（发酵工程专业论文）胰蛋白酶的固定化技术及其在水产加工中的应用研究.pdf

摘要 作为功能性材料的壳聚糖、脱乙酰壳聚糖，由于其一系列独特的性质作为固定化酶载 体材料已经广泛应用于酿酒工业、制糖工业、渔业、废水处理、环境污染的定点测控等研 究领域。固定化酶比游离酶具有多方面的优点。本文以多孔壳聚糖球为载体，戊二醛为交 联剂制备固定化胰蛋白酶，研究了多孔壳聚糖球载体的制备条件、固定化反应中戊二醛浓 度、给酶量、p h 值、温度、固定化时间对固定化胰蛋白酶活力的影响。并进一步对固定化 胰蛋白酶的性质，固定化胰蛋白酶水解鲢鱼蛋白的条件，以及鲢鱼蛋白的水解度，水解产 物中可溶性蛋白得率，氮溶指数进行了研究。 通过研究确定了制备多孔壳聚糖球载体的最佳条件为：壳聚糖浓度3 ，凝结液 为：4 n a o h ：9 5 乙醇( 4 ：1 ) ，室温处理3 h 。固定化胰蛋白酶的条件为：每克载体加入 交联剂( 用p h 值7 0 缓冲液配制戊二醛) 5 m l ，浓度为0 5 0 ，活化温度为2 5 ，1 5 0 r p m 条件下振荡活化2 h ，酶液的浓度为7 m g m l ( 用p h7 0 缓冲液配制) ，加酶量5 m l g 载体， 固定化温度1 5 c ，1 5 0 r p m 振荡固定化2 4 h 。在此条件下固定化胰蛋白酶活力4 7 2 3 9 u g 固 定化酶，固定化效率4 2 9 。固定化胰蛋白酶的最适反应温度范围3 0 c - - - 6 0 c ，游离胰蛋 白酶的最适反应温度5 0 c ；固定化胰蛋白酶的最适p h 值范围7 0 - - 9 0 ，游离胰蛋白酶最 适p h 值范围7 0 - - 7 5 。固定化胰蛋白酶的热稳定性和p h 值稳定性比游离酶有所提高。固 定化酶的k m 值为9 8 9 m g m l ，游离酶的米氏常数k m 值为8 9 9 m g m l 。利用固定化胰蛋 白酶水解鱼肉蛋白，重复4 次后，其活力为初始活力的4 6 0 6 。以2 0 的鲢鱼蛋白为底物， 水解时间1 2 0 m i n ，温度4 0 c ，最大水解度8 7 3 ，可溶性蛋白得率6 9 5 5 ，水解物的氮 溶指数6 2 2 4 。 关键词： 壳聚糖；胰蛋白酶；固定化酶；鲢鱼蛋白 a b s t r a c t c h i t i na n dc h i t o s a na sf t m c t i o n a lm a t e r i a l sh a v eau n i q u es e to fc h a r a e t e r i s t i e s i m m o b i l i z e d e n z y m ew i t hc h i t o s a n 嬲c a r d e rh a v e b e e nw i d e l yu s e di nw i n ei n d u s t r y , s u g a ri n d u s t r y , f i s h e r i e s ， a n df o rw a s t e w a t e rt r e a t m e n t ，t h ef i x e dp o i n tp o l l u t i o nc o n t r o la n ds oo n i nt h i sp a p e r , i m m o b i l - i z e dt r y p s i nw a s p r e p a r e du s i n gp o r o u sc h i t o s a nb e a d s 嬲c a r r i e ra n dg l u t a r a l d e h y d ea sc r o s s - l i n k i n ga g e n t t h ec o n d i t i o n s o fp r e p a r a t i o np o r o u se h i t o s a nb e a d s ，t h ee f f e c t so ft h e c o n c e n t r a t i o no f b o t he n z y m ea n dr e a g e n t ，t h ep nv a l u eo ft h es o l u t i o n ，t h et e m p e r a t u r e ，a n d t h er e a c t i o n t i m eo nt h ea c t i v i t yi nt h ew h o l ei m m o b i l i z ep r o c e s sw e r es t u d i e d w ea l s o r e s e a r c h e dt h ec h a r a c t e ro fi m m o b i l i z e dt r y p s i n ，t h ec o n d i t i o no fh y d r o l y s i ss i l v e rc a r p ，t h e d e g r e eo fh y d r o l y s i s ，t h es o l u b l ep r o t e i ny i e l da n dt h en i t r o g e nd i s s o l v e di n d e x a c c o r d i n gt o 仃i a l ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n o fp r e p a r ep o r o u se h i t o s a nb e a d sa r ea sf o l l o w i n g ： c o n c e n t r a t i o no fe h i t o s a nw a s3 ，c r o s sl i n k i n gs o l u t i o nw a s4 n a o h ：9 5 e t h a n o l ，g l o m e r a t - i n gt i m ew a s3 h ；t h eo p t i m u mi m m o b i l i z ec o n d i t i o nw a sp h7 0 ，c o n c e n t r a t i o no fg l u t a r a l d e h y d e 0 5 ，c o n c e n t r a t i o no ft r y p s i n7 m g m l ，t e m p e r a t u r e15 0 c ，a n dr e a c t i o nt i m e2 4 h a tt h i s c o n d i t i o nt h e a c t i v i t y o fi m m o b i l i z e dt r y p s i nw a s4 7 2 3 9 u gw e tp a r t i c l e s ，i m m o b i l i z e d e f f i c i e n c yw a s4 2 9 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ei m m o b i l i z e dt r y p s i nd i s p l a y e dt h eo p t i m u m a c t i v i t ya tp h 7 0 - - 。9 0 ，t e m p e r a t u r e3 0o c - - 6 0o ca n dk mv a l u e s9 8 9 m g m l a n df r e et r y p s i n s h o w e dt h eo p t i m u ma c t i v i t ya tp h7 o 7 5 ，t e m p e r a t u r e5 0o ca n dk mv a l u e8 9 9 m g m l c o m p a r e d 、析t hf r e et r y p s i n , t h ei m m o b i l i z e dt r y p s i nh a db e t t e rs t a b i l i t yi nt h e r m a la n dp h s t o r a g e s i l v e rc a r pp r o t e i nw a sh y d r o l y z e db yi m m o b i l i z e dt r y p s i nw h i c hw a sr e u s e d4t i m e s ， t h ea c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e dt r y p s i nr e m a i n e d4 6 0 6 o p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s4 0o c ，t h e d e g r e eo fh y d r o l y s i sw a s8 7 3 ，t h es o l u b l ep r o t e i ny i e l dw a s6 9 5 5 a n dt h en i t r o g e nd i s s o l v e d i n d e xw a s6 2 2 4 k e y w o r d s ：c h i t o s a n ；t r y p s i n ；i m m o b i l i z e de n z y m e ；s i l v e rc a r pp r o t e i n 发表论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 发表论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一、发表论文 。蛋白酶的固定化及其在生物活性物质开发中应用的研究进展，食品科学，2 0 0 0 8 ，0 2 ( 2 9 ) ：4 6 6 4 7 1 二、学位论文使用授权声明 本人同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容提供给有关方面，编入 中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、天津商业大学博 硕士学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 栖纠施 y 讴、 一 箜二童堕童 1 1 课题研究的背景 第一章前言 1 1 1 胰蛋白酶结构及催化机理 胰蛋白酶是一种动物来源的蛋白水解酶( 尤以动物的胰脏含量最丰富) ，属于内肽酶。 