（材料科学与工程专业论文）钛氧薄膜表面氨等离子体浸没离子注入以及生物化修饰.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第1 ii 页 摘要 本文采用非平衡磁控溅射沉积技术在硅基底上制备了钛氧( t i o ) 薄膜， 并对其进行氨等离子体浸没离子注入处理，在砸o 薄膜表面引入氨基基团。 采用原子力显微镜( 删) 和x 射线光电子能谱( s ) 技术对注入前后 的样品进行表面形貌和化学成分的分析，用酸性橙染色法计算注入后 面0 薄膜表面氨基密度。在此基础上，分别固定以及联合固定细胞外基质 成分中的重要生物分子层粘连蛋白( l n ) 和纤连蛋白( f n ) 。最后通过体外 人脐静脉血管内皮细胞( h u v e c ) 原代培养实验评价未处理的砸o 薄膜、 注入后的面一o 薄膜以及固定生物分子后的n o 薄膜表面的内皮细胞相容 性，采用光学显微镜观察细胞形态。 接触角结果显示，注入后的t i 0 薄膜较之未处理的t i o 薄膜接触角减 小，亲水性增加。酸性橙i i 染色法及x p s 结果显示经过注入处理后可在甄o 薄膜表面产生亲水性基团一n h 2 。s e m 及a f m 结果显示注入后的币o 薄膜 表面粗糙度增加。免疫荧光染色结果显示在经过注入处理的t i 0 薄膜表面 成功地分别固定了l 肛、f n ，并且l n 和f n 联合固定成功。 体外人脐静脉内皮细胞培养实验结果表明，面一o 薄膜本身具有一定的 内皮细胞亲和性，经过氨等离子注入后的t i o 薄膜对细胞生长有良好的促 进作用，在经过注入处理的t i o 薄膜表面固定h 和f n 能进一步促进内皮 细胞的生长，且在经过注入处理的雨一o 薄膜表面联合固定层粘连蛋白和纤 连蛋白促内皮化效果显著，优于表面固定单种蛋白的方法。 以上试验结果表明，离子注入可以在t i 0 表面引入功能基团氨基，并 且同时可以改变薄膜表面的亲水性、粗糙度等性质，可在一定程度卜促进 内皮细胞的黏附。在具有氨基基团的t i o 薄膜表面固定l n 和f n 对内皮细 胞的生长有良好的促进作用，且在具有氨基基团的t i 0 薄膜表面联合固定 层粘连蛋白和纤连蛋白促内皮化效果更为显著。因此，在t i 0 薄膜表面固 西南交通大学硕士研究生学位论文第1v 页 西南交通大学硕士研究生学位论文第v 页 a b s t r a c t i nt h i sw o r k ，t i of i l m sw e r es y n t h e s i z e db yu n b a l a n c em a g n e t r o n s p u t t e r i n go ns i l i c o ns u b s t r a t e s ，a n dt h e nt r e a t e db yp l a s m ai m m e r s i o ni o n i m p l a n t a t i o n ( p r o ) u s i n ga m m o m ag a s e si no r d e rt oi n t r o d u c ea m i n og r o u pt o t i - 0f i l m ss u r f a c e t h es t r u c t u r ea n dt h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o no ft h es u r f a c e w e r ea n a l y s e db ya t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) a n dx - r a yp h o t o e l e c t r o n s p e c t r o s c o p y ( x p s ) t h ed e n s i t yo fa m i n og r o u po nt h es u r f a c eo ft r e a t e dt i - o f i l m sc a nb er a t i o n e db ya c i do r a n g ei i a f t e rt h a t ，l a m i n i n ( l n ) a n df i b r o n e c t i n f i n ) w e r ei m m o b i l i z e d t ot h es u r f a c eb a s e do nt h ea m i d og r o u p t h e m o r p h o l o g yo fe n d o t h e l i a lc e l l sw a so b s e r v e db yo p t i c a lm i c r o s c o p y i nt h e e n d ，h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ( h u v e c ) p r i m a r yc u l t u r e e x p e r i m e n t sw e r ea d o p t e d i nv i t r ot oe v a l u a t et h ec o m p a t i b