（水生生物学专业论文）我国罗非鱼主要引进种的遗传分析及分子标记研究.pdf

论文题目：我国罗非鱼主要引进种 的遗传分析及分子标记研究 专业：水生生物学 硕士生：吴丰 指导老师：林浩然院士 摘要 罗非鱼( t i l a p i a ) 隶属于硬骨鱼类纲( o s t e i c h t h y e s ) 、鲈形目( p e r c i f o r m e s ) 、 鲈形亚目( p e r c o i d e i ) 、丽鱼科( c i c h l i d a e ) ，约有7 0 0 种( 陈素芝，1 9 9 2 ；林振亮，2 0 0 4 ) 。 由于罗非鱼具有生长快、繁殖力强、食性杂、病害少、抗病力强、适应性强等特 点，已经成为我国南方大部分地区和北方地热资源丰富地区的重要养殖品种。但 近年来，由于遗传渐渗、近亲繁育等原因，引起罗非鱼品种混杂和种质退化，造 成生长速度降低、体色变杂、性成熟提早。 本研究以罗非鱼为研究对象，利用随机扩增多态d n a ( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a , r a p d ) 和线粒体基因序列分析( d n a s e q u e n c i n g ) 技术，分别检 测了核基 ( n u c l e a rg e n e ) g l 核# b 基 ( e x t r a n u c l e a rg e n e ) 的遗传变异，从三个层面 ( 种内遗传变异、种问亲缘关系和不同属间的分类地位) 逐层进行深入探讨，以期为 罗非鱼品种混杂和种质退化问题的解决提供理论依据。研究主要包括以下部分： 一罗非鱼线粒体d n a 基因序列分析 通过p c r 扩增出罗非鱼线粒体1 2 sr r n a 、1 6 sr r n a 、c y t b 和d - l o o p 基因 部分序列，纯化后直接测序。利用多个生物软件对序列变异和碱基组成进行分析， 计算k i m u r a2 - p a r a m e t e r 遗传距离、平均核苷酸差异数、平均位点核苷酸替代数等 遗传信息指数，并构建u p g m a 和n j 系统树。结果表明：( 1 ) 线粒体测序技术鉴定 出五种单倍型：( a ) 红罗非鱼单倍型，( b ) 荷那龙罗非鱼单倍型，( c ) 莫桑比克母系单 倍型( 莫桑比克罗非鱼一莫荷罗非鱼) ，( d ) 尼罗罗非鱼母系单倍型( 尼罗罗非鱼一奥 尼罗非鱼) ，( e ) 奥利亚罗非鱼单倍型。( 2 ) 线粒体基因联合构建的u p g m a 和n j 系 统树中，红罗非鱼与荷那龙罗非鱼首先聚在一起，然后与莫桑比克母系形成姐妹 支，然后与尼罗罗非鱼母系聚类；奥利亚罗非鱼位于系统树的底部。o ) 将本实验 数据与g e n b a n k 其它罗非鱼共同构建分u p g m a 和n j 系统进化树，罗非鱼分为 o r e o c h r o m i s 、s a r o t h e r o d o n ，五l o p i a 三属，o r e o c h r o m i s 、s a r o t h e r o d o n 两属有着共 同的起源，支持t r e w a v a s 基于形态学的观点。 二罗非鱼随机扩增多态d n a ( r a p d ) 分析 本实验对1 9 2 个罗非鱼个体的随机扩增d n a 多态性进行分析。从6 0 条引物 中筛选出1 0 条扩增效果稳定的引物进行r a p d 扩增，一共检测出1 4 7 个位点，罗 非鱼位点多态率分布于9 5 2 3 9 4 6 之间，平均为2 6 4 5 。通过软件统计多态 位点比率、基因多样性、s h a n n o n 指数、遗传分化指数、遗传相似度、遗传距离等 遗传参数，并构建u p g m a 系统进化树。结果表明：( 1 ) 引物$ 2 5 7 ，s 1 8 3 扩增出 用于区分尼罗罗非鱼( 吉富) 与奥尼罗非鱼的特异r a p d 条带，引物$ 1 6 7 扩增的 r a p d 特异条带可以用于区分莫桑比克罗非鱼和莫荷罗非鱼。( 2 ) 罗非鱼多态位点 比率，基因多样性，s h a n n o n 指数三组数据变化趋势基本一致：其中奥利亚罗非鱼 的遗传多样性最低，奥尼罗非鱼、尼罗罗非鱼( 吉诺玛) 和莫荷罗非鱼的遗传多 样性明显高于其它罗非鱼。( 3 ) 奥尼罗非鱼与父本奥利亚罗非鱼、母本尼罗罗非鱼 ( 吉富) 与的遗传一致度分别为o 8 2 5 3 和o 8 2 3 9 。从这一结果可以看出，奥尼杂 交鱼从其父本和母本得到了近乎相同数量的遗传物质。( 钔根据遗传距离建立 u p g m a 树，罗非鱼分为两支，奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼、为一支； 莫桑比克罗非鱼、莫荷杂交鱼、荷那龙罗非鱼、红罗非鱼为另一支。 