它易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有机溶剂，分子量为2 3 8 0 0 ，等电点为1 0 5 ，其 单一肽链含有2 3 3 个氨基酸残基和六对二硫键( 如图卜1 所示) 。 图1 1 胰蛋白酶的三维结构图，其活性中心由三种氨基酸组成：s e r a s p h i s 胰蛋白酶专一地水解赖氨酸与精氨酸羧基形成的肽键，活性按多肽、酰胺、酯的顺序 递减。胰蛋白酶属于水溶性蛋白质，在溶解状态下与底物溶液形成的均相反应体系中表现 出高的催化活性，在医药、食品工业等领域有广泛的应用1 2 1 ，还在蛋白质的序列分析， 多肽的酶促合成以及亲和吸附分离等方面有广泛的应用前景【3 1 。但是未经固定化的胰蛋白 酶在溶液中稳定性差，容易发生消化反应，使酶催化反应难以控制，催化效率下降，不利 于产物的提纯精制，导致生产成本高。因此固定化胰蛋白酶的研究具有重要的意义。 1 1 2 蛋白酶的简介 酶是一类生物催化剂，能够催化构成细胞代谢的所有反应，生物体内形形色色的化学 反应均是在酶催化下进行的。到目前为止，人们已从生物体( 动物、植物以及细菌等微生 物) 中分离、鉴定出2 0 0 0 多种酶。它的主要成分为蛋白质，还有一些辅助成份是由非蛋 白质结构，如金属离子：钠( n a + ) 、钾( k + ) 、镁( m g + ) 、锌( z n 2 + ) 、铜( c u 2 + ) 、铁( f e 2 + ) 1 第一章前言 等，以及有机化合物：v c 、v b 、v a 等一类的维生素物质构成。它们起到辅助酶蛋白催化 底物作用。若缺少这些成份，酶蛋白的催化活性将大大降低，甚至不能起催化作用。因此， 人们将酶蛋白加辅助因子这两部分结合体，称为全酶。同一般催化剂相比，酶有以下几个 特点：催化效率高，酶可在常温常压下操作，不需要高温高压和强烈的酸碱度；专一 性强，对底物具有高度的特异性，也就是说，一种酶只能作用于一种底物或一类化合物； 反应条件温和，酶本身为蛋白质，它对化学品、温度、p h 都十分敏感，故可用简单的办 法来控制反应进程；酶的活性是可以调节控制的。 虽然酶在生物体内能够催化许多化学反应，但用作工业催化剂仍存在缺陷【4 】。因为酶 是由蛋白质组成的，其高级结构对所处的环境十分敏感。一般情况下，对热、强酸、强碱、 有机溶剂等均不够稳定，在存放、反应中容易失活，酶中常常带有杂蛋白及有色物质，易 造成产物被污染，难以分离提纯，限制了酶促反应的广泛应用。在本世纪六十年代发展起 来的酶固定化技术既克服了上述不足【5 】，又在一定程度上保持了酶特有的催化活性，从而 成为生物技术中最为活跃的研究领域之一。1 9 7 1 年第一届国际酶工程会议正式对固定化酶 6 1 下定义为：固定化酶( i m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e ) 是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶， 能连续的进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。 1 1 3 蛋白酶的固定化原则 为了最大限度发挥固定化酶的优势，并避免其缺陷。通过几十年的探索研究，人们已 经总结出了一套酶固定化的遵循原则川，具体如下： 必须注意维持酶的正常构象。酶蛋白的活性中心与空间构象密切相关。因此，在酶 的固定化过程中，要维持酶的正常构象，保证酶的活性，做到不伤及酶的活性中心； 固定化酶应能有效回收储藏再利用。所以酶与载体必须有一定的结合强度，利于反 复使用； 固定化应有利于生产自动化，连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械 强度，不能因机械搅拌或其他作用力而破碎或脱落； 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近以及产物的扩散； 固定化酶载体应有较好的稳定性，不与底物、产物或反应液发生化学反应； 固定化酶的制备步骤应相对简单易行，以利于工业生产。 1 1 4 固定化酶的性质一1 酶在水溶液中以自由的游离状态存在，但是固定化后酶分子便从游离状态变为牢固结 2 第一章前言 合于载体的状态，其结果往往引起酶性质的改变，一般认为其原因可能有两种：一是酶本 身变化；二是受固定载体的物理或化学性质影响。所谓酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化；载体影响则主要体现在固定化酶的 周围形成了能对底物产生影响的扩散层，以及静电的相互作用等。 1 1 。4 1 相对活性的改变：固定化酶与自由酶相比，其活性总是有不同程度的下降，其影 响因素主要有以下四个方面：底物与相对活性：酶固定化后，由于载体的空间位阻阻碍 大分子底物的接近，因而水解大分子底物能力的降低比水解小分子底物能力的降低更为显 著；专一性与相对活性：由于酶在固定后产生立体障碍，所以尤其在作用于大分子底物 时，酶的专一性会发生改变，而且酶的活性会有所降低。根据酶的专一性不同，采用同样 载体同样方法制得的固定化酶的相对活性也将不同；酶量与相对活性；单位载体上偶联 的酶少，相对活性也就比较高；偶联酶越多，相对活性就越低；载体与相对活性；载体 结构对固定化酶的相对活性有着极为重要的影响。 