（材料科学与工程专业论文）层层组装构建细胞选择性界面的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 聚对苯二甲酸乙二醇酯( p i 强) 是广泛应用予大、中型动脉替代物的人工血管材料， 倪当其应用于小口径( 直径小于6m m ) 的人工血管时，常由于血栓的形成和平滑肌细胞 过度增生而导致移植的失败。内皮化是解决这一问题的重要途径。本论文以层层静电自组 装技术为手段，良p e t 片作蒸底模型，构建了具有溶胀结构的阻抗菲特异性细胞粘附的 多层膜体系，并在多层膜表匿分裂固定了辘特异性促进蠢皮缨稳糕附鳃生物活性抗体分子 和功能性短默片段，研究了多层膜表薅内皮细胞秘平滑腿缨胞的粘附行必。 本文首先以模拟细胞膜表面“糖质衣阻抗非特异性细胞粘附的功能为出发点，采用 肝素( h e p ) 和壳聚糖( c h i ) 在p e t 表面层层组装。设计具有阻抗非特异性细胞粘附功 畿多层膜界面。石英晶体微天平( q c m - d ) 测试表明肝素、壳聚糖成功的交替组装在晶片 表面。体外抗凝盘实验显示肝素的协褥作耀导致本来致凝盘的壳聚糖层表现出良好的抗凝 赢性能。对多层膜表瑟肉皮缍麓和平滑瓿细胞培养兹磷究显示，两种细胞的粘驸率帮增殪 率均显著低予t c p s 对照，细胞形态坚圆球形来镳展状态，纲胞嚣积比羽：p s 上细胞蘧积 小，表明多层膜表藤能有效阻抗内皮细胞和平滑肌细胞粘附。随多层膜层数增多，阻抗细 胞粘附特性( 即细胞惰性) 略微增强，说明多层膜的溶胀结构导致其阻抗内皮细胞和平滑 肌细胞的粘附，结构越溶胀，细胞惰性越强，是一种良好的阻抗非特异性细胞粘附的界面。 其次本文以缨胞表面抗原特异性结合抗体分子酶生物扼制为扈示，在具有辍抗菲特异 性细胞糙酣的( 野素麓聚糖) 多层膜表蘧圈定c d 3 4 抗体，利用c 羚弘抗体与内皮褪细貔 表面抗原的特异性相互作用达到促进内皮细胞选择性粘附的鬓的。采用静电吸附的方式， 在带正电的壳聚糖作最外层的多层膜表面固定带负电的c d 3 4 抗体。q c m d 测试表明抗体 固定密度约为4n g 釉2 。q c m _ d 稳定性测试表明，固定了抗体的多层膜在模拟人体斑液 流速环境下的p b s 溶液中冲洗2 小时后，仍然保持稳定。对抗体功能化的多层膜表面内皮 细脆培养的研究显示，固定了抗体的多层膜可以提高内皮细胞的粘附率。平滑肌细胞体外 培养结果表噗，抗体功能纯的多层膜仍畿有效阻抗平滑飘细胞兹耠附，说明c p 3 4 抗体分 子只对内皮细胞煮特异性相互佟雳，对平滑飙细胞没有摆互作薅。该研究构建了可键避内 皮细胞粘附，阻抗平滑肌细胞粘附的具有内皮细胞选择性的界嚣。 浙江大学硕士学位论文 最后本文以细戆表露的整合素特异性识别短序列多获片段的生物原理力癞示，在具有 阻抗鼍基特异性细胞糙黔的多屡膜表蕊固定魁d v 功能性短默片段，剩用r 蔓d v 与内皮细胞 表面整合素的特异性识别作用达到促进内皮细胞选择性粘附的目的。采用层层静电自组装 的方式将共价接枝了默m v 的壳聚糖负载到( 肝素壳聚糖) 多层膜表面，并用茚三酮一紫 外光谱分析、石英晶体微天平测试证明了多层膜表面成功固定了r e d v 短肽。对r e d 、，功 能化的多层膜表面内皮细胞和平滑肌细胞培养的研究湿示，固定了r e d v 短驮的多层膜可 以促进内痰细胞的粘附，但仍阻抗_ 平滑瓶细胞的粘附。对改变氨基酸序罗| l 的另一种短获： r 毯塑功能他的多屡膜表匿内皮缨貔培养结果显示，r 琵翌登功能化多层膜对内皮缨艴起阻 抗糕附诈用。说明多层膜表露促进内皮细胞的精附是融于固定了赃d v 功能饿短肽片段导 致的，r e d v 只对内皮细胞具有特异性识别作用，对平滑肌细胞没有识别功能。该研究构 建了另一种可促进内皮细胞粘附，阻抗平滑肌细胞粘附的具有内皮细胞选择性的界面。 关键词：p l 灌人工血管，层层静电自组装，肝素，壳聚糖，c d 3 4 抗体，l 违d i v 短腋，内 皮细胞选择性，平滑肌细胞 i i 浙江大学硕士学位论文 a bs t r a c t p o l y ( 甜哆1 et c | 印b 虹埝l a t e ) 口e dh 菸b e e nu s e d 蛳c c e 豁f h l l yi n 骶a 缸g 也ep a m o l o g ) ，o f l a r g ed i 锄e t 盯a 蹴西陷( 6m m ，i 彻哪d i 卸【赡t 哪，b u th 弱n o tk l e np r o v e nt ob es u c c c s s f i l li n r c p l a c i n g 湖a l l 凼珊e t l e rb 1 0 0 dv e s s e l s ( 9 2 ，粘度5 5m p a s ，厦门星隆达化学试剂有限公司) ；聚乙烯亚胺( p e i ，lm g ，m i ，溶于 p h - 7 4 的p b s 溶液，m wc a2 5 0 ，0 0 0 ( l s ) ，a l 血c hk ) 2 1 2 多层膜的制备 2 。1 2 1p e t 膜的胺解 5 0 乙醇超声清洗1 5 3 0 分钟，蒸馏水反复超声清洗数次，每次1 0 分钟，n 2 吹干。