i l i t yo ft h e e n d o t h e l i a lc e l l so nt h es u r f a c eo ft h eu n t r e a t e dt i of i l m s 、p i i i t r e a t e dt i o f i l m sa n dt h et i - of i l m si m m o b i l i z e db yb i o m o l e c u l e s t h em o r p h o l o g yo f e n d o t h e l i a lc e l l sw a so b s e r v e db yo p t i c a lm i c r o s c o p y t h ec o n t a c ta n 舀eo fp i l l t r e a t e dt i - 0f i l m ss u r f a c ew a sl o w e rt h a nt h a to f t h eu n t r e a t e dt i of i l m s i ti n d i c a t e st h a tt h ew e t t a b i l i t yo fp i l l t r e a t e dt i o f i l m si sal i t t l eh i g h e rt h a nt h eu n t r e a t e dt i - 0f i l m s t h ea c i do r a n g ei ia n dx p s r e s u l t ss h o wt h a tt h ef u n c t i o n a lg r o u po fa m i d oh a sb e e ni n t r o d u c e dt ot h e s u r f a c eo ft i - of i l mb yp l a s m ai m m e r s i o ni o ni m p l a n t a t i o n t h er e s u l t so fs e m a n da f m s u g g e s tt h a tt h er o u g h h e s so ft h ep i l l - t r e a t e dt i of i l m ss u r f a c eh a s b e e ni n c r e a s e d n er e s u l to fi m m u n o f l u o r e s c e n c ei n d i c a t e st h a tl a m i n i na n d f i b r o n e c t i nh a sb e e ni m m o b i l i z e dt ot h ep i l l 。t r e a t e dt i 0f i l ms u r f a c e e n d o t h e l i a lc e l lc u l t u r e e x p e r i m e n ts u g g e s t st h a t ，t h ea m i n og r o u p sa r e 西南交通大学硕士研究生学位论文第vi 页 h e l p f u l f o r t h ea d h e s i o na n dp r o l i f e r a t i o no fh u v e c t h el a m i n i na n d f i b r o n e c t i nc a nf u r t h e re n h a n c eh u v e c sa d h e s i o n ，p r o l i f e r a t i o n ，a n dg r o w t h a c c o r d i n g t ot h ee n d o t h e l i a lc e l lc u l t u r e e x p e r i m e n t ，c o m p a r e d t ot h e p i l l - t r e a t e dt i - of i l l si m m o b i l i z e dw i t hl a m i n i no rf i b r o n e c t i no n l y ，t h ep i i i t r e a t e dt i - of i l m si m m o b i l i z e dw i t hb o t hl a m i n i na n df i b r o n e c t i nc a np r o m o t e t h ea d h e s i o na n dg r o w t ho fe n d o t h e l i a l a l lt h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ei o ni m p l a n t a t i o nc a ni n t r o d u c ef u n c t i o n a l g r o u po n t ot h es u r f a c eo ft i of i l mt oc h a n g ei t sp r o p e r t i e sl i k ew e