（环境科学专业论文）高效复合菌降解氯代苯胺类化合物的特性研究.pdf

a b s t r a c t c h l o r i n a t e da r o m a t l ch y d r o c a r b o n sa n dt h e l rd e r l v a t i v ea r ec h e m i c a lm a t e r i a l s ， i n t e 册e d i a t ep m d u c t so fo 唱a 1 1 i cc o m p o u i l d sa n do 曙a n i cs o l v e n t sw h i c ha r ew i d e l y a p p i i e di ni n d l l s t r y ，s u c ha sc h e m i c a l ，m e d i c i n e ，c u r r y ，e l e c t r o na r ds oo n m o s to f 山e ma r cp e r s i s t e n ti nt h ee n v i r o n m e m t h e ya r et o x i ct oa q u a t i co r g a n i s m s ，a 1 1 d n o n r e a d yt ob eb i o d e g r a d e db ym em i c r o o 唱a n i s m si nn a t u r ew a t e la tp r e s e n t ，m a n y r c s e a r c h e sh a v e b e e nd o n ea b o u tt h eb i o d e 掣a d a t i o no fc h l o r i n a t e da r o m a t i c h y d r o c a r b o n s h o w c v e r ，m e r e盯ef c wr e p o r t sa b o u t 此 b i o d e g r a d a b i l i t y o f c h l o r o a j l i l i n e s i ti s v e r yi m p o n a n tt op r o t e c tw a t e rr c s o l l r c e s t o s t u d y t l l e b i o d e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i co f c l l l o r o a n i l i n e s d o m i n a i l tm i x e db a c t e r i a w h i c hw a sa b l et o 嘣l i z ec h l o r o a n i l i n e sa ss o l ec a r b o n s o u r c e ，w a si s o l a t e d ，i n c u b a t e da i l dd o m e s t i c a t c df r o mt h ea c t i v a t e ds l u d g ec o l l e c t e d f 沁mm er e t u m e ds l u d g ew e l lh o l ei nm ei n d u s t r i a lw a s t e w a t e rt r e a t l i l e n tp l a n to f l 舀s ep e 订o c h e m i c a lc o m p a n y b yi d e m f i c a t i o n ，m ed o m i n a n tm i x e db a c t e r i a i n c l u d e df o u rk i n d so fb a c t e r i a ，w 1 1 i c hw e r e 订历。所d n 船，爿如口z 喀p 甩p 只p f b “幽埘d 门船 a n d4 c f 加d 慢弦p m c e d 已门d c d 瑚nb yb a c t e r i a 伊o w t h i r l l l i b i t i o ne x p 硎m e n t ，i th a s b e e ns h o w nt h a tm ei s o l a t e dm i x e db a c t e r i aw e r em o r et o l e r a n tt oc 1 1 l o r o a n i l i n e st h a n t h eb a c t e r i a 行o mn a t u r ew a t e r ( y h 舀z e 鼬v e r ) ，a n da f k rm ed o m e s t i c a t i o nw i t h a 1 1 i l 血ea n d2 一c h l o r o a n j l i n es e l e c t i v em e d i u m t 1 1 et o l e r a t i o no fd o m i n a n tm