在 p e i 溶液中浸泡3 0 - 6 0 分钟，p b s 溶液中清洗3 次，每次1 分钟，n 2 吹干备用。 2 1 2 2 多层膜的组装 肝素溶液和壳聚糖溶液均溶解在p h 的h a c 疗妇c 1 缓冲液中( o 0 1 8m n a a c ，o 0 8 2m h a c 和o 1 4mn a c l 溶液) ，浓度为lm 咖i ，。胺解的p e t 片带正电，在负电的肝素溶液 中浸泡1 5 分钟，p i = 4 的h a c 烈a c l 缓冲液中浸泡1 分钟清洗；然后浸入带正电的壳聚糖 溶液中浸泡1 5 分钟，p h = 4 的m 气c 肘a c l 缓冲液中浸泡1 分钟清洗，如此完成l 双层的组 装循环。重复上述操作得到不同层数的多层膜。 2 1 3 多层膜的表征- 石英晶体微天平法( q c m d ) q c m - d ( q - s e n a b 公司，瑞典) 用来跟踪组装过程。石英晶片表面发生变化，振荡 频率( 包括基频1 ，v = 5m h z 和泛频3 ，5 ，7 ，v 分别为1 5 ，2 5 和3 5 瑚z ) 发生变化，。 频率( v ) 的减少往往意味着晶体表面质量的增加。具体操作参见文献【5 7 1 ，首先将镀 有金电极的石英晶片浸在浓氨水：双氧水：三蒸水( v ) = 1 ：l ：5 的洗涤液中加热煮沸1 5 3 0 分钟，以三蒸水逐次置换洗涤液，防止晶片被氧化，n 2 吹干备用。以1 0 0 此分钟的速度 向样品池中输送p h = 4 的h a c n a c l 缓冲液( 以下简称缓冲液) ，待信号稳定后，记为初始 频率f o 。通入p e i 溶液1 0 分钟，缓冲液1 0 分钟，使晶片表面带正电。然后依次通入lm 咖i ， 的肝素溶液，缓冲液，lm g m i ，的壳聚糖溶液和缓冲液各1 0 分钟，如此完成1 双层的组装 循环。重复上述循环过程，得到1 0 双层壳聚糖作最外层的多层膜。信号每1 2 秒记录一次， 溶液温度稳定在2 0 o 0 5 。 2 5 浙江大学硕士学位论文 2 1 4 复钙化时间测试多层膜的血液相容性 将人体血浆( 已除去c a 2 + ) 和o 0 2 5m 的c a c l 2 溶液放到3 7 水浴中预热。取4 0 止 人体血浆滴加在样品膜片上，静置6 0 秒后，滴加c a c l ：溶液4 0 此，同时开动秒表计时， 将一根不锈钢小钩在膜片上的溶液中均匀缓慢的搅动，并检查是否有纤维蛋白形成，记 录小钩上刚开始出现丝状物的时间，此时间即是复钙化时间，每个样品重复测6 次，取 平均值。 2 1 5 多层膜表面的细胞体外培养 内皮细胞和平滑肌细胞培养细节参见附录i 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 石英晶体微天平法( q c m - d ) 表征多层膜的组装过程 耋 7 b i l a y e r s f i g u r e2 1q c mf r e q u e n c ys h i 凤( - v ) v e 嚣l l sa s s e m b l yb i l a y e r so f a c l l i t o s a l l t e 册j m t e d ( h e p c h d l of i l m t h ef o u rh 锄l l i c sa r er 印r e s e n t e dv = ( ) 5 ，( ) 1 5 ， ( ) 2 5 锄d ( v ) 3 5 m h z ( 一) i i l d i c a t em el i n e a rf i to f d a t a ( ) 肝素壳聚糖体系的组装过程采用石英晶体微天平跟踪，由于石英晶片表面发生变化， 振荡频率( 包括基频1 ，v = 5 m h z 和泛频3 ，5 ，7 ，v 分别为1 5 ，2 5 和3 5 m h z ) 也发生 变化，频率( 疗v ) 的减少往往意味着晶体表面质量的增加，不同振荡频率下的v 值 一2 6 浙江大学硕士学位论文 若相差较大，说明多层膜结构较溶胀。q c m d 测试f 值的变化如图2 1 显示，频率不同( 1 ， 3 ，5 和7 ) ，v 随层数变化曲线也不同( 曲线一，和v ) ，说明肝素壳 聚糖多层膜结构较溶胀。取基频( v - 5 ) 曲线作线性拟合( 曲线一) ，发现晶体振荡频率 随着组装层数的增加逐渐降低，并且基本呈线性关系，说明多层膜的厚度随组装层数的增 加呈线性增长，该体系每层组装的物质量基本相同，具有一致性和重复性。 2 2 2 体外评价血液相容性 前面研究表明利用层层静电自组装可以在p e t 表面制备肝素壳聚糖涂层。在此，用 复钙化时间来研究组装了( 肝素壳聚糖) l o 双层多层膜的血液相容性。复钙化时间的基本原 理是在已除去c a 2 + 的血浆中重新加入c a 2 + ，测定血液出现凝固的时间即复钙化时间。其意 义在于检测内源凝血系统，当血液中纤维蛋白原、血酶原等凝血因子缺乏或有抗凝物质存 在时，复钙化时间会有所延长。表2 1 表示了p e t 膜，胺解p e t 膜和组装了1 0 双层 ( h e p c h i ) 多层膜，肝素和壳聚糖分别作最外层多层膜的复钙化时间。