（皮革化学与工程专业论文）极稀溶液中胶原多肽构象的研究.pdf

at h e s i ss u b m i t t e df o rt h e a p p l i c a t i o no f t h em a s t e r sd e g r e eo f e n g i n e e r i n g t h e s t u d y o fc o n f o r m a t i o no fe x t r e m e l y d i l u t e g e l a t i ns o l u t i o n s c a n d i d a t e ：y u a n x i a o j i a o s p e c i a l t y ：l e a t h e rc h e m i s t r ya n d e n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl it i a n d u o s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h ti n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a j u n e ，2 0 1 0 ， - 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名：蠡j 迭 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：蔓0 埠 导师签名： 山东轻t 业学院硕t 学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t 一i 第1 章绪论1 1 1 胶原蛋白分子结构1 1 2 胶原多肽构象的研究方法2 1 2 1 荧光光谱法2 1 2 2 红外光谱法3 1 2 3 拉曼光谱法4 1 2 4 圆二色谱法4 1 2 5 原子力显微镜法4 1 2 6 粘度法5 1 3 胶原多肽溶液的聚集行为6 1 4 高分子溶液及粘度异常行为7 1 4 1 高分子溶液浓度区域7 1 4 2 中性高分子溶液的粘度异常行为8 1 5 课题立意1 0 1 6 本文创新点l l 第2 章胶原多肽溶液的不稳定性1 3 2 1 前言1 3 2 2 实验部分1 3 2 2 1 实验试剂及材料l3 2 2 2 实验方法1 4 2 3 结果与讨论1 6 2 3 1 光电水平乌氏粘度计的设计和使用1 6 2 3 2 胶原多肽含量的测定1 7 2 3 3 胶原多肽等电点的测定一1 7 2 3 5 胶原多肽溶液的不稳定性1 9 2 4 本章结论2 3 日录 第3 章极稀胶原多肽溶液的粘度行为2 5 3 1 前言2 5 3 2 实验部分2 6 3 2 1 实验试剂及材料2 6 3 2 2 溶液的配制2 6 3 2 3 粘度的测定2 7 3 3 结果与讨论2 7 3 3 1p h 对溶液粘度的影响一2 7 3 3 2 胶原多肽溶液的粘度异常行为2 9 3 3 3 离子强度对溶液粘度的影响3 4 3 3 4 温度对溶液粘度的影响3 4 3 4 本章结论3 7 第4 章胶原多肽 t 1 的计算及吸附行为3 9 4 1 前言3 9 4 2 实验部分4 0 4 2 1 实验试剂及材料4 0 4 2 2 溶液的配制4 0 4 2 3 粘度的测定4 l 4 3 结果与讨论4 l 4 3 1 理论背景4 l 4 3 2 不同温度下胶原多肽m 】及吸附4 3 4 3 3 不同乙醇溶液中胶原多肽 t 1 】及吸附4 6 4 3 4 改进实验方法研究吸附行为4 7 4 4 本章结论5 l 第5 章结论5 3 5 1 结论。5 3 5 2 论文的不足和展望5 4 参考文献5 7 蜀c j 射6 7 硕士期间发表的论文与成果6 9 2 山东轻丁业学院硕一 ：学位论文 摘要 应用高精度光电水平乌氏粘度计系统的研究了稀浓度到极稀浓度区胶原多肽 在不同条件下的粘度行为，初步探讨了稀溶液中胶原多肽在玻璃毛细管壁上的吸 附对其粘度行为的影响，具体结果如下： 测定了不同浓度胶原多肽溶液的流出时间，结果表明：稀浓度到极稀浓度区 胶原多肽水溶液在1 5 o 下流出时间的标准偏差值很大，其流出时间波动很大， 这主要与胶原多肽分子链中带电氨基酸间静电相互作用、疏水性氨基酸间疏水作 用和肽键间氢键作用引起的结构变化有关，使胶原多肽溶液处于不稳定状态。升 高温度、调节p h p i 、添加低浓度的乙醇均能增强胶原多肽溶液的稳定性，而且 低浓度下的胶原多肽溶液比高浓度下稳定性要好。 用粘度法研究了胶原多肽在4 2 0 c 下不同p h 及不同盐浓度对其溶液性质的 影响，探讨了小分子盐对胶原多肽粘度浓度依赖性及其链尺寸的影响。