关键词：罗非鱼线粒体，r a p d ，1 2 sr r n a ，1 6 sr r n a ，c y t b ，d l o o p ，遗传多 样性，亲缘关系 i l t i t l e ：t h eg e n e t i ca n a l y s i sa n dm o l e c u l a r m a r kr e s e a c ho ft h em a i n t i l a p i ai nc h i n a m a j o r ：h y d r o b i o l o g y n a m e ：w uf e n g s u p e r v i s o r ：l i nh a o r a n ( a c a d e m i c i a n ) a b s t r a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nr p c r ) w a su s e dt oa m p l i f yt h em i t o c h o n d r i a l1 2 sr r n a , 1 6 s r r n a ，c y t ba n dd - l o o pg e n e sp a t i a ls e q u e n c ef r o mt i l a p i ai nc h i n a ，a n dp c rp r o d u c t sw e r e d i r e c t l ys e q u e n c e da f t e rp u r i f i e d b ym e a n so fs e v e r a lb i o s o f t w a r e s ，s e q u e n c ed i f f e r e n c e s a n db a s ec o m p o s i t i o nw e r ea n a l y z e d s o m eg e n e t i ci n f o r m a t i o ni n d i c e sw e r ec a l c u l a t e d ， i n c l u d i n gg e n e t i cd i s t a n c e ，a v e r a g en u m b e ro fn u c l e o t i d ed i f f e r e n c eb e t w e e ns p e c i e sa n d a v e r a g en u m b e ro fn u c l e o t i d es u b s t i t u t i o np e rs i t eb e t w e e ns p e c i e se t c t h e s es e q u e n c e s ， t o g e t h e rw i t ht h eh o m o l o g o u ss e q u e n c e so fo t h e rf i s h e so b t a i n e df r o mg e n b a n k , w e r eu s e d t oc o n s t r u c ti j p g m aa n dn jt r e e s t h er e s u l to ft h i se x p e r i m e n ts h o w e dt h ef a c ta sf o l l o w ：( 1 ) f i v eh a p l o t y p e sw e r ei d e n t i f i e d b ym i t o c h o n d r i a ld n as e q u e n c i n g ( 2 ) r e dt i l a p i a a n do r e o c h r o m i sh o r n o r u mw e r e c l u s t e r e dw i t hd m o s s a m b i c u sa n dh y b r i dt i l a p i af dm o s s a m b i c u s d h o r n o r u m ) f i r s t l y , a n ds e c o n d l yc o m b i n e dw i t hn i i ta n dh y b r i dt i l a p i a ( d a u r e u s 0 n i l o t i c u s ) ，f i n a l l y g r o u p e dw i t hna u r e u s ( 3 ) t i l a p i aw a sd i v i d e di n t ot h r e em a j o rg e n e r a ，o r e o c h r o m i s ， s a r o t h e r o d o na n d7 1 i l a p i a o r e o c h r o m i sa n ds a r o t h e r o d o no r i g i n a t e df r o mac o m m o n a n c e s t o r u s i n g1 0o u to f6 0r a n d o mp r i m e r s ，r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) w a s a p p l i e dt oa n a l y z et h eg e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e n e t i cr e l a t i o no f1 9 2i n d i v i d u a l sf r o mt i l a p i ai n c h i n a at o t a lo f1 4 7r a p dl o c