（发酵工程专业论文）通过非发酵途径改造构建利用蔗渣产异丁醇宿主菌株的研究.pdf

l l i i iiiii i i ii i i it iii l y 17 3 8 2 4 2 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作一：啷履 学位论文使用授权说明 扣| 。年o s 只z - 多h 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 啪口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 黼：印新签连盛f 魅幽哆r 通过非发酵途径改造构建利用蔗渣产异丁醇宿主菌株的研究 摘要 国家能源供应多元化是国家能源策略的一个重要方面，在世界未来的 能源结构中，可再生生物能源将是能源利用的主体之一，异丁醇是理想的 新一代生物燃料。运用异丁醇发酵代谢机理和发酵工程技术，改造宿主菌 株，可以提高异丁醇产量和产率，降低生物燃料异丁醇的成本，力争早日 实现其规模化生产。利用氨基酸生物合成途径和2 酮戊酸中间体，通过非 发酵途径改造，在适宜的宿主菌株中生产异丁醇具有良好的研究和应用前 景。本论文研究通过改造大肠杆菌非发酵途径，构建适于利用蔗渣产异丁 醇的宿主菌株。 为了阻断丙酮、乙醇的生物合成，利用r e d 重组系统对大肠杆菌代谢 途径中的旁路基因进行敲除。对r e d 重组系统实验条件进行了优化，发现 敲除目的基因的最佳条件是：l 阿拉伯糖诱导浓度为4 0l at o o l ，感受态细胞 培养浓度为o d 6 0 0 = 0 6 0 ，电转化加入的d n a 浓度为2 0 n g ，所转入的电击感 受态细胞数为3 1 0 8 ；对大肠杆菌基因做双敲除及第三次敲除时，突变下 一个基因的l 阿拉伯糖诱导最适时间比突变前一个基因稍需延长。利用r e d 重组系统，成功实现对大肠杆菌p f l b 、f r d a b 和办r 基因的缺失，构建了 p f l b 、办别b 和办r 三基因缺失b w 2 5 11 3 f 工程菌株。 为了在大肠杆菌中引入异丁醇合成相关途径，以酿酒酵母模式菌株的基 因组d n a 为模板，p c r 扩增苯丙酮酸脱羧酶( a r o l o ) 及乙醇脱氢酶i i ( a d h 2 ) 基因，再将a r o l o 和a d h 2 连于载体p s e 3 8 0 ，转入宿主工程菌b w 2 5 1 1 3 f 中，构建工程菌株b w 2 5 11 3 f 2 。 细胞生长检测显示，b w 2 5l1 3 f 2 工程菌株生长未受突变影响；蔗渣经 高压爆破联合稀碱预处理，结构、酶解性能改善，可以被工程菌b w 2 5 11 3 f 2 利用作为碳源，蔗渣水解液的利用检测显示，工程菌b w 2 5 1 1 3 f 一2 对蔗渣 水解液利用良好。以上检测显示b w 2 511 3 f 2 可望成为适于利用蔗渣产异 丁醇的菌株。本研究通过非发酵途径改造获得可望利用蔗渣产异丁醇的宿 主菌株，为进一步菌株改造，实现发酵法高效生产异丁醇做出实验铺垫。 关键词：异丁醇非发酵途径r e d 重组系统细胞生长蔗渣水解液 r e s e a r c ho nc o n s t r u c t i o no f a h o s ts t r a i n u s e di nb a g a s s eb u t a n o lp r o d u c t i o nb y e n g i n e e r i n gn o n f e r m e n t a t i v ep a t h 佾l y a b s t r a c t s e a r c h i n gd i v e r s ee n e r g yr e s o u r c e i so n eo fi m p o r t a n tp o li c yi nm a n y c o u t r i e s b i o f u e l h a sb e e ni n c r e a s i n gt a k e ni n t e r e s t e df o ri ti sa ni d e a lr e n e w a b l e e n e r g y c o m p a r e dw i t ht h em a j o ra v a i l a b l eb i o f u e le t h a n o l ，i s o b u t a n o le x h i b i t s b e t t e rp r o p e r t yt h u si ti sc o n s i d e r e da sas u p e rn e x t - g e n e