1 1 4 2 最适p h 值与p h 曲线的改变：酶在固定后，最适p h 值与p h 曲线常会发生偏移。 一般认为由两种因素造成：一是载体含有大量带电基团，其多电解质的微环境影响着酶的 活力；二是由于酶作用产物导致在固定化酶颗粒内建立一种带电的微环境。 1 1 4 3 米氏常数的改变：酶在紧紧结合于电中性载体的表面或孔内后，载体造成的微环 境使扩散因素成为酶反应动力学的限制因素。底物分子以扩散运动穿过扩散层而与固定化 酶接触反应。由于酶的作用引起扩散层中底物浓度迅速降低，而载体的空间位阻却妨碍新 的底物扩散进来，因而必须在相对于自由酶较高的底物浓度时才能达到最大反应速度。这 在动力学参数上表现为米氏常数( k m ) 比自由酶的米氏常数( k i n ) 要高。而且由于载体 的干扰和酶蛋白本身在固定过程中侧链基团的化学改变，往往导致最大反应速度( v m a x ) 变小。 1 1 4 4 稳定性的增加：酶在固定后，稳定性普遍增加，表现在以下几个方面：热稳定 性增加；储存稳定性增加；在蛋白质变型剂中的稳定性增加。 1 1 5 酶解海洋蛋白的研究背景 1 1 。5 。1 活性肽的研究现状 生物活性肽是指那些有特殊生理活性的肽类。过去认为，人体吸收的蛋白质主要是以 氨基酸的形式吸收的，近年来，国际科学界研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后，主要 以小肽的形式吸收比完全游离氨基酸更易，更快被机体吸收利用【1 0 1 。从营养角度评价，二 肽、三肽等低肽被人体消化吸收的效率要比同一组成的氨基酸高，因此可作为食品添加物。 3 第一章前言 这些低肽的渗透压较氨基酸低，而且在人体小肠部位的通透性也比氨基酸高，因此可提高 吸收率。此外，低肽的风味一般要优于单个氨基酸，也不易产生过敏。其中某些低肽不仅 能提供人体生长发育所需的营养物质，且同时具有重要的生理功能，如促进矿物质吸收肽、 防治肝性脑病肽、易消化吸收肽、抗菌肽、吗啡片肽、类吗啡拮抗肽、血管紧张素转换酶 抑制肽、抑制胆固醇作用肽、机体防御功能肽等。上述功能是原蛋白质或组成氨基酸所不 具备的，且许多活性肽的组成氨基酸并不一定是必需氨基酸，对其营养性影响不大【1 1 】。这 就为更充分地利用蛋白质资源，特别是那些原本认为生物效价不高的蛋白质资源提供了新 的机遇。 由于天然存在的活性肽大部分或含量微少，或提取难，不足以大量生产供给所需；化 学人工合成又费时费力，成本昂贵；因此，人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物这条 途径来。 1 1 5 2 海洋蛋白源是开发生物活性肽的重要资源之一 海洋生物资源的优化利用和高值化是未来1 5 年我国海洋高技术发展的重要研究内容 之一。海洋生物物种的多样性以及所含化合物的特异性，为海洋生物资源的开发利用提供 了许多机遇与挑战。由于海洋存在许多极端环境，如高压( 深海) 、低温( 极地、深海) 、高 温( 海底火山口) 和高盐等。为了适应这些极端的海洋环境，海洋生物蛋白质无论氨基酸的 组成或序列都与陆地生物蛋白有很大的不同。种类繁多的海洋蛋自氨基酸序列中，潜在着 许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就释放出有活性的肽段。 将陆地微生物发酵工程和酶工程技术应用于海洋蛋白资源的综合利用研究，以海洋生 物蛋白资源为原料，通过生物酶解、提取、加工，可生产许多酶解陆地蛋白源和化学合成 所无法生产的产品和材料，研制出系列天然、高效、新颖的生物活性肽。通过蛋白酶水解 这些蛋白所获得的生物活性肽具有很多优点：原料廉价，成本低，安全性好，不需要很高 级的实验条件和很贵重的仪器设备，便于工业化生产。大量文献表明，该研究领域发展很 快，已经受到了各国科学家和政府的高度重视，在短短的几年里就有众多的生物活性肽被 辨认出来并进行了系统研究。通过酶工程技术现已从海洋低值鱼虾中分离出多种具有抗高 血压活性的活性肽。其氨基酸序列如下：c 8 肽( 沙丁鱼) 为l e u l y s v a l g l y v a 卜l y s g l n t y r ；c l l 肽( 沙丁鱼) 为t r y l y s s e r p h e l y s i l e l y s g l y t y r p r o v a l m e t ： c 8 肽( 金枪鱼) p r o t h r h i s i l e l y s t r p g l y - a s p ；c 3 肽( 南极磷虾) 为l e u - l y s t y r 。但游离酶的不稳定性以及成本高一直制约着酶解制备活性肽的大规模生产。 1 2 课题研究的国内外文献综述 4 第一章前言 1 2 1 固定化酶的一般方法： 依据酶的性质及用途，传统固定化方法可分为包埋法、吸附法、共价结合法、交联法 4 种【1 2 】。 1 2 1 1 包埋法： 包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中，这样可以防止酶 蛋白释放，但是底物仍能渗入格子内与酶相接触。此法较为简便，酶分子仅仅是被包埋起 来，生物活性破坏少，但此法对大分子底物不适用。 凝胶包埋：凝胶包埋法是将酶包埋在交联的水不溶性凝胶的空隙中的方法。