（应用化学专业论文）味精发酵与纯化新工艺集成研究.pdf

摘要 谷氨酸钠，俗称味精，有着很重要的生理生化功能。但在生产中，需完成谷氨酸铵 一谷氨酸一谷氨酸一钠的产品转化过程，要经过等电，离子交换等步骤。在增大经济成 本的同时，对环境造成了巨大的压力。本文首创性的研究了直接生成谷氨酸钠的发酵工 艺过程，并通过合成固定相，采用离子交换色谱法从发酵液分离提纯谷氨酸钠。取得以 下结论： 1 通过对发酵液成分分析方法探讨，得到双缩脲法测定蛋白质最小检测量至 1 5 m g m l ，平行相对偏差小于2 ；通过标准曲线，探讨m g o 法和华勃氏微量减压仪 法测定谷氨酸铵以及谷氨酸盐的可行性。 2 对1 6 8 、t 3 、k 1 进行紫外与d e s 诱变，筛选出产酸较高的菌株。结果表明：通 过d e s 诱变后的t 3 菌株，是我们所需要的高产酸菌株。 3 用n a 2 c 0 3 代替发酵过程调节p n 的尿素，在发酵液中直接生成谷氨酸钠，探讨尿 素、生物素、接种量对发酵的影响。结果表明，随着尿素的不断减少，发酵产生的谷氨 酸铵逐渐减少，谷氨酸钠含量逐渐增大，当尿素减少到6 0 时，产物9 9 以上是谷氨酸 钠；随着生物素的逐渐增大，发酵产酸先增大后减小，确定生物素最佳添加范围是 0 9 0 ，1 o ；随着接种量的增大发酵产酸先增大后减小，确定了接种量的最佳范围为 0 9 1 1 m l 。运用正交试验，考察各因素对发酵产酸率、谷氨酸钠含量的影响，并对其 进行综合评价，得到最佳发酵组合：尿素的减少量占总尿的6 0 ，生物素添加量0 9 ， 接种量1 0 m l ( 发酵液总体积2 0 m l ) 。 4 合成固定相，以分离度为指标，考察离子交换树脂的p k a 和离子交换容量，发酵 液的p h ，洗脱液的p h ，对发酵液中组分色谱分离的影响。结果：p k a 对组分分离几乎 不产生影响；离子交换容量产生一定影响，但分离度变化从o 3 3 , - 0 4 7 ，影响幅度较小； 随着洗脱液的p h 的减小，分离度逐渐减小，确定采用p h = 7 的纯水作为最佳的洗脱液； 发酵液的p h 是影响色谱分离的主要影响因素。p h 由8 增大到1 2 时，分离度由0 5 5 增 大到o 9 0 ，发酵液的p h 不断增大，可以增大组分的分离度，使组分能够实现更好的分 离，但其改变了最终的产物( 由谷氨酸一钠转变成谷氨酸二钠) 。因此，发酵液料液的 p h 应该控制在7 左右。 关键词：分离，发酵，色谱，分离度，诱变 m s g ( m o n o s o d i u mg l u t a m a t e ) ，p r o v e r bw e i j i n g ，h a sv e r yi m p o r t a n t a c t i o no l l p h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y b u td u r i n gt h ep r o d u c e ，n e e dt oa c h i e v et h ef o l l o wp r o c e s s ： g l u t a m a t ea m m o n i u m 。g l u t a m a t e - - , m o n o s o d i u mg l u t a m a t e g ow i t hi s o e l e c t r i ca n di o n e x c h a n g e s oi tn o to n l yi n c r e a s et h ee c o n o m yc o s t ，b u ta l s ob r i n gt h ee n v i r o n m e n tp r e s s u r e s ot h es t u d yd e s c r i b et h a tm o n o s o d i u mg l u t a m a t ei sp r o d u c e dd i r e c t l yi nf e r m e n t a t i o nl i q u i d a n ds y n t h e s i z ea p p r o p r i a t es t a t i o n a r yp h a s e t os e p a r a t ea n de x t r a c tt h em s gb yi o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ( i e c ) t h er e s u l t sa sf e l l o w s ： 1 i tw a so b t a i n e dt h a tt h em i n i m a lp r o t e i nw a s1 5 m g m lb ym e a n so f t h eb i u r e tr e a c t i o n t h o u g ht h es t u d yo fa s s a ym e t h o d w i t ht h es t a n d a r dc u r v e s ，u s et h em g om e t