t t a b i l i t ya n d r o u g h n e s s ，s oi tc a ni n h e r et h ec e l l sa d h e s i o n l a m i n i na n df i b r o n e c t i nc a l lb e i m m o b i l i z e do n t ot h es u r f a c eo ft i of i l mb ya m i n og r o u p l a m i n i na n d f i b r o n e c t i nc a np r o m o t et h ea d h e s i o na n dg r o w t ho fe n d o t h e l i a lc e l l s t h i sw o r k p r o v i d eag o o dw a yf o rs u r f a c ee n d o t h e l i a l i z a t i o nb yi m m o b i l i z i n gl a m i n i n a n d f i b r o n e c t i no n t ot h es u r f a c eo fp i i i t r e a t e dt i of i l m k e y w o r d s ：t i t a n i u m o x i d et h i nf i l l ，p l a s m ai m m e r s i o ni o ni m p l a n t a t i o n ， l a m i n i n ，f i b r o n e c t i n ，e n d o t h e l i a lc e l l 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i 页 西南交通大学学位论文创新性声明 本人声明所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得西南交通大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示感谢。 本学位论文成果是本人在西南交通大学读书期间在导师指导下取得的， 论文成果归西南交通大学所有，特此声明。 本学位论文的主要创新点如下： 本论文探索了无机材料表面氨基基团( n h 2 ) 的形成，工作具有重要价值， 并对无机心血管材料表面生物分子的固定提供一种新的方法，将为血液接 触无机材料的表面生物化奠定基础，并对获得生物相容性表面提供指导。 梅馨 2 0 0 9 年5 月 格罄 2 一g 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 西南交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权西南交通大学可以将本论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复印手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书； 2 不保密留，使用本授权书。 ( 请在以上方框内打“”) 嫦黧崭g 燧f 轹i 辫j ：紫三 日期：加7 f g- ( 分 f 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 1 1 生物医用材料 1 1 1 生物医用材料的概念 生物医学材料( b i o m e d i c a lm a t e r i a l s ) ，又称生物材料( b i o m a t e r i a l s ) 。用以 和生物系统结合，以诊断、治疗或替换机体中的组织、器官或增进其功能 的材料。它可以是天然产物，也可以是合成材料，或者是它们的结合，还 可以是有生命力的活体细胞或天然组织与无生命的材料结合而成的杂化材 料。生物医学材料币同于药物，它的主要治疗目的是不必通过在体内的化 学反应或新陈代谢来实现，但是可以结合药理作用，甚至起药理活性物质 的作用。与生物系统直接结合是生物医用材料最基本的特征，如直接进入 体内的植入材料，人工心肺、肝、肾等辅助装置中与血液直接接触的材料 等。除应满足一定的理化性质要求外，生物医用材料还必须满足生物学性 能要求，即生物相容性要求，这是它区别于其他功能材料的最重要特征f l - 2 1 。 1 1 2 生物医用材料分类 生物医用材料及其制品种类繁多，是由于不同学科的科学家从各自的研 究侧面，形成种类繁杂的现象，有多种分类方法。通常情况下，可根据材 料属性、功能、来源、使用部位、使用要求分类。 按材料属性分类，依材料的组成和性质分为医用金属材料、高分子材料、 无机材料和复合材料。 按材料的功能分类，可以分为血液相容性材料、软组织相容性材料、硬 组织相容性材料、生物降解高分子药物材料等。 按材料来源分类，可以分为自体组织、同种异体器官及组织、异种器官 及组织、天然生物材料、人：合成材料。 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 按使用部位分类，可以分为硬组织材料、软组织材料、心血管材料、血 液代用材料以及分离、过滤、透析膜材料。 