i x e d b a c t e r aw a si m p r o v e de v i d e n t l y t h eb i o d e g r a d a b i l i t yt ot l l ec h l o m a n i l i n e su s e dt h ed o m i n a j l tm i x e db a c t e r i aa s d e g r a d a t i o nm i c r o o r g a n i s mb yl a b o r a t o r ys i m u l a t i o nm e m o d t h er e s u l ts h o w e dt h a t d o r n j n a n tm i x e db a c t e r i ad o m e s t i c a t e d 、i t ha n j l i n ea n d2 一c h l o r o a n j l i n ew a sa b l et o u m i z e3 一c h l o m a l l i l i n e ，4 一c h l o r o a i i i l i n e 鲫d2 ，4 一d i c h l o r o a n i i i n ea ss o l ec a r b o ns o u r c e a 1 1 de n e 唱ys o u r c e h o w e v er ，2 一c h l o r o a n i l i n e ，w h i c hw a su s e dt od o m e s t i c a i et | l e d o m i n a mm i x e db a c t e r i a lw a st 1 1 em o s te a s i l yt ob eb i o d e g r a d e d ，w h i l e4 一 c h l o r o a l l i l i n e 啪s 山em o s td i m c u l t l yt ob eb i o d e g r a d e d t h eb i o d e g r a d a t i o nr a t eo f 2 ，4 - d i c l l l o r o a r i i l i n ei sh i 幽e r t h a t l3 - c h j o m 趾i l m ea 1 1 d4 - c h l o r o a i l i l i n e c o m p a r e dw i t he x i s t e n c el o n c ly ，w h e n2 一c h l o r o a i i i l i n ea n d2 ，4 一d i c h l o r o a n i l i n e c o - e x i s t i n 昏2 ，4 一d i c h i o r o a i l j l i n ew o u l di n h i b i tt l l eb i o d e 静a d a t i o no f2 - c h l o m a l l i l i n ei n t h ei n i t i a ls t a g e b u ti tw o u l dn o th a v ean o t a b l ee 行色c to nt h en n a lb i o d e g r a d a t i o nr a t e o f2 一c h l o r o a n i l i n e ，h o w e v e r t h eb i o d e g r a d a t i o nr a t eo f2 ，4 一d i c h l o m a n i l i n ew a s i m p r o v e do b v i o u s l yb e c a u s eo ft h ee x i s t e n c eo f2 一c h l o r o a l l i l i n ew h i c hw a sm o r e i l 学位论文独创性声明： 本人所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同事对本研究所做 的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如不实，本人负全 部责任。 论文作者( 签名) ： 虱矗苤娜年厂月，。日 ( 注：手写亲笔签名) 学位论文使用授权说明 河海大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光 盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件或电子文档，可以 采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅。论文 全部或部分内容的公布( 包括刊登) 授权河海大学研究生院办理。 论文作者( 签名) ： 童i 至篮 一肿 月，。日 ( 注：手写亲笔签名) 河海大学硕：l 毕业论文高效复合菌降解氯代苯胺类化合物的特眺研究 l 绪论 众所周知，水是人类的生命之源，生存之本。