h o da n d h u a b o s h im e t h o dt om e n s t r u a t et h ec o n t e n to ft h eg l u t a m a t ea m m o n i u ma n dg l u t a m a t es a l ti s f e a s i b l e 2 i n d u c e dt h e1 6 8 、t 3 、k lb yu va n dd e st ob r e e dt h eh i g ha c i df u n g o i d t h er e s u l t s s h o w ：t h et 3b yd e si st h eh i g ha c i df u n g o i dt h a tw en e e d 3 u s et h es o d i u mb i c a r b o n a t ei n s t e a do ft h eu r e , aw h i c hu s e dt oc o n t r o lt h ep ho ft h e f e r m e n t a t i o nl i q u o r s e e i n ga b o u ta r e a , b i o t i n ，i n o c u l a t ei n f l u e n c eo nf e r m e n t a t i o n as e r i e so f o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sa r ec a r d e do u tt oo p t i m i z et h ep a r a m e t e r s t h e r e a f t e r , t om a k eg e n e r a le v a l u a t et o t h e m t h er e s u l ti so b t a i n e d ：t h eq u a n t i t yo fb i o t i na d d i t i v ei so 9 ( q u a l i t yv o l u m er a t i o ) i n o c u l a t e a d d i t i v e i s l 0 m l ，c o m p a r e w i t h t h e o r i g i n ，t h e b e s t u r e ar e d u c i n g i s 6 0 * 0 ( t h ec h i e f f e r m e n t a t i o n v o l u m e i s 2 0 m u 4 s y n t h e s i z ea p p r o p r i a t es t a t i o n a r yp h a s e u s et h er e s o l u t i o na si n d e x ，s e e i n ga b o u tt h e p k aa n de x c h a n g ec a p a b i l i t yo fs t a t i o n a r yp h a s e ，t h ep ho fm o b i l ep h a s e ，t h ep ho ft h e f e r m e n t a t i o nl i q u i d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ep ho ft h ef e r m e n t a t i o nl i q u i di st h ec h i e f i n f l u e n c ef a c t o r ，7 皓p ho ft h ef e r m e n t a t i o nl i q u i dc h a n g ef r o m8t o1 2 t h er e s o l u t i o nf r o m 0 5 5t o0 9 0 k e yw o r d ：s e p a r a t i o n ，f e r m e n t a t i o n , c h r o m a t o g r a p h y , r e s o l u t i o n , i n d u c e d i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：尊鱼日期：妒7 年6 月7 乡日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：兰! ! 童鱼导师签名： 日期：卫唧年占月弓日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 谷氨酸钠概述 1 1 谷氨酸钠简述 谷氨酸钠( m o n o s o d i u mg l u t a m a t e ) ，俗称味精。是通过谷氨酸菌种，以淀粉为最初 原料发酵而成的。德国的立赫生教授发现利用硫酸分解小麦面筋蛋白质最先分解得到味 精的母体谷氨酸，1 8 7 2 赫拉西惠与哈勃门、乌尔夫化学方法制出谷氨酸，1 9 0 8 年日本 的池田菊苗在研究食品呈味性时从海带中提出了谷氨酸，但是收得率低，劳动强度大。 