实验结果 表明：胶原多肽溶液在等电点及远离等电点时的溶液性质截然不同；胶原多肽浓 度为0 4 m g m l ，其等电点在5 0 附近；在等电点附近加入小分子盐，胶原多肽溶 液表现出明显的反聚电解质性质；在远离等电点时，胶原多肽溶液表现出聚电解 质行为。在极稀浓度区胶原多肽溶液粘度出现急剧上升，随着小分子盐的加入， 极稀浓度区胶原多肽溶液的粘度急剧下降；当盐浓度足够高时，胶原多肽溶液的 1 1 。以c 曲线趋于一条直线。 此外，考察了不同温度下尿素和s d s 对胶原多肽溶液粘度的影响。结果表明： 胶原多肽水溶液在温度比较低时由于氢键的作用，主要以三股螺旋结构存在，随 着温度的升高，胶原多肽分子发生从螺旋到无规线团的转变，到大约3 0 0 c 时， 完成解螺旋，该过程为热可逆过程。尿素的加入降低了完全解螺旋的温度。表面 活性剂s d s 增强了胶原多肽分子的疏水作用，使其发生分子内折叠。 根据修正后的粘度公式，编写出计算程序，对得到的实验数据进行计算，得 到胶原多肽特性粘数h 及毛细管内壁界面参数l m 、k 和b a r ，结果表明：胶原多 肽在水溶液的特性粘数随温度增加而减小；在乙醇水混合溶剂中的特性粘数随乙 醇浓度的增加先减小后增大再减小，均与实验值相吻合。计算得到的毛细管有效 吸附层厚度比胶原多肽分子在溶液中的实际尺寸大的多，说明溶液中流动的 胶原多肽分子与毛细管壁上吸附的胶原多肽分子链之间存在一个排斥层。 关键词：胶原多肽；粘度；构象；反聚电解质性质；聚电解质效应：吸附 山东轻t 业学院顾l 学位论文 a b s t r a c t i nt h i s p a p e rw es u m m a r i z e dt h er e s e a r c hp r o g r e s so fv i s c o s i t yb e h a v i o ro f p o l y m e rd i l u t es o l u t i o na n dc o n f o r m a t i o no fg e l a t i n v i s c o s i t yo fg e l a t i ns o l u t i o n sw i t h c o n c e n t r a t i o n sb e t w e e n10 4a n d10 - s 管矗a n dd i f f e r e n ts o l u t i o ns y s t e mw e r es t u d i e d s y s t e m a t i c a l l yv i aah i g h p r e c i s i o np h o t o e l e c t r i cv i s c o m e t e r , c o v e r i n gt h ee x t r e m e l y d i l u t ez o n e s o u rm a i nf i n d i n g sa r ea sf o l l o w s ： t h ef l o wt i m eo fg e l a t i na td i f f e r e n ts y s t e mw a sd e t e r m i n e d ，g e t t i n gt h es t a n d a r d d e v i a t i o no ft h ef l o wt i m e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：g e l a t i ns o l u t i o nw a su n s t a b l ei nt h e c o n c e n t r a t i o no fd i l u t ea n de x t r e m e l yd i l u t er a n g ea t 15 o c t h i sm a yb ed u et o c o i l h e l i xt r a n s f o r m a t i o no fg e l a t i nm o l e c u l e sr e s u l t i n gb ye l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s b e t w e e nc h a r g e da m i n oa c i d s ，h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n sa n d h y d r o g e nb o n d i n g b e t w e e np e p t i d eb o n d s m 地s t a b i l i t yo fg e l a t i nc a nb ee n h a n c e db y e l e v a t i n g t e m p e r a t u r e ，a d j u s t i n gp h p ia n