1 1 3 生物医用材料的发展以及研究内容 2 0 世纪6 0 8 0 年代开发了第一代生物医用材料并应用于临床，包括骨 钉和骨板、人工关节，人工心脏瓣膜和人工血管等，这些生物材料呈生物 惰性，即尽量将受体对植入器械的异物反应降到最低。 从2 0 世纪8 0 9 0 年代第二代生物医用材料的研究重点转向了生物活性 材料。这些生物活性材料能够在生理条件下发生可控的反应，并作用于人 体。包括生物活性玻璃、生物陶瓷等，并应用于整形外科和牙科。 2 0 世纪9 0 年代后期，第三代生物医用材料则是将生物活性材料与可降 解材料这两个独立的概念结合起来，在可降解材料上进行分子修饰，诱导 细胞增殖、分化，以及细胞外基质的合成与组装1 3 l 。 生物医用材料由于具有特殊的生理功能，其研究内容涉及到仿生学、材 料学、化学、物理学、医学等多个学科，主要包括材料合成、加工制备、 宏观与微观结构表征、理化性能测试、材料与机体的相互作用以及材料在 生物体内的代谢等，最后用于临床i l 。 1 2 生物材料的表面改性 1 2 1 生物材料的表面改性方法 生物材料表面的化学、物理及力学性质，包括表面成分、结构、形貌、 亲疏水性、电荷、导电性等均会影响材料与生物体之间的相互作用。通过 生物材料的表面改性可以改善材料表面原有的性能或赋予其特殊的功能， 进而改善生物材料与生物体的相容性。一般的表面改性技术可以分为物理 方法、化学方法以及生物方法等。下面着重介绍辐射接枝技术、等离子技 术、离子注入技术、电化学法以及层层自主装技术。 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 1 辐射接枝技术 辐射接枝法仞是在辐射聚合反应的基础上随着聚合物改性的需要而发展 起来的，迄今辐射接枝技术已成为研制各种性能优异的新材料和对原有材 料进行改性的有效手段之一。辐射接枝法是利用高能辐射使聚合物a 产生活 性点( 自由基或离子) ，再由该活性点引发单体b 的接枝聚合。该方法需要材 料表面有一定的活性基团，能在高能辐射作用下产生大量的活性点，从而 引发反应进行。通常高分子材料表面都有丰富的活性基团，因此，辐射接 枝技术主要应用于高分子材料。而无机材料由于本身的限制，辐射接枝有 一定的难度1 6 1 。 2 等离子体技术 等离子体气体经电离产生的大量带电粒子( 离子、电子) 和激发态的中性 粒子( 原子、分子) 所组成的体系。经过等离子体表面处理的方法可以在无 机材料表面生成各类活性生物基团。这种方法是利用气体( 如：氩、氮、氧、 氢、氨等) 的等离子体中的能量粒子和活性物种与待加工材料的表面发生表 面键化合，使其表面产生特定的官能团( 如o h 、n h 2 等) 。这种反应能同时 改变材料表面成分和结构，达到材料表面改性的目的【7 j 。与传统的改性技 术相比，具有成本低，操作简便，不受材料形状、性质限制，改性的程度 可通过工艺条件加以控制等优点。并且，它只改变材料的表面性质，而不 会改变其本体性质。 一般生物材料的等离子体处理采用低压高频辉光放电的方式，在等离子 体处理装置中充入无机气体并施加射频电场，可在生物材料表面引入各种 功能活性基团( 如n h 2 、s 0 3 、o h 、c o o h 等) ，使材料表面的润湿性 和表面张力显著变化，从而使蛋白质、细胞在材料表面的吸附行为发生变 化，进而对生物材料的血液、组织相容性产生影响1 8 l 。 s h o u - j u nx i a o f g l 等人介绍可通过水蒸气等离子体处理或者化学预处理方 法如在双氧水与盐酸中浸泡的方式，使无机材料表面产生羟基，从而为表 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 面固定生物大分子提供了必要的条件。g a n a p a t h y l l o l 用二氯硅烷( d s ) 低温射 频等离子体处理玻片和聚乙烯表面，表面接枝上s i c l x 基团，再进行原位衍 生反应固定木瓜蛋白酶( p a p a i n ) 。 3 离子注入技术 离子注入是将电离的原子经电场加速后，快速注入固体材料表面，从 而引起材料表层成分和结构的改变，导致原子环境和电子组态等微观状态 的扰动，改善材料表面性能i n l 。离子注入法以其注入深度可控、不影响基体 材料的本身力学性能、注入的离子渗入材料表层、形成的注入层与基体无 明显界面等优点，在材料科学以及生物医学等各个领域发挥了重要作用。 利用离子注入技术可以提高生物材料表面硬度及耐磨性，在改善生物材料 的生物相容性方面成效也甚好。 本论文所用的表面改性方法主要是离子注入法，这将在1 2 2 节中详细介 绍。 4 电化学法 电化学法就是用电化学的方法，通过调节电解液的浓度、p h 值、反应 温度、电场强度、电流等来控制反应的制备方法。包括电泳沉积、电沉积( 电 结晶1 、复合电镀等几类。 电化学处理方法除了具有操作简单，原材料利用率高，工艺连续性好， 易于实现自动化生产的优势外，还具有可对复杂的非平整和多孔表面的基 体进行改性的优点。又因为其在较低温度( = 7 0 0 c ) 下进行，所以又具有可 以避免基体高温相变的优点。 