直到1 9 5 6 年日本协和发酵首先研究成功用微生物发酵淀粉方法制得味精，这种方法一 直延续至今【1 捌。随着生物技术的不断发展和对味精需求量的不断增加，味精的产量在逐 年的提高，味精已成为第一大发酵产品。我国经过数十年的发展，一跃成为名列世界第 一的味精生产大国，从1 9 9 4 年的3 0 万吨到1 9 9 9 年的5 0 万吨直到2 0 0 3 年的1 2 7 万吨， 而在2 0 0 3 年世界味精的总产量为1 5 0 万吨。这种上升的趋势也在逐年的提高。 1 1 2 结构特征 化学名称：l a 一氨基戊二酸【1 ，5 】单钠一水化合物 分子式； c 5 h s n 0 4 n a n 2 0 例 相对分子量： 1 8 7 1 3 霄霄 n a o 一邑一e h c h 厂c h 2 一g o hn a o e e h c h 厂c h 2 一c o h 分子结构： n h 2 1 1 3 理化性质3 , 4 1 密度粒子相对密度1 6 3 5 ；视相对密度o 8 0 - 4 ) 8 3 熔点 旋光度 溶解性 吸湿性 热稳定性 与h c l 与n a o h 加热 1 9 5 ( 在1 2 5 以上易失去结晶水) m d ? o = + 2 4 8 - - + 2 5 3 。( c = 1 0 ，2 5 m o l l h c i ) 易溶于水，不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂，难溶于纯酒精 温度5 0 ，其临界湿度在9 0 以上 1 2 5 结晶水放散，2 8 0 炭化 生成谷氨酸或谷氨酸盐酸盐 生成谷氨酸二钠盐，加酸后仍可生成谷氨酸钠 水溶液中长时间加热部分脱水生成吡咯烷酮羧酸钠 1 1 4 生理生化功能 3 1 谷氨酸钠被食用后，经胃酸作用转化为谷氨酸，被消化吸收构成蛋白质，并参与体 内其他代谢过程，有较高的营养价值。它虽是一种非必需的氨基酸，但在脱氨基、转氨 基、脱羧、解氨等反应中起着很重要的作用。 江南人学硕i ：论文 1 脱氨基作用。谷氨酸在机体辅酶i 作用下，生成a 氨基戊二酸，其进入三羧酸 循环( t c a ) ，成为蛋白质和碳水化合物的中问代谢的一个重要连接者【5 1 。 2 谷氨酰胺的生成和对氨的解毒。在机体内谷氨酸能与血液中的氨结合，生成谷 氨酰胺，可解除代谢过程中所产生的氨的毒害作用。 谷氨酰胺参加脑组织代谢，起能源作用，并能改善脑机能。谷氨酰胺还能与人体内 的苯乙酸作用，生成苯乙酰谷氨酰胺，以解除苯乙酸的毒性。 3 谷氨酸在人体内可转化为糖，再进入糖代谢。 1 1 5 应用领域o l 谷氨酸钠独特的生物学性质，使其在在食品工业、医药工业、制造工业和农业等领 域都有着十分广泛的应用。 1 食品工业 在食品方面作为一种食品添加剂，最重要的功能在于产生“鲜味”；另外还可以改 善和加强食品的自然风味，克服异味。随着国家现代化、社会化的需要，食品加工业在 不断壮大。对味精的需求扶摇直上，味精在罐头、冷藏食品、熟食品加工、小食品和快 餐调料等方面的应用同益广泛。 2 医药工业 谷氨酸钠进入胃肠后，很快分解出的谷氨酸立即参与体内的正常的物质代谢过程； 当葡萄糖供应不足时，谷氨酸还能及时替补作为脑组织的能源，改善脑组织的机能；谷 氨酸能与人体内血氨结合生成无毒的谷氨酰胺，具有保肝的重要生理功能并辅助治疗肝 病、肝功能不全、肝功能受损及肝昏迷；谷氨酸钠在临床上用于治疗某些精神病疾患、 增强记忆、安定情绪及对神经衰弱等有明显的效果和辅助治疗精神分裂症和癫痫病。谷 氨酸钠已被列入许多国家的药典。 3 制造工业 焦谷氨酸钠( 味精脱水生成的产物) 具有极强的吸湿性，能保持皮肤湿润，防止干 燥，并增强皮肤和毛发的柔软和弹力。日本己有以谷氨酸钠( 或谷氨酸) 为原料生产的 高级人造革、化妆品和洗涤剂等产品。 4 农业领域 作为植物生长调节剂，谷氨酸可增加柑橘果实的含糖量，降低酸度。此外，谷氨酸 钠可用于农药的制备。谷氨酸钠既是西红柿保护性杀菌剂，又是防治果树腐烂病的特效 杀菌剂。 1 1 6 谷氨酸钠生产现状及几种改进方法 谷氨酸钠现行生产工艺； 2 第一章绪论 可以看出现在味精生产均采用先从谷氨酸铵发酵液分离谷氨酸半成品，用n a o h 或 n a 2 c 0 3 进行中和转化为谷氨酸一钠，经脱色、浓缩、精制而成味精的基本工艺1 6 】。因此 在提取工艺中，需要完成：谷氨酸铵一谷氨酸一谷氨酸一钠的产品转化过程。而此 转化过程需要消耗大量的酸碱，产生大量环境污染，提高生产成本。 综上所述，在味精的生产过程中存在两大问题： 1 在谷氨酸发酵过程中，随着谷氨酸的不断生成，发酵液的p h 值不断的减小，对 谷氨酸菌产生抑制，为了维持发酵的最佳条件，采用流加尿素和液氨( 现在大多采用的 是液氨) 的方法。发酵法在微生物发酵阶段，主要是获得谷氨酸，在氨过量存在的情况 下以谷氨酸铵的形式存在，所以从发酵罐出来的是谷氨酸铵，而不是我们所希望的谷氨 酸，这样就为后序的味精的生成和制备带来很大的不良影响。 2 在味精生产过程中，采用上述的流程可以看出所流加的液氨最后以硫铵废液的形 式排出，只是起到调节p h 的作用，而且谷氨酸铵重新中和转化为谷氨酸要消耗大量的硫 酸和盐酸，在增大成本的同时，也增大环境的污染，造成资源的浪费。