交联聚丙 烯酰胺凝胶包埋法是首先被采用的包埋技术。 微胶囊包埋：将酶包埋于半透性聚合体膜内，形成直径为l - 1 0 0 1 x m 的胶囊j 这种固 定化酶是以物理方法包埋在膜内的，只要底物和产物分子大小能够通过半透膜，底物和产 物就能够以自由扩散的方式通过膜【1 3 】。 1 2 1 2 吸附法： 吸附固定是最简单的方法，酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和氢键。此方 法又分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法：使用对蛋白质具有高度吸附能力的非水溶性载体，如活性炭、几丁质、 多孔玻璃等作为吸附剂，将酶吸附到表面上使酶固定化，这种方法操作简单，反应条件温 和，载体可反复使用，但结合不牢固，酶容易脱落。 离子吸附法：利用蛋白酶在解离状态下可用电荷引力而固着于带有与酶蛋白电荷相异 的离子交换剂( z k 不溶性载体) 上的固定化方法。此法操作简单，固定较为牢固，在工业 上用途颇广。 1 2 1 3 共价法： 蛋白酶分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键连接的方法。 其优点是酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件 苛刻，目前已建立的方法包括：重氮法：如图1 - 2 所示，将具有氨基的不溶性载体，以 稀盐酸和亚硝酸钠处理，成为重氮化物，再与酶分子偶联，酶蛋白中的游离氨基，组氨酸 中的咪唑基，酪氨酸中的酚基，可与其结合。 r _ 小m 2 一【】走n - - n c n 【酶】一r _ - n = n _ 一【酶】 图卜2 重氮法固定化酶示意图 5 第一章前言 肽键法：此法是将有功能基团的载体与酶蛋白中赖氨酸的e 一氨基或n 末端的a 一氨基作 用形成肽键，成为固定化酶。烷基化法和芳基化法：以卤素为功能基团的载体与酶蛋白 的氨基或巯基发生烷基化或芳基化反应形成固定化酶。交联法：使酶与带两个以上的多 官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交 联酶。与共价结合法一样都是靠化学结合的方法使酶固定化，其区别在于交联法使用了交 联剂。 1 2 2 传统固定化改进方法 对传统固定化方法的部分改进能提高固定化酶的活力，如将戊二醛的一端用二乙醇胺 保护后活化载体，再脱保护并用于酶的固定化，避免了载体或酶的自身交联反应，从而可 以较大幅度地提高固定化酶的酶活力回收 1 4 。利用空间悬臂技术将减小酶促反应及固定化 酶时的空间阻碍而提高固定化酶的活性，如采用不同链长的二元胺等交联剂活化聚氯乙烯 及聚丙烯酸甲酯等大孔球状载体时，固定化酶的活力随着侧基的链长增加而提高。m e r y e m n o u a i m i 等研究了将胰蛋白酶分别通过聚y , - - 醇二胺( p e g d i a m i n e ) 、葡聚糖醛、葡聚糖氨 牛血清白蛋白固定在合成高分子材料聚酯上与直接将胰蛋白酶固定在聚酯上，证实了通过 长臂可以将生物分子有效定向固定在固体介质上，有效减小由于介质表面特性引起的立体 位阻和空间环境的影响 1 5 】。此外四种传统固定化方法的联合使用是设计高效合理固定化酶 的发展趋势。 1 2 3 现代固定化方法定向固定 定向固定法即通过不同的方法，把酶和载体在酶的特定位点连接起来，使酶在载体表 面按一定的方向排列，使它的活性位点面朝载体表面的外侧排列( 如图卜3 ( b ) 所示) 。传统 的固定化方法随机固定化( r a n d o mi m m o b i l i z a t i o n ) ( 如图卜3 ( a ) 所示) 常导致酶 活力下降，这主要是因为酶蛋白常常通过赖氨酸残基上的e 一氨基与载体活性基团偶合， a b 图卜3 ( a ) 酶的随意固定化( b ) 酶的定向固定化 6 性也点 第一章前言 酶表面分布有多个赖氨酸残基，与载体作用时可以采取多种空间取向，酶蛋白多点附 着在载体上，结构发生了变异，增加了底物接近酶活性中心时的空间位阻，使酶活力下降， 同时，多位点结合也会降低固定化酶的载酶量。由于酶的定向固定化有利于底物进入到酶 的活性位点里去，具有容量大、活性高的优点，将成为今后固定化酶方法研究的一大热点 【1 6 一删 o j a r o s l a v at u r k o v a 、邵文海、曹黎明等先后对定向固定化方法做了综述，据报道定向固 定化酶的方法有：氨基酸置换法、抗体偶联法、生物素亲和法、疏水定向固定法、酶和金 属离子连接法、共价固定法等【2 1 彩】。 h u a n g 等通过定点突变在枯草蛋白酶( s u b f i l i s i n ) 分子表面远离活性中心的位置引入半 胱氨酸( c y s ) 残基【2 4 】。经蛋白质空间折叠后暴露出c y s ，利用c y s 残基上的巯基固定枯草 蛋白酶分子，取得了较好的固定效果。定点突变用于定向固定要求对蛋白质的核酸序列及 空间结构有充分了解，蛋白质分子表面不含所要引入的氨基酸残基，而且引入的氨基酸不 能影响蛋白质分子的正常空间折叠及构象改变。v i s w a n a t h 等用特定位点基因突变法实现定 向固定化酶嘲。