目前，绝大多数研究都集中在利用电化学结晶沉积法、电泳沉积法在 t i 基体上沉积磷酸盐涂层或含羟基磷灰年5 c a o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 1 幂j 薄膜，其生物 活性都是这些外加涂层所反映 f j 来的，而这些外加涂层恰恰是富含羟基等 活性基团的表面。 m s h i r k h a n z a d e n f , z l 采用电化学方法在钛合金基体上由烷氧基化合物制 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 备了面0 2 薄膜，他们发现这种室温制备的薄膜表面吸附有相当数量的羟基和 小分子如c o o h 、o h 、n h 2 、c = o 等，而且这种纳米孔，n 0 2 薄膜在室温下 可与有机小分子形成化学键，这样就有可能与生物大分子相结合。i s h i z a w a h h 3 等用阳极氧化法将含少量水的n a n 0 3 ，甲醇溶液作为电解液，以钛或钛 合金作为阳极进行阳极氧化，可在表面制得锐钛矿型的表面层，与甲醇反 应生成钛酸甲酯 t i ( o c h 3 ) 4 。由于水的存在，钛酸甲酯迅速水解，形成无 定型t i 0 2 ，其中包含t i o h 。 5 层层自组装技术 层层自组装是用逐层交替沉积的方法，借助各层分子间的弱相互作用 ( 如静电引力、氢键、配位键等) ，使层与层自发地缔和形成结构完整、性能 稳定、具有某种特定功能的分子聚集体或超分子结构的过程1 1 4 】。其组装分子 种类广泛且数量较大；制备条件简单，可仿照细胞外基质环境多分子组装 构建生物活性表层；反应温度低，保证了生物分子具有维持生物活性的天 然构象，生物相容性更佳。此法可以转载生长因子、引入蛋白多糖及控制 药物缓释i 5 1 。层层自组装技术在成功用于有机材料生物化后，近几年开始用 于无机材料。 t a n 等【1 6 】利用聚乙烯亚胺( p e i ) 和肝素层层沉积的方法制备了具有抗凝血 性能的生物功能表面，发现这种经多层膜改性的表面能够抵抗血小板的黏 附并有效延长静态凝固时间，从而为心脏血管材料的表面改性提供了新的 方法。 1 2 2 离子注入技术 1 2 2 1 离子注入原理 离子注入是7 0 年代初逐步发展起来的种新颖的表面改性方法，就是 在离子注入机( 实际上是一个小型加速器) 中把离子( 例如n + 、c + 、0 + 、c r + 、 a 矿、y + 等各种非金属或金属离子) 加速成具有几万至几十力( 甚至几百万) 电子伏能量的束流，并注入于固体材料的表层。离子注入将引起材料表层 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 的成分和结构的变化以及原子环境和电子组态等微观状态的扰动，由此导 致材料各种物理、化学或机械性能的变化。其内容上主要包括三个方面： 1 改善物理性能例如改善材料表面的电磁学及光学性能，提高超导 的转变温度等： 2 改善化学性能例如提高材料表面的抗腐蚀、抗氧化性能； 3 改善机械性能例如改变材料表面的摩擦系数，提高表面硬度和抗 磨损能力，改善材料的疲劳性能等。 离子注入可以根据工艺要求任意选取注入添加的元素，注入时可以精确 控制注入的剂量。离子注入的横向扩散可以忽略，深度均匀，适合大面积 注入。对于不同的材料，注入不同元素的离子，在不同的条件下，可以获 得不同的改性效果彻。 1 2 2 2 离子注入对生物材料的表面改性及研究现状 离子注入技术应用广泛，通过注入一定剂量和能量的离子到材料表面， 可以改变材料表层的化学成份、物理结构和相态，从而改变材料的力学性 能、化学性能和物理性能。离子注入技术应用到生物材料改性上，主要是 通过提高生物材料的抗腐蚀性、耐磨损性、硬度或是改变材料表面化学成 份，最终提高材料的生物相容性。 1 提高生物材料的耐腐蚀性能 生物医用金属材料包括医用不锈钢、钴合舍、钛合金、以及钽铌锆合金 等常用作人工假体、牙种植体、骨创伤产品及人工关节等人体硬组织替代 物和修复物。生物医用金属材料要求具有良好的力学性能和耐蚀性能，可 采用离子注入的方法对其进行表面改性，使之达到应用要求。杨征等1 1 8 】将氮 离子注入到纯钛及t i 6 a i 4 v 中，通过改变注入的参数提高改性层的深度及 改性层t i n 的浓度以此来提高了纯钛及钛合金的耐腐蚀性能。刘瑶等1 1 9 l 使用 强流金属源离子注入机对医用纯钛表面进行c 离子注入。结果表明，c 离子 注入后医用纯钛表面生成了一层包括t i c 强化相和游离念c 的表面改性膜， 使医用纯钛在模拟体液中的耐磨损性能和耐腐蚀性能提高。 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 2 提高生物材料的耐磨性能和硬度 有研究者1 2 0 - z - 】用离子注入的方法增强聚碳酸酯( p c ) 薄膜的表面硬度和耐 磨损性能。注入离子为c 、n i 等离子，结果表明，注入2 x 1 0 1 5i o n c m 2 c 离子 可将p c 薄膜的耐磨损性能提高1 9 倍，摩擦系数减小2 0 ；未改性p c 薄膜的 硬度为0 2 8 3 g p a ，注入c 离子后p c 薄膜的硬度增h n n o 7 1 2 g p a ，注) k l x l 0 1 6 i o n e r a 2n i 离子后的p c 薄膜硬度为1 0 3 2 g p a 。 