iw e r eo b t a i n e d ，a n dp e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cl o c if r o m t i l a p i av a r i e df r o m9 5 2 t o3 9 4 2 s o m eg e n e t i ci n f o r m a t i o ni n d i c e sw e r ec a l c u l a t e db y 1 i i s o m eb i o - s o f t w a r e s ，i n c l u d i n gp e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cl o c i ，g e n ed i v e r s i t y , s h a n n o ni n d e x ， g s t ，g e n e t i ci d e n t i t ya n dg e n e t i c d i s t a n c e t h er e s u l to ft h i se x p e r i m e n ts h o w e dt h ef a c ta sf o l l o w ：( 1 ) t w op r i m e r sc o u l db eu s e dt o d i s t i n g u i s hn ta n dh y b r i dt i l a p i af o a u r e u s nn i l o t i c u s ) 。 d fm o s s a m b i c u sa n dh y b r i d t i l a p i a ( 0 m o s s a m b i c u s d h o r n o r u m ) w e r ed i s t i n g u i s h e db yo l l ep r i m e r ( 2 ) v a r i e t ym l e s o fp e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cl o c i ，g e n ed i v e r s i t ya n ds h a n n o ni n d e xw e r es i m i l a r s t a t i s t i c a l d a t as h o wt h a tg e n e t i cd i v e r s i t yo fh y b f j d ( d a u r e u sxd n i l o t i c u s ) ，g e n o m a rt i l a p i aa n d h y b r i dt i l p i a ( o m o s s a m b i c u s dh o r n o r u m ) w e r eh i g i l e rt h a nt h a to fd a u r e u s ，n i l t , r e d t i l a p i a d m o s s a m b i c u sa n dd h o r n o r u m m o r e o v e r ，g e n e t i cd i v e r s i t yo fda u r e u si st h e l o w e s ti nt h e m ( 3 ) g e n e t i ci d e n t i t i e so fb e t w e e nh y b r i dt i l a p i a ( da u r e u sxdn 1 l o t i c u s ) a n dh e rp a r e n tw e r eo 8 2 5 3a n d0 8 2 3 9 f r o mt h a t ，h y b r i dt i l a p i a ( na u r e u s 0 n i l o a c u s ) g o tt h es a m ea m o u n to fg e n e t i cm a t e r i a lf r o mh e rp a r e n t s ( 4 ) b a s e do nu p g m at r e e ，t i l a p i a c l u s t e r e di n t ot w ob r a n c h e s n i l t , g e n o m a rt i l a p i a ，d a u r e u sa n dh y b r i dt i l a p i a ( 口a u r e u s 0 n i l o t i c u s ) c l u s t e rt o g e t h e r ；r e dt i l a p i a ，h y b r i dt i l a p i a ( 0 m o s s a m b i c u sxo h o r n o r u m ) ， dm o s s a m b i c u sa n dd h o r n o r u mg r o u p e de a c ho t h e r k e yw o r d s ：t i l a p i a ，r a p d ，1 2 sr r n a ，1 6 sr r n a ，c y t b ，d - l o o p ，g e n e t i cd i v e r s i t y , g e n e t i c r e l a t i o n 1 1 国内外罗非鱼现状 第一章文献综述 1 _ 1 1 罗非鱼的分类地位及分布 罗非鱼( f i l a p i a ) 隶属于硬骨鱼类纲( o s t e i c h t h y e s ) 、鲈形目( p e r c i f o r m e s ) 、鲈形亚目 ( p e r c o i d e i ) 、丽鱼科( c i c h l i d a e ) ，约有7 0 0 种( 陈素芝，1 9 9 2 ；林振亮等，2 0 0 4 ) 。 