如果酶中没有半胱氨酸或酶的活性位点中没有半胱氨酸，可以在酶的特定 位点上通过基因突变引入特殊半胱氨酸，例如将丝氨酸变为半胱氨酸，一般对于这个半胱 氨酸，酶可以通过引入的半胱氨酸的一侧的巯基和载体表面的亲巯基团反应，从而使酶和 载体在特定位点进行固定化。枯草杆菌蛋白酶( s u b t i l i s i n ) 没有半胱氨酸，而且在远离活性位 点的位置存在丝氨酸，可以通过基因突变法用s h 替代一o h ，把丝氨酸变异为半胱氨酸，通 过动力学分析发现变异后的酶的活性与水溶液中的酶的活性并没有太大的区别，说明这种 变异对酶的功能没有影响。 s p i t z n a g e l 等用碘乙酸活化多孔玻璃珠，定点固定抗体酶4 8 g 7 4 a 1 的f a b 片段用于反应 动力学研究【2 6 1 ；z b l l k o v a 等以无孔羟烷基甲基丙稀酸酯固体为载体，通过固定异凝乳蛋 白酶的多克隆抗体定向固定胰凝乳酶，载体的负载1 达1 6 6 7 i _ t g g ，固定化胰凝乳酶的回收 率达蛩j l o o ，固定化酶分子的有序排列，使活性中心充分暴露，使大分子底物易于接近 酶活性中心，固定之后酶的动力学参数有所提高【2 7 】。 m a r i e - l a m el e s a i c h e r r e 等分别通过生物素和其抗体之间的亲和作用、硫酯和n 末端含 半胱氨酸的通过化学连接反应实现缩氨酸在玻璃载体表面的定向固定【2 8 1 。 金属离子螯合亲和层析( 妇m o b i l 娩e dm e t a li o na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , i m a c ) 技术$ j 用金属螯合配体与蛋白质表面的供电子氨基酸一组氨酸的咪唑基，胱氨酸的巯醇基等( 其中 以组氨酸最为重要) 以配位作用紧密结合的原理，从而对蛋白质进行分离、纯化【2 9 】。金属 第一章前言 螯合载体对固定到表面的蛋白质构象影响小，这种技术可应用于定向固定化酶。p a w a n g u p t a 等利用该技术将菠萝蛋白酶定向固定在金属螯合载体琼脂糖6 b 一亚氨基二乙酸 ( i d a ) 一c u 2 + 上，固定化酶的回收率、稳定性、操作稳定性大大提高【3 0 1 。刘琳琳等利用金属 螯合配体与蛋白质相结合的原理，选用磁性琼脂糖一亚氨基二乙酸( i d a ) 一c u 2 + 做为金属螯 合载体，定向固定了木瓜蛋白酶，并对固定化条件和酶学参数进行了深入研究，为这种技 术广泛应用于固定化酶奠定了基础【3 1 】。 1 2 4 固定化酶载体材料的研究概况 1 。2 4 。1 载体的选择 固定化酶的性质是由酶和载体两者共同决定的【3 2 1 ，它们之间的交感作用使固定化的酶 具有独特的物理化学和动力学性质，而此性质对于实际应用具有重要意义。在选择载体时， 固定化酶对载体材料的性能有如下要求【3 3 1 ： 功能基团一般来说，载体材料带有能与酶发生反应的官能团，如带有o h 、。c o o h 、 c h o 等反应性基团，则可大大提高载体材料与酶之间的结合力，同时也提高固定化酶的操 作性和稳定性； 渗透性和比表面积好的载体材料应具有大的比表面积和多孔结构，因为具有这样 结构的载体材料易和酶相交联，并可提高固定化率； 溶解性一般来说，载体材料要求是不溶于水的。这不仅可以防止酶失活，还可以 防止酶受到污染； 机械刚性及其稳定性这些对载体材料是非常重要的性质。由于固定化酶的一个最 大的特点是要能重复使用，这就要求载体材料的机械刚性和稳定性都非常好； 组成和粒径一般来说，材料的粒径越小，其比表面积就越大，与自由酶固定化程 度就越高，固定化效率也就越高； 对微生物的抵抗性在长时间的使用中，载体材料必须要能防止微生物的降解作用， 对微生物抵抗性好的载体材料可以长时间的使用； 再使用性这对于那些比较昂贵的载体材料尤其重要，如其再使用性能很差，就会 提高固定化酶的操作成本。 载体材料作为固定化酶的一部分，其结构特性对固定化酶的各种性能都有着巨大的影 响，因此自固定化酶技术兴起以来很多学者就一直致力于对载体的研究。随着科学技术的 发展无机材料、天然高分子材料、合成高分子材料以及复合材料等先后用于固定化酶载体 r 材料的研究。 1 2 4 2 壳聚糖材料 壳聚糖材料是地球上存在的及其丰富的天然高分子材料，其含量仅次于纤维素是唯一 的一种天然碱性多糖，其来源广泛是世界上产量最丰富的、可再生的有机资源之一，因此 壳聚糖材料是令人感兴趣的一类适合工业需要的固定化酶载体材料。甲壳素( 蚓化学命 名为b ( 1 ，4 ) 一2 乙酰氨基- 2 脱氧d 葡萄糖，壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素的脱乙酰基 产物，也叫脱乙酰甲壳素，简称( c t s ) 。它们的结构式【3 4 】分别为： o o c h i t o s a n o 图1 4 甲壳素( c h i t i n ) 和壳聚糖( c h i t o s a n ) 的结构 甲壳素结构与纤维素类似，分子中含有h o h 和h - n h 键可进行化学修饰，还含有 分子间氢键。甲壳素的这种有序的大分子结构，在一般的溶剂中不容易溶解。壳聚糖的分 子结构中含有游离氨基，溶解性能有了一些改观，但也只能溶于某些稀酸，如盐酸、醋酸、 乳酸、苯甲酸、甲酸等，不溶于水及碱溶液。