r a t i o nb i o f u e l b a s e d a p p l i c a t i o no ft h ei s o b u t a n o lf e r m e n t a t i o nm e c h a n i s m ，m e t a b o l i ce n g e n e e r i n g a n df e r m e n t a t i o n e n g e e r i n g c o u l d i m p r o v e h o s ts t r a i n sf o ri s o b u t a n o l p r o d u c t i o n t h i s w o r k p a v e s t h e w a y t om a k ei s o b u t a n o l p r o d u c t i o n e c o n o m i c a l l y a n d i n d u s t r i a l l y a v a i l a b l e i th a s g r e a tp o t e n t i a l f o r b i o t e c h n o l o g i c a l r e s e a r c ha n db i o f u e li n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n t o p r o d u c e i s o b u t a n o li nas u i t a b l eh o s ts t r a i nt h r o u g h2 - k e t o i s o v a l e r a t ei n t e r m e d i a t e si n a m i n oa c i db i o s y t h e s i so fn o n f e r m e n t a t i v ep a t h w a y h e r ew es h o wc o n s t r u c t i o n o fah o s ts t r a i nu s e di n b a g a s s e b u t a n o l p r o d u c t i o nb ye n g i n e e r i n g n o n f e r m e n t a t i v ep a t h w a y t oi n c r e a s ei s o b u t a n o lp r o d u c t i o ni ti sn e c e s s a r yt ok n o c k o u tt h eg e n e so f b y p a t h w a yt or e d u c ef o r m a t i o no fb y p r o d u c ts u c ha se t h a n o la n da c e t o n e w e i i i a p p l i e dr e d c o m b i n a t i o ns y s t e mf o rd e l e t i o no ft a r g e tg e n e sa n do p t i m i z e dt h e m a n i p u l a t i o np a r a m e t e r sb yc o m p a r i n gt h ee f f e c to ft r a n s f o r m a t i o nc o n d i t i o n s ， i n d u c t i o nc o n d i t i o na n dc e l lr e c o v e r yc o n d i t i o n so nt h eg e n ek n o c k o u tr e s u l t s o fec o l i t h eo p t i m i z e dt r a n s f o r m a t i o nc o n d i t i o nw a st h a t2 0 n gd n ai sa d d e d i n t o3x10 8c e l l sp e rt r a n s f o r m a t i o n ，c u l t u r eu s e df o rp r e p a r a t i o no fc o m p e t e n t c e l li sa tc o n c e n t r a t i o no f0 6 0o d 6 0 0v a l u e t h ei n d u c t i o nt i m er e q u i r e df o r k n o c k i n g - o u tt h es e c o n dg e n ew a sr e l a t i v el o n g e rc o m p a r i n gw i t ht h a tf o rf i r s t g e n e ，t h ei d e a lc o n c e n t r a t i o nf o ra r a b i n o s ei n d u c t i o nw a s4 0 p m n oo b v i o u s i n f l u e n c ew a sf o u n dw h e nt h er e c o v e r yt i m ew a sa d j u s t e d m u t a n tb w 2 5113 f w a sc o n s t r u c t e db yk n o c ko u to f p f l b 、f r d a b 和办厂u s i n gr e d c o m b i n a t i o n s y s t e m i no r d e rt oi n t r o d u c eo n f e r m e n t a t i v ep a t h w a yi n t oec o l i ，a r oloa n da d h 2 a m p l i f i e df r o my e a s tw a si n s e r t e di n t op l a s m i dp s e 38 0a n dt r a n s f o r m e di n t o b w 2 5113 fw h i c hr e s u l t e di nr e c o m b i n a t i v es t r a i nb w 2 51 l3 f - 2 t h ea b i l i t yt ou s eb a g a s s eh y d r o l y s a t e ( p r e t r e a t e db yu l t r a h i g hp r e s s u r e e x p l o s i o n ) a sc a r b o ns o u r c e ，t h a ti s ，s t r a i n b w 2 5113 f 一2w a sa p o t e n t i a l l y s u i t a b l eh o s ts t r a i no fb a g a s s eb u t a n o lp r o d u c t i o n t h i sw o r ki sa s s o c i a t e dw i t h i m p r o v e m e n to fan o n n a t u r a lh o s ts t r a i nt of a c i l i t a t ep r o d u c t i o no fb a g a s s e i s o b u t a n o lb ye n g i n e e r i n gm e t a b o l i cp a t h w a y k e yw o r d s ：i s o b u t a n o l ；n o n - - f e r m e n t a t i v e p a t h w a y ；r e d - c o m b i n a t i o n s y s t e m ；c e l lg r o w t h ；b a g a s s eh y d r o l y s a t e i v 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章前言1 1 1 异丁醇的功能、开发应用研究概况及目前主要生产方法2 1 2 非发酵途径改造产异丁醇宿主菌株的研究3 1 2 1 大肠杆菌非发酵途径的改造3 1 2 2 影响异丁醇合成的重要基因4 1 2 2 1 苯丙酮酸脱羧酶基因a r 0 1 0 4 1 2 2 2 乙醇脱氢酶i i 基因a d h 2 5 1 2 2 3 丙酮酸甲酸裂解酶基因p j m 5 1 2 2 4 延胡索酸还原酶基因f r d a g 一5 1 2 2 5 d n a 结合转录双重调节基因f n r 6 1 2 2 6 细菌抗氧化系统o x y r 6 1 3 基因敲除技术简介6 1 3 1 基因敲除技术6 1 3 2 r e d 重组机制7 1 4 蔗渣生产异丁醇的研究背景9 1 5 本研究目的、意义以及课题简介1 1 1 5 1 本研究的目的及意义1 1 1 5 2 本课题的主要内容1 2 1 6 本课题的技术路线1 3 第二章材料与方法1 4 2 1 本研究所用菌株和质粒1 4 2 1 1 菌株和质粒1 4 2 1 2 