罗非鱼的分类较困难，一直存在争议。一些罗非鱼鱼类文献中，曾将各种罗非鱼 笼统地归为乃t a p a 属。目前最为广泛接受的是t r e w a v a s ( 1 9 8 2 ) 的分类法，可把罗非鱼 分为三个属，其代表种类及特征如表1 1 。 表1 1 罗非鱼的分类及其代表特征 t a b l 1 t a x o n o m yo ft f l a p i aa n dt h e i rr e p r e s e n t a t i v ec h a r a c t e r i s t i c s 属名代表性种类 代表性特征 豇k p 抽t z f f f f f( 1 ) 附着孵化 z r e n d a l l i ( 2 ) 鳃耙6 1 2 t c o l l g i c a ( 3 ) 颚、下咽骨上篦齿粗 z g u i n e e n s i s ( 4 ) 多食水生植物 s a r o t h e r o d o n s g a l i l a e u s ( 1 ) 雄鱼或双亲营口腔孵卵 s m e l a n o t h e r n ( 2 ) 鳃耙1 2 2 7 ( 3 ) 颚、下咽骨上篦齿细 o r e o c h r o m i so n i l o t i c u s ( 1 ) 仅雌鱼皆营口腔孵卵 d a u r e u sf 2 1 鳃耙1 2 2 7 o m o s s a m b i c u s f 3 1 颚、下咽骨上篦齿由粗到细排列 d m o r t i m e r i 罗非鱼原分布于整个欧洲大陆的淡水和沿岸的咸淡水水域，为非洲湖、河中的主 要经济鱼类。由于罗非鱼具有生长快、繁殖力强、食性杂、病害少、抗病力强、适应 性强等特点，现已在中美洲、南美洲和东南亚等地区广泛养殖。 1 1 2 罗非鱼国外引种养殖简史 罗非鱼原产于非洲，但其养殖业却始于东南亚。 1 9 3 9 年，拉克莫谢在印度尼西亚的爪哇岛偶然发现了莫桑比克罗非鱼，这是在 亚洲首次发现罗非鱼，当时仅见2 早36 ( 王楚松，1 9 8 7 ) 。几年后，该鱼即在爪哇岛普遍养 殖。迄今未见有莫桑比克罗非鱼从非洲移植到亚洲的其它记载。人们推测，后来亚洲 各地所养殖莫桑比克罗非鱼都是由这几条鱼繁衍而来，并认为这是其养殖性能差的原 因( 李思发，1 9 9 3 ) 。 莫桑比克罗非鱼于1 9 5 0 年被引入菲律宾，并迅速繁衍起来，但现已被淘汰。2 0 世 纪7 0 - 8 0 年代菲律宾先后十余次引进了尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、齐氏罗非鱼等种类 ( 白云飞，2 0 0 1 ) 。罗非鱼的引进与养殖彻底改变了该国淡水养殖的面貌。 日本最早于1 9 5 4 年从泰国引进了莫桑比克罗非鱼( 雍文岳，1 9 7 8 ；应杰，1 9 8 2 ) 。1 9 6 2 年从埃及开罗引进尼罗罗非鱼2 0 0 尾，约成活1 2 0 尾。同年又从埃及引入1 早26 的齐 氏罗非鱼f 李思发，2 0 0 0 ) 。 1 9 6 5 年，泰国从日本引进尼罗罗非鱼5 0 尾，成活1 9 旱1 96 ，次年起便大量繁殖， 并形成了较纯的c h i t r a l a d e 品系( 李思发，1 9 9 3 ) 。 1 9 4 6 年吴振辉和郭启彰将莫桑比克罗非鱼从新加坡引入台湾，这便是台湾“吴郭鱼” 的由来( 王楚松，1 9 8 7 ) 。此后，1 9 6 4 年从日本引入尼罗罗非鱼。1 9 6 9 年开始生产莫桑比 克罗非鱼和尼罗罗非鱼的杂交鱼，不论正反交杂交种，统称“福寿鱼”，为当时台湾农渔 民及一般消费者最重要的动物蛋白质来源。 美国于1 9 5 5 年引进莫桑比克罗非鱼鱼苗2 0 尾，1 9 5 7 年又从以色列引入奥利亚罗 非鱼1 0 尾到奥本大学，当时仅成活1 早36 。后来，1 9 7 4 年美国从巴西引入尼罗罗非 鱼的“加纳品系”鱼苗2 0 0 尾到奥本大学，同年又引进了该鱼的“埃及品系”，计成 活6 0 早2 06f 李思发，1 9 9 3 ) 。 1 _ 1 _ 3 我国罗非鱼引种养殖概况 自从1 9 7 8 年引入尼罗罗非鱼后，我国大陆罗非鱼养殖业有了迅速的发展。1 9 7 9 年 - - 2 0 0 4 年间，其产量以平均2 2 4 5 的速度迅速增长( 如图1 1 ) 。1 9 8 4 年产量仅o 8 1 万吨，2 0 0 4 年产量达8 9 7 万吨( f a of i s h s t a tp l u s l ，成为继中国大陆传统养殖种类鲢、 鳙、草鱼、鲤、鲫之后的第六位主要淡水养殖种类。