从表中看出p e t 的复钙化时间是4 3 0 9m i i l ，而对于p h = 4 条件下组装的多层膜，无论是壳聚糖作最外层 还是肝素作最外层，在3 0m i i l 内都没有出现凝血。这表明肝素壳聚糖多层膜有良好的抗 凝血性能，经其改性后的p e t 的复钙化时间延长，由凝血材料转变为抗凝材料，提高了 p e t 的血液相容性。对于壳聚糖层，由于肝素是一种非常强的抗凝血剂，它的层间穿插导 致本来致凝血的壳聚糖层表现出良好的抗凝血性。 ， 1 a b l e2 1d a t ao f p l 枷腧r e c a l c 纸a l i 矗雠e 碳( p r d s a 呷l e s 勰：p e t 俩s t 岫 p e t 山：n i n o l y 笳dp e l p e ta m i l y z e db yp e i ，( h e p c h i ) l o - 1 0b i l a y e 璐o f c l l i t o s 锄锄1 1 1 i n 砷e d h 印a r i c h i t o s 锄如p o s i t e d ap e ts 唧l e ，饵e p 怒h i ) io 5 - 1 0b i l a y 粥o f h 印痂t 踟n i n a 硼 h 印撕肌l l i t o s 觚d e p o s i t e d ap e ts a 呷l c d a t a 淝p r c s 咖e da s 眦姐s t a n d 盯dd e 啊a t i o f f i v ed i 饪h e n te x p e r 曲舱n t s s 觚啦c l o t t i n gt i m e p e t 蛐o l y z e dp e t ( h e p c h i ) l o ( h e p c h i ) lo 5 4 3 0 9m i l l 4 4 0 3m i i l n oc l 砷妇g i n3 0 m i i l n o c l 0 竹i 1 1 9 i n3 0 m i i l 2 2 3 惰性多层膜表面内皮细胞体外培养的研究 本部分采用j a 行e 等6 3 6 4 1 提出的经典技术进行内皮细胞( e c ) 的培养，细胞种植密度 2 7 浙江大学硕士学位论文 为3 1 0 4 个埘l l 。对于细胞培养的结果将通过观察细胞的形态，测定细胞的数量等指标进 行表征。 2 2 3 1 内皮细胞粘附率、增殖率的研究 选择不同最外层的( 肝素壳聚糖) l o 多层膜，在其表面体外培养内皮细胞，分别在4 小 时和3 天后用f d a 对粘附在材料表面的细胞进行染色，荧光显微镜下拍照计数，计算其4 小时的粘附率和3 天的增殖率，并与t c p s 和p e t 对比，结果如图2 ，2 所示。可见多层膜 表面内皮细胞的粘附率和增殖率远远低于t c p s 对照组，显示出良好的细胞惰性，且不同 最外层对细胞的粘附率和增殖率影响很小。 零 ， 董 巴 m 正 s a m p i e s f i g u r e2 2a d l l e s i o na n dp r o l i 向弧o nr a t e so f e i l d o l e l i a lc e l l s0 n ( h e p c h d l o 舢l t i l a y e r e df i l m s s 卸叩l e s 的ml e f tt 0r i g h ta ：t c p s ，研s t i n ep e tc 硫o s 姐- t e n n i n a t e da n d h 印撕n t 锄i 越t e d 饵e p c h d l om u l t i l a y e r c df i l 瞄， 2 2 3 2 内皮细胞形态观察 细胞的形态和功能之间有着密切的联系，细胞形态的好坏直接影响细胞的分化、基因 表达及细胞外基质的分泌等功能【6 5 一。t c p s ，p e t 和( 肝素壳聚糖) l o 多层膜材料表面接种 的内皮细胞在体外培养4 小时和3 天后，用f d a 染色拍照，在荧光显微镜下观察细胞的形 态。 如图2 4 所示，多层膜( c ，d ) 表面呈现出阻抗细胞粘附的特性，细胞数目远远少于 t c p s ( a ) 和p e t ( b ) 对照，具有良好的细胞惰性。内皮细胞均呈圆形未铺展状态，但 t c p s 表面的细胞面积要略大于多层膜表面的细胞面积。肝素作最外层的多层膜( d ) 细胞 面积比壳聚糖作最外层( c ) 的细胞面积更小，但细胞数目略多，所以总体来说，最外层物 2 8 浙江大学硕士学位论文 质对多层膜的细胞惰性影响不大。 