抗生素和其它试剂15 2 2 方法与步骤15 2 2 1 克隆表达1 6 v 2 2 2 基因敲除1 9 2 2 3 蔗渣的前处理2 5 2 2 4 蔗渣的酶解方法2 5 第三章结果与分析2 6 3 1 r e d 重组系统利用的最佳条件摸索2 6 3 1 1 转化条件对突变影响2 6 3 2 影响异丁醇生产的代谢旁路的基因敲除2 9 3 2 1 影响异丁醇生产的代谢旁路的基因敲除3 0 3 3p f l b 、办幽b 和加缺失突变体非发酵途径的改造3 2 3 3 1 酿酒酵母总d n a 的提取( 图3 3 1 ) 3 4 3 3 22 酮酸脱酸酶( a r o l o ) 及乙醇脱氢酶( a d h 2 ) 基因的克隆3 4 3 4 蔗渣前处理3 6 3 4 1 超高压爆破碱法前处理蔗渣3 6 3 4 2 超高压爆破对蔗渣结构的影响3 7 3 4 3 超高压爆破碱法对酶解的影响3 7 3 5 构建宿主菌株的生长、蔗渣水解物的利用检测4 0 3 5 1 生长检测4 0 3 5 2 蔗渣水解物的利用检测4l 第四章讨论4 2 4 1 通过非发酵途径改造获得适于利用蔗渣产异丁醇的宿主菌株4 2 4 2 实验方法优化提高宿主菌株非发酵途径改造效率一4 2 4 3 超高压爆破碱法处理蔗渣有利于蔗渣异丁醇宿主菌株发酵4 3 第五章结论与展望4 4 5 1 结j 沧4 4 5 2 展望4 4 参考文献4 6 致谢5 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文5 3 附勇毛i 5 4 附录i i 6 0 v 1 广西大学硕士学位论文通过j 发酵途径改造构建利用蔗渣产异丁醇宿主菌株的研究 第一章前言 近几年来，随着不可再生性资源能源的逐渐消耗，可再生性资源能源成为各个国家 甚至各个地区的研究热剧。生物质能源产业的规模性发展成为全球性的话题，无论市 场油价高低运行，各国扶持政策始终保持着延续、深化生物质能源的发展，生物质能源 产业发展和市场的格局欣欣向荣。近年来，全球生物质能源的生产和使用量正持续增涨， 主要用做车用替代燃料。美国前总统布什曾在2 0 0 7 年国情咨文中公布能源的目标：在 未来1 0 年内，美国将通过开发替代燃料和提高燃油效率将汽油消耗量降低2 0 。中国 也加大了技术研发和财政支持的力度，正努力完善市场政策的体系，这些举措将有效推 动生物质能源的技术进步和产业化进程【2 j 。 目前生物燃料仍以燃料乙醇为主，但乙醇并不是一个理想的生物燃料，因为它的能 量密度比汽油低，而且由于它的吸湿性造成了储存和分配方面的问题。而高级醇如异丁 醇( c 4 和c 5 ) 的能量密度和汽油接近，不吸湿，并且与乙醇相比，波动较小。近两年 人们发现异丁醇的物理性能更优于乙醇，异丁醇所含能量较高且对环境影响较小、释放 的蒸汽压较低，不溶于水可用作混合原料，而且具有低挥发性，其腐蚀性也较乙醇低。 由于异丁醇不溶于水，低蒸汽压力，使得异丁醇的运输可依靠现有的汽油输送管道及分 销渠道。这就意味着可以不用另外建设混合设施、储存罐以及零售管道使得成本较低。 此外，现有汽车引擎可直接使用异丁醇，不需要掺入汽油，并且与生产1 加仑的乙醇相 比，生产l 加仑的异丁醇消耗的能量较少，且能多生产至少5 0 的可用能源1 3 j 。因此利用 燃料异丁醇代替燃料乙醇作为车用替代燃料在将来是极有可能的【4 1 。2 0 10 年3 月美国勒芒 系列赛a m e r i c a nl em a n ss e r i e s ( a l m s ) 宣布，视异丁醇为其第五能源。b p 异丁醇乙醇 调合物( b pa l m si b e2 0 ) 己被认证可列入l m p - l m l 一l m p 2 分类中应用。b p 公司及其开发伙 伴杜邦公司对异丁醇燃料组分非常重视，通过他们先进生物燃料合资企业b u t a m a x ，正 在开发商业化设施以制造异丁醇。 成异丁醇具有良好的发展前景，能利用发酵法生产被视为生物燃料汽油替代品的可再生 能源异丁醇是目前市场及人们所极为期待的口1 。 2 广西大学硕士掌位论文通过j e 发酵途径改造构建利用蔗渣产异丁醇宿主菌株的研究 1 2 非发酵途径改造产异丁醇宿主菌株的研究 就目前市场而言，为了使异丁醇在工业生产方面发酵法较化学法更具有竞争力，发酵 法必须拥有短时问内达到较高产量的优势。传统的发酵菌株不能满足生产需要，需要对 异丁醇生产宿主菌株进行改造，提高其产物耐受性、原料利用率等性状【引。 1 2 1 大肠杆菌非发酵途径的改造 传统的发酵途径是指微生物自身所拥有的代谢途径，而非发酵途径则是指微生物中 本不存在，但通过人工合成然后导入微生物中利用微生物自身代谢途径产生的产物或中 间产物的代谢途径。