3 提高生物相容性 研究发现，通过离子注入可以在生物材料表面得到活性基团，从而提高 材料表面的生物相容性。y o u t a ox i e t n 的研究表明，用等离子体浸没离子注 入技术( p i l l ) 将h 2 0 和h 2 共同注入到t i 表面可以形成t i o h 基团，而单注入 h 2 0 或是h 2 都不能得至t j t i o h 基团。有研究者i j 在铝合金( t i 6 a 1 4 v ) 基体上用 大气等离子喷涂法沉积了纳米t i 0 2 粉末，随后用等离子体离子浸没注入技 术( p i l l ) 注入了氢等离子体。注入电压为3 0 v ，脉冲频率为2 0 0 h z ，射频 功率为1 0 0 0 w ，注入时间为2 h ，工作压力为5 x 1 0 - 2 p a ，氢离子与t i 0 2 薄膜表 面最外层的氧反应生成了t i - o h 键。表面的t i - - o h 基团在s b f ( 模拟体液) 中能够诱导磷灰石成核结晶。文献【：；l 中报道，利用核工业西南物理研究院全 方位离子注入装置，对t i 6 a 1 4 v 材料进行氮离子注入。注入剂量为3 1 0 r 7 i o n c m 2 ，电压为5 0 k v ，频率为2 0 0 h z ，试样温度在2 0 0 3 0 0 左右，脉宽为 2 51 1s ，发现注入后t i 6 a 1 4 v 的生物相容性有明显改善，其血液相容性性能 明显优于目前国际公认血液相容性最好的生物材料热解碳。应用离子注入 技术，可以在材料表面制备特异性官能团，从而提高材料的生物相容性。 且离子注入对材料表面进行改性，不会影响到材料的本体性能。 1 3 材料表面生物化研究 生物化学表面改性是在材料表面固定生物大分子、表面构造细胞外基质 层及种植细胞等在材料表面引入，七物物质的技术方法，目前研究的趋势是 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 综合利用生物材料表面改性技术( 包括表面形态改性、物理化学表面改性 及生物化学表面改性。材料的表面形态改性包括表面粗糙度控制、表面微 米纳米图形构造。物理化学表面改性包括表面覆膜、离子注入、等离子体 表面接枝、表面自组装等所有改变材料表面的物理与化学性质的技术) ， 构造可以被生物体特异性识别的表面嘲。 下面从材料表面抗凝活化层的构建、表面磷脂化、表面内皮细胞化等方 面介绍血液接触材料表面生物化的研究进展。 1 3 1 表面抗凝活化层的构建 在材料表面涂覆各种抗凝生物分子与蛋白，如肝素、白蛋白、水蛭素、 前列腺素、尿激酶，能有效抑制血液中凝血因子的活化及血小板的聚集与 活化，从而抑制材料表面凝血幽。 材料表面肝素化。肝素广泛存在于动物的肝、肺、心、脾、肾、血液里， 具有优异的抗凝血性，是典型的天然抗凝血物质。材料表面的肝素化，一 般有物理吸附法和化学结合法两种。前者的结合不太牢固，但肝素的构象 能够保持；而后者的结合稳定，但肝素的构象不易保持，这也是化学固定 之后，肝素的生物活性较低、材料抗凝血性的改善还不很明显的缘故彻。 材料表面固定白蛋白。材料对白蛋白吸附后不易粘附血小板，故可在表 现覆盖一层白蛋白来对材料进行修饰，称为白蛋白钝化。因此，用白蛋白 涂层或改善材料的表面结构的方法，可以提高材料的血液相容性。白蛋白 在材料表面的结合状态是白蛋白可否发挥作用的关键。物理吸附法获得的 白蛋白涂层结合力较差，在与血液接触中容易与其他蛋白质发生交换作用， 从而使抗凝血性能逐渐下降。用共价接枝方法能使材料表面形成的白蛋白 层与基体之间有很高的结合能力1 2 8 l 。 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 1 3 2 表面磷脂化 在高分子材料表面引入磷酸胆碱可以明显改善其血液相容性。这是由于 类磷脂结构的高分子材料表面具有强烈吸附血液中磷脂分子的作用。当表 面与血液接触时，血液中的磷脂分子首先被吸附结合到材料表面，自组装 成类似生物体表面的磷脂层，从而使蛋白质与材料表面的相互作用变弱， 蛋白质与血细胞不被吸附和激活，阻碍了抗凝血过程的发生【驯。文献【3 0 l 报道， 由n a k a b a y a s h i 研制的人工血管显示出极好的生物相容性和安全性，这是由 于组成该材料的共聚物分子中带有典型的磷酸酯基团，对血浆中的磷酸酯 分子有强烈的吸附作用，可以吸附血液中的磷脂分子，并将它们牢固结合 在共聚物表面，形成一层自组装仿生物膜，而这这层自组装仿生物膜与血 细胞和血浆蛋白之间的相互作用很弱，而且不激活这些血液成分，；从而有 效抑制了材料表面的血浆蛋白吸附、血小板黏附以及血小板的活化和血栓 的形成【3 1 3 l 。 1 3 3 表面内皮细胞化 正常血管的血管壁表面内皮细胞层是维持血管表面不发生凝血的重要 组织，因此改善抗凝血性乃至血液相容性最理想的途径应是在生物材料的 表面种植、培养血管内皮细胞。但是直接把内皮细胞种植在一般生物材料 表面不仅繁殖慢而且过一定时间后还容易从材料表面上脱落下来，如果将 生物材料表面进行改性，可以促进内皮细胞在其表面粘附。 本研究的重要目的之一是在材料表面活化的基础上，采取生物化手段促 进内皮细胞在材料表面的黏附与生长。因此材料表面内皮化将在1 4 节中详 细介绍。 