f i g u r e2 4f l u o r e s c e n c ei i i l a g e so f e n d o 圮l i a lc e l l sm o 叩h o l 9 影a 舶rc u l t u 他df o r4 h o na ) t c p s ，”p f i s t i n ep e t ，c ) c h i t o s 锄- t e 珊i n 如d ( h e p c h i ) l o d ) h e p 晌- t e m i n a t c dm e p ，c h d l o m u l t i l a y e r e df i l m s s c a l e p 聆r l t s2 0 0 岬 f i g u r e2 5f l u o r e s c e n c ei m a g e so fe n d o t h e l i a lc e l l sm o r p h o l o g ya f t e rc u l t u r e df o r3 do na ) t c p s ，b ) p r i s t i n ep e t ，c ) c h i t o s a n - t e 瑚i n a t e d ( h e p c h i ) l o ，d ) h e p a r i n t e m i n a t e d ( h e p ，c h i ) 1 0 m u l t i l a y e r e df i l m s s c a l e p r e s e n t s2 0 0p m 2 9 浙江大学硕士学位论文 3 天后( 图2 5 ) 多层膜表面内皮细胞( c ，d ) 数目虽然有所增加，但相对于t c p s ( a ) 上基本铺满的细胞增殖情况，多层膜仍然阻抗细胞的增殖和生长；p e t 材料( b ) 上的细 胞数目约为多层膜上细胞数目的两倍，说明多层膜能有效阻抗内皮细胞的增殖和生长。观 察t c p s 和p e t 表面内皮细胞形貌，可以看出3 天后多数细胞铺展良好，细胞面积很大， 而多层膜表面细胞仍然呈圆球形未铺展态，且细胞面积较小；最外层物质不同对多层膜上 内皮细胞的增殖没有影响。 2 2 4 惰性多层膜表面平滑肌细胞体外培养的研究 本部分对于平滑肌细胞培养的结果将通过测定细胞的活性、粘附率和观察细胞形貌来 进行表征，细胞种植密度为3 1 0 4 个m l 。 2 2 4 1 平滑肌细胞m t t 活性测试 研究了不同双层和不同最外层( 肝素壳聚糖) 多层膜表面的平滑肌细胞活性。在t c p s 、 p e t 及多层膜表面接种平滑肌细胞，体外培养一段时间后，用m t t 比色法测定不同材料 表面的细胞活性，并与t c p s 作对比，如图2 6 所示。 可见4 小时内( 图2 6a ) 多层膜上平滑肌细胞活性均显著低于t c p s 对照，说明( 肝 素壳聚糖) 多层膜能有效阻抗平滑肌细胞的短期粘附。5 双层多层膜表面的细胞活性略高 于l o 双层和1 5 双层多层膜，1 0 双层和1 5 双层多层膜的细胞活性基本相同，壳聚糖作最 外层的多层膜细胞活性略低于肝素层。从3 天后的m t t 测试结果可见( 图2 6b ) ，多层膜 上的细胞活性比p e t 和t c p s 都低，说明多层膜可以有效抑制平滑肌细胞的长期生长；5 双层壳聚糖作最外层上的细胞活性略高，但总体来说，不同层数和不同最外层多层膜对平 滑肌细胞活性影响不大。 ，3 0 浙江大学硕士学位论文 紊 、一 室 五 一 s 8 s a m p b s f i g u r e2 6c e l lv i a b i 脚o f 锄o o m 删l 】s c l ec e l l sc u l t u 托df 0 ra ) 4h o u 巧勰db ) 3d a y s ( 1 删忧h d i 删l t i l a y e r e df i l l s s 锄p l e s 舶ml e nt dr i 咖矾：t c p s ，两s t i 舱p e t h e p 椭t e m i n a t e d ( h e p ，c h i ) 5 ，c l l i t o 朝n 也r i l l i n a t e d ( h e p ，c h i ) 5 ，h e p 撕n 砘m i n a t e d ( 皿p c h i ) l o ，c h i t o s a n - t e r r n j n 咖d ( 脏p ，c h i ) l o ，h e p 撕n t e 渤i l l a t e d ( h e p c h i ) 1 5 觚d c h i t o s 觚咖l i n a t e d ( h e p 肥h i ) 1 5m u h i l a y e d e df i l i 璐 2 2 4 2 平滑肌细胞粘附率测试 在分别以肝素和壳聚糖作最外层的( h e p c h i ) 5 双层和1 0 双层多层膜上种植平滑肌 细胞4 小时后，f d a 染色拍照计数，计算材料表面平滑肌细胞的粘附率，如图2 7 所示。 可以看出，多层膜表面平滑肌细胞的粘附率明显降低，约为t c p s 对照的5 2 0 ，为p e t 的l o 5 0 ，显示出良好的阻抗细胞抗粘附特性。而且，随着多层膜层数增加，细胞粘附 率逐渐降低。这可能是由于多层膜层数增多，膜结构更加溶胀导致的。最外层物质不同对 3 1 一零一童暑毋5il。q 浙江大学硕士学位论文 多层膜表面平滑肌细胞粘附率影响不大。 