da d d i n gl o wc o n c e n t r a t i o n so fe t h a n o l ，a n dt h e s t a b i l i t yi nt h el o wc o n c e n t r a t i o ni sb e t t e rt h a ni nt h eh i g hc o n c e n t r a t i o n s o l u t i o np r o p e r t i e so fg e l a t i nw e r es t u d i e dw i t hd i f f e r e n tp ha n dc o n c e n t r a t i o n s o fs a l ta t4 2 0 1 2v i av i s c o m e t r y mr e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e d u c e dv i s c o s i t y ( 叼s p c ) o fg e l a t i nr e f l e c t e dh u m p s h a p e dc h a n g e sw i t hp h ，a n dt h em i n i m u mv a l u eo f v i s c o s i t yw a sa tp h 2 5 0 ，c o r r e s p o n d i n gt oi t si s o e l e c t r i ep o i n t , w h e r eg e l a t i ne x h i b i t e d a n t i p o l y e l e c t r o l y t eb e h a v i o r , r e d u c e dv i s c o s i t ym s ) i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n so fn a c l ，b u to nc o n t r a r yb e t ha b o v ea n db e l o wt h ei s o e l e c t r i cp o i n t t h er e d u c e d v i s c o s i t yo fg e l a t i n e x h i b i t e dad r a s t i ci n c r e a s ew i t h d e c r e a s i n g c o n c c i l t r a t i o n ( c ) i nt h ee x t r e m e l yd i l u t ea q u e o u ss o l u t i o n s ，w h i e hi sat y p i c a l p o l y e l e c t r o l y t ee f f e c t h o w e v e r , t h eu p s w i n gw a si n h i b i t e dw h e nt h en a c li sa d d e d ， a n dt h er e d u c e dv i s c o s i t yc u r v er e n d e r e da sa s t r a i g h tl i n ei n0 5 mn a c l i no r d e rt og e tm o r ei n f o r m a t i o no nt h ec o n f o r m a t i o no fg e l a t i n ，t h et e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e so ft h er e d u c e dv i s c o s i t yo fg e l a t i ns o l u t i o n si nw a t e r , o 0 2 ml f f e aa n d 6 1o 珥ms d sw e r ed e t e r m i n e di nt h et e m p e r a t u r er a n g ef r o m15 0t o4 2 0 0 c t h e r e d u c e dv i s c o s i t yv a l u e sa td i f f e r e n t t e m p e r a t u r e si n d i c a t e d t h a tt h eh e l i x - - c o i l t r a n s i t i o nd i m i n i s h e do re v e n t u a l l yt e r m i n a t e da ta r o u n d3 0 0 0 c ，i n d i v