壳聚糖材料比其他固定化酶载体具有独特的 生化性质：无毒性、良好的凝胶特性，独特的生物兼容性、降解产物的无毒性、生理惰性、 显著的蛋白质的亲和性、金属离子螯合性等。甲壳素壳聚糖是一种取之不尽、用之不竭的 再生资源，它们能以相对低廉的成本从甲壳类动物( 主要是螃蟹、小虾、龙虾、磷虾) 的硬 9 第一章前言 壳中获得，也可以从海产品加工业的废物中获得。近十多年来，国际上十分重视这一资源 的开发和利用，从1 9 7 7 年至1 9 9 1 年己召开了5 次开发利用甲壳素的国际会议。目前， 壳聚糖材料尚未得到充分的开发利用，与其它一些酶的固定化载体相比，具有广泛的开发 前景。 g 锄z ed u r g m la l t l 】n 等用乙二醛为交联剂制备壳聚糖球载体固定化胃蛋白酶【3 5 1 。该方 法制备的壳聚糖珠，克服了长时间在酸性条件下壳聚糖颗粒融解的问题，与溶液酶相比热 稳定性及贮存稳定性有很大程度的提高，由牛奶凝乳试验证明固定化胃蛋白酶可用于实际 生产。z h e n x i n gt a n g 等用离子凝胶法制备壳聚糖颗粒，用于固定化中性蛋白酶的研究【3 引。 酶固定在壳聚糖颗粒上之后，热稳定性，操作稳定性，以及储藏稳定性都大大提高了。f e n g n a ) ( i 等用壳聚糖一聚7 , - - 醇( p e g 2 0 0 0 ) 包埋硅胶制备多孔载体固定胰蛋白酶，分别以环氧 试剂，重氮试剂，戊二醛等活化载体制备固定化酶 3 7 1 。实验结果表明，重氮化作用得到的 固定化酶活性回收率最高。固定化酶的稳定性比溶液酶明显提高，溶液酶和固定化酶的最 适温度都在4 0 左右，重氮化作用制备的固定化酶最适温度6 0 c 。 壳聚糖与粘土、活性炭等天然吸附类材料耦合制备凝胶可以克服单一壳聚糖凝胶密度 小易漂浮于底物表面，影响传质的缺点，且能增大凝胶机械强度使结构更加紧密有序。 m i n y u nc h a n g 等研究了以壳聚糖和粘土的复合物固定化p 葡萄糖苷酶，有效地提高了酶的 热稳定性和酶活【3 8 】。具体方法如下：等量的壳聚糖和活性泥混匀，用1 的乙酸配成2 的 胶体，用注射器以恒定速度滴到1 5 n a o h 和9 5 乙醇混合溶液( 体积比为4 ：1 ) 中交联1 天， 去离子水反复冲洗之至中性得固定化载体。利用此方法分别研究了以湿态壳聚糖复合物和 冷冻干燥后壳聚糖复合物以及纯壳聚糖为载体，用戊二醛活化固定化酶。试验结果表明固 定化酶的储藏稳定性比游离酶提高了许多，重复使用5 0 次后，干燥的复合载体固定化酶的 活性比其他两种载体固定化酶的活力高。 1 2 4 3 纳米材料 纳米材料是指具有纳米量级的超微粒构成的固体物质。纳米材料具有三个结构特点： 结构单元或特征维度尺寸在纳米数量级( 1 1 0 0r i m ) ；存在大量的界面或自由表面； 各纳米单元之间存在一定的相互作用。由于纳米材料结构上的特殊性，用纳米材料作固定 化酶载体具有一些独特的优点：提供较大的比表面积，可以根据蛋白质分子的大小设计合 适的孔径，具有较大的负载量，最大程度降低酶分子和底物之间的扩散限制阻力。j u n g b a e k i m 等阐述了纳米材料在固定化酶，以及提高酶的稳定性方面的最新进展，指出纳米技术 1 0 第一章前言 的发展和纳米材料的开发为固定化酶的发展以及提高酶稳定性提供了新的机会【3 9 1 。 近年来纳米技术取得突破性进展，开发出各种各样的纳米材料满足纳米材料在各领域 应用需要。尽管纳米材料作为固定化酶载体材料的研究还处于探索阶段，通过各种方法包 括吸附法、共价结合法、包埋法、以及各种传统方法的综合运用将酶固定在纳米载体的研 究已有报道。纳米材料从形态结构上可分为：纳米颗粒、纳米纤维、多孔纳米材料和单分 子纳米酶颗粒四类。 ( 1 ) 纳米颗粒 j i a 等指出纳米颗粒在溶液中独特的性质，在均相和异相的中间态催化作用值得关注 【4 0 1 。颗粒大小以及溶液粘度决定颗粒在溶液中的灵活性，理论和试验研究证明颗粒的灵活 性影响颗粒状固定化酶的活性。 ( 2 ) 纳米纤维 k i m 等以戊二醛为交联剂，将0 【。胰凝乳酶聚集体固定在电镀聚苯乙烯纳米纤维表面， 酶负载量比共价法高9 倍多【4 l 】。固定化酶操作稳定性极好，在连续一个月振荡条件下检测 没有活性损失。这种方法将酶固定在纳米纤维上，酶的稳定性，酶活回收率大大提高，为 酶在生物医药，生物传感器等领域的大规模应用提供了可能。 ( 3 ) 多孑l 纳米材料 自1 9 9 2 年m o b i l 课题组开发出多具有高比表面积、高孔体积、以及有序孔道的多孔材 料m c m - 4 1 以来，纳米材料中孔径大小为2 - - 一5 0 n m 的介孔分子筛等多孔硅酸盐材料作为 生物催化剂载体的备选材料之引起了广泛关注。d i a z 和b a l k u s 第一次报道了将酶固定在介 孔分子筛m c m 4 1 ，发现固定化酶的效果取决于酶分子的大小【4 2 】。尤其是大分子酶如山葵 过氧化物酶( 直径为4 6 n m ) 固定在m c m 4 1 ( 孔径4 n m ) 载体上，固定化效率很低。但 是m c m - - 型载体固定化小分子酶取得了很好的结果。随后，s b a 1 5 ( 孔径为5 - - 一1 3 n m ) 和m c f 一型( 孔径为1 5 - - 一4 0 n m ) 材料的出现解决了m c m 4 1 载体不能固定化大分子酶的 问题。