紊 = c 墨 芑 s a m p b s f i g u 陀2 7a d h e s i r a t eo f 锄o o m 姗j s c l ec e l l s 帆( h e p c h i ) im u l t i l a y e r e df i l m s s 锄p l e s舶ml e r t o r i 出a r e ： t c p s ， p r i s t i n ep e t h e p 撕n t e n n i n a t e d( h e p c h d 5 ， c h i t o s 如七姗i n a t e d ( h e p c h l ) 5 ，h e p a r i n - t e 眦i n a t e d ( h e p ，c h i ) l o 勰dc h i t o s 锄- t e n n i n a t c d ( h e p c h i ) 1 0m u h i l a y e 陀df i l m s 2 2 4 3 平滑肌细胞形态观察 本文研究了分别以肝素和壳聚糖作最外层的( h e p c h i ) 5 双层和1 0 双层多层膜表面 的平滑肌细胞形态。 图2 8 是体外培养4 小时后的平滑肌细胞形态，可以看出t c p s ( a ) 上平滑肌细胞已 经基本铺展，细胞面积较大，细胞数目较多，而多层膜( c f ) 上细胞呈未铺展的圆球形， 细胞面积很小，细胞数目较少，显示出了良好的细胞惰性；1 0 双层多层膜( e ，f ) 上细胞 数目略低于5 双层( c ，d ) 的多层膜，最外层物质不同对细胞粘附及形态影响不大。 - 3 2 浙江大学硕士学位论文 f i g i l r e2 8f 1 u 0 舱s c c ei i n a g e so fs m 0 0 曲m 璐c l ec e l l sm o 咄o l o 科a f t c rc u l t u r e d 矗) r4 h o u 璐o na ) t c p s ，b ) 呻s m ep e t ，c ) h e p 撕n 蜘n i n a t e dq e p ，c h i ) 5 ，d ) c l l i t o s 柚如珊i 彻l e d o e p c h d 5 ，e ) h e p 甜i i 卜t e 眦i n a t e d ( h e p c h i ) l o 枷df ) c h i t 0 媚n t 咖i 珑l t t i d ( h e p c h i ) l o m u l t i l a y e r e df i l m s 图2 9 是体外培养3 天后的平滑肌细胞表面形貌，可以看出t c p s ( a ) 对照上的平滑 肌细胞已经基本长满，而且十分铺展，而p e t ( b ) 和5 双层肝素作最外层的多层膜( c ) 上细胞虽然也呈铺展状态，但数量很少，细胞很稀疏，仍然呈现出细胞惰性。5 双层壳聚 糖层膜( d ) 和1 0 双层的多层膜( e ，f ) 上细胞均呈圆球形未铺展态，且细胞数目远远小 于t c p s 对照，说明多层膜能有效抑制平滑肌细胞的增殖和生长。随多层膜层数增加，细 胞数目略有减少，说明层数越多，多层膜越厚，结构越溶胀。 一3 3 浙江大学硕士学位论文 f i g u r e2 9f l u o 他s n c ei m a g e so fs m o o t hm u s c l ec e l l sm o r p h o l o g y 心e rc u l t i 鹏df o r3 d a y s 蚰a ) t c p s ，b ) p 商i i l ep e t c ) h e p 撕n - t e 咖i n a t e d ( h e p c h d 5 ，d ) c h i t o s 锄钯m i n a ：i e d ( h e p ，c h i ) 5 ，e ) h e p a r i i l - t e h n i n a t e d ( 眦p c h i ) 1 0a n df ) c l l i t o n - t e 珊i n a t e d 删h d l o m u l t i i a y e r e df i l m s 2 3 本章小结 本章主要采用层层静电自组装的方式在p e t 膜片表面制备了肝素壳聚糖多层膜，并 考查了多层膜表面内皮细胞和平滑肌细胞的粘附和增殖情况。 1 采用层层组装的方式在胺解的p e t 膜上制备了肝素壳聚糖多层膜。q c m 跟踪了 层层组装过程，随着组装层数增加其线性降低的频率变化结果表明壳聚糖和肝素在p h = 4 的酸性条件下有很好的自组装性能，组装遵循线性变化的规律。体外抗凝血实验显示肝素 的协同作用导致本来致凝血的壳聚糖层表现出良好的抗凝血性能。 2 内皮细胞和平滑肌细胞的粘附率测试结果显示，多层膜表面的两种细胞的粘附率 3 4 浙江大学硕士学位论文 均显著低于t c p s 对照。短时间内细胞形态观察显示t c p s 上内皮细胞和平滑肌细胞呈多 边形，铺展良好；而多层膜上细胞均呈圆球形未铺展状态，显示出良好的细胞惰性。长期 内细胞形态观察显示t c p s 上内皮细胞和平滑肌细胞基本长满，细胞面积十分铺展，细胞 数目很多；而多层膜上细胞仍呈圆球形未铺展状态，细胞数目远远低于t c p s 对照，显示 出良好的阻抗细胞增殖能力。