i d u a lg e l a t i n c h a i n su n d e r w e n tac o i l t o h e l i xt r a n s i t i o na st h et e m p e r a t u r eo fs o l u t i o nf r o m4 2 0t o 15 o o c h o w e v e r , t h eh e l i x - - c o i lt r a n s i t i o nd i m i n i s h e da ta r o u n d2 0 0 0 cw i t ha d d i n gt o 1 1 r e a h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n sc a u s e dt h ec l a a i nf o l d i n gi nt h ep r e s e n c eo fs u r f a c t a n t a b s t r a c t s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e b a s e do ne q u a t i o nw i t hi n t e r f a c ee f f e c tc o r r e c t i o n , ap r o j e c ta n dap r o c e d u r ef o r d i s p o s i n go fv i s c o s i t yd a t aw e r ep r o p o s e d v i s c o s i t yd a t ao fg e l a t i n - w a t e rs y s t e ma t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sa n dg e l a t i n - w a t e r - e t h a n o ls y s t e mw e r ed i s p o s e db yt h ep r o c e d u r e a n dt h ec o r r e s p o n d i n gv i s c o s i t ya n di n t e r f a c ep a r a m e t e r sm 】、k m 、ka n db e f rw e r e o b t a i n e d i tw a sf o u n d ，【1 1 】o fg e l a t i ni ns o l u t i o nd e c r e a s e d 、) l r i mi n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e ， a n dt h e r ee x i s t e dt h em i n i m u ma n dm a x i m u m 、析t l li n c r e a s i n go fe t h a n 0 1 t h er e s u l t s w e r ec o n s i s t e n tw i t ht h ee x p e r i m e n t a lv a l u e f r o mt h ea n a l y s i so fv a r i a t i o no fa d s o r b e d t h i c k n e s sw i t hc a p i l l a r yr a d i u s ，t h a tt h e r ee x i s t e dar e p u l s i v el a y e rb e t w e e np o l y m e r c h a i n so ff l o w i n gs o l u t i o na n da d s o r b e dp o l y m e rc h a i n s k e y w o r d s ： g e l a t i n ；v i s c o s i t y , c o n f o r m a t i o n ； a n t i p o l y e l e c t r o l y t e b e h a v i o r ； p o l y e l e c t r o l y t ee f f e c t ；a d s o r p t i o n i l 山东轻工业学院硕1 ：学位论文 第1 章绪论 胶原是动物组织的一种结构蛋白，约占动物体蛋白总量的1 4 t 1 1 ，是由动物细 胞合成的一种生物高分子，广泛地存在于动物的骨、腱、皮肤及其它结缔组织中， 具有支撑器官、保护机体的功能。对于胶原蛋白的研究，可以分为两个大的方面： 结构及性质的理论研究【2 l 和生物材料【”】及工业方面的应用研究。