目前高浓度有机 废水大都是通过等电离交提取谷氨酸工艺产生的，生产1 吨味精大约要消耗0 5 吨浓硫酸， 产生近1 吨硫酸铵并排放2 0 吨高浓度有机废水。 目前国内外很多研究对味精生产进行工艺改进。主要集中在以下两个方面： 1 提高谷氨酸铵发酵收率，降低能耗、粮耗。 2 改进味精提取工艺。 1 王大春等1 7 】利用中空纤维微孔滤膜( p v d f ) 提取谷氨酸。传统生产工艺是将发酵 液调酸直接进行低温等电结晶，然后母液再经离子交换吸附后，用絮凝剂絮凝方法收集 菌体。工艺流程复杂，收率低。基于这种情况设计了内压中空纤维膜装置n 师双向流工 艺流程： 该双向流的工艺特点是同一支中空纤维膜组件在过滤工作过程中，同时处于工作与 清洗状态，从而保持膜的高效分离功能，所采用的膜为聚偏氟乙烯( p v d f ) 膜。和传 统的工艺相比，不需再进行离子交换，可减少三分之一的用酸量，减少废水排放，降低 污水处理成本，等电收率可达9 3 9 4 。 一但是在过程中仍要流加大量的液氨，从发酵液中出来的产物还是谷氨酸铵，通过大 量的浓硫酸、盐酸中和，最后会以硫铵废液的形式排出。虽然较传统的方法用酸量减少 江南大学硕士论文 了1 3 ，可是量仍旧很大，所以还需改进。 2 廖戎等悸j 采用阴离子交换树脂提取谷氨酸。谷氨酸发酵液的p h 为6 8 , - - 7 2 。谷氨酸 主要以阴离子形式存在。因此直接从发酵液中通过阴离子交换树脂提取谷氨酸是可行 的。采用2 0 1 x 7 型阴离子交换树脂，最优吸附条件为流速1 m l m i n 。用0 8 m o l l n a o h 洗 脱，洗脱时流速为l m l m i n 。此时谷氨酸收率为9 7 5 。 此实验是验证直接提取谷氨酸的可行性，但此时产物谷氨酸是以吸附树脂上的形式 存在，要想得到谷氨酸产物，就需要从树脂柱上洗脱下来，这样会消耗大量的酸碱，同 样会造成对环境的污染。 3 张鸿剔9 j 等采用电渗析方法应用在味精生产。大多数味精生产厂家都采用发酵法 生产谷氨酸，然后采用一次低温等电法提取工艺来分离谷氨酸。存在着分离过程中用大 量的酸来中和从发酵液中生成的谷氨酸铵，造成了很大的环境压力。此研究表明先用电 渗析脱去一部分铵盐，然后再用离子交换树脂提取。此方法将谷氨酸发酵液通过电渗析 器，这样发酵液中的盐离子就在阳极和阴极的作用下发生迁移，而达到尽可能使发酵液 中的盐脱去的目的。这样，不但减少了离子交换树脂的用量，提高谷氨酸的提取率，同 时也节省酸碱用量，减少对环境的污染。 采用电渗析脱盐与离子交换相耦合的工艺提取发酵液中的谷氨酸铵【1 2 1 ，可以减少 交换树脂的用量，对后序的离子交换和浓缩结晶等分离工艺有利。但是得到的产物仍然 是谷氨酸铵，结果只是提高谷氨酸铵的收率，但是要想得到产物谷氨酸，还要经过传统 的离子交换等工艺，不能从根本上解决现行味精生产工艺中遇到的问题。 4 常秀莲【”】等采用弱碱性离子交换树脂提取谷氨酸的研究。试验中合成三种不同的 阴离子交换树脂。得到结果：谷氨酸的吸附等温线与初始的谷氨酸的浓度无关，但溶液 的p h 的变化对其影响很大，在谷氨酸的等电点( p i = 3 2 2 ) 附近，吸附量最大。 但是谷氨酸发酵液的p h 一般都是在7 0 左右，要想得到最大的吸附量，必须加入大 量的酸，使其达到谷氨酸的等电点，为后序的工艺带来很大的压力。 5 谢宪章1 1 4 j 等从发酵液直接生成味精的新工艺研究。现在普遍使用的方法是以等电 点法从发酵液中分离谷氨酸。但是，由于发酵液中共存的蛋白质、色素等高分子化合物 等电点p h i 3 4 ，与谷氨酸等电点相近，固而在谷氨酸结晶中会混入多量的杂质，使谷 氨酸结晶纯度低，并给精制谷氨酸钠的后序带来麻烦与耗费。其采用的方法是：将新 鲜发酵液高速离心去菌体，加入氢氧化钠调整p h 6 8 7 0 ，加入当量的钠盐，减压浓缩， 冷却结晶，产品分离。 在此工艺中应该存在以下问题：若发酵液中存在的是谷氨酸铵，就不需要用氢氧化 钠调节p h ，然后在里面加入钠盐，也就不会发生反应生成谷氨酸钠。若发酵液中存在的 是谷氨酸，用氢氧化钠调节p h 过程中，就会生成谷氨酸钠，那后面所要加的钠盐目的何 在? 而且如果发酵液中存在的是谷氨酸，由于产物的抑制菌种就会不生成产物，因此， 其题目从发酵液中直接生成味精的说法有点牵强。 而本研究根据目前工艺存在的问题以及上述对谷氨酸钠生产的各种改进，提出在发 4 第一章绪论 酵液中直接生成谷氨酸钠，并采用离子交换色谱对谷氨酸钠分离提纯，废糖水循环使用 的理念。研究思路如下图所示。 1 2 谷氨酸发酵 谷氨酸发酵是在谷氨酸生产菌为基础，以葡萄糖为主要原料，在生物素、无机盐、 生长因子等存在下进行生物合成的。谷氨酸的生物合成途径包括：酵解途径( e m p ) 、 磷酸乙糖途径( h m p ) 、三羧酸循环( t c a ) 、乙醛酸循环、伍德沃克曼反应( c 0 2 的 固定化反应) 【l5 1 。而这些反应所需的酶系都是在谷氨酸生产菌的作用下产生的。因此筛 选、选育出活力强、产酸高的菌株对谷氨酸生产来说是至关重要的。 