我国大陆最主要的养殖品种是尼 罗罗非鱼( 吉富) 和尼罗罗非鱼( 吉诺玛) ，其次是奥尼罗非鱼和红罗非鱼，而橙色莫 桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼刚刚引进产量还很少。 1 1 3 1 莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼和莫荷罗非鱼 我国于1 9 5 6 年首次从越南引进莫桑比克罗非鱼，开始罗非鱼的养殖，但是由于该 鱼过度繁殖、生长慢、个体小、体色黑不受人们欢迎，逐渐被淘汰( 夏德全，2 0 0 0 b ) 。 近年来，橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼( 又名霍诺鲁姆罗非鱼) 被珠江水产研 究所引入。这两个品种是国内新引进种，主要在广东省高要市养殖。雌性橙色莫桑比 克罗非鱼和雄性荷那龙杂交后代，雄性率几乎可达1 0 0 。 图1 1 我国罗非鱼年产量变化e f l ( f a of i s h s t a tp l u s ) f i g u r e1 1 a n n u a lp r o d u c t i o no ft i l a p i a si nc h i n a ( f a of i s h s t a tp l u s ) 1 1 3 2 奥利亚罗非鱼 1 9 8 1 年我国首次引进奥里亚罗非鱼。1 9 8 3 年再次从美国奥本大学空运3 8 尾奥利 亚罗非鱼，次年繁殖5 万尾向全国推广( 王楚松，1 9 8 7 ) 。而美国的奠基群只有1 早36 。 大陆的奥利亚罗非鱼实际上都是这一尾雌鱼的后代( 李思发，1 9 9 3 ；曹萤等，1 9 9 7 ) 。 1 1 3 3 尼罗罗非鱼 1 9 7 8 年7 月，长江水产研究所首次从尼罗河苏丹境内引进2 2 尾尼罗罗非鱼，同年 湖北省又引进3 0 尾这些鱼很快取代生长慢、体色黑的莫桑比克罗非鱼在我国推广养殖。 此后，1 9 8 5 年湖南省水产局又从尼罗河下游埃及境内引进了一个尼罗罗非鱼品系，成 活1 0 尾，现主要在南方部分地区养殖( 吴福煌等，1 9 9 8 ) 。1 9 9 3 年全国水产技术推广总站 从美国奥本大学引进了一个尼罗罗非鱼品系( “美国”品系) ，是否推广，尚未见报道。 1 9 9 4 年从菲律宾转引了“埃及”品系3 0 0 0 尾，这是我国首次大批量引进尼罗罗非鱼。 1 9 9 5 年，再次从尼罗河苏丹境内引进5 3 尾尼罗罗非鱼。1 9 9 8 年9 月，李思发教授通 过政府渠道，从埃及引进原种尼罗罗非鱼3 0 0 0 尾，这是我国首次大批量直接从原产地引 进尼罗罗非鱼( 李家乐，李思发，2 0 0 1 ) 。我国目前养殖主要品种是尼罗罗非鱼( 吉富) 和 尼罗罗非鱼( 吉诺玛) 。 ( 1 1 尼罗罗非鱼( 吉富) 3 尼罗罗非鱼( 吉富) 是遗传性状改良后的罗非鱼( g e n e t i ci m p r o v e m e n to ff a n n e d t i l a p i a ) ，英文全称的词首字母缩写为n i l t ，中文以象音法称为吉富。该鱼是1 9 9 2 年在 亚洲发展银行( a d b ) 和联合国开发署c o n d p ) 的资助下，国际水生生物资源管理中心 i n t e r n a t i o n a lc e n t e rf o rl i v i n ga q u a t i cr e s o u r c e sm a n a g e m e n t ，( i c l a r m ) j 及其合作 者从非洲及菲律宾收集了8 个尼罗罗非鱼品系( 以色列、新加坡、台湾、泰国、肯尼亚、 埃及、加纳、塞内加尔) ，经过多代选育出来新品系尼罗罗非鱼( 李思发，2 0 0 1 ) 。1 9 9 4 年至1 9 9 6 年三年问，大量试验结果一致表明，吉富品系罗非鱼具有生长快( 李思发等， 1 9 9 7 ) 、起捕率高( 李思发，李晨虹，1 9 9 7 ) 及遗传性状稳定等优点，是一个值得推广的优 良品种。我国大部分养殖场养殖的尼罗罗非鱼( 吉富) 都是1 9 9 4 年从菲律宾引进的 那一批尼罗罗非鱼。 f 2 1 尼罗罗非鱼( 吉诺玛) 尼罗罗非鱼( 吉诺玛) ，又称g e n o m a r 超级罗非鱼。1 9 9 9 年，n i l t 基金与挪威 的私营公司g e n o m a r 联合，g e n o m a r 获得继续进行选择育种以及在国际上销售进一步 改良的n i l t 品系鱼的权利。目前g e n o m a r 公司已经在中国大陆建立分公司，开始销 售第十代培育出来的新品系( 刘峰等，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 4 奥尼罗非鱼 尼罗罗非鱼( 早) 奥利亚罗非鱼( 6 ) 杂交所产生的后代，一般称为奥尼鱼或尼奥 鱼，雄性率较高，可达8 0 9 0 。奥尼鱼在生长，产量，抗寒，起捕率等经济性状方面 具有明显的杂种优势( 王楚松等，1 9 8 9 ) 。 1 1 3 5 红罗非鱼 红罗非鱼是罗非鱼中生长速度较快的一种，由于杂食性，繁殖力强，广盐性，疾 病少，体大，体色鲜艳和肉味鲜美细嫩等特点，在广东和港澳地区很受消费者和生产 者的欢迎( 陈素芝，1 9 9 2 ；陈素芝等，1 9 9 4 ；李家乐等，1 9 9 9 ) 。