在理论研究方 面，人们通过研究胶原结构性质，了解胶原构象与功能的关系，为生命科学、医 学、皮革等领域提供理论依据和指导；在工业应用方面，人们通过各种手段改进 胶原的物理化学性质，使之成为具有良好生物兼容性的应用材料。近年来，随着 胶原提取技术的发展，人们对其结构、性质的研究逐渐深入，对胶原生物功能的 认识日益提高，其以良好的生物兼容性已经在食品、纺织、化妆品和生物医学材 料等多个领域发挥着巨大的作用，具有广泛的发展前剽1 0 1 2 1 。 1 1 胶原蛋白分子结构 到目前为止，至少发现t 2 7 种胶原蛋白( i x x v i i 型) ，另外有报道说2 0 多种其 他蛋白质中也含有胶原状结构区域【1 3 d 4 】。早在1 9 3 8 年a s t b u d ，【1 5 1 就提出胶原是由3 条链共用螺旋轴而组成三股螺旋结构，p a u l i n g 和c o r e y 1 6 】也提出相同意见，但是这 种猜想与胶原纤维x 衍射图的结果不一致；r a m a c h a n d r a n 和k a r t h a t l 7 2 0 】在1 9 5 4 年通 过观察胶原纤维的x 射线衍射图，得到更精确的螺旋参数证明每个螺旋回合的氨基 酸接近3 3 3 而不是3 ，于是他们验证了胶原是卷曲螺旋的三股螺旋结构，由3 条左 旋的0 【链经右手螺旋绞合而成。三股螺旋的分子量约为3 0 0 k d t 2 1 1 ，其中每条q 链含 1 0 5 2 个氨基酸残基，a 链有一个很明显的特征是，它i 由g l y - x - y 重复单元组成，一 般x 为脯氨酸，y 为羟脯氨酸；组成胶原蛋白的仪链有2 条不同的，甚至有3 条不同 的，分别用仅1 、0 【2 、a 3 表示。 胶原多肽是由动物的结缔或表皮组织中的胶原部分水解而获得，为无色或淡 黄色透明、半透明的薄片或微粒，是个聚多肽链。胶原多肽分子的化学组成如下： 甘氨酸占2 6 ，丙氨酸和精氨酸以1 ：1 的比例共同占2 0 ，脯氨酸为1 4 ，谷氨酸 和羟脯氨酸也是以1 ：l 的比例共同占2 2 ，天门冬氨酸6 ，赖氨酸5 ，缬氨酸、 亮氨酸、丝氨酸均占2 ，其余异亮氨酸和苏氨酸等共占1 。根据制备过程的不同， 将胶原多肽分为a 型和b 型胶原多肽，a 型为酸解胶原多肽，其等电点为9 0 左右； b 型为碱解胶原多肽，等电点在5 0 左右瞰2 3 1 。 第l 章绪论 1 2 胶原多肽构象的研究方法 1 2 1 荧光光谱法 荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种有效方法。它能提供包括激发光谱、 发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，通过 对这些参数的测定，可以推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化，从而阐明蛋 白质结构与功能之间的关系。荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、 方法简便等优点。蛋白质荧光光谱技术的研究方法主要有：荧光猝灭或增强法、 荧光共振能量转移法、同步荧光光谱法和三维荧光光谱法等。 ( 1 ) 荧光猝灭法 1 在蛋白质分子中，能发射荧光的氨基酸有色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 以及苯丙 氨酸( p h e ) 。有的蛋白质含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸，其自身具有荧光，即“内 源荧光，而且t r p 残基对微环境的变化很敏感，并且大多数蛋白质中都含有几个 不同种类的t r p 残基，因而常作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象； 对于那些本身没有荧光或荧光很弱的蛋白质，可以利用“外源荧光 ，即荧光探 针法来研究蛋白质分子构象的变化。 荧光淬灭指由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起的 荧光强度降低的现象。淬灭都需要荧光基团与淬灭剂分子之间的接触，故淬灭研 究可以揭示荧光基团在蛋白质中的位置及淬灭剂对它们的渗透程度，因而可以判 断其是动态还是静态猝灭，进行荧光寿命的测量；还可以计算出结合常数、结合 位点数、淬灭常数、荧光给体受体间的距离以及确定溶质与蛋白质问的作用力。 在利用外源荧光探针研究蛋白质分子构象中多数情况下是利用探针的荧光增强现 象【2 4 1 ，而对荧光猝灭现象的利用较为少见，魏【2 5 】等用邻菲罗啉作为荧光探针研究 了核酸对其的荧光淬灭，建立了一种新的思路。 ( 2 ) 荧光共振能量转移法 能量转移现象，即为内源发色基团发生荧光淬灭和外源发色基团发生荧光敏 化的现象。