西南交通大学硕士研究生学位论文第10 页 1 4 材料表面内皮化的研究 1 4 1 内皮细胞的作用 内皮细胞位于血管内腔面，呈单层细胞排列，不仅是介于血管壁租血液 之间的屏障结构，还可合成和分泌多种生物活性物质，维持血管收缩和舒 张、凝血与抗凝血等的平衡，从而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。 内皮细胞同血细胞一样表面带负电荷，因而具有抗血小板聚集、防止血液凝 固和血栓形成的作用，从而保持血液的正常流动和血管的长期畅通。完整 的内皮细胞层为血管提供了一个抗血栓的屏障i ，3 1 ，在人工材料表面种植血 管内皮细胞可以形成一个类似体内血管的抗血栓表层i 卅，因此在材料表面 种植、培养血管内皮细胞是提高材料抗凝血性和血液相容性的最理想的途 径。 1 4 2 细胞与材料的相互作用 细胞在材料上的粘附包括两个过程：贴附过程和粘附过程嘲。贴附过程 是由细胞与材料之间的一些物理、化学作用，如范德华力、离子力等所引 起的，贴附过程非常迅速。粘附过程是由材料与一些生物活性分子如细胞 外基质蛋白、细胞膜蛋白、细胞骨架蛋白等相互作用而引起，因此粘附期 较长。只有当细胞与材料发生适当的粘附，才能在材料表面进行铺展生长， 乃至分化、增殖。细胞与材料之间的粘附作用是通过细胞膜上的受体 ( r e c e p t o r s ) 来调节的，这些受体能特异性地识别材料表面的粘附分子1 3 7 l 。一 些细胞外基质蛋白如纤维连接蛋白( f n ) 、玻璃粘连蛋白( v n ) 、层粘连蛋白( l n ) 等能够被细胞膜上的受体特异性地识别，若生物材料在培养液或体液中能 够吸附这类蛋白时，细胞就可以以这类蛋白为介导，粘附于材料表面，从 而进行生长、分化、迁移、增殖。 西南交通大学硕士研究生学位论文第11 页 1 4 3 材料表面内皮化的国内外研究现状及分析 自m a n s f i e l d 【蚓1 9 7 0 年提出人工血管内皮化概念并首次尝试从动物活体 组织获取血管内皮细胞进行人工血管内皮化试验以来，这一技术已不断完 善。 1 材料表面直接种植内皮细胞 r o s e n m a nje i 3 9 等将内皮细胞直接种植在聚四氟乙烯血管上，并植入犬 动脉壁，当血管暴露于流动性血流中，大量内皮细胞会被冲掉，在最初的 3 0 m i n 一2 4 h ，有7 0 2 的内皮细胞丢失，4 6 周后仅剩下4 4 的内皮细胞。 武忠h 训等将空白聚酯材料和表面预衬纤连蛋白的聚酯材料表面种植人 脐静脉内皮细胞，并在定常流条件下观察表面细胞粘附的稳定性。结果显 示在流体切应力值为8 1 9 d y n e c m 2 的作用下，空白聚酯材料表面细胞残留率 仅为1 3 7 3 ，而表面结合纤连蛋白的聚酯材料表面细胞残留率为4 0 7 5 。 目前，在材料表面直接种植内皮细胞，普遍存在一个共同难题，即内皮 细胞在材料表面粘附的牢固程度及其生长活性一直不能令人满意，难以形 成完整的粘附牢固且持久的具有体内生命活性的内皮细胞单层。因此，材 料表面预先进行处理再固定内皮细胞受到很多研究者的重视。 2 材料表面活化后固定内皮细胞 s h e l t o nr m 1 l 等将聚四氟乙烯用氮等离子体和氧等离子体处理，表面形 成了含氮和含氧的基团，并且亲水性增加。将改性后的聚四氟乙烯进行人 内皮细胞培养，表面形成了单层的细胞，但在未处理的聚四氟乙烯上却未 能形成单层细胞。 y s u z u k i f 2 1 将n a + 、n 2 + 、0 2 + 和心+ 离子注入到聚苯乙烯和聚亚安酯表 面，发现细胞黏附能力均有所提高。 m a s a y al w a k i 4 ，l 将惰性气体元素、活性气体元素等注入聚酰亚胺、聚乙 炔、聚四氟乙烯等有机材料中，成功地改变了有机材料的表面性质，促进 了内皮细胞粘附。 西南交通大学硕士研究生学位论文第12 页 3 材料表面生物化后固定内皮细胞 s h iq 1 4 4 l 等在植入支架7 天后的狗的皮下注入粒细胞集落刺激因子 ( g c s f ) ，4 周后取出，g c s f 表面形成了单层的内皮细胞层，而未加 g c s f 的一组表面只有纤维蛋白凝固物，没有内皮细胞形成。 h ew 嗍等将胶原和p ( l l a c l ) 混合制备成纳米纤维，这种纳米纤维在 形态和化学性质上分细胞外基质很像。体外人冠状动脉内皮细胞培养结果 显示，混合纳米纤维可以促进内皮细胞的粘附、增殖及活性，并且细胞形 态未发生变化。 j i 等通过在聚乳酸基材表面层层交替组装上海藻酸钠西n a t e ) 多聚赖 氨酸( p l l ) 、聚醚酰亚胺( p e i ) 明胶、脱百酰壳聚糖( c s ) a l g i n a t e 及p e i a l g i n a t e 等不同的聚阴阳离子对，构建了一系列类细胞外基质组分的表面。 具有显著地促进软骨细胞和骨细胞的吸附和生长1 4 6 1 。 杨荣1 4 7 1 等将一种生物活性肽u r o c o r t i n 加入聚四氟乙烯中并进行内皮细 胞培养，结果表明加u r o c o r t i n 组的聚四氟乙烯表面黏附内皮细胞的能力与 未加u r o c o r t i n 组之间没有明显差异，但是内皮细胞增殖生长速度却明显快 于未加u r o c o r t i n 组。 