1 9 7 3 年，珠江水产研究所从 日本引进1 2 0 0 尾以色列红罗非鱼，同年，广东水产研究所也从日本引进2 9 0 0 尾以色 列红罗非鱼。2 0 0 0 年，c p 食品公司从台湾引进台湾红罗非鱼。 红罗非鱼大多是莫桑比克的橘红色突变种和正常体色的奥利亚罗非鱼，尼罗罗非 鱼，霍诺鲁姆罗非鱼杂交后代( 何学军等，2 0 0 2 ) 。最早报道的台湾红罗非鱼，是雌性莫 桑比克的橘红色突变种与正常雄性尼罗罗非鱼的杂交后代( g a l m a n e t a l ，1 9 8 3 ) 。另外一 个佛罗里达红罗非鱼，是雄性莫桑比克的橘红色突变种与正常的雌性荷那龙罗非鱼的 4 杂交后代( b e h r e n d se t t ，1 9 8 2 ) 。随后佛罗里达红罗非鱼被引入巴西和牙买加开始与奥 利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼杂交，逐步遍布大多数中美洲和南美洲国家。第三种红罗非 鱼品系是从埃及红色尼罗罗非鱼与野生奥利亚罗非鱼杂交而成，称为以色列红罗非鱼 ( h u l a t ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。而且上述三个主要品系的红罗非鱼已经与来源不明的红罗非进行 杂交，所以大多数红罗非的遗传背景都需要进一步研究( l o v s h i n ，2 0 0 0 ) 。 1 1 4 我国罗非鱼存在主要问题 我国现有品种罗非鱼中，除去刚刚引入不久的一些原种外，对其它各品种罗非鱼 罗非鱼种质现状有一个基本共识，就是退化和混杂，而且随着时间的推移，情况会愈 加严重。退化的最明显表现是生活力降低，生长速度减慢，成熟个体小型化：种质混 杂，主要是渐渗杂交。引起种质退化和品种混杂的可能原因有：不合理引种，遗传渐 渗，近亲繁殖。 1 1 4 1 不合理引种 不合理引种主要有三种情况：一，繁殖种群的有效量过小。一个种群的群体因某 种原因( 如引种) 在数量上突然大量减少，就会发生遗传瓶颈效应，其结果是导致数量性 状的丢失，所保留的群体越小，丢失的越多，瓶颈次数越多，丢失越严重。例如1 9 8 5 年引进的8 5 系尼罗罗非鱼一共成活1 0 尾，繁育群体的有效大小还不足4 尾。而一般 认为，鲑鳟鱼类和鲤鱼有效引种群体量最少不低于雌雄各2 0 0 尾。 二，引进的种群种质不纯。罗非鱼是很容易种问杂交的鱼类，并且杂种可育。非 洲大多水域都生存两种或两种以上的罗非鱼。国内1 9 7 8 年从尼罗河苏丹境内引进的3 0 尾尼罗罗非鱼，经鉴定3 尾为伽利略罗非鱼。这说明该水域至少存在两种或两种以上 的罗非鱼，该水域尼罗罗非鱼的纯度令人怀疑。 一 三，间接引种。凡不是从原产地直接引种，而是从经引地的间接引种，均认为是 间接引种。间接引种可能发生多次瓶颈变异，同时由于经多次引种，种质混杂的机会 也可能增加。我国1 9 8 3 年从美国奥本大学引种的奥利亚罗非鱼，就是美国从埃及引种 存活1 旱36 奥利亚罗非鱼的后代。 1 1 4 2 遗传渐渗 遗传渐渗现象在国外罗非鱼中普遍存在( g r e g ge t 以，1 9 9 8 ；r o g n o ne ta l ，2 0 0 3 ) 。一 个物种的基因如果引入到另一个物种的基因库中的现象叫渐渗杂交。如果这两个物种 在自然界重叠分布，或在同一养殖系统里养殖，而且能产生可育后代，那么杂交后代 一般倾向于同较为繁盛的物种回交。这样就造成了群体内的大多数个体同较为繁盛的 物种相似，但也保留着另一亲本物种的一些性状。我国尼罗罗非鱼养殖群体中已存在 遗传渐渗问题，须注意防杂和提纯( 李思发等，1 9 9 5 ) 。 1 1 4 3 近亲繁殖 近亲繁殖往往导致近交衰退，它主要表现是生活力降低，生长受抑制，以及其它 经济性状的衰退。近交衰退的本质是由于同型合子的增加，使遗传基础变得简单化， 最终导致群体基因库萎缩。罗非鱼的产卵周期短，世代间隔小，很容易发生亲子间， 兄妹或表兄妹间的近交，更加速了近交衰退的发展。近交衰退会随着近交世代的增加 而累积，血缘越近的个体间交配，累积越快。 1 2 遗传多样性研究进展 1 2 1 生物多样性内涵 根据联合国生物多样性公约，生物多样性的定义是指所有来源的活的生物体 中的变异性，包括陆地、海洋和其它生态系统及其所构成的生态综合体，它包括物种 多样性、生态系统多样性和遗传多样性三个层次。 f 1 1 物种多样性 物种是遗传特征十分相似，能够繁殖出有生殖能力后代的一类生物。估计全球生 物种类在2 0 0 万到一亿之间，更准确地说大约在1 0 0 0 万左右，而已被人类描述和命名 的仅有1 4 0 万种，就是说绝大多数的物种尚未被发现和确认。科学家相信仅在深海底 部就可能有1 0 0 万个未被描述的物种。 f 2 ) 生态系统多样性 生态系统多样性是指生物圈内无机环境，生物群落和生态过程的多样性以及生态 系统内无机环境差异，生态过程变化的多样性。其中，无机环境不仅是生物群落乃至 生态系统形成的基本条件，而且无机环境的多样性在一定程度上影响了生态系统的多 样性。生物群落多样性则包括各种各样生存的生物群落，各群落彼此之间多层次的相 互作用及动态变化。生态过程是指生态系统的组成，结构及功能等在时间和空间尺度 上的变化，这也是生态系统研究中的一个重要方面。 ( 3 ) 遗传多样性 6 遗传多样性，又称基因多样性，是指种内不同群体之间或一个群体内不同个体的 遗传变异的总和。