1 9 4 8 年，f o r s t e r 对于这种实验现象提出了偶极偶极相互作用发生能量 转移的理论。给体分子与受体分子之间发生无辐射能量转移必须满足下述三个条 件：( 1 ) 给体本身必须能发荧光，( 2 ) 给体的荧光光谱与受体的吸收光谱应满 足相当程度的光谱重叠，( 3 ) 给体与受体之间的距离应足够靠近。通过观测能量 转移现象，可以得到很多蛋白质分子的结构信息，特别是可以应用于溶液中分子 的微区结构分析【2 6 j 。 共振能量转移技术对生物大分子结构的分析在溶液中进行，无需复杂的结晶 等样品处理步骤，因而快速、灵敏，同时与x 射线晶体衍射法相比，其测定结果 更能反映生物大分子结构与功能问的关系。 2 山东轻工业学院硕十学位论文 共振能量转移技术可以轻松地分析生物大分子三维结构及特定位点间距离。 ( 3 ) 同步荧光光谱法 同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长的情况下来测绘荧光光谱图。与 普通的荧光技术相比，同步荧光技术具有简化谱图、提高选择性、减少光散射干 扰等特点，适用于分析光谱互相重叠、不易分辨的多组分混合物。 由a ；l - - 1 5 r i m 所得到的同步荧光仅显示蛋白质酪氨酸残基的光谱特征，保持 九= 6 0 n m 作出的同步荧光光谱仅表现出色氨酸的荧光。同步荧光的最佳九难以选 择，解决这一难题的方法就是三维同步荧光光谱法。应该指出的是，共振光散射 法( r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，r l s ) 和同步荧光光谱的原理是一致的。r l s 技术是 一种高灵敏度的分析测试新技术，在普通荧光光度计上选择合适的激发和发射通 带宽度，采用相等的激发和发射波长，同时扫描激发单色器所得的同步光谱( 即 瑚) ，即为散射粒子的共振散射光谱。由于散射光谱中蕴藏着物质结构与含量的 信息，所以r l s 已用于蛋白质构象的研究中。唐【2 7 】利用共振光散射( r l s ) 技术，研 究了不同p h 溶液中胶原多肽分子的构象。结果表明，在p h 接近等电点时，胶原多 肽分子收缩，结构相对紧密，r l s 强度最大；p h 偏离等电点，胶原多肽分子由于 质子化或去质子化作用而带电，静电斥力使肽链伸展，r l s 强度降低。 ( 4 ) 三维荧光光谱法 三维荧光光谱法是由激发波长轴) 发射波长( x 轴) 荧光强度( z 轴) 三维坐标 所表征的矩阵光谱，通常具有较高的选择性。国内的鄢【2 8 】等人首次将三维荧光光 谱法用于测定溶液状态下蛋白质的构象。该方法能够较直观地表t j y j t r p 残基在蛋白 质分子中的微环境及其在不同条件下的构象变化，因而可望得到广泛的应用。 除了以上这些荧光光谱法外，还有一些新的基于荧光光谱的新方法。如荧光 偏振法、时间分辨和相分辨荧光分析法等。 1 2 2 红外光谱法 对于红外光谱，每种氨基酸残基都是发色团，它适用于不同状态、不同浓度 及不同环境中蛋白质和多肽的测定。红外光谱一般主要研究其中的酰胺i ( 1 7 0 0 , - - , 1 6 0 0 c r f f l ) 和酰胺i i ( 1 6 0 0 1 5 0 0 c m 1 ) 谱带。红外光谱中应用二阶导数谱结合去卷积 和曲线拟合等处理方法【2 9 1 ，可以定量地计算出蛋白质的二级结构。黄3 0 】等对胶原、 胶原c a c l 2 、胶原羟基磷灰石等几种体系的红外光谱进行了比较研究。发现胶 原矿化后，红外光谱中胶原的酰胺i ，i i ，带的吸收强度显著降低，i i ，带 接近消失，i 带发生红移现象。提出胶原中的羧基( c o o h ) 、羰基( c o o 。) 为胶原 矿化的两类成核位点，钙盐在成核位点上结晶。 在红外光谱的基础上，1 9 8 6 年i s a on o d a 首先提出7 - - 维红外光谱的概念【3 1 1 。 二维红外光谱不仅能够提供由温度变化引起的蛋白变性过程中结构动态变化的微 3 第l 章绪论 观信息，并且比传统的傅立叶红外光谱法和做二阶导数谱和去卷积谱能够提供更 多的信息。 肖1 3 2 j 等应用二维红外光谱研究了胶原多肽在加热( 1 5 9 5 ) 条件下构象变 化的规律。结果证明胶原多肽原蛋白三股肽链之间的氢键减弱，逐渐解螺旋，每 条肽链因伸直其螺旋度减少，整个蛋白的无序结构增加。 1 2 3 拉曼光谱法 拉曼光谱的原理和机制都与红外光谱不同，红外光谱为吸收光谱，拉曼光谱 则是散射光谱。但拉曼光谱提供的结构信息却与红外光谱类似，且二者可以互相 补充，因为，有些官能团的振动在拉曼光谱能观测到，在红外光谱中则很弱，甚 至不出现，而另一些基团的振动，在拉曼光谱中很弱，甚至不出现，在红外光谱 中则可能是强吸收带，只有采用这两种光谱方法，才能得到振动频率的全貌。