代谢工程组学以及基因工程技术是用于改造发酵菌株，使之成为非 发酵工程菌株的有力工具，如今加利福尼亚大学洛杉矶分校j a m e sc l i a o 教授利用代谢 工程手段对大肠杆菌进行了改造，使其能够利用非发酵途径生产长链醇类如异丁醇( 如 图3 ) 。非发酵途径生产醇类的策略原理是：2 酮酸是氨基酸的生物合成途径中的中间体， 这些代谢物可被2 一酮基酸脱羧酶( 1 c s ) 通过广泛的底物范围转化为醛，然后被乙醇 脱氢酶( a d h s ) 转化为醇类。利用这项战略，只需非母本宿主代谢的两个步骤，通过氨基 酸生物合成途径利用2 酮酸作为中间体可以生产出各种醇类生物燃料。由于氨基酸生物 合成途径能够产生各种各样的2 酮酸。如缬氨酸生物合成途径产生的2 酮戊酸可以作为 生产异丁醇的基材1 9 j 。在这个研究中，主要是将控制溶剂产生的代谢途径导入遗传操作 方面极其成熟的大肠杆菌中，在一定范围内改变了大肠杆菌的代谢途径，使大肠杆菌能 够生产异丁醇。当然在微生物中转入一些原来没有的代谢途径的表达可能导致代谢失 衡，而且异源代谢的产物及中间产物的积累，可能会导致细胞毒性反应【1 0 j 2 1 。于是利用 基因工程和代谢工程技术，解除代谢过程中将可能存在的产物或者中间产物等的抑制， 提高菌种对异丁醇的耐受性，并强化异丁醇生产中的关键酶，切断丙酮、乙醇的生物合 成代谢途径，以便提高异丁醇在溶剂中的比例，这些实验必将成为今后研究高产异丁醇 的发展方向之一。 这一战略实施在大肠杆菌中，其实这一代谢途径不仅可应用于大肠杆菌还可应用于 酿酒酵母。这些宿主生物体有着快速的生长速度，而且是兼性厌氧菌，为大规模生产工 艺设计灵活和经济所允许【1 3 ，1 4 】。通过改造，可以获得优良的异丁醇发酵菌株，大肠杆菌 3 通过j 发酵途径改造构建利用蔗渣产异丁鹤e 宿主菌株的研究 和酿酒酵母均是理想的改造对象。 g l u c o s e l 啪a t e v a l i n eb i o s y n t h e s i s l l v l h e 0 图3 、非发酵途径生产异丁醇 f i 9 3 t h en o n f e r m e n t a t i v ep r o d u c t i o nw a yo fi s o b u t a n o l 1 2 2 影响异丁醇合成的重要基因 根据代谢工程组学的研究发现苯丙酮酸脱羧酶基因a r 0 1 0 、乙醇脱氢酶i i 基因a d h 2 、 丙酮酸甲酸裂解酶基因矽b 、延胡索酸还原酶基n f r d a b 、d n a 结合转录双重调节基晰， 等会直接影响到异丁醇的生物合成。 1 2 2 1 苯丙酮酸脱羧酶基因a r 0 1 0 酿酒酵母基因组中有五个可能用于编码苯丙酮酸脱氢酶活性的基因，包括编码脱羧 酶活性的a r 0 1 0 ，它是以焦磷酸胺素为辅酶的。另外四个基因中有三个是丙酮酸脱羧酶 p d c l 、p d c 5 、p d c 6 ，一个是同样是编码脱羧酶的t h l 3 。v u r a l h a n 等对苯丙酮酸脱羧酶 基因座了比较详细的研究，他们发现在以l 苯丙氨酸为氮源的条件下，a r 0 1 0 的转录水 平比其他的四个基因高出3 0 倍。2 0 0 7 年浙江大学的杨霄等人通过实验证明了a r 0 1 0 才 是主要决定苯丙酮酸脱羧酶的活性的基副1 5 j 。 4 广西大学硕士掌位论文 通过非发酵途径改造构建利用蔗渣产- r r - 丁醇宿主菌株的研究 1 2 2 2 乙醇脱氢酶i i 基因a d h 2 乙醇脱氢酶i i 英文名a l c o h o l d e h y d r o g e n a s ei i ，简称a d h 2 。当反应环境中缺乏葡萄 糖碳源时，a d h 2 负责催化利用乙醇作为碳源的初始反应的酶 1 6 , 1 7 】。缺乏a d h 2 活性的菌 株是不能在以乙醇为唯一碳源的培养条件下生长【1 8 】。虽然a d h l 和口d h 2 具有8 9 的相似 序列，但由于其底物的亲和力有所不同，对于乙醇的k m 值只有乙醇脱氢酶的其他几 种的十分之一左右【1 9 , 2 0 。因此，a d h 2 对乙醇具有高度的亲和力，在代谢过程中，口d h 2 能够氧化乙醇成为乙醛。 1 2 2 3 丙酮酸甲酸裂解酶基因p f l b 丙酮酸甲酸裂解酶英文名p y r u v a t e f o r m a t e 1 y a s e ，简称p f l ，在大肠杆菌的代谢途径 中，是葡萄糖代谢途径中的一种关键酶，它能够催化丙酮酸及辅酶a 所参与的反应，使 其生成甲酸及乙酰辅酶a 。虽然丙酮酸甲酸裂解酶在有氧气存在的条件下会发生失活， 并且是不可逆的失活，但由于大肠杆菌中存在一个激活系统，该系统在厌氧的条件下， 经过激活系统( 激活因子及辅酶构成) 可以将没有活性的丙酮酸甲酸裂解酶转化成有活 性的，这个系统也是大肠杆菌对厌氧代谢途径的一个保护系统。