然而，随着近年来经济的高速 增长和城市化水平的不断提高，城市水体污染状况日趋加重，不仅严重破坏了城 市景观，而且危害人类健康。水资源的匮乏加之水环境的污染，成为当今 ! ；! = 界面 临的最大的问题之一。如何消除城市污染水体对生态系统及人类健康的影响日益 迫切地提上日程。 1 1 氯代芳烃的污染状况及主要来源 据统计，目前世界各大水体中已检出的有毒有害有机化合物的总数达2 2 2 1 种，仅饮用水中就有7 6 5 种之拶“。氯代芳烃是一类污染面积广、毒性较大的化 合物，不仅对水生生物的毒性很强，易于在生物体内富集和累积，而且通过自然 水体中的微生物降解作用很难消除其影响【2 ，3 1 。该类污染物能在环境中高度持留， 对生态环境和人体健康构成威胁。水体中氯代芳烃的污染现象在欧美乃至世界各 国都有报导【4 ，5 1 。在美国环保署( e p a ) 所列的1 2 9 种优先污染物中氯代芳烃类 化合物占2 5 种之多，受到人们的日益关注。 氯代芳烃的来源之一是工农业生产各个环节的产品或中间产物。如多氯联 苯，很多国家都曾大量生产，从润滑剂到可塑剂，从印刷机油墨成分到电容器、 变压器等电子器材的散热剂，其应用相当广泛。而具有较高持久性和强毒性的氯 代苯类是重要的有机化工原料，广泛用于农药、医药、材料合成等行业。氯代酚 类长久以来被广泛应用于术材防腐、防锈剂、杀真菌剂和一般杀虫剂等的生产中。 氯代苯胺类化合物则在杀虫剂、染料、塑料和药物等的合成中大量使用，另外， 除了直接进入自然界的氯代苯胺类化合物外，它又是氯代硝基芳烃类化合物和除 草剂( 如苯胺甲酸酯、某酰苯胺) 的常见中间代谢产物 6 】。 氯代芳烃的另一个重要来源是饮用水氯化处理过程中的某个环节。饮用水加 氯消毒技术起源于】9 0 8 年，至今已有近百年的历史。但随着当今水体中可溶性 有机化合物含量的增加，氯化消毒在某些有机污染物存在的条件下有可能产生一 些严重危害人体健康的氯化副产物。我国1 9 9 1 年一项调查表明，在给水源污染 的条件下，长期饮用加氯消毒水的人群，死于消化系统和泌尿系统癌症的危险性 明显增加【”。 水环境中氯代芳烃的第三个主要来源是一些含氯污染物的焚烧过程。焚烧过 河海大学硕：l 毕业论文 i 效复合菌降解氯代苯胺类化合物的特一盹研究 程释放到大气环境中的不完全燃烧产物，经雨雪等大气沉降过程进入地表水体。 此外，氯代芳烃还可以通过多种其它途径进入水环境。随着人们环保意识的 提高和环境科技的进步，各种污染物降解手段日新月异地发展，但一些未成熟的 降解方法在某些环节如处理不当，很可能会产生更加有害的化合物。如s a h o o 等 在对含硝基苯和少量四氯化碳的水溶液进行辐射降解时，发现了氯代苯的生成， 而当含有大量四氯化碳时则会产生多种氯代酚和氯代硝基酚等【9 1 。又如在用活 性炭构成的过滤床处理亚氯酸盐的过程中，体系中存在少量酚类或硝基酚类时， 不仅会大大减弱活性炭对亚氯酸盐的吸附，还会产生氯代酚等副产物。而当没有 活性炭参与时，亚氯酸盐和酚类是不易反应的【】。 1 2 氯代芳烃在环境中的持久性及健康影响 外源化合物进入生态系统后，其环境降解速率通常受化合物本身的物化性质 以及环境因子( 如温度、光线、水分、空气、土壤、生物体特性等) 制约。氯代 芳烃在环境中持久存在的可能原因有：由于氯代芳烃结构稳定，在自然环境中的 物理、化学或生物因子作用下，该类物质在自然环境中的降解率较慢；由于氯代 芳烃一般为半挥发或挥发性物质，在环境中有较高的迁移速率，与环境介质的作 用时间较短，加上本身的分子结构特点而表现出环境过程的稳定性；氯代芳烃在 自然界中难于发生化学降解、光降解或被微生物代谢降解，一旦排放到环境体系 中，氯代芳烃可在水体、土壤、大气和生物体中长期存在，”i 。 多数氯代芳烃具有刺激性强、易被皮肤吸收、易在生物体内积累等特点。由 于分子亲脂性高，氯代芳烃一般难溶于水，因而能够在生物体内的脂肪或蛋白质 中积累，并通过食物链的生物富集作用，在高级捕食者或消费者中成千上万倍地 累积，即产生所谓的生物放大效应。其中，化合物本身的性质，如取代基团或原 子的位置及数目等均可改变化合物在环境中与其它物质的反应活性。李玉梅等在 研究氯代芳烃对氏江水中混合细菌的生物毒性时发现，氯原子的存在，对化合物 毒性的贡献要比甲基( - - c h 3 ) 、胺基( 一n h 2 ) 更大，且氯原子取代基个数越多， 其毒性越强【l 。尤其是氯代酚类，由于具有相对较高的水溶性，对水体的污染潜 能更高。1 9 9 9 年，我国广东某水库发生大量鱼虾中毒死亡，阻塞出水的现象， 经调查证实，是由于附近山林中荔枝农大量使用除草剂五氯酚所致i l “。 具体来讲，氯代苯类具有一定的麻醉性( 当邻二氯苯平均体积分数高于1 0 0 河海大学坝士毕业沦义高效复合菌降解氯代苯胺类化合物的特性研究 时，可能会致命) ，且能刺激呼吸器官、损害中枢神经系统，引起神经障碍，在 体内积累会逐渐损坏肝、肾等器官，在潮湿环境中还有一定的腐蚀作用。 氯代酚类化合物为原生质毒物，属于高毒性物质，对一切生物个体都有毒害 作用1 1 5 】，其毒性直接影响对水的饮用和水产养殖，还可以强烈地抑制水体中其它 生物如细菌、海藻和软件动物等的自然生长速度，有时甚至会使它们停止生长。 