1 2 1 谷氨酸生产菌的选育、分纯、保藏 菌种的选育分自然选育和诱变选育两种： 自然选育：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌体的自然突变而进行菌种筛选 的过程，即分离、纯化。自然变异的结果往往导致菌种的退化，在生产和保藏过程中会 不断发生变异，引起衰退；斜面菌种如果移接次数较多，往往由于有少量菌体细胞的自 然变异致使斜面菌种不纯而影响发酵结剁。因此，谷氨酸生产菌需要定期分离纯化， 通常采用的方法是稀释分离法或平板划线分离法。 诱变育种：通过诱变剂处理就可以提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出 具有优良特性的变异菌株的方法。诱变育种具有速度快，收效大，方法简便等特点，是 谷氨酸菌种选育的一种主要的方法。诱变育种是利用微生物自发突变和诱发突变进行选 育菌种的总称。能提高菌种突变率的物质称为诱变剂，其种类很多，按性质可分为：物 理诱变剂、化学诱变剂与生物诱变剂三大类m 。 化学诱变剂 物理诱变剂生物诱变剂 碱基类似物碱基反应物d n a 中插入缺失碱基物 紫外线( u v )2 氨基嘌呤硫酸二乙酯吖啶类物质噬菌体 快种子( f n )5 溴尿嘧啶亚硝酸i c r 类化合物 x 射线8 氮鸟嘌呤氮芥 c 0 6 0 乙烯亚胺 激光羟胺 注：i c r 是美国研究所合成的吖啶类的氮芥衍生物 江南大学硕士论文 1 2 2 谷氨酸生产菌的代谢控制育种 为了更好的适应谷氨酸生物合成途径及代谢调节机制以及高产谷氨酸应具备的生 化特性，谷氨酸菌种要进行代谢育种。 1 2 i2 1 菌种日常工作1 1 s 】 1 定期分纯：一般l 2 月分纯一次，挑选产酸高、生长快、无噬菌体感染的菌株。 2 ，j 、剂量诱变刺激：用紫外线( 1 0 - 2 0 s ) 、通电、激光等轻微处理，可以淘汰生长微 弱的菌株，并能激发溶源性噬菌体，使挑出来的菌是产酸高、生长旺盛、无噬菌体感染 的优良菌株。 3 高产菌制作安培管：通过诱变选育或分纯出的高产酸菌马上作安培管，防止变异。 1 2 2 2 选育各种特征菌株 菌种能高产谷氨酸，首先要使菌种具备在高糖、高酸的培养基中仍能正常生长、代 谢的能力，即在高渗透压的培养基中菌体的生长和谷氨酸的合成不受影响或影响很小。 而且谷氨酸发酵目的是积累谷氨酸，如果菌种在合成谷氨酸的同时却在分解利用谷氨 酸，就达不到积累谷氨酸的目的。所以也必须使菌种不能分解利用谷氨酸，切断a 酮戊 二酸继续向下氧化的反应。另外还有许多研究学者对菌株进行变异处理得到如下特征的 谷氨酸菌株 1 9 l ： 1 选育细胞膜渗透性好的突变株。 2 选育强化c 0 2 固定反应得突变株。 3 选育减弱乙醛酸循环的突变株。 4 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到酮戊二酸代谢的突变株。 5 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株。 6 选育减弱h m p 途径后段酶活性的突变株。 1 3 离子交换技术 离子交换是一种继蒸馏、萃取、吸收等化工分离手段之后，新崛起的一种化工分离 操作技术。离子交换过程是被分离组分( 即被提取、被纯化的离子或分子) 在水溶液与 固体交换剂之间发生的一种化学计量分配过程，该过程遵循固一液非均相扩散传质的普 遍规律而不同于传统分离过程【2 0 , 2 ”。 离子交换一般是指一种可逆的固一液化学反应，其中固体就是离子交换剂( 树脂) 。 离子交换剂由惰性骨架( 母体) 、固定基团和活动离子( 也可叫交换离子或反离子) 三 部分组成：如阳离子型离子交换剂r _ s o r - - - m ，其中r 为惰性骨架，s 0 3 为固定基团， m 为活动离子或可交换离子，s 0 3 m 为活性基团或功能基团。 离子交换剂具有一定的空间网状结构，当与溶液接触时，与溶液中的特定离子进行 交换，即离子交换树脂上的可交换离子( 阳离子或阴离子) 被溶液中带同种电荷的特定 离子取代，而不溶性固体骨架在这一交换过程中不发生任何化学变化。该过程一般可以 用方程式表达为；肋+ + i 删+ b + ( r 代表树脂中除可交换离子以外的其它部分， 6 第一章绪论 即惰性骨架与固定基团；b 为可交换离子；a l + 为待分离组分) 。离子交换现象是自然界 普遍存在的一种物质运动形式，离子交换的应用最早是从泡沸石类天然矿物净化水质开 始的。离子交换剂经历了泡沸石、磺化煤、酚醛树脂等发展阶段，到1 9 4 5 年美国人迪 阿莱里坞发表了有关阳离子交换树脂的制备方法之后，出现了凝胶型苯乙烯合成树脂， 这使得近代离子交换技术的发展进入了全新时期。自5 0 年代以来，我国离子交换技术 取得了飞速发展，建立了一定规模的离子交换树脂工业及应用系统。 1 3 1 离子交换过程的理论基础 1 3 1 1 静力学l 捌 离子交换是按化学当量关系进行的。离子交换方程式的一般形式可写成： 土4 + 三互营互+ 1 4 z 1 z z z ， 式中：a l ，a 2 液相中离子； 4 ，4 吸附在树脂上的离子； z l ，z 2 表示离子a l ，a 2 的价数。 