与物种多样性和生态系统多样性相比，基因的不可视性使得人们辨 别遗传水平的多样性比较困难。但它不仅是生物多样性的重要组成成分，而且是物种 多样性和生态系统多样性的基础，也是生命进化和物种分化的基础，更是评价自然生 物资源的重要依据。因为遗传多样性的降低可能减低一个物种对环境改变的适应能力， 降低生态系统中物种的丰富度，导致渔业资源的崩溃，甚至物种的灭绝。 1 2 2 遗传多样性研究方法 遗传多样性研究通常从4 个不同的水平进行，即形态水平，细胞水平，生化水平， d n a 水平。前3 个水平都是基因表达型的标记，可利用的多态座位很少，易受环境影 响，往往难以满足遗传多样性研究需要。然而，遗传信息储存在染色体、细胞器和基 因组的d n a 序列中，故d n a 水平的遗传多样性就显得格外引人注目。特别是上世纪 8 0 年代初分子标记和技术的出现和飞速发展对遗传多样性的检测和研究提供了更丰富 的手段。 1 2 1 1 形态标记 鱼类形态标记包括质量性状和数量性状。质量性状偏重于鳞被和体色，数量性 状则包括体长，体厚，体重，体高，头长，吻长，眼长等。形态学往往观察方便，所 以至今仍是许多物种起源分化的研究和物种分类的基础( 邓务国，1 9 9 4 ) 。但由于形态标 记是建立在个体性状描述和宏观观测水平上，得出的结论往往是不完善的，容易引起 争论( 苟德明等，1 9 9 5 ) 。 李加乐( 李家乐等，1 9 9 9 ) 报道奥尼同亲本尼罗罗非鱼，奥利亚罗非鱼形态上的异同 点和判别方法，建立区分尼罗，奥利亚和奥尼鱼的简单判别公式。并且认为从体色上 奥尼鱼偏于父本奥利亚罗非鱼，从三种多元分析的结果均表明奥尼鱼的体型偏于母本 尼罗罗非鱼。 李思发( 1 9 9 8 ) 通过传统形态学测定和框架测定相结合，用三种多元分析方法，比较 了尼罗罗非鱼五个品系的形态差异。尼罗罗非鱼品系间的形态差异属种内差异，须有 多项参数综合判别才能辨别。 1 2 1 2 细胞标记 显微镜技术的改进，不仅使人类认识到微观世界的生物多样性，并且建立了染色体 核型和带型分析技术来鉴别宏观物种的分类及核型演化。国内外从6 0 7 0 年代开始进 行鱼类染色体研究。先后有学者用压片法、胚胎细胞一低渗一空气干燥法、外周血淋 巴细胞培养低渗一空气干燥法、肾细胞p h a 活体注射一空气干燥法( 或火焰干燥法) 等多种方法相继用于鱼类染色体标本制各，使鱼类染色体的研究工作得到迅速发展，同 时各种显带技术c 带、r 带、q 带、g 带应用到鱼类染色体研究中。原位杂交技术及 显微图像分析仪等现代手段使染色体显带技术有了进一步完善和提高，染色体核型分 析研究由过去的以技术为主转向以寻求适宜方法为主( 韩荣成等，2 0 0 3 ) 。 陈敏容( 1 9 8 3 ) 等报道莫桑比克罗非鱼，尼罗罗非鱼，伽利略罗非鱼的二倍体染色 体数目都是4 4 ，8 s m + 3 4 s t + 2 t 。3 种罗非鱼的染色体组型形态基本相似，用常规染色体 染色的方法难以区分。 伊洪滨( 1 9 9 5 ) 采用p h a 体内培养法，取鱼体肾细胞用空气干燥法制备奥利亚罗非 鱼，尼罗罗非鱼的染色体，经核型分析，奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼均为2 n = 4 4 ， 6 s m + 2 4 s t + 1 4 t ；n f = 5 0 。 1 2 1 3 生化标记 1 9 4 1 年b e a l d 和t a u m 通过研究红色面包酶的生化突变型，提出了“一个基因一个 酶”的假说，创立了生化遗传学，这也是第一个将生化标记用于遗传多样性分析的实 例。生化标记主要指同工酶技术，迄今为止，应用同工酶技术研究遗传变异己积累了 丰富的资料，并建立起检测种群遗传分化、遗传多样性和基因流水平的方法。研究表 明，分布地域广、寿命长、基因交流频繁、结实量大、处于演变末期阶段群落中的物 种具有较高的遗传变异水平，影响生物种群遗传结构最重要的因素是繁育系统和基因 交流程度。 同工酶作为遗传标记虽然具有较稳定、简便、迅速、所需实验材料少等优点，但 是随着同工酶水平上研究的大量开展和深入，其弱点和局限逐渐为人们所认识。比如 同工酶电泳只能检测编码同工酶蛋白的基因位点，而对非结构基因则无能为力；并且 所检测的位点数目不可能很多( 一般常用2 0 3 0 个) ，尽管目前可分析的遗传座位超过1 0 0 个，但对整个基因组来讲只是很小的部分。因此，一批等位酶位点的变异并不一定代 表整个基因组的变异，而且有些隐蔽的变异可能无法通过电泳检测到，例如不改变氨 基酸序列的点突变，所以酶电泳可能会低估遗传变异水平。 李志忠( 2 0 0 0 ) 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分别对奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼及 8 其后代奥尼杂交鱼的5 种组织的m d h ( 苹果酸脱氢酶) 进行了比较。3 种罗非鱼肌肉组 织m d h 同工酶表现种间差异，即细胞质型f s m d h ) 在电泳时迁移率的不同可以作为鉴 别奥利亚罗非鱼，尼罗罗非鱼及其杂交种的遗传标记。 许玉德( 1 9 9 9 ) 用石蜡切片法和不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳法研究比较奥利亚 罗非鱼，尼罗罗非鱼和杂交种的精巢l d h ( 异柠檬酸脱氢酶) 同工酶。