氯代酚类对生物组织具有较强的变性作用，强烈刺激皮肤、黏膜，有腐蚀性，且 其本身在低浓度下就可散发出特殊恶臭，其毒性一般随着氯取代基的增多而增强 | 1 6 1 ”j 。一氯酚、二氯酚具有最强的刺激性，其嗅觉和味觉的阈值分别约在1 0 8 和4 1 0 1 1 f 平均体积分数) ，而这类物质的水生物致毒浓度多数只比其嗅觉阈值 稍高，少数在产生嗅觉的同时亦产生致毒作用l ”】。 氯代苯胺类化合物具有致癌、致畸、致突变作用，同时还具有麻醉作用，苯 胺对人体的血液和神经系统的毒性很强，4 氯苯胺更具溶血性；4 氯苯胺在土壤 和水体里可通过氧化聚合作用而产生较其前体物结构更复杂，毒性更大的有机化 合物。此外，多氯联苯等污染物还被列入环境荷尔蒙( 又称环境激素) 范畴，这 类化合物会通过各种途径进入动物和人类肌体，导致内分泌功能的紊乱，产生一 系列生态效应【1 9 j 。这类化合物进入人体后还会影响体内激素对免疫系统、神经系 统和内分泌系统的正常调节作用，造成对人类健康的更大危害20 1 。长期暴露于多 氯联苯会对肝脏造成伤害，同时引起氯唑疮，还会导致恶心、呕吐、黄疸和疲劳 等症状。 1 3 氯代芳烃在环境中的迁移 氯代芳烃类物质通过挥发、扩散、溶解、吸收、吸附等作用在生态系统中迁 移。其中少部分通过生物降解、光解、水解、电离等作用转化为其它代谢物质， 大部分则富集于土壤、沉积物及生物体内，对人类和动植物构成持久而严重的威 胁。氯代芳烃能够在生态系统的水体、土壤中以蒸汽形式进入大气介质或吸附在 大气颗粒物上，由于难以降解，一般通过长距离地迁移后，仍会以原化合物的形 式返回地面。正是由于浚类化合物的难降解和挥发性或半挥发性特性，使其能在 全球范围内迁移。氯代芳烃在水环境中迁移一转化模型见图1 1 【2 ”。 河海大学顺十毕业论文 i 效复台菌降觯氯代苯胺类化台物的特性研究 图1 1 ，氯代芳烃在水环境中迁移一转化的箱式模型 1 4 氯代芳烃类化合物的生物降解研究 生物处理能通过微生物作用将有毒物质转化为无毒物质，投资少，且无二次 污染，近年来已成为各国研究的热点。i f l 前，对于氯代芳烃类化合物，国内外就 微生物的富集、分离以及菌种的鉴定、化合物的降解脱氯机制、第二基质存在时 的诱导、对同类有机物的共代谢等生物降解性能进行了大量的研究 2 2 , 2 3 i ，对诱导 酶系统的特性共代谢降解等方面的研究也已起步1 2 4 1 ，为开展经济而有效的氯代难 降解有机污染物生物控制技术的研究奠定了基础。 在微生物的作用下，许多氯代芳香化合物都能产生4 i 同程度的降解，但由于 氯代程度及氯代位置的不同，其生物降解性也存在明显的差异。例如，3 氯苯甲 酸、3 氯邻苯二酚、4 一氯邻苯二酚、3 ，5 一二氯邻苯二酚等都能够作为纯培养时微 生物生长的碳源和能源，被彻底降解为二氧化碳和水，释放出无机氯离子。另一 些化合物如4 一氯联苯、l 一对氯苯基1 苯乙烷等，在它们的分子结构中，未被氯取 代的苯环被开环裂解，产生乙醛和丙酮酸，可用于微生物的生长，而被氯取代的 苯环则生成产物4 一氯苯甲酸，所以这类化合物在纯培养中虽可作为生长基质，但 只能被部分降解【25 1 。还有一些化合物，在纯培养中根本不能作为微生物的生长基 质，如一些多氯联苯，但它们在共基质混合培养条件下，主要借其它生氏基质的 4 河海大学硕：匕毕业论文高效复合菌降解氯代苯胺类化台物的特牲研究 重组技术等现代生物技术使得构建高效降解工程菌成为可能。 有研究者认为，大多数氯代芳烃类化合物的微生物降解是由质粒控制的。 w d e j o n 曲e 等从被3 - 氯苯胺和3 ，4 一二氯苯胺污染的土壤中分离得到1 2 株降解 菌，通过研究它们的相关降解质粒多样性首次证明，所有降解蔺中的相关降解质 粒都属于i n c p 1p 类质粒，进而表明，i n c p 1p 是一类在氯代芳烃类化合物的微 生物降解中起重要作用的质粒【4 。 l a t o 丌e 等通过假单胞菌属的苯胺或甲苯胺降解菌几和氯代邻苯二酚降解菌 b 1 3 进行自然基因交换，得到降解性能都有所提高的5 株杂交菌，其中菌株j l 5 对3 一氯苯胺的降解能力最强f 4 ”。 钟文辉从污水厂中分离出一菌株s s l 6 ，可利用苯酚、水杨酸等为唯一碳源 和能源，但不能利用2 ，4 二氯酚、儿茶酚、2 一氯苯甲酸等为唯一碳源生长。菌株 d t 2 4 1 1 携带有完整可降解2 ，4 一二氯酚的2 ，4 一二氯酚羟化酶基凼( d c p a ) ，作者 从d t 2 4 1 一l 上提取出这种基因片段p b s l 1 2 用肺”d 凹酶切后克隆至s s l 一6 基因 载体p k t 2 3 0 上，获得了r b s k l 1 等几十个转化子。经实验证明，新获得的： 程菌已具有很好的降解2 ，4 一二氯酚的能力。 高效工程菌具有高效、不污染环境等特点，越来越引起人们的重视，但是在 实验研究和实际应用中也发现了不少问题，关于工程菌机理的深层次问题仍属于 黑箱范畴，阻碍了工程菌技术的进一步应用和发展。 1 4 2 氯代芳烃类化合物的降解机制 氯代芳烃类化合物由于其本身的芳环结构和氯原子的存在而具有很强的毒 性和抗生物降解能力，这主要是由于氯原子的d 电子和苯环上的丌电子形成稳定 的共轭体系的缘故。