武忠1 4 8 】等的研究表明在聚酯材料表面共价结合人工合成的r g d 以及预 衬纤连蛋白均可促进内皮细胞的粘附和增殖，且二者作用无显著差异，但 r g d 促进细胞黏附的作用更加明显。 由研究现状可知，预先将蛋白、多肽、明胶、细胞生长因子等大分子物 质固定于生物材料表面，充当临近细胞、基质、可溶性因了的受体，使表 面形成一个能与生物活体相适应的过渡层，可以促进细胞在材料表面的黏 附。但是，若要生物大分子牢固地固定在生物材料表面，必须使生物大分 子中的某些基团与材料表面的反应性基团化学键合，这通常要求材料表面 具有o h 、c o o h 、n h 2 等反应性基团。因此，通过表面改性使材料表面 具有这螳基团是在材料表面固定生物大分子的前提1 4 9 l 。 西南交通大学硕士研究生学位论文第13 页 1 4 3 1 无机材料表面基团化的研究 从目前材料表面内皮化的研究中可以发现促内皮化的研究多集中在高 分子材料上，而无机材料因为表面缺乏活性基团，较难实现表面内皮化， 因此，对无机材料表面改性，使之具有活性官能团，对无机材料表面内皮 化具有重要意义。 大多数无机材料表面都有一层薄的化合物膜，在一定条件下可以形成 附着于表面的羟基( - - o h ) 、氨基( - t e a 2 ) 、羧基( - c o o n ) 等官能团使表面 具有生物活性。 其中，具有羟基基团的生物材料并不能直接固。定生物分子，一般采用双 官能试剂或偶联活化剂连接材料与表面生物分子。常用的双官能团试剂有 戊二醛( g a ) 、对硝基苯氯甲酸酯( n p c ) 、马来酰亚胺( m a ) 、二异硫氰酸酯 等。 而氨基基团n h 2 不仅能使材料表面带一定的正电荷，调节表面亲水疏 水平衡，还可以与蛋白质肽链发生官能团间的相互作用，进而促进细胞黏 附。因此在无机材料表面得到氨基基团，对内皮细胞黏附有重要意义。 苏葆辉1 5 0 l 等利用n 2 与n h 3 混合气氛对聚羟基磷酸钙钠( h p p a ) 进行低温 等离子体处理，结果表明，经等离子体改性后，氨基、羟基被引入材料表 面，使其生物活性提高。 陈治清【s - l 等将羟基磷灰石至于置于真空高压电场中，通入n i t 3 、h 2 、 n 2 混合气体，在电容耦合辉光放电的等离子体环境中，使材料表面瞬间获得 活性氨基结构，且对材料本体的形态和性能不产生任何影响。 n i n a g a k i l 钮l 等对无定形碳( a c ) 进行等离子体处理，把无定形碳放入 用耐热玻璃制成的管状反应器中，通入n h 3 等离子体，射频功率为1 3 5 6 m h z ，同时得到了含氮和含氧基团。并且氨基的含量与射频功率的值有关， 当射频功率为1 0m h z 时，能更好的在a c 表面得到氨基。 s i p e h i f 5 ，i 等用无水氨气对聚苯乙烯培养皿及聚四氟乙烯膜进行了等离子 西南交通大学硕士研究生学位论文第14 页 体处理，将氨基成功地引入材料表面，从而促进了牛内皮细胞在这两种材 料上的黏附生长。 可见，在无机材料表面直接形成氨基基团的研究较少，且大多是采取等 离子体处理方法。而另有研究者例采用离子注入的方式在室温下将氨基以 5 x 1 0 1 7i o n c m 2 、l x l 0 1 7i o n e r a 2 和5 x 1 0 1 6i o n c m 2 的注入剂量注入到纯钛表面， 注入能量为l o o k e v ，离子束电流密度为1 毗2 。成功地将氨基基团引入 到纯钛材料表面，形成以t i n 为主的含钛、氨基化合物的改性层。并且此方法 对材料本体的机械性能及粗糙度等方面影响很小。 1 4 3 2 材料表面固定生物大分子 材料表面细胞附着机理揭示，细胞不是直接附着在材料表面，而是附 着到细胞黏附分子的表面。细胞粘连过程受细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ， e c m ) 表面的蛋白质特异识别控制。细胞与细胞外基质蛋白的相互作用主 要通过其表面特异性的受体整合素与细胞外基质蛋白上特异性配体的相互 识别，相互结合和相互作用实现了跨膜信号传递，促使细胞发生一系列的 生理生化反应，从而铺展、黏附于材料上。因此，促进内皮细胞在生物材 料表面黏附，除了改变材料本身性质：表面自由能、表面亲水疏水平衡、 表面荷电性能以及表面拓扑结构，还可以采取在材料表面接枝生物大分子 来调控内皮细胞表面受体与材料表面的连接方式，促进内皮细胞黏附，使 细胞保持良好行为与功能。 细胞外基质蛋白主要包括纤连蛋白( f i b r o n e c t i n ，r n ) 、胶原蛋白 ( c o l l a g e n ，c n ) 、层粘连蛋白( l a m i n i n ，l n ) 、玻璃连接蛋( v i t r o n e c t i n ，v n ) 等。 纤连蛋白( f n ) 是一种广泛存在于细胞外基质、血浆及其他体液中的糖蛋 白，作为一种重要的粘附分子与几种整合素受体结合，参与细胞粘附、迁 移伤口愈合、免疫与炎症等生理和病理过程。 层粘连蛋白( l n ) 是也是一种糖蛋白l 。其结构上至少由二条肽链以二硫 西南交通大学硕士研究生学位论文第15 页 腱联接而成，主要分布于基膜上，血中浓度小于1 0 比g m l 。主要介导上皮 细胞及内皮细胞的粘附，从而影响细胞的生长、分化和运动。研究表明， 许多细胞膜能合成h ，其中主要是各