多层膜层数对细胞惰性略有影响，层数越多，惰性越强；最 外层物质不同对惰性基本无影响。( 肝素壳聚糖) 多层膜体系是一种良好的阻抗非特异性 细胞粘附和增殖的界面。 层层静电自组装这种工艺简单的表面固定技术可以构建具有抗凝血和阻抗非特异性 细胞粘附协同功能的界面。 一3 5 浙江大学硕士学位论文 第3 章惰性多层膜表面固定c d 3 4 抗体实现内皮细胞选 择性粘附的研究 抗体是免疫系统用来鉴别和抑制外源物质( 例如细菌和病毒) 的一种蛋白质复合体。主 要存在于血清中，外分泌液和组织液中也有。每种抗体只识别特定的目标抗原，抗体与抗 原结合之后会引发免疫反应。除了内皮祖细胞可以特异性表达c d 3 4 抗原，正常入l 5 的骨髓低密度有核细胞、o 0 l 的外周血单个核细胞以及l 的脐血细胞也可表达c d 3 4 分子，绝大部分组织毛细血管和脐动、静脉内皮细胞也为c d 3 4 阳性细胞”】。因此利用c d 3 4 抗体来与c d 3 4 阳性细胞表面抗原结合的原理可以选择性捕获这类细胞。我们选用脐静脉 内皮细胞与c d 3 4 抗体分子结合。由于抗体结构的特殊性，固定于固相载体表面的抗体容 易失活变性，或由于抗原结合位点的丢失而失去抗原结合能力。因此，在材料表面如何有 效固定c d 3 4 抗体，并保持抗体的活性，是一个首要解决的问题。目前固定c d 3 4 抗体的 方法主要有物理吸附，随机的共价结合和导向性固定。 细胞生物学研究表明，细胞表面由糖脂和糖蛋白组成的细胞“糖质衣”结构是介导细 胞细胞间特异性相互作用的重要结构7 】。其紧密排列的高亲水性糖链可通过熵排斥作用有 效阻抗细胞表面的非特异性粘附作用；而细胞表面抗原抗体间则通过特异性相互作用达到 识别和促进粘附。阻抗非特异性粘附和特异性识别作用是在人体体液这一复杂系统中实现 特异性作用的关键。 本章着重利用静电吸附的方式在( 肝素壳聚糖) 多层膜表面固定c d 3 4 抗体分子，来 获得模拟细胞表面抗原与抗体结合反应的特异性生物活性分子改性多层膜表面。( 肝素壳 聚糖) 多层膜能有效阻抗细胞的非特异性粘附，以模拟细胞膜表面糖链阻抗非特异性细胞 粘附的功能；c d 3 4 抗体分子则起到与脐静脉内皮细胞表面抗原发生特异性相互作用，促 进内皮细胞粘附的作用。构建这种具有阻抗非特异性细胞粘附和特异性捕获协同作用的多 层膜表面，可以实现对平滑肌细胞的阻抗和对内皮细胞的特异性捕获功能，从而实现内皮 细胞的选择性粘附，为促进人工血管表面快速内皮化提供了一种可行的途径。本研究利用 石英晶体微天平跟踪了c d 3 4 抗体在( 肝素壳聚糖) 多层膜表面的固定过程，对固定抗体 的多层膜进行了稳定性测试，并进一步研究了抗体功能化的多层膜表面内皮细胞和平滑肌 细胞的粘附行为。 浙江大学硕士学位论文 3 1 实验部分 3 1 1 试剂与材料 肝素钠( h e p ，高分子量，山东福瑞达生物化工有限公司) ：壳聚糖( c h i ，脱乙酰度 9 2 ，粘度5 5n 】p a s ，厦门星隆达化学试剂有限公司) ：聚乙烯亚胺( p e i ，lm i 咖也溶于 p h = 7 4 的p b s 溶液，m wc a2 5 0 ，0 0 0 ( l s ) ，触砸c h 公司) ；c d 3 4 抗体( 1 - i 3 ，2 0 舭 溶于p b s 溶液，s a n t ac m zb i o t e c h n o l o g ) ，h l c ) 3 1 2 多层膜的制备 3 1 2 1p e t 膜的胺解 参见第二章2 1 2 1 节。 3 1 2 2 多层膜的组装 参见第二章2 1 2 2 节。 3 1 2 3c d 3 4 抗体的固定 待组装好的一定层数壳聚糖作最外层的多层膜在室温下自然干燥后，用圆形冲刀制备 成直径为1 2 衄的圆形薄膜，放入4 8 孔板中，每孔加入2 0 舭的c d 3 4 抗体稀释液5 0 0 弘l 4 下孵化1 2 小时，在超净台中将膜片取出移入新的4 8 孔板中，备用。 3 1 3q c m - d 法表征抗体固定及稳定性测试 多层膜的跟踪过程参见第二章的2 1 3 节，当组装完第l o 双层壳聚糖作最外层的多层 膜后，用p h = 7 4 的p b s 缓冲液以1 0 0 刖分钟的速度冲洗石英晶片3 0 分钟，然后以1 0 0 刖 分钟的速度通入2 0p 咖n l 的c d 3 4 抗体稀释液1 0 分钟，将蠕动泵暂停，孵化1 2 小时，再 以l o o “u 分钟的速度通入p b s 缓冲液l 小时，记录通入抗体前后p b s 缓冲液的f 值变化， 即可计算得到多层膜上固定抗体的密度。 抗体固定的稳定性测试：抗体固定1 2 小时并用p b s 缓冲液洗后，将蠕动泵开到最大 流速( 5 7 9 止分钟) ，继续用p b s 缓冲液冲洗石英晶片2 小时。 3 1 4 固定c d 3 4 抗体的多层膜表面体外细胞培养 内皮细胞和平滑肌细胞培养细节参见附录i 。 3 7 浙江大学硕士学位论文 3 2 结果与讨论 3 2 1 抗体固定的表征及稳定性测试 有多种不同的方法用于抗体在固相支持物表面的固定，较多采用的是共价键结合的方 式。