同时，氯原子的存在会抑制苯环裂解酶的活性，从而增加了 它们的抗生物降解能力。并且这种抗生物降解能力随着氯原子取代位置、取代个 数的不同而变化。氯代芳烃类化合物降解的关键在于氯取代基的去除，即脱氯， 可分为氧化脱氯和还原脱氯，除了脱氯机制外，还存在共代谢机制4 w ，该机制能 够改变化合物的分子结构，使其在生物培养中更易被微生物降解。 f 1 1 氧化脱氯 氯代芳香化合物氧化脱氯是指芳香环被氧化并脱去氯取代基的过程，根据脱 氯发生的先后，脱氯过程存在两种方式：一种是先脱氯再开环，另一种是先开环 河海大学硕二l ：毕业论文南效复台茁降解氯代苯脏类化合物的特性_ i j f 究 再脱氯。 先脱氯再开环 开环前脱氯有羟基取代氯和c c l 键氧化断裂两种途径。 m i d d e l d o r p 等发现，假单胞菌具有利用4 氯苯甲酸作为唯一碳源和能源的 能力，4 氯苯甲酸的生物降解首先在羟基化酶的作用下，有分子氧存在时转化为4 一羟基苯甲酸，同时脱去一个氯离子，4 一羟基苯甲酸再氧化为3 ，4 一二羟基苯甲酸， 然后裂解开环 4 8 j ，图卜2 为对氯苯甲酸的氧化脱氯途径。 图1 2 4 一氯苯甲酸的氧化脱氯途径 c c l 键氧化断裂由双加氧酶催化完成，它是从氯代芳烃上去除氯取代基的 一个替补途径。洋葱假单胞菌矿化2 氯苯甲酸就是典型的一例 4 ”。 先开环再脱氯 氯代邻二酚是先开环再脱氯方式的一个典型代表。氯代酚氧乙酸类如2 ，4 _ d ，m c p a 等在假单胞菌属( n g “幽m o c s p ) ，节杆菌属( 一r 胁r 0 6 把rs p ) ， 黄单胞菌属( ，v 0 6 d c 把r m ms d ) 等菌种的好氰作用下都产生末端产物氯代邻二 酚，氯代邻二酚首先在氧化酶的作用下开环为3 一氯一顺，顺一粘糠酸，内酯化过程 中释放出氯离子【5 0 1 ，脱氯降解途径如图卜3 所示。 氯代芳香化合物的好氧脱氯是微生物降解的一种重要机制。很多微生物都能 在好氧条件下对大多数取代类型的氯代芳香化合物发生作用。 噼) c c 人 t c严l 怒。r 器 少一叫叫 一 2 ，4 一二氯苯胺 4 一氯苯胺 3 氯苯胺 2 氯苯 胺。由此可以看出，c l 取代基数目越多，化合物的毒性越强；当c l 取代基个数 相同时，耿代位置不同，刺其毒性也有较大影响。 f 2 ) 由研究结果可见，本研究采集的原始菌对毒物的耐受性高于自然水体中 的混合细菌；而且经选择性培养和驯化后，复合菌对毒物的耐受性又进一步提 高。 f 3 ) 由表3 1 中化合物对江水细菌和驯化后的复合菌的急性毒性，进行线性 回归分析，所得结果如图3 7 所示。 所得结果显示，化合物对江水细菌和驯化后的复合菌的急性毒性之间存在明 显的线性关系，相关系数达到0 9 6 。 河海大学顺：卜毕业论文高教复台菌降解氯代苯胺娄化台物的特性_ j 究 3 6 3 4 坦 q g3 2 盆 譬 t 3 2 8 3 63 73 83 944 14 2 - i g l c5 0 ( 江水细菌) 图3 7化合物对江水细菌和复合菌的急性毒性相关性曲线 3 4 本章小结 通过细菌生长抑制实验证明，分离得到的原始菌对氯代苯胺的耐受性高于自 然水体中( 长江) 的混合细菌；而且经苯胺和2 一氯苯胺驯化后，复合菌对毒物的 耐受性又进一步提高。化合物对江水细菌和驯化后的复合菌的急性毒性之间存在 明显的线性关系，相关系数达到0 9 6 。几种氯代苯胺的毒性( - l g l c s o ) 范围在 2 9 2 3 6 0 之问，其毒性大小顺序为：2 , 4 ，6 一三氯苯胺 2 ，4 一二氯苯胺 4 - 氯苯胺 3 氯苯胺 2 氯苯胺。 河海大学坝上毕业睑文 商效复合菌降解氯代苯胺类化合物的特性研究 4 高效复合菌对氯代苯胺的生物降解实验 4 1 实验试剂与材料 4 1 1 受试化合物 2 。氯苯胺：中国上海亨新化： 制剂厂，分析纯； 3 氯苯胺：中国上海亨新化工制剂厂，分析纯； 4 ，氯苯胺：中国上海亨新化工制剂，分析纯； 2 ，4 一二氯苯胺：美国n e wj e r s e y ，分析纯。 4 1 2 试剂 n a o h ：南京化学试剂厂，分析纯； k h 2 p 0 4 ：南京化学试剂一厂，分析纯； f e s 0 4 7 h 2 0 ：上海山海学团实验一厂，分析纯； m g s 0 4 - 7 h 2 0 ：中国上海金山化工厂，分析纯； c a c l 2 ：宜兴市化学试剂三厂，分析纯； ( n h 4 ) 2 s 0 4 ：宜兴市第二化学试剂厂，分析纯： n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ：南京化学试剂厂，分析纯： z n s 0 4 7 h 2 0 ：中国上海金山化工厂，分析纯： 甲醇：江苏汉邦科技有限公司，色谱纯。 