关于大肠杆菌中的丙酮 酸甲酸裂解酶基因，人们已经相当了解其催化机理及三维结构【2 1 - 2 4 1 。由于丙酮酸甲酸裂 解酶是丙酮酸代谢途径中的重要分支，该基因会直接影响大肠杆菌代谢中的最终产物的 量，因此，为了增加丙酮酸在合成缬氨酸途径中的竞争能力而提高异丁醇的产率，我们 想到了阻断其分支代谢途径【2 5 。2 7 1 ，于是首先将目光转向了矽基因的敲除。 1 2 2 4 延胡索酸还原酶基因f r d a b 延胡索酸还原酶英文名f u m a r a t er e d u c t a s e ，简称f r d ，也称富马酸还原酶，是 把延胡索酸催化还原成琥珀酸的酶，在催化过程中从n a d h 中接受h ，它是微生 物新城代谢中无氧呼吸过程中的一个重要的呼吸酶【2 8 1 。f r d 有四个亚基，其中有两个 是水溶性的，分别为f r d a 黄素蛋白和f r d b 铁硫蛋白。以及另外两个亚基f r d c 膜蛋白 和f r d d ，这两个膜蛋白均处于内膜。f r d a 和f r d b 均为催化亚基，其中f r d a 亚基包含 有f a d 的辅助因子1 2 引。敲除大肠杆菌b w 2 5 113 尸厂佃中的富马酸还原酶基因p d a b ，可 以减少途径中其它副产物，增加对丙酮酸的供应。 通过j e 发酵途径改造构建利用蔗渣产异丁醇宿主菌株的研究 1 2 2 5 d n a 结合转录双重调节基因办厂 f n r 是d n a 结核转录双重调节基因，它通过上百个调控基因介导从厌氧到好养的生 长，它还介导许多基因的转录和功能，如耐受性，趋化性以及分子合成等等。虽然该调 节基因的活性直接由氧来调控，但它可以同时在厌氧和好氧两种状态下使菌体增长。 1 2 2 6 细菌抗氧化系统o x y r 对于活性氧对细菌的生理代谢造成的氧化损伤起防卫作用的d f y 硒周节子是最早 发现的具有抗氧化的调节系统之一，也是实验研究最为广泛和深入例的抗氧化系统之 一。 似川调节蛋白是细菌中l y s r 型转录调节因子家族的成员之一 3 1 , 3 2 】。o x y r 调节蛋白 主要的生理代谢作用有：抗氧化作用【3 3 】、致病性3 4 1 、外膜蛋白相型3 5 1 、抑制自发突变、 耐药1 生 3 6 , 3 7 】、耐辐射3 8 1 、铁代谢等。 1 3 基因敲除技术简介 1 3 1 基因敲除技术 基因敲除代谢工程有力的工具，是基于胚胎干细胞技术和同源重组技术的基础上 逐步完善并发展起来的，它主要是利用d n a 的转化技术【3 9 】，将带有靶基因同源臂和抗 性或其他筛选片段的重组载体导入至靶细胞中，通过重组载体与靶细胞染色体上的同源 序列之间发生重组，将外源片段整合进所需敲除的内源基因的基因组中后使特定靶基因 失活的一种技术。 基因敲除技术主要有以下几个步骤构成：i 构建基因重组载体( 将带有靶基因同源 臂和目的基因的d n a 片段都重组至带有标记的基因载体上，此基因载体即为基因打靶 载体，这个载体总共包括三部分靶基因同源臂、外援目的基因及标记基因) ；i i 将重组 载体转化入靶细胞中( 采用电穿孔或者显微注射之类的方法将重组载体导入靶基因细胞 核内) ；i i i 在转化子中筛选阳性细胞( 用筛选培养基筛选转化成功的细胞) ；i v 检测阳性 克隆的表型特刎4 0 】( 检测转化成细胞的生物学特性，对该菌株进行形态学和分子生物学 6 厂西大掌硕士掌位论文通过爿 发酵途径改造构建利用蔗渣产异丁醇宿主菌株的研究 的检测) 4 1 1 ；基因敲除的主要策略有：整个基因完全敲除策略；基因特定部分敲除策略； 精细突变的引入( 比较常用的方法有基于重组酶系统的方法【4 2 j 以及“t a ga n de x c h a n g e ” 和“hi ta n dr u n ”) ；基因捕获策略( 即大规模随机基因敲除) 。 近几十年来，基因敲除已经成为一种极为重要的重组d n a 技术，而在微生物代谢 工程的研究中，为了构建特定的基因工程菌时，广泛采用了以下两种技术：在细菌中进 行基因敲除主要利用入噬菌体的r e d 系统；在酵母中利用p c r 介导的基因中断技术。 利用此方法构建的基因工程菌可以改变生物代谢途径，阻断不需要的副产物的正常进 行，阻止有毒物质或副产物的形成，促进特定产物的积剽4 3 1 。 入噬菌体的r e d 系统是原核敲除系统的代表，是入噬菌体基因r e d 区段编码的一个 能够启动细菌染色体与外源d n a 发生同源重组的系统，这个系统主要由3 个基因组成： b e t ( a k a f l ) ，e x o 和g a mf ，口砌一，p l 操纵子控制了这三个基因【4 4 4 7 1 。