1 3 1 2 动力学 由于树脂放入水溶液中表面就会始终存在一层薄膜，所以离子交换过程一般包括下 列五个步骤： ( 1 ) 溶液中的a 离子扩散到树脂表面； ( 2 ) a 离子从树脂表面再扩散到树脂内部的活性中心； ( 3 ) a + 离子与树脂上b 离子发生交换反应； ( 4 ) 解吸离子b 白树脂内部扩散到树脂表面； ( 5 ) b 离子再从树脂表面扩散到溶液中。 其中( 1 ) 和( 5 ) 为外部扩散，( 2 ) 和( 4 ) 为内部扩散，( 3 ) 为化学交换反应。 整个交换反应的控制步骤是扩散。至于究竟是内部扩散还是外部扩散属控制步骤，要随 操作条件而变。一般说来，液相速度愈快或搅拌愈激烈，浓度愈稀，颗粒愈大，吸附愈 弱，则愈是趋向于内部扩散控制；相反，液体流速慢，浓度浓，颗粒细，吸附强，则愈 是趋向于外部扩散控制。 1 3 2 离子交换树脂 1 3 2 1 离子交换树鹰的组成及分类j 离子交换树脂是一类带有功能基的网状结构的高分子化合物，其结构由三部分组 成：不溶性的三维空间网状骨架，连接在骨架上的功能基团和功能基团所带的相反电荷 的可交换离子。根据树脂所带的可交换的离子性质，离子交换树脂可大体分为阳离子交 换树脂和阴离子交换树脂。 阳离子交换树脂是一类骨架上结合有磺酸( 一s 0 3 h ) 和羧酸( - - c o o h ) 等酸性功 江南人学硕f ：论文 能基的聚合物。将此树脂浸于水中时，交换基部分像普通酸样发生电离。以r 表示树脂 的骨架部分，阳离子交换树脂( r s 0 3 h ) 或( r - - c o o h ) 在水中时的电离如下： r - 一s 0 3 h 专r s 0 3 + h + r 一一c o o h 寸r c o o 。+ h + r s 0 3 h 型树脂易电离，具有相当于盐酸或硫酸的强酸性，称为强酸性阳离子交换 树脂。而r - - c o o h 型树脂类似有机酸，较难电离，具有弱酸的性质，因此称为弱酸性 阳离子交换树脂。 。 阴离子交换树脂是一类在骨架上结合有季铵基、伯胺基、仲胺基、叔胺基的聚合物。 其中，以季铵基上的羟基为交换基的树脂具有强碱性，称为强碱性阴离子交换树脂，而 具有其他胺基的阴离子交换树脂碱性较弱，称为弱碱性阴离子交换树脂。 按骨架结构不同，离子交换树脂可分为凝胶型和大孔型树脂两大类。由苯乙烯和二 乙烯苯( d v b ) 混合物在引发剂存在下进行自由基悬浮聚合，得到具有交联网状结构的 聚合体。这种聚合体一般是呈透明状态的，无孔的凝胶型树脂。其中d v b 为交联剂， 其加入量占单体的百分比表示网状结构粗密的尺度，称为交联度。交联度高的树脂骨架 结构的链难于伸展，吸水量也受到限制，不易溶胀；而交联度低的树脂吸水量大，溶胀 也大。离子交换树脂吸水后，树脂相内产生微孔，反离子可扩散进由吸水而产生的微孔 内进行离子交换，微孔的大小依赖于树脂的交联度。因此，交联度是离子交换树脂的重 要指标之一。 1 3 2 2 离子交换树脂的基本要求 树脂在应用上与过滤、色层分离及活性炭处理等有点相似，其主要特点是要求树脂 能长期重复( 数千次) 使用，所以树脂的质量及规格等应有如下基本要求。 1 机械强度在使用条件下，要求树脂不破裂，不丢失，否则影响效果，污染体系。 对树脂的具体要求是，耐干湿冷热变化、耐酸碱胀缩、抗流速磨损等。一般讲，树脂以 球形小颗粒使用、处理比较方便。 2 化学稳定性要求树脂使用寿命长，能耐有机溶剂、稀酸、稀碱及氧化剂，还原 剂等。 3 选择性高、再生性能好树脂在浓缩、分离等应用上，要求选择性越高越好，但 它受到再生效果、交换速度等因素的限制。 4 结构性能好在使用条件下，树脂的孔度、孔径大小合适，孔径分布狭窄、比表 面积大、抗污染性能好等洲。 1 4 离子交换色谱 离子交换色谱( i e c ) 通过固定相表面带电荷的基团与样品离子和流相离子( 淋洗 离子) 进行可逆交换、离子偶极作用或吸附，实现色谱分离，它主要用于分离离子型 化合物。离子交换色谱是较早开发应用的液相色谱方法。1 8 4 8 年，t h o m p s o n 等人在研 究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。2 0 世纪4 0 年代，具有稳定交换特性的 聚苯乙烯离子交换树脂问世，至5 0 年代，离子交换色谱出现了第一个发展高潮。它对 8 第一章绪论 核原料的提取、天然及裂变稀土元素的分离、纯化、人造元素的发现和坚定等做出了重 要贡献。 高速离子交换色谱分离方法的发展始于氨基酸分析。2 0 世纪5 0 年代，离子交换色 谱进入生物化学领域，经过s p a e k m a n 、m o o r e 、s t e i n 等人的努力，实现氨基酸分离分 析自动化，研制成功氨基酸自动分析仪。6 0 年代，全多孔键合离子交换剂的出现，导致 高压、高速、高效近代离子交换色谱的产生。从1 9 5 1 年m o o r e 等人开始，到1 9 6 9 年高 效离子交换色谱产生的1 8 年内，随着离子交换固定相填料的发展，将常见氨基酸的分 析时间从2 2 小时缩短到l 小时。离子交换色谱的近期应用大多涉及生物化学分离 2 5 1 。 1 4 1 离子交换色谱优点 ( 1 ) 分析速度快现代科学研究、产品质量控制要求的分析样品数量不断增加， 分析速度显得越来越重要。