4 1 3 实验仪器 本实验所需仪器和器皿如下： ( 1 ) 液相色谱仪：w j t e r s l 5 2 5 型，配中国江苏汉邦科技有限公司产2 5 0 4 6 m m ，l i c h r o s p h e 卜5 一c 1 8 反相柱及w a t e r s 产2 4 8 7 型双波长紫外检测器； ( 2 ) 恒温震荡器：s h a b a 型，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司； ( 3 ) 医用无菌操作台：s w c j 2 型，南通科学仪器厂： ( 4 ) p h 检测仪：j e n c 0 6 0 1 0 型，卜海任氏电子有限公司： ( 5 ) 紫外i 叮见分光光度计：u v - 1 2 0 1 型，北京瑞利公司； ( 6 ) 电子天平：f a 2 1 0 4 s 型，上海精密科学有限公司； ( 7 ) 热力蒸气压力消毒器：y x 一4 5 0 z 型，上海三申医疗器械有限公司； ( 8 ) 电热恒温干燥箱：南京实验仪器厂； ( 9 ) 冰箱：k k 2 2 e 2 8 t l 型，西门子冰箱生产工j ； 1 4 河海人学砸一l 二毕业论文l ：效复台苗降解氯代苯胺类化台物的特性研究 检测器：美国w a t e r s2 4 8 7 型双通道紫外检测器； 色谱柱：中国汉邦科技有限公司产2 5 0 4 6 m m ，l i c h r o s p h e 卜5 一c 1 8 反相柱； 流动相：甲醇水= 7 0 3 0 ( v v ) ( 当2 一氯苯胺、2 ，4 二氯苯胺共存时，甲醇 水6 0 4 0 ( v 厂v ) ) ； 流量：1 o m l m i n ： 分析波长：2 4 9 n m ： 柱温：4 0 ： 进样量：2 5u l 。 ( 3 ) 标准曲线的绘制 将氯代苯胺溶液分别稀释成实验所需的浓度梯度，用注射器抽取2 3 m 1 ， 并用孔径为o 4 5 n m 的针头式有机滤膜过滤，取2 5 山进样分析，测定其在最大 吸收波长下的峰而积，以峰面积( s ) 对其浓度( c ) 作图，即得到该化合物的 标准曲线。 ( 4 ) 生物降解实验中氯代苯胺浓度的测定 在相应的色谱条件下，测定其峰而积，利用标准曲线计算氯代苯胺的残余浓 度。 4 2 5 空白、回收率及精密度实验 ( 1 ) 空白实验 用注射器抽取2 3 m l 蒸馏水，经孔径为0 4 5 u m 的针头式有机滤膜过滤后 进行高效液相色谱分析，确认在选定化合物处有无峰形。 ( 2 ) 回收率 取蒸馏水，加入一定量的氯代苯胺储备液，使其浓度为l o m l ，用注射器 抽取2 3 m l ，经孔径为o 4 5 u m 的针头式有机滤膜过滤后注入到容积为1 0 m 1 的 比色管中，进行高效液相色谱分析，得出峰面积：然后利用标准曲线算出1 0 m g l 浓度对应的峰面积，回收率按下式计算： 回收率= 色谱分析所得峰面积 标准曲线计算所得峰面积 1 0 0 ( 2 ) 精密度 配制已知浓度的氯代酚标准液，经j l 径为o 4 5 u m 的针头式有机滤膜过滤后 河晦火学硕二| ：毕业论文 高被复台苗降解氯代苯胺娄化合物的特性划f 究 注入到容积为1 0 m l 的比色管中，连续进样5 次进行测定，计算误差值，以检测 仪器的精密度。 4 2 6 降解动力学分析 微生物转化有机化台物的速率可采用修正的m o n o d 酶动力学方程来拙述， 即： 一掣= 揣 斫 l ，l k 。+ i c i l 、7 式中：口。微生物的最大生长速率，( h 。1 ) ； 【b 卜一有效的微生物浓度，( 个l ) ： y 一微生物细胞的产量因子，即每单位浓度的有机物所产生的细胞 的浓度； 悠半饱和常数，数值上等于细菌生长速度达到最大生长速度一半 时的基质浓度； 【c 】有机物的浓度。 在典型的环境条件下，基质浓度 q 比缸小得多，方程( 1 ) 可转化为 一掣：参m 】 ( 2 ) 出。“1 、7 若口在整个反应过程中基本保持不变，上式可进一步简化为 一睾：一髓 ( 3 ) 西 、7 积分得： l i l c = 一船+ l nc 1 0 ( 4 ) 式中：c 1 瞬时氯代苯胺的贱留浓度( m 叽) ； c 厂一氯代苯胺的初始浓度( m l ) ； 卜氯代苯胺的微生物反应一级速率常数( d 。) 。 4 3 结果与讨论 4 3 1 氯代苯胺单独存在时的生物降解特性 ( 1 ) 氯代苯胺标准曲线的测定 取各氯代苯胺储备液，分别稀释到所需浓度梯度，进行h p l c 测定，结果见 图4 1 4 - 4 。 7 町海大塞麓g j j 薹萋薹妻耋蠢羹妻蒜蕊主善茸圭季乏鞋薹；主耋妻羹莓 霎4 - 1 ；喜奏善渤篓譬蒸霎窭蔓 篓零耋薹薹囊矍? 吾冀萎薹蒸蕈墓薹妻耋耋薹耋羹蓄鲢；妻l o m g l 耄l 一藿篓 翼羹萎荔囊萋窭j 薹羹茎薹耋攀塞冀銎霎薹；鎏，1 ；姜：扫叁霎枣蠢薷型囊薹萋荔= 蠡雾鬟葡一i ； 莲4 - 2 。羹奏藿薹窆薹奢 筻囊蔫霎：冀薹翼羹姜藿些鬟0 9 8 j 霎羹蚕塞塑薹。蔷鲤羹薹垂笔签名) 学位论文使用授权说明 河海大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光 盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件或电子文档，可以 采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅。论文 全部或部分内容的公布( 包括刊登) 授权河海大学研究生院办理。 河街火学坝：卜毕业埝文 高皴复台菌降解氯代苯胺类化台物的特性研究 图4 - 6 2 - 氯苯胺l d 降解谱圈 图4 72 氯举胺2 d 降解谱圈 图4 - 8 2 - 氯苯胺3 d 降解谱盟 坷海大学硕二l 毕业论文 高技复合菌降觯氯代苯胺类化台物的特性研究 图4 - 9 2 - 氯苯胺4 d 降解谱图 图4 一i o 2 氯举胺5 d 降解谱图 图4 - 1 1 2 - 氯苯胺7 d 降解谱图 4 2 河海大学顾士毕业论文 商敛复台菌降解氯代苯胺娄化台物的特性研究 图4 - 1 2 2 - 氯苯胺1 4 d 降解谱酗 根据标准曲线求出2 氯苯胺在不同时刻的残留浓度，得到2 一氯苯胺的生物 降解衄线如图4 1 3 所示。 ；| 一拍 十降解 。2l 。 图4 - 1 3 2 - 氯苯胺的生物降解曲线 采用上述同样的方法，得到3 - 氯苯胺，4 - 氯苯胺，2 ，4 一二氯苯胺的生物降解 曲线见图4 1 4 4 1 6 。 河海火学硕：i 二毕业论文 高效复台菌降解氯代苯胺娄化合物的特忡研究 o24681 0 1 21 4 时问( d ) 【刳4 1 6 2 4 氯苯胺的生物降解曲线 用线性回归分析方法对图4 1 3 叫一1 6 中实验数据进行处理，求得几种氯代苯 胺的生物降解速率常数、半衰期及最终去除率见表4 3 。 表4 3 各氯代苯胺的生物降解特性 2 氯苯胺l n c = 01 0 2 什23 2 o1 0 26 709 l 3 氯苯胺 i n c = 0 0 5 8 t + 2 3 2o 0 5 81 2 00 9 4 4 一氯苯胺 i n c = o 0 5 5 t + 16 300 5 51 2 60 9 2 2 4 二氯苯胺l n c = 一o 0 9 什1 6 3o 0 9 7 70 9 5 + k 的相对误差为0 0 2 5 4 结果表明，采用苯胺和2 一氯苯胺驯化的复合菌能分别以3 一氯苯胺、4 - 氯苯胺 及2 ，4 二氯苯胺为唯一碳源和能源进行生长代谢。几种氯代苯胺的生物降解基本 上都是在2 7 d 完成的，1 0 d 后达到降解平衡。说明混合菌对几种氯代苯胺的降 解都存在一定的滞后期，这可能是因为驯化时间不够长，且驯化时加入了易降解 的苯胺，混合菌为适应新的环境需合成能利用该有机物的酶，而经过滞后期，混 合菌对有机物的适应能力增强，即产生了相应的酶系，降解速率加快。几种氯代 苯胺的最终去除率分别为：2 氯苯胺6 0 ，3 一氯苯胺4 0 7 ，4 一氯苯胺3 7 9 ， 6 5 4 3 2 ， 0 1，eu赳蛏 河街大学顶：卜毕业论义 高效复菌降解氯代苯胺类化合物的特性研究 2 , 4 一氯苯胺5 5 6 。最容易降解的化合物是用于驯化复合菌的2 氯苯胺，2 , 4 二氧 苯胺的降解率高于3 一氯苯胺和4 氯苯胺，而4 氯苯胺最难降解。 4 3 2 两种氯代苯胺类化合物共存时的生物降解特性 采用液相色谱测得的共存化合物在o d ，l d ，2 d ，4 d ，5 d ，7 d ，1 4 d 的色潜图 如图4 1 7 4 2 3 所示。 图4 一1 7 2 一氯苯胺与2 , 4 二氯苯胺共存0 d 时的降解谱圈 图4 - 1 8 2 - 氯苯胺与2 , 4 二氯苯胺共存1 d 时的降解谱图 河海大学颂j j 毕业论文高教复合菌降解氯代苯胺类化台物的特性研究 图4 。1 9 2 氯苯胺与2 ，4 ，二氯苯胺共存2 d 时的降解谱图 图4 2 0 2 氯苯胺与2 , 4 二氯苯胺共存4 d 时的降解谱图 图4 _ 21 2 - 氯苯胺与2 , 4 二氯苯胺共存5 d 时的降解谱图 4 7 河海大学硕：i ：毕业论文高效复合菌降解氯代苯胺娄化合物的特。m 肝究 03691 2i5 时间( d ) 十对照( 2 0 m g l ) + 降解( 2 0 m g l 1 十对照r l o m g l 1 * 降解( 1 0 m g l ) 口一对照( 5 m 叽) + b 一降解( 5 m g t ，1 图4 2 5 不同2 一氯苯胺初始浓度下的降解曲线 表4 - 5 2 - 氯苯胺的生物降解数据 + k 的相对误差为一0 7 42 2 大时，微生物需要更长的适应期，以产生足够多的代谢目标化合物的酶。从毒理 学角度看，氯代苯胺类化合物能与微生物机体内的亲核成分如蛋白质、酶等发生 亲电作用而破坏机体的正常新陈代谢过程【8 ”。因此，随着溶液中2 氯苯胺浓度 的增加，更多的2 一氯苯胺分子将穿过生物膜进入微生物体内，并与机体靶位发生 强烈的不可逆键合，从而大大增强了2 一氯苯胺的毒性，导致一些微生物的代谢受 到抑制，甚至停止。另一个原因叮能是由于复合莴的接种量比较少，导致高浓度 系统中有效生物量不足。 ( 2 1 复合菌浓度对降解效率的影响 通过改变接种量，研究了复合菌浓度对水中2 氯苯胺降解率的影响。在一定 量灭菌无碳源培养基中分别加入l o m l 、2 0 m l 、4 0 m l 、6 0 m l 接种液及2 一氯苯胺储 备液，2 一氯苯胺的初始浓度为l o m g l 。降解曲线见图4 。2 6 。 