董【3 3 j 等应用拉曼光谱研究了不同温度下的i 型胶原多肽。给出了拉曼谱线强度的温度 依赖性，从中得到4 个变性温度4 2 ，6 8 ，o 和9 0 ，其中4 2 ，6 8 与d s c 和s h g 的 测量结果一致。可见，激光拉曼谱线的变化能提供胶原多肽结构改变的微观信息， 拉曼光谱在测量生物材料的变性特性方面比其他检测手段更方便、准确、有效。 1 2 4 圆二色谱法 蛋白质的圆二色性可对其峰位做定性分析，再结合f a s m a n 概率统计原则可对 蛋白质各构象进行定量分析。圆二色光谱是目前应用最广泛的测定蛋白质二级结 构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。王【3 4 】 等通过圆二色谱法对水解胶原在不i - d j p h 条件下0 c 螺旋等构象的变化及不浸酸铬 鞣剂与水解胶原作用后对胶原构象的影响。结果表明，在高p h 值条件下，o 【螺旋 结构有所降低，反平行1 3 折叠片结构有所增加趋势。水解胶原在p h = 4 6 时，与不浸 酸鞣剂作用，其仅螺旋结构数量均减少，无规卷曲增加明显，水解胶原较稳定的 氢键结构减少。在高p h 条件下，不浸酸铬鞣剂的加入，无规卷曲结构变化不大， 但平行p 一折叠增加明显。y a n g 等【3 5 】应用圆二色谱研究t o l y - p r o a r g 对胶原状三股 螺旋结构稳定性的贡献，发现g l y - p r o a r g 和g l y - p r o h y p 起到同样的稳定作用，其 用同样的方法研究了非极性残基【3 6 1 、离子对【3 7 】和离子化残基【3 8 1 对胶原三股螺旋结 构稳定的影响。 1 2 5 原子力显微镜法 原子力显微镜( a f m ) 是一种可以在实空间观察到原子级分辨率图像的实验仪 器，通过它可以观察到单个原子在物质表面的排列状态。a f m 探测针尖和被测样 品之间的相互作用力，不受样品导电性的影响，可在大气条件下以高倍率观察样 品表面，且不需要进行任何表面处理，可得到样品表面的三维形貌，因此得到了 4 山东轻工业学院硕士学位论文 广泛的应用。 暨南大学王蔡【3 9 枷】利用原子力显微镜( a r m ) 成像技术先后研究了猪和牛皮的 i 型胶原在溶液中的聚集行为，观察了胶原溶液在u v b 照射前后形态的变化。钟 等【4 1 】应用原子力显微镜研究了鱼鳞胶原蛋白在不同溶液条件下的聚集行为。 综上所述，以上方法各有其优缺点，但是对于溶液中蛋白质构象的研究都具 有很大局限性，比如红外和拉曼光谱法及原子力显微镜受样品制备的限制，不能 准确反映胶原多肽在溶液中的构象；荧光光谱由于只有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨 酸发光，只能反映的胶原多肽的局部构象变化，而且胶原蛋白中酪氨酸和色氨酸 的含量非常低，所以此方法不适用于极稀溶液胶原多肽的构象研究。我们应用粘 度法研究水溶液中胶原多肽构象的变化，这种方法能很好的反映胶原多肽在溶液 中的整体构象改变。 1 2 6 粘度法 高分子溶液的粘度研究不仅可用来测定聚合物的分子量，而且也可用来研究 高分子在溶液中的构象变化、高分子链的无扰尺寸、柔顺性等。 ( 1 ) 高分子溶液粘度表示法 在高分子溶液中，我们对液体的绝对粘度不感兴趣，感兴趣的是高分子进入 溶液后所引起的溶液粘度的变化。 相对粘度( r r )仉= 一r ( 1 1 ) 吼 式中刁溶液粘度 纯溶剂粘度 ，7 ，表示溶液粘度相对于纯溶剂粘度的倍数。 比浓粘度( ，7 印)= 仉- i ( 1 2 ) 表示在溶液粘度比纯溶剂粘度增加的比数。 比浓增比粘度0 - 型 ( 1 3 ) 表示浓度为c 的情况下，单位浓度增加对溶液增比粘度的贡献。单位为c ，即 m u g 或lo o m l g 。 特性粘数 ，7 】 b 1 = 贻c ( 1 4 ) 特性粘数 刁】，它是指溶液浓度趋近于无限稀释时的比浓增比粘度，其数值不 随浓度而改变，在规定的高分子及溶剂中，此值决定于单个高分子的结构及分子 量。 ( 2 ) 胶原多肽溶液的粘度研究 2 0 世纪2 0 年代，d a v i s 4 2 】发现胶原多肽溶液粘度与其放置时间、 h i + 浓度、 s 第l 章绪论 胶原多肽浓度有关，其粘度随放置时间而增加，在2 4 h 内达到最大值后粘度逐渐 下降，他认为胶原多肽粘度的下降是由细菌降解引起的。到9 0 年代，j i r i l 4 驯也发 现胶原多肽水溶液粘度在低温下随放置时间而增大，但是没有出现最大值：而且 发现胶原多肽在水溶液中的粘度随其浓度的减小而出现上弯现象，但是在k s c n 溶液中成线性关系，其解释为聚电解质效应。最近，d o m e n e k l 4 4 在研究胶原多肽 溶液粘度行为时，同样发现其在水溶液稀浓度区粘度出现上弯现象，但是在醋酸 缓冲液中其稀浓度区粘度上弯现象有所减弱，他认为这就是明显的聚电解质效应。 