一般而言，离子色谱法分析一个样品平均只需约1 0 m i n 。近 年来，不断开发出高柱效的离子色谱柱，6 个常见的无机阴离子( f 、c i 。、n 0 2 。、b r 、 n 0 3 和s 0 4 2 。) 在5 m i n 内可以完全分离，并实现同时定量分析。 ( 2 ) 检测灵敏度高随着信号处理和检测器制作技术的进步，不经过预浓缩可以 直接检测p g ，l 级的离子。进样量在5 0 l 时，无机阴离子和阳离子的检测下限在1 0 t t g l 左右。绝对检出量在纳克水平。 ( 3 ) 选择性好通过选择合适的分离模式和检测方法，可以获得较好的选择性。 首先，一定的分离模式只对某些离子有保留，如在分离含有机物的食品、生物等样品时， i c 可以较好地避免有机物的干扰。在使用抑制型电导检测时，可以通过抑制器将被测离 予的反离子从体系中排除，只有与被测离子带相同电荷的离子有响应。采用只对被测离 子有响应的选择性检测器也可大大提高选择性。在柱后衍生化法中，可以通过衍生化试 剂与待分析的某类离于的选择性反应来实现选择性分析。 ( 4 ) 多离子同时分析在2 0 r a i n 左右时间内，实现1 0 个以上离子的同时分离已是 一件很容易的事。现在，同时分离无机离子和有机离子、离子与非离子极性化合物、阴 离子与阳离于等不同类型离子已不再困难。另外，离子色谱法的峰面积工作曲线的线性 范围一般有2 3 个数量级，所以，含量相差数百倍或上千倍的不同离子也可一次进样， 同时准确定量。 ( 5 ) 离子色谱柱的稳定性高色谱柱的稳定性主要由所用填料的类型决定。离子 色谱法中使用最多的是有机聚合物作基质的境料，这种境料比反相h p l c 中通常使用的 硅胶基质填料要耐强酸和强碱性流动相。有机聚合物作基质的填料不如硅胶基质填料耐 有机溶剂，所以，在离子色谱中，为了改善疏水性离子的色谱峰形状，在流动相中加入 有机溶剂时必须控制很小的有机溶剂比例( 如5 以下) 。可喜的是，近两年已有能耐 1 0 0 有机溶剂和在全p h 值范围( p h i 1 4 ) 内适用的高性能离子色谱柱上市 2 6 1 。 1 4 2 分离度 色谱分析的目标就是要将混合物中的各组分分离，两个相邻色谱峰的分离度r ( r e s o l u t i o n ) 定义为两峰保留时间差与两峰峰底宽平均值之商。即 9 江南人学硕 论文 r ：弛! 二型：堕 w l + w 2w l + w 2 式中：t r i 和t r 2 分别为峰l 和峰2 的保留时间；w l 和w 2 分别为峰l 和峰2 在峰底 ( 基线) 的峰宽，即通过色谱峰的变曲点( 拐点) 所作的三角形的底边长度 2 7 1 。 1 4 3 离子交换色谱的应用 离子交换色谱( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，i e c ) 是通过带电的溶质分子与离子 交换剂中可交换的离子进行交换，而达到分离目的的方法。该法主要依赖电荷问的相互 作用，利用带电分子中电荷的微小差异进行分离，且有较高的分离容量。几乎所有的生 物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换法己广泛用于生物大分子的分离纯 化。由于离子交换色谱分辨率高、工作容量大且易于操作，它已成为蛋白质、多肽、核 酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要方法，在合成多肽分离中约有7 5 的工艺采用 离子交换色谱。 1 丁永胜1 2 8 j 等采用离子交换色谱积分脉冲安培法实现了对氨基酸处于阴离子状念 的分析。目前常用的检测是先将氨基酸梯度洗脱，柱后衍生反应，紫外或荧光检测。最 常用的衍生试剂有茚三酮( n i n h y d r i n ) 和邻苯二甲醛( o p a ) 。此外还有柱前衍生化一 反相色谱法。但这些方法普遍存在缺点，诸如：柱后衍生要附加装置和衍生化试剂自身 的限$ 0 - 柱前衍生存在氨基酸衍生物不稳定，衍生反应副产物和试剂本身的干扰等。针 对上述缺点提出离子交换色谱一积分脉冲安培法( h p i c i p a d ) 。固定相采用疏水性 薄壳型阴离子交换树脂，去离子水、2 5 0 r a m 氢氧化钠和11 0 m 醋酸钠溶液三元梯度淋洗， 积分脉冲安培法直接测定。是一种可以直接用于氨基酸分析的新方法，不需要进行柱前 或柱后衍生化。 2 张红梅1 2 9 】等采用离子交换色谱实现对天冬氨酸和赖氨酸的分离。洗脱液收集的速 度为lm l m i n ，用刻度试管每管收集4 m l ，首先用p h 5 3 的柠檬酸缓冲液洗脱收集l 4 管，然后改用p h = 1 2 的n a o h 溶液收集5 1 2 管。结果天冬氨酸全部收集在第4 管，赖氨 酸收集在第1 0 管，经比色分析后作图可得两个单一吸收峰。 3 汤家芳【3 0 等采用氨基酸制备色谱一d p s c 离子交换树脂柱实现了对发酵l 缬氨酸的 分离。从苯乙烯，甲基丙烯酸甲酯、二乙烯苯合成了具有磺酸、羧酸功能基团的新型d p s c 离子交换树脂，并对其表征了选择性、分离度、理论等板高度。