d e e r e 等详细研究了用多孔硅酸盐固定化细胞色素c ，研究表明只有多孔硅酸盐的 孔径大于蛋白分子直径，并且多孔硅酸盐表面经充分改性之后，才能达到很好的吸附效果 4 3 1 。y i u 等研究了将胰蛋白酶吸附在m c m 4 1 ，m c m 4 8 ，s b a 1 5 等具有纳米级孔径载体 上，其研究结果表明多孔材料表面的功能基团对固定化效果起关键作用，载体载酶量的高 低取决于载体孔径和酶分子直径大d 4 4 4 1 。近几年的研究趋势是通过更精密的方法修饰多孔 硅酸盐材料，扩大入口孔径尺寸或者改变孔径结构而是酶分子迅速固定在多孔材料上。用 多孔材料固定化酶已应用于生物传感器，多肽合成，纸浆漂白等方面，相信在不久的将来 第一章前言 会有越来越多的固定化酶在不同领域的应用被报道。 ( 4 ) 单分子纳米酶颗粒 k i m 等报道了一种纳米酶复合物颗粒( s e n s ) ，是提高酶稳定性方面的一个创新【4 5 i 。 s e n s 的合成方法：首先乙烯基通过共价修饰酶分子表面的赖氨酸残基，用烯丙酰氯连接到 酶分子表面，在酶分子表面形成线性聚合体；其次把与酶分子共价结合的聚合体置于水相 中，线性聚合体在水相中水解并相互聚合，从而在每个酶分子间形成有机或无机复合物网 格( 如图1 5 ) 。严格控制反应条件，使交联反应只在酶分子表面发生，产生离散的纳米酶 颗粒，而不是包埋聚合酶( 如图1 6 ) 。以蛋白酶为模型制备纳米酶颗粒s e n s ，产率达3 8 7 3 ，这一结果表明采用s e n s 的形式固定化酶在更多领域里应用是可行的。在s e n s 独特 结构中，酶分子通过多点共价结合置于三维聚合网格中，网格的厚度仅几纳米，使底物和 酶分子的活性位点能够充分接触，没有传质障碍。固定化胰凝乳蛋白酶s e n c t ，和游离 胰凝乳蛋白酶相分别置于3 0 。c 缓冲液中，游离酶2 天内迅速自溶，而固定化酶活性6 天内基 本不变。4 c 条件下保存五个月固定化酶的活力基本不变。动力学研究表明，酶分子表面 的纳米级网格对酶与底物的传质没有明显影响。 图1 - 5 单分子纳米酶颗粒合成示意图 o e n z y m 2 v n i e i d e s 图1 - 6 单分子酶颗粒与包埋法固定化 酶的示意图 s e n s 是一种活性和稳定性都很高的酶的形式，由于s e n s 颗粒仅几纳米大小，因此可 进一步固定在多孔材料上，预计联合s e n s ( 活性和稳定性极高的酶) 和多孔材料( 提供大 表面积和可调孔径的载体) 可制备出理想的酶反应器，应用于生物制药，生物传感器和其 他生物催化过程。 1 2 第一章前言 1 2 4 4 人工合成高分子材料 高分子合成材料具有良好的抗微生物性能，机械强度大，有再生能力和价格优 势。因而以高分子合成材料开发研制酶固定化载体前景看好。9 5 年以来，多家杂志 先后对多种新型人工合成高分子材料作为酶固定化载体的可行性进行了报道，如聚 丙烯酸甲酯大孔树脂( 交联度为3 0 ) 经二乙烯三胺胺化在p h = 7 5 时固定化猪胰 蛋白酶效果良好。用聚苯乙烯阴离子交换树脂为载体吸附a 一淀粉酶，用对苯二酚 与甲醛合成凝胶状树脂固定糖化酶等。苯氨基磺酸型多孔聚苯乙烯可经重氮化与酶 结合；而磁性聚乙二醇载体和，一羧基聚乙二醇磁性毫微球可以通过戊二醛为 交联剂固定化酶。l e asb o n n i n g t o n 等人用聚醚氨与p ( c h 2 0 h )反应得到二种新 型高聚物膜，再利用膜上过剩的一o h 与尿酶上的一n h 2 键合得到固定化酶。此酶 在催化尿素水解反应中催化活力与用乙酰甲壳素固定化的尿酶活力相等，比键合到 尼龙载体上的尿酶活力高三倍。 1 2 4 5 磁性材料 磁性微球是由超顺磁性的核和聚合物外壳组成，外壳可以保护酶不与金属氧化物( 通 常是铁氧化物) 核心接触。在载体材料中渗入特定粒子以增加其密度或赋予磁性，将有利 于改善其传质、吸附及分离性能。r o b i n s o n 等于1 9 7 3 年第一次将磁性物质作为酶固定化的 载体，此后，磁性载体越来越多地应用于酶的固定【4 6 】。以这种磁性粒子作为酶的固定化载体， 可以弥补传统的非磁性载体固化酶的不足，可以直接把磁性酶投入反应器中催化底物，借 助磁性酶具有磁响应性，在外加磁场作用下可方便简单地回收酶，省去了固化酶装拆柱的麻 烦，简化反应装置。d e s h e n gj i a n g 4 7 】等将壳聚糖与磁性f e 3 0 4 纳米粒子耦合应用，用反相 悬浮法制得壳聚糖磁性微球，以戊二醛为交联剂制备固定化漆酶，制得的小球颗粒形态完 好，颗粒均匀，平均直径为0 5 1 t i n 。制得的固定化漆酶的热稳定性，操作稳定性，储藏稳 定性大大提高。温燕梅等【4 胡以化学共沉淀法制得的磁性聚乙二醇胶体粒子为载体固定胰蛋 白酶，此粒子具有粒径小，表面积大、粒径均匀、对蛋白质有较大吸附容量并有较强磁响 应性等特点。任广智等【4 9 1 用磁性壳聚糖作为载体用吸附法对脲酶进行固定化研究结果表 明，磁性壳聚糖对脲酶的固载量与磁性壳聚糖微球的粒径交联度及酶溶液的离子强度成反 比。 1 2 4 6 热敏凝胶 聚n - 异丙基丙烯酰胺( p n p 川) 线型聚合物在水溶液中具有独特的热行为，即随着水 第一章前言 溶液温度升高，其溶解性下降，到某一温度时会发生相分离而产生沉淀，但降低温度时， 它又可逆性地恢复到原来在低温下的状态。这一相