为了探索胶原多肽溶液粘度反常行为的原因，c h e n g 4 s 研究了不同温度下极稀胶 原多肽溶液的粘度反常行为，并用吸附学说对其反常行为进行解释。正由于胶原 多肽溶液粘度的异常行为，导致其在极稀浓度区的粘度研究报道甚少。 1 3 胶原多肽溶液的聚集行为 在过去2 0 年，带电的合成或生物大分子在水溶液中的凝聚得到了广泛的研究 7 】。综合前人所做的研究，可以将凝聚分为简单和复杂两种凝聚过程。比如， 加入盐或醇类促进聚电解质的凝聚属于简单凝聚；两个带相反电荷的大分子或一 个聚电解质和一个带相反电荷的胶体通过联合相互作用而聚集叫复杂凝聚【4 引。 k o k u f u t a 4 9 1 对凝聚的相关特征进行了很详尽的总结，他认为聚集的过程即为带电大 分子溶液经过液液相分离从而产生高分子富集的浓相的过程。稀相和浓相不兼容 也不混溶，而且可以保持两相平衡。必须指出的是，这里的凝聚和沉淀不一样。 凝聚是大分子超级富集，其与上清液可以达到相平衡。蛋白质聚电解质体系是胶 体聚电解质聚集的特殊情况。在这个体系中主要是因静电力而导致凝聚，因此聚 电解质所带电荷必须足够多才能产生静电相互作用从而使其聚集，但是不能太大， 否则就发生沉淀。对蛋白质凝聚的研究，不仅为了解其蛋白质结构提供基础，而 且为蛋白质相关的工业过程提供实际应用。 胶原多肽是研究简单凝聚的理想原料。到目前为止，研究胶原多肽简单凝聚 的报道还比较少，但是研究胶原多肽与阿拉伯树胶和a 型与b 型胶原多肽间的聚集 的比较多 s o - 5 1 1 。 v e i s a r a n y i t 5 2 】基于a 型与b 型胶原多肽间的聚集提出了稀相聚集模型。关于聚 集的相关理论模型还有o v e r b e e k v o o m i s 3 】、n a k a j i m a - s a t o t 5 4 1 和t a i n a k a t 5 5 】模型。 o v e r b e e k - v o o m 模型主要用于估算体系的总自由能，包括胶原多肽分子带电基团间 的静电自由能和溶质与溶剂相互作用的混合自由能，b u r g e s s i s 6 研究表明胶原多肽 与阿拉伯树胶间的聚集适合此模型。以上模型均基于复杂聚集而提出的，所以比 较适合用来解释复杂聚集的实验现象。对于简单聚集，比如d e i b e r i s r 在研究极稀胶 原多肽溶液的聚集时采用t s m o l u c h o w s k i 聚集理论来分析实验数据。 6 山东轻丁业学院硕f ：学位论文 b o h i d a r 58 】应用浊度法研究胶原多肽的简单聚集表明，聚集与温度、p h 、离子 强度等因素有关；b u n g e n b e r g i s 9 】研究表明聚集还与分子量、聚离子浓度及分子无 规蜷曲构象有关。 蔡等( 3 9 】应用原子力显微镜研究了不同种属和不同浓度一型胶原的微观结构， 结果表明即使浓度很低时( 3 2 1 x g m l ) ，在溶液中也未能以单体形式存在，而是单体和 聚集体共同存在；钟等【4 i 】在研究鱼鳞胶原多肽时也发现同样的现象，即i o l x g m l 下都鱼鳞胶原多肽同样以单体及聚集体形式共存。这说胶原多肽原分子间很容易 发生聚集。 1 4 高分子溶液及粘度异常行为 在2 0 世纪2 0 年代，德国化学家s t a u d i n g e r 为了证明高分子是由小分子通过 共价键而组成的线性化合物的假设，率先对高分子溶液的粘度进行了研究。事实 上，早期的高分子溶液研究的目的是建立分子量测定或分子表征的方法，到目前 为止高分子溶液理论已相对成熟。高分子不能以气体状态存在，因此单一高分子 表征只有在分子间完全分离的稀溶液下进行，这就是重点研究高分子溶液性质的 原因。 1 4 1 高分子溶液浓度区域 高分子溶液的性质随其浓度的不同有很大的变化，所以其浓度分区问题是高 分子溶液理论和实验研究的重要课题。上个世纪3 0 年代，s t a u d i n g e r 首次提出了高 分子溶液的临界浓度概念，并指出物理性质发生不连续变化的浓度为临界浓度。 至7 0 年代初8 0 年代末，g e n n e s 6 0 提出了明确的高分子溶液结构物理图象( 如图1 1 ) ， 这使高分子溶液理论在这一方面有了突破性的进展，它不仅说明其他理论无法解 释的实验事实，而且还预测了很多高分子应具有但是还未进行实验研究的性质。 他根据不同浓度下溶液性质的不同，把高分子溶液划分为稀溶液、亚浓溶液和浓 溶液，从稀溶液到亚浓溶液的分界浓度是接触浓度c ，从亚浓溶液到浓溶液的分 解浓度为交叠浓度c + 。 在稀溶液区，c c + 时，高分子线团相互穿透，交叠的程度随浓度的增加而增大。到c = c + 时， 整个溶液各处的链段密度相等，在c + 以上，溶液各处的链单元密度值将与密度成 正比，逐渐增加。1