e x o 基因的结晶在 溶液中形成环形三聚体，中间有一个通道，旁边既可以可以调节d s d n a ，又可以调节 s s d n a i 4 s l ，当它结合在双链d n a 的末端时，可以沿着5 7 端向3 端开始降解d n a ， 由此产生3 7 突出端1 4 引。而b e t 基因编码的b 蛋白是一种退火蛋白，它的单亚基分子 量为2 5 1 8k d 。b e t a 蛋白在溶液中能自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链d n a 3 7 突出端，防止d n a 被单链核酸酶降解，同时介导互补单链d n a 的退火，待双链d n a 退 火完后, b e t a 蛋白便从d n a 双链上解离下来。g a m 基因分子量为1 6 0 0 0 d a ，它结合宿 主蛋白时， r e c b c d 的外切酶活性会遭受到抑制【5 0 5 1 1 。 1 3 2 r e d 重组机制 从上个世纪开始，有人在文章中报导过入编码的产物能引导细菌内部重组【5 3 】，随后 c l a r k 报道过九r e d 系统，文章中提到的重组机制见下图( 如图1 ) ： 7 广西大学硕士学位论文通过j e 发酵途径改造构建利用蔗渣产异丁醇宿主菌株的研究 l 5 7 i ：，之。i ：。，。a 。e = = 二；f 一3 | b e t ae = = 二二兰e e ( 脚3 ， 凸凸么 = = = = = 国岛* 懒 奎十 一一 s i n 9 1 e s t r a n dl ：l ：l _ 、s t r a n di n v a s i o n a n n e a l i n g g 臣关毫瞄 一饫嗣嘛一 i 、= 一 图1 ：r e d 重组机制示意图 f i g l ：r e dr e s t r u c t u r i n gm e c h a n i s md i a g r a m 当b e t a 蛋白与单链d n a 37 突出端结合后，可以形成两种重组机制： ( 1 ) 单链退火( s i n g l es t r a n da n n e a l i n g ) 模型【5 4 】( 如图一左) ：另一同源序列为单链d n a ， b e t a 蛋白则介导互补单链d n a 的退火，完成重组过程。 ( 2 ) 链侵入( s t r a n di n v a s i o n ) 模型( 如图一右) ：参与重组的另一同源序列为没有断裂 的双螺旋d n a 链，单链d n a 在r e c a 蛋白的作用下侵入双链d n a ，完成重组过程。 下图2 描述了通过r e d 重组系统进行基因敲除的过程。 8 一 广西大学硕士学位论文 通过非：发酵途径改造构建利用蔗羞产异丁醇宿主t 1 株的研究 j 量 e 三习 l霾 e 三习 图2 -r e d 重组系统进行基因敲除 f i g2 ：t h eg e n ek n o c k o u tb yr e dr e c o m b i n a t i o ns y s t e m 先合成一对引物，每一条引物的57 端与靶基因同源，有3 5 - - 6 0b p 。然后拿抗性 质粒当作模板，p c r 扩增得到一个中间为筛选基因，两头是需要敲除基因的同源臂。然 后将扩增到的片段电击转化到宿主菌中( 菌中包含有r e d 重组系统) ，r e d 重组系统在 宿主菌中得到适量的表达，其中入核酸外切酶与p c r 扩增片段中的两个同源臂末端结 合在一起，通过酶切使基因组d n a 产生游离的37 端单链d n a 区域，使两同源臂以链侵 入的方式与宿主染色体之间形成重组。重组完成后再进行筛选基因的消除即可完成对靶 分子的定向敲除得到靶基因缺失的突变体。 1 4 蔗渣生产异丁醇的研究背景 蔗渣是一种工业固体废弃物，也是一种可再生性资源。由于蔗渣燃烧时释放二氧化 硫较少，只需用水膜除尘器即可使其烟气排放量达到国家标准，由此可以减少排放费用， 还可以利用其燃烧产生热量的电力或者蒸汽供糖厂使用或者外销，因此在制糖工业开始 以来普遍用作锅炉燃料。尽管如此，在糖价低迷、人们同益重视能源的效率利用、环境 保护的情况下，人们发现蔗渣当做燃料并不是最效率的利用途径，除了燃烧、用于造纸、 活性炭吸附、膳食纤维，蔗渣可以被生物利用，蔗渣通过预处理，再利用各种微生物进 行液态或者固态发酵之后得到各类有价值的生物产品，例如，富含蛋白的生物饲料、酶、 氨基酸以及生产生物质能源生物柴油、燃料乙醇、丁醇、异丁醇等。 众所周知，广西是全国最大的甘蔗生产基地，广西的甘蔗种植面积达1 5 0 0 万亩， 几乎接近全国的7 0 。