0 5 0 5 o ： 拿s山一刚蛙 河海大学付i ：卜毕业论文高教复台菌降解氯代苯胺类化台物的特性研究 图4 2 6 不同接种量条件下2 氯苯胺的降解曲线 由图4 2 6 可知，当复合菌的投加量从1 0 m l 逐渐增加到6 0 m 簿；l 。謦攀菇 蹦肇搓至叁笠茗s 静稿韫掣二6 秽：霉输晶i 撩毡聋凼龆耀赢馨寺箸器桀菇柴万 公牖酚越旗瓣笪窘罟是蟛湍；署器笛器群弩嚣玺；舔锲辈蒂蓠觜避旗蛋群巢篱 糕嚣箍爱衙则越多，并最终导致被降解的氯代苯胺的量越大。因此，提高溶液中的 微生物量，有助于提高氯代苯胺的生物降解效果。 ( 3 ) 添加生长基质的影响 在9 0 m l 无碳源培养基中加入1 0 m l 接种液和一定量的2 一氯苯胺和苯胺溶液， 设2 氯苯胺的初始浓度为1 0 m g l ，苯胺的初始浓度分别为5m g l 、i o m g l 、 1 5 m g l 、2 0 m g l ，研究添加苯胺对2 一氯苯胺生物降解的影响。添加不同浓度苯 胺时2 一氯苯胺的降解曲线见图4 2 7 ，图4 2 8 显示了1 0m g l 2 - 氯苯胺与1 0m g l 苯胺共基质条件下的降解益线与1 0m g l2 - 氯苯胺单独存在时的降解曲线。 从图4 2 7 、4 2 8 中可以看出，当2 一氯苯胺与苯胺共基质时，共代谢作用明 显。束添加苯胺时，初始浓度为1 0 m g l 的2 一氯苯胺的最终去除率为5 8 3 ，而 当苯胺存在时，2 氯苯胺的降解出现了迟滞期，即当苯胺降解基本完成时2 一氯苯 胺才开始降解，同时，随着苯胺浓度的不断增大，2 氯苯胺的降解迟滞期有所延 长，达到降解平衡的时间也不断延迟，但最终的去除率得到不断提高，当苯胺初 始浓度为2 0 m g l 时，2 一氯苯胺的最终去除率达到6 9 。 这说明，添加苯胺有助于2 氯苯胺的生物降解，共代谢作用明显。苯胺属于 易降解物质，复合菌群在开始时以利用苯胺为主，以支持自身的生长与繁殖。只 有当苯胺降解近乎完全时，复合菌群的降解目标才会向2 一氯苯胺转移。复合菌群 河海大学付i ：卜毕业论文高教复台菌降解氯代苯胺类化台物的特性研究 图4 2 6 不同接种量条件下2 氯苯胺的降解曲线 由图4 2 6 可知，当复合菌的投加量从1 0 m l 逐渐增加到6 0 m 簿；l 。謦攀菇 蹦肇搓至叁笠茗s 静稿韫掣二6 秽：霉输晶i 撩毡聋凼龆耀赢馨寺箸器桀菇柴万 公牖酚越旗瓣笪窘罟是蟛湍；署器笛器群弩嚣玺；舔锲辈蒂蓠觜避旗蛋群巢篱 糕嚣箍爱衙则越多，并最终导致被降解的氯代苯胺的量越大。因此，提高溶液中 的微生物量，有助于提高氯代苯胺的生物降解效果。( 3 ) 添加生长基质的影响 在9 0 m l 无碳源培养基中加入1 0 m l 接种液和一定量的2 一氯苯胺和苯胺溶液， 设2 氯苯胺的初始浓度为1 0 m g l ，苯胺的初始浓度分别为5m g l 、i o m g l 、 1 5 m g l 、2 0 m g l ，研究添加苯胺对2 一氯苯胺生物降解的影响。添加不同浓度苯 胺时2 一氯苯胺的降解曲线见图4 2 7 ，图4 2 8 显示了1 0m g l 2 - 氯苯胺与1 0m g l 苯胺共基质条件下的降解益线与1 0m g l2 - 氯苯胺单独存在时的降解曲线。 从图4 2 7 、4 2 8 中可以看出，当2 一氯苯胺与苯胺共基质时，共代谢作用明 显。束添加苯胺时，初始浓度为1 0 m g l 的2 一氯苯胺的最终去除率为5 8 3 ，而 当苯胺存在时，2 氯苯胺的降解出现了迟滞期，即当苯胺降解基本完成时2 一氯苯 胺才开始降解，同时，随着苯胺浓度的不断增大，2 氯苯胺的降解迟滞期有所延 长，达到降解平衡的时间也不断延迟，但最终的去除率得到不断提高，当苯胺初 始浓度为2 0 m g l 时，2 一氯苯胺的最终去除率达到6 9 。 这说明，添加苯胺有助于2 氯苯胺的生物降解，共代谢作用明显。苯胺属于 易降解物质，复合菌群在开始时以利用苯胺为主，以支持自身的生长与繁殖。只 有当苯胺降解近乎完全时，复合菌群的降解目标才会向2 一氯苯胺转移。复合菌群 x 河海大学硕：忙毕业论文高教复合菌降解氧代苯胺类化合物的特性研究 5 结论与建议 5 j 结论 f 1 1 从南京市扬子石化净水一车间曝气池取活性污泥样品，进行富集、分离 和驯化，得到氯代苯胺类化合物的耐受菌，初步鉴定氯代苯胺类耐受菌组成包括 黄单胞菌属( x a n t h o m o n a s ) 、产碱杆菌属口l c a t i g e n e s ) 、假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 及放线菌科诺卡氏属叫c l i n o m y c e t a c e a en o c a r d i a ) 。 ( 2 ) 通过细菌生长抑制实验证明，分离得到的原始菌对氯代苯胺的耐受性高 于自然水体中( 长江) 的混合细菌；而且经苯胺和2 氯苯胺驯化后，复合菌对毒 物的耐受性也明显提高。 f 3 ) 以驯化后的复合菌为降解微生物，采用实验室模拟方法研究了4 种氯代 苯胺单独存在时的生物降解特性。结果发现，采用苯胺和2 一氯苯胺驯化的复合菌 能分别以3 一氯苯胺、4 一氯苯胺及2 , 4 一二氯苯胺为唯一碳源和能源进行生长代谢。 但是，相比较而言，用于驯化复合菌的2 一氯