ，0 1m p a 灭菌1 5 m i n 。 3 e 1 l i k e r 培养基( g ，l ) ：胰蛋白胨2 0 ，蔗糖5 ，酵母提取物5 ，氯化钠4 ，明胶2 5 ， 乙酸钠1 5 ，葡萄糖5 ，抗坏血酸o 5 ，乳糖5 ，p h6 8 ，o 1m p a 灭菌1 5 m i n 。 4 t y c 培养基( g ，l ) ：胰胨1 5 ，酵母膏5 ，l 一胱氨酸o _ 2 ，乙酸钠2 0 ，硫酸钠o 1 ，氯 化钠1 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 ，碳酸氢钠2 ，蔗糖5 0 ，p h7 - 3 ，0 1m p a 灭菌1 5m i n 。 2 2 3 主要试剂及仪器设备 2 2 3 1 主要试剂 葡萄糖 蛋白胨 胰蛋白胨 酵母膏 分析纯 b r b r b r 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 第二章l - 乳酸菌株的筛选及鉴定 n a 2 h p 0 4分析纯 y e a s te x t r a c t t r y p t o n e 蜗牛酶 p r o t e i l l a s ek1 0 0 t 砌酶 其余试剂均为分析纯 2 2 3 - 2 仪器设备 国药集团化学试剂有限公司 0 x o i d 0 x o i d 华美生物工程公司 宝生物工程大连有限公司 上海迪奥生物科技有限公司 高效液相色谱仪a g i l e n th p1 1 0 0 系列：美国惠普公司 7 c 1 8 2 5 4 fc 1 8 液相色谱柱：江苏汉邦科技有限公司 一j 据cc l c lc h i r a lc o l 哪n ：a d v a i l c e ds 印a r a t i o nt e c l l i l o l o g i e si n c u s a 梅特勒s 4 0 k 酸度计：m e n i e rt o l e d o s h z 一3 型水循环真空泵：河南省巩义市仪器厂 电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司 s b a _ 4 0 c 生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所 7 2 1 型分光光度计：上海第三分析仪器厂 c r 2 2 g 高速冷冻离心机：n l e 姗oi e c ，i e cm i l e l l 一r f p c r 仪( p t c 一2 0 0p e l t i e rn l e 衄a lc y c l e r ) ：m jr e s e a r c h 3 1 3 0g e n e t i ca n a l y z e r ：a p p l i e db i o s y s t e m s ，u s a 2 3 实验和分析方法 2 3 - 1l 广乳酸菌株的分离 2 3 1 1 产酸构型的测定 对于平板中挑出的产生透明圈较大的菌株液体培养后，离心去除菌体后，上清液经 过0 4 5 岬膜过滤后经过手性h p l c 柱测定乳酸的构型和产量，珊f p c 手性柱，流动相为 5n l n l o l lc u s 0 4 溶液，流速1 0m u r n i n ，紫外检测波长2 5 4i 蚰，柱温3 0 。c 。 2 3 1 - 2 乳酸总量测定 发酵液体经0 4 5 “m 微膜过滤后，液相测定乳酸产量。分析条件：c 1 8 柱，流动相 o 0 5 m o l l k h 2 p 0 4 溶液，用磷酸调节p h 2 5 ，紫外2 1 5 姗检测，流速im u m i n ，柱温 3 0o c 。 2 3 1 3 还原糖的测定 d n s 法【3 0 1 。 江南大学硕士学位论文 2 3 2 出发菌株的筛选 2 3 2 1 增殖培养和稀释分离 1 将新鲜的样品1g 置于5 0 m l 增殖培养基中，富集培养8h 。 2 取出富集培养液1m l ，经过l o 。，1 0 ，1 0 一，1 0 4 ，1 0 一，1 0 缶，1 0 7 七个梯度稀释后， 分别倾注到含有碳酸钙固体的m r s 、e l l i k e r 、t y c 筛选培养基中，在3 0 。c 和3 7