（林产化学加工工程专业论文）桂油生物技术法合成天然苯甲醛探索及其分析方法构建.pdf

柱油生物技术法合成天嚣摹甲睦挥囊a 其分析方法柏建 桂油生物技术法合成天然苯甲醛 探索及其分析方法构建 摘要 天然苯甲醛是一种广范应用于食品、医药、化妆品行业的高价香料。 筛选能将肉桂醛转化成苯甲醛的酶源菌株，是微生物转化法生产天然苯甲 醛的前提条件。 本文以广西肉桂油的主要成分肉桂醛为底物，以微生物产生的酶为催 化剂来合成天然苯甲醛。土样采集主要选择桂油厂周围、花圃堆积肥等地 方。其研究内容主要包括两个方面： ( 1 ) 产酶菌种的筛选、发酵以及酶催化合成天然苯甲醛反应的研究 通过大量实验，采用常规方法培养时，共筛出1 8 1 株对肉桂醛有耐受 性的菌株；将常规培养基换成细菌培养基以后，共筛出3 6 株菌。对每一株 分离得到的菌株都进行摇瓶试验，检验其产生的酶是否具有催化肉桂醛转 化成天然苯甲醛的能力。结果表明，常规方法培养时，大部分菌株的转化 产物中苯甲醛含量都低于1 ，仅8 株菌大于3 ，计算这8 株菌对应的产物 中苯甲醛产率，苯甲醛产率最高为1 3 0 2 ；而采用细菌培养基培养时，转 化产物中苯甲醛含量普遍高于2 ，苯甲醛最高产率为1 7 1 9 。 ( 2 ) 复杂体系简单分析方法的构建 考虑到酶催化所得转化液为多元混合体系，本论文重点考察了用紫外 l l l l - ：硅l 生物垄p k 法合成天然革甲醛挥索及其分析劣咤 构建 分光光度仪对水中肉桂醛和苯甲醛进行定性定量分析的测定方法，给出了 混合体系中肉桂醛和苯甲醛浓度与吸光度计算公式： 与气相色谱法相比，紫外一可见分光光度法适用性更强，更适合工厂 实验室检测。 关键词：肉桂醛天然苯甲醛生物转化紫外分光光度法 磅 鸳 铲 ” m 蚴 o 霹 咏 叫 _ 皇 盯 陬 陬 = = ，、l 广西大掌硕士学位论文桂油生物技术诗暗成天然摹甲日 探索覆其分析力崎柏建 s t u die s0 nt h ebio s y n t h e siso fn a t u r a lb e n z a l d e h y d e f r o mc l n n a m o n0 i la n dt h ee s t a b l l s ho fa n a l y t i c a l a p p r o a c hf o rt h ec o m p lic a t e ds y s t e m a b s t r a c t n a t u r a ib e n z a i d e h y d eisak i n do fe x p e n s i v ef r a g r a n c et h a tisw i d e i yu s e d i nf o o d m e d i c ir ea n dc o s m e t i c sin d u s t r y s c r e e n in gt h em i c r o o r g a n i s mt h a tc a n c o n v e r tc in n a m o no iit ob e n z a i d e h y d eb ye n z y m ew a st h ep r e r e q u i s i t eo fe n z y m a t i c s y n t h e s is t h isp a p e rw a sa i m e d t os y n t h e s iz en a t u r a ib e n z a i d e h y d ew i t he n z y m eo b t a i n e d b ym i c r o o r g a n is m c i n n a m a i d e h y d eisa ne s s e n t i a ic o m p o n e n to fc i n n a m o no ii i n t h i sr e s e a r c hi tw o r k e da sas u b s t r a t e a n da i lt h es o iis a m p i e sw e r ec o ii e c t e d f r o mt h es u r r o u n d i n g so fc i n n a m o no ii f a c t o r y ，f i o w e rf e r t iii z e ra n ds oo n o n t h ew h o i e t h isr e s e a r c hm a i n i yin c i u d e dt w oa s p e c t s ： ( 1 ) t os c r e e na n df e r m e n tt h es t r ain sp r o d u cin gt h eaim e de n z y m ea n ds t u d y o nt h ee n z y m a t i cs y n t h e s i sr e