但对于( 肝素壳聚糖) 惰性多层膜体系，若采用共价交联的方式固定抗体，会使多层 膜结构的刚性增强，模量增大，丧失了其阻抗非特异性细胞粘附的能力。而非共价键的物 理吸附具有操作简单，高抗体吸附容量，较低的非特异性吸附，较好地保持蛋白质的空间 结构和抗体活性等优点，因此我们采用非共价键吸附的方式在多层膜表面固定抗体。 我们利用带正电的壳聚糖与带负电的抗体间的静电吸附作用，将抗体用层层静电自组 装的方式固定在壳聚糖作最外层的( 肝素壳聚糖) 多层膜表面，并用q c m d 记录了抗体 固定前后f 值、d 值等的变化，如表3 1 所示，可以看出抗体固定后，频率3 的f 值下降 了1 3 7h z ，d 值也有微小变化。经过讥s c l 躺t i c 粘弹性模型拟合计算得出了固定上的抗 体的厚度约为3 2 删，抗体的固定密度约为4n g 佃n 2 ，证明c d 3 4 抗体通过静电吸附成功 固定在了多层膜表面。 1 a b l e3 1c h m 陡庇锄i o f c d 3 4a n t i t ) o d yi 姗0 b i l 谳i o np r o c e s sb yq c m d 1 kf 1 0 w 砒o f c d 3 4 a 1 1 t i ：l ，o d ys o l u t i 锄i s1 0 0 江硒na t 地b e 咖i n g ，锄d 血髓s t o p p e dn o 、7 l r i n g 稳定性测试结果见表3 2 ，可以看出抗体固定以后，增大p b s 缓冲液的流动速度，并 没有使q c m - d 的f 值、d 值产生很大变化，f 3 增加了2 5h z ，d 3 增加了2 1 0 7 。相比 于抗体固定过程中f 值、d 值的变化( f 3 减少了1 3 7h z ，d 3 增加了2 6 1 0 r 6 ) ，最大流 速p b s 冲洗下的f 值和d 值基本没有变化，说明长时间的静电吸附固定的抗体具有一定 程度的稳定性。经过、，i s c o e l a s t i c 粘弹性模型拟合计算得到p b s 冲洗前后抗体层的厚度也几 乎没有变化，只减少了o 51 1 l l l ，对抗体的固定质量基本没有影响。 3 8 浙江大学硕士学位论文 1 a b l e3 2s t a b i l 时t i 豁to f c d 3 4 锄d b o d yi 删m o b n i z a t i o np f o c e s sb yq c m - d 。1 kf l i 口wr a c e o fp b ss o l 嘶0 ni s5 7 9 皿血l i l l 因此，这种在多层膜表面利用静电相互作用物理吸附固定抗体的方法是可行的，并具 有一定程度的稳定性。 3 2 2c d 3 4 抗体功能化的多层膜表面内皮细胞粘附行为的研究 本部分研究了c d 3 4 抗体功能化的( h e p c m ) l o 多层膜表面，内皮细胞粘附行为的 变化。在t c p s 、未固定抗体的多层膜和抗体功能化多层膜表面种植脐静脉内皮细胞，细 胞种植密度为1 1 0 5 个m l ，体外培养一定时间后，比较不同表面内皮细胞的活性和形貌。 3 2 2 1 内皮细胞粘附率测试 分别在5 双层和1 0 双层固定了c d 3 4 抗体的( 肝素壳聚糖) 多层膜表面体外培养脐 静脉内皮细胞一定时间后，用f d i a 染色，荧光显微镜下拍照计数，计算抗体固定前后多层 膜表面的细胞粘附率，并与t c p s 作对照，结果如图3 1 和3 2 所示。 可以看出无论是5 双层( 图3 1 ) 还是1 0 双层( 图3 2 ) c d 3 4 抗体功能化的多层膜， 其内皮细胞粘附率在2 小时内都显著高于未固定抗体的多层膜，说明抗体功能化的多层膜 可以促进内皮细胞的粘附。但相比于t c p s ，抗体功能化的多层膜表面内皮细胞粘附率只 占4 0 6 0 ，说明多层膜的溶胀结构仍对内皮细胞粘附起阻抗作用。不同组装层数对抗体 功能化的多层膜促进内皮细胞粘附作用的影响不大。 3 9 浙江大学硕士学位论文 f i g l 】鹏3 11 1 l ea d h e s i o n 豫t eo f h 啪觚瑚n b i l i c a iv e i i l 锄d o t l l e l i a ic e l i sc u l t i l l e df 研5 i i l i 枷l t e s ，6 0i i l i 姗t e s 锄d1 2 0n 血u t e so nd i 丘确l ts l l f e s ：t c p s ，m e p c h i ) 5 - a bp 蚓懈 c d 3 4a n t i b o d y i m m o b i l i z e d ( h e p c h d 5 咖l t i l a y e 豫df i l i i l s 锄dm e p c h 耽m u i t i l a y e r e df i l m s 、一 空 罡 c 垒 怒 翟 秀 o f i 孵3 2 1 l l ea d l l e s i o nm t eo f h l 脚nu m b i l i c a lv e i i le n ( 