结果发现，罗非鱼 杂交一代兼容了双亲l d h 同工酶的酶谱特征。 赵金良( 1 9 9 7 ) 用聚丙烯酰胺凝胶水平电泳分析了“吉富”，“埃及”，“7 8 ”，“8 8 ”及 “美国”五个品系尼罗罗非鱼的生化遗传特征，发现不同品系尼罗罗非鱼在肝脏e s t ( 酯 酶) 同工酶的表型上有明显差异。r s t 2 谱带为吉富和埃及品系所特有，可作为与其他品 系罗非鱼区别的遗传标志。 1 2 1 4d n a 分子标记 1 9 5 3 年，w a s t o n 和c r i c k 提出了d n a 分子结构的双螺旋模型，宣布了分子遗传学时 代的到来。1 9 7 4 f i z ，g r o d z i c k e r 等首次提出d n a 限制性片段长度多态性可以作为遗传标 记，开创了直接应用d n a 多态性作为遗传标记的新阶段。1 9 8 5 年m u l l i s 等发明了聚合酶 链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r l ，大大加速了d n a 多态性的研究。随着分子 生物学的发展，遗传标记的概念发展为在核酸分子水平上具有相对差异的等位基因。 因它们广泛地存在于高等生物d n a 的编码区和非编码区，故称之为d n a ) _ r j _ - 子标记。 d n a 分子标记是基于研究d n a 分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在长 短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性，是d n a t j ( 平上遗传变异的直接反映。 根据多态水平的高低和发展历史，目前的d n a 分子标记可分为三类： 第一类是基于r f l p 和p c r 的d n a 分子标记，如：限制性酶切片断多态性( r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) ，变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) ，随机扩增多态性d n a ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ， r a p d ) ，寡核苷酸引物p c r ( o l i g op r i m e r - p c r ) ，单链构象多态性p c r ( s i n g l es t r a n d c o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m p c rs s c p ) ，d n a 扩增产物指纹分析( d n a a m p l i f i c a t i o n f i n g e r p r i n t i n g , d a d ，扩增片断长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， a f l p ) ，测序标记位点( s e q u e n c et a g g e ds i t e ，s t s ) 等。 第二类是重复序y i j d n a 分子标记，如小卫星d n a ( m i n i s a t e l l i t ed n a ) ，简单重复序 y o ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) ，简单序列重复区间( i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t s ， i s s r ) ，短重复序列( s h o r tr e p e a ts e q u e n c e ，s r s ) ，串联重复序歹l j ( t a n d e mr e p e a ts e q u e n c e ， t r s ) 等。这类d n a 分子标记，多态性水平较为丰富。 第三类是以测序技术为核心的分子标记，如表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ， e t s l 和线粒体d n a ( m t d n a ) 多态性标记。 现将遗传多样性常用的几种标记的原理和特点逐一分析归纳。 ( 1 ) r f l p 标记 r f l p 是1 9 8 0 年由美国学者b o s t s t e i n 发现的快速识别d n a 多态性的第一种方法， 现在依然被广泛应用。其基本原理是用限制性内切酶酶切不同个体的基因组d n a 后， 产生大小不同的d n a 片断，通过电泳和s o u t h e r n 印记转移到支持膜上，利用同位素或 非同位素标记的某一片断d n a 作为探针，使酶切片断与探针杂交，从而显示与探针含 同源序列的酶切片断在长度上的差异。这种差异反映了d n a 分子水平上的变异，它既 可能是限制性内切酶识别位点的改变，也可能是部分片断的缺失、插入、易位、倒位 等。 r f l p 标记的特点是：o r f l p 是一种共显性标记，它可以区分纯合体及杂合体基 因型，能够提供单个位点上较完整