用新型d p s c 离子交换 树脂在制备规模从发酵缬氨酸液中分离l 缬氨酸，应用0 2 m o l ln i 玉c i 和0 5 m o l l n h 4 0 h ，流速6 0m l m i n , 温度2 5 ，梯度沈脱，减少保留体积4 5 。 4 陈文蕾1 3 l 】等采用离子交换色谱分离食物色素中的无机阴离子。系统研究了5 种食 用色素在阴离子交换树脂上的吸附性能和7 种无机阴离子的洗脱行为及其离子色谱淋洗 条件。拟定了在线离子交换预分离离子色谱分析食用色素中无机阴离子的方法。该 法简便、快速、灵敏度高，已成功地用于标准物质的定值工作。用于合成样的分析，回 收率达9 5 1 0 4 ，5 次平行测定的相对标准偏差不超过3 ，满足分析要求。 1 0 第一章绪论 1 4 4 阴离子交换色谱 本研究采用的阴离子交换树脂为固定相来分离提取发酵液中的谷氨酸钠，阴离子交 换色谱法( a n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，a e c ) 以阴离子交换剂为固定相，用来分析 阴离子。影响阴离子保留的因素主要有： ( 1 ) 流动相流速通过增大流动相流速，可以减小溶质离子的保留，又不会明显 地降低色谱柱的柱效。不过，因受柱压和成本的限制，不可能将流速增加得太大。另一 方面，虽说减小流速可以使分离度增大，但受分析时间和峰展宽的限制，我们也只能在 很有限的范围内，通过减小流速来改善分离效果。流速的变化既不影响流动相的p h 值 和离子强度，也不影响溶质的洗脱顺序，所以，通过改变流速来控制保留时间的操作是 很容易实现的。在离子色谱分析中，通常使用的流速范围是1 - 2 m l m i n 。 ( 2 ) 分离柱长度从理论上讲，分离柱越长，理论塔板数越高，即分离效率越高。 同时，溶质的保留时问也随柱长的增长而增加。分离弱保留离子或多组分样品时，为了 得到较好的分离，通常要选择较长的色谱柱，有时还可将两根相同的分离柱串联起来使 用。如果样品简单或溶质保留强，则可选择较短的分离柱。通常情况下，离子色谱柱的 尺寸为长5 0 1 0 0t o n i ，内径4 8 m m 。 ( 3 ) 流动相种类流动相的选择主要依据所采用的检测方法和溶质离子性质。一 般来说，淋洗离子与固定相之间的作用力应和溶质离子与而定相之问的作用力相当。 ( 4 ) 淋洗剂的浓度对于一个液相色谱分离体系，当选定了分离柱和淋洗剂后对 溶质保留影响最大的实验参数是淋洗剂的浓度和p h 值。一般来说，淋洗剂浓度增大， 通常使溶质保留值减小。 ( 5 ) 流动相p h 当为了改善溶质分离而改变流动相中两种物质的比例时，流动相 的p h 值和离子强度都会发生变化，也都会对溶质的保留产生影响。一般来说，随着淋 洗剂浓度的增加，如果流动相p h 值的变化并未引起溶质离子价态的变化，则溶质的保 留都会减小。流动相p h 值不仅影响有机酸类淋洗剂的离解，还会影响多元弱酸类溶质 阴离子的离解【丑讲】。 1 5 立题依据与意义 味精工业也是我国发酵工业中的最大污染源，2 0 0 3 年全国味精产量1 2 7 万吨，排 放高浓度有机废水1 0 0 0 万吨，c o d 含量达3 7 万毫克公斤。排放的有机物总量为： c o d 6 3 万吨，b o d 3 1 5 万吨，s s 5 0 4 万吨。总废水按每吨排3 0 0 吨计，达2 亿吨左右， 同时产生干固物约2 5 0 万吨。 生产过程中每吨味精需要消耗4 0 0 k g 氨水、7 0 0 k g 硫酸、2 5 0 k g 盐酸，同时有3 0 至4 0 的粮食被作为废物排入环境，造成严重的浪费和污染。排放的污染物负荷量十 分惊人。 本研究提纯味精新工艺具体内容是：改进发酵工艺，将原来发酵产生谷氨酸铵，改 为生产谷氨酸钠。将谷氨酸钠发酵液经过模拟移动床色谱分离装置，使其中所含无机盐、 蛋白质、色素、糖等各类杂质除去，谷氨酸钠产品液经过脱色、浓缩和结晶直接生成味 江南大学硕士论文 精；发酵废糖水返回发酵罐用于循环发酵。 该新工艺具有对环境完全亲善的清洁生产特点，可大大降低味精生产过程中严重的 三废污染状况，新工艺消除了冷冻等电和离交工艺，因此在新工艺中不需要加任何硫酸、 减少近一半的氨水、节省近8 0 的盐酸。 1 6 研究内容 1 对谷氨酸钠发酵液主要成分分析方法的确定，主要是残糖和谷氨酸盐检测方法的研究。 2 对菌种进行分纯诱变，挑选出高产的谷氨酸生产菌。 3 通过用n a c 0 3 代替调节发酵液p h 的尿素在发酵液中直接生成谷氨酸钠，探讨调节p h 的尿素量以及所添加的n a c 0 3 量，以及尿素，生物素，接种量对发酵的影响。 4 色谱分离条件的研究，以分离度为指标考察不同类型的树脂、发酵料液的p h 、淋洗液 的p h 对谷氨酸钠发酵液分离的影响。 1 2 第二章发酵液成分分析方法的确立 第二章发酵液成分分析方法的确立 2 1 引言 一步直接生成谷氨酸钠的发酵液成分复杂，其主要成分为谷氨酸钠、谷氨酸铵、残 糖、蛋白质、菌体和c a 2 + 、m 矿等一些金属离子。这些成分作为发酵的指标和后序分离 工艺的指标，对新的发酵工艺有着重要的指导作用，因此需要对上述的成分精确的检测， 以便对发酵过程做出及时的调控。 由