1 0 m e l i a lc e l l sc u l t u r e df o r5 1 1 1 i n u t e s ，1 5m i n u t e sa 1 1 d1 2 0n l i l l u t e s0 nd i 脏r e n ts u r 最l c e s ：t c p s ，m e p c h i ) l o - a bp r e s e n t s c d 3 4a n t i b o d y - i 姗0 b i l i z e d ( h e p c h i ) l o 舢l t i l a y e r e df l h n s 锄d ( h e p c h i ) l om u l t i l a y e 阳d f i l m s 对抗体功能化的( 肝素壳聚糖) 1 0 双层多层膜体外培养脐静脉内皮细胞一定时间后， h ) a 染色拍照，计算细胞粘附密度，绘制多层膜表面细胞密度随时间变化的曲线，并与未 固定抗体的多层膜和t c p s 作对照，如图3 3 所示。可以看出，抗体固定5 分钟后多层膜 表面的细胞粘附密度就开始增大，1 5 分钟后达到最大值，说明c d 3 4 抗体与脐静脉内皮细 4 0 ， 浙江大学硕士学位论文 胞表面抗原结合速度非常快，抗体功能化的多层膜可以快速促进内皮细胞的粘附。 譬 曼 害 番 呈 8 f i g u r e3 3m a 血e s i c i l n ，鼯o fh 咖姐l b i l i c a l 、陀i n 饥d o 岫l i ac e l l sc u l n j 删伽l o b i l a ) ，e 璐o f ( h e p c h d 锄dc d 3 4 锄伺，o d y i l l l m 曲i l i z e dm e p c h i ) 脚l t i l ，a 他df i l i n s 3 2 2 2 内皮细胞的形态观察 观察5 双层的c d 3 4 抗体功能化的( 肝素壳聚糖) 多层膜与t c p s 上的脐静脉内皮细 胞形态，如图3 4 所示，可见未固定抗体的多层膜( c ，ei ，l ，o ) 表面在5 小时内都没有任 何细胞粘附，显示出良好的阻抗细胞粘附的特性。而抗体功能化的多层膜( b ，e ，l l ，l ( n ) 表 面的内皮细胞数目明显高于未固定抗体的多层膜表面的细胞数，说明通过固定c d 3 4 抗体， 可以促进内皮细胞在惰性多层膜表面的粘附。比较抗体功能化的多层膜与t c p s ( a d ，g ，j ， m ) 上的内皮细胞数目，发现抗体功能化的多层膜表面细胞数仍少于t c p s 上的细胞数。2 小时内抗体功能化的多层膜和t c p s 表面的内皮细胞形态都呈圆球形，细胞面积也没有差 别，说明c d 3 4 抗体捕获的内皮细胞活性没有下降。 浙江大学硕士学位论文 i。ji。二。 。：l 【， 。：i 。蔓 d ) 。l 小i l 。t ： 。i 卜一? 。叫 卜：0 二 f i g l l r e3 4f l u o r e s c e n c ei 眦g e so f h u m 吼1 l i 】曲i l i c a lv e i i le n d o m e l i a lc e n sm o t p h o l o g y a d r | e r c u l t i l r e df o r5m i n u t e so na ) t c p s ，b ) c d 3 4a n t i b o d y - i m m 曲i l i z e d ( h e p c h i ) 5 ，c ) ( h e p c h i ) 5 ； f o r1 5m i n u t e s0 nd ) t c p s ，e ) c d 3 4 锄曲o d y - i m m o b i l i z e d ( h e p c h i ) 5 ，f ) ( h e p c h d 5 ；f o rl h o u ro ng ) t c p s ，h ) c d 3 4a i l t i b o d y i 础n o b i l i z c d ( h e p c h i ) 5 ，i ) ( h e p c h i ) 5 ；f o r2h o i 璐o nj ) t c p s ，k ) c d 3 4a n t i b o d y i m m o b i l i z e d ( h e p c h i ) 5 ，1 ) ( h e p c h i ) 5 舢l t i l a y e r e d 舢i l s 3 2 3c d 3 4 抗体功能化多层膜表面平滑肌细胞粘附行为的研究 本部分研究了c d 3 4 抗体功能化的( 肝素壳聚糖) ，多层膜表面，平滑肌细胞粘附行 为的变化。在t c p s 、未固定抗体的多层膜和抗体功能化多层膜表面种植平滑肌细胞，细 胞种植密度为1 1 0 4 个m l ，体外培养一定时间后，比较不同表面平滑肌细胞的粘附数量 浙江大学硕士学位论文 和形貌。 3 2 3 1 平滑肌细胞粘附数量的研究 在5 双层固定了c d 3 4 抗体的( 肝素壳聚糖) 多层膜表面体外培养平滑肌细胞一定时 间后，用