广西有5 6 个县( 市、区) ，将近有两千万的农民从事甘蔗的种植， 占广西农业总人口的百分之五十左右。广西的甘蔗基本应用于制糖业，在利用甘蔗制糖 9 广西大掌硕士掌位论文通过j e 发酵途径改造构建利用蔗渣产异丁醇宿主菌株的研究 的工业生产中，蔗渣是其主要副产品。蔗渣是甘蔗在产糖过程中经过破碎，提取蔗汁后 的甘蔗茎的纤维性残渣。每产蔗糖1 吨，可得1 8 2 5 吨蔗渣。蔗渣的组成成分有：纤 维素3 2 - - 4 8 、半纤维素1 9 - - 2 4 、木质素2 3 - - 3 2 、灰分4 。 利用蔗渣生产异丁醇的流程为：前处理一发酵一产物分离。蔗渣中所含的纤维素 和半纤维素组分可以经过水解后产生葡萄糖、木糖等单糖，这些单糖经微生物发酵转化 后可成为生物质能源网或生物化工原料酬。众所周知，蔗渣与其它木质纤维材料一样， 其构成成分纤维素、半纤维素和木质素等紧密结合在一起构成了一个相当牢固的木质纤 维结构，因此在酶解过程无法彻底的进行，也没办法直接应用于微生物发酵。为了更好 的利用蔗渣，在其酶解前需要进行前处理【5 7 】。 对于蔗渣的前处理，至今已研发了数十种工艺方法，目前最常用的方法分别为生 物处理、机械处理、热处理、酸处理、碱处理、不同方法结合处理等。 生物处理法主要利用微生物来提高蔗渣的酶解率。所使用的微生物通常能够降解木 质素和半纤维素。生物前处理不仅可以除去木质素组分，也可以除去各种微生物的抑制 物。 机械处理方法通常是先将蔗渣粉用粉碎机械粉碎，然后用球磨机将其更进一步地磨 成微粒粉末状。该方法处理的目的是降低蔗渣的纤维素结晶度和聚合度，增加酶对其作 用的有效面积【5 引。经机械方法前处理后，蔗渣的酶解率一般增加5 - 2 5 ，酶解时间缩 短2 3 - - - 5 9 。不过，c h a n g 和h o l t z a p p l e ( 2 0 0 0 ) f 5 9 】手旨出，粒度低于4 0 目后，机械处理对 酶解率和酶解时间几乎没有影响。 热处理技术通常是利用高温来提高蔗渣的酶解率，包括蒸汽处理、高温热水、蒸汽 爆破( 蒸爆) 处理等多种前处理工艺。研究表明，加热温度达到1 5 0 - - 1 8 0 时，首先是 半纤维素，随后是木质素开始产生溶解【6 0 , 6 1 】。半纤维素的溶解与其的组分有关。木聚糖 极不稳定，较易溶出，而葡萄糖胺则在加热后变化很少，较为稳定。 酸预处理工艺利用稀酸或浓酸对蔗渣进行预处理。目前大多数报道采用稀硫酸、稀 硝酸、磷酸或稀盐酸。采用稀硫酸的报道较多，浓度一般为o 5 - - 0 8 1 6 2 】。 与稀酸处理相比较，稀碱处理对木质素和半纤维素主要是溶出作用，并不使之分解。 联合前处理工艺指将二种或多种不同的前处理方法结合，同时对木质纤维材料进行 前处理。 虽然处理的方法不少，但这些方法仍存在一定的不足，有些通过前处理后其酶解效 率仍较低6 3 1 ，也有些处理后仍需较大的酶使用量【6 4 1 ，这些都会使蔗渣的水解及酶解处理 1 0 通过j e 发萌 途径改造构建利用蔗渣严异- j - 醇宿麦菌株的研究 的费用耗材成为一个比较实际性的难以跨越的问题。 高压均质技术是二十世纪7 0 年代初发明的主要应用于食品工业的酶处理、医药领 域的样品准备，也是应用于化妆品业、制药业、油漆业及石油化工等方面产品的均 质、乳化的一种重要工艺手段。8 0 年代开始高压均质技术被用于生物技术领域的组织 分散及微生物细胞的破碎，已成功破碎大肠杆菌( e s c h e r i c h 肠c o t i ) 、枯草芽孢杆菌旧 a c i l l u ss u b t i l i s ) 、乳酸杆菌a c t o b a c i l l u sde l b r u e c ki is s p l ) 、酿酒酵母体1c e r e vi s i a e ) 、丝 状真菌黑曲霉俾hi z o pu sn i gr i c a n s ) 等菌种的细胞。另外，该技术还能够降低羧甲基纤维 素的聚合度。高压均质的作用过程和蒸汽爆破、氨爆等木质纤维材料的前处理技术极为 相似，即先对物料进行高压处理，然后将压力瞬间释放，产生爆破作用，使物料破碎。不 同的是处理压力为液压，而且极高( 3 0 2 0 0 mp a ) ，远高于蒸汽爆破法( 2 10 2 1 2 mp a ) 和氨爆法( 约2 13 mp a ) 。因此，高压均质实质上是一个采用液压为处理手段的超高压爆破 过程。该技术对微生物的破胞和降低羧甲基纤维素聚合度的作用暗示可以将它用于破坏 木质纤维材料的结构，对生物质进行前处理。 预处理后的蔗渣经纤维素酶糖化，可供微生物发酵异丁醇。异丁醇产物可以通过下 游处理进行纯化。发酵液经过除固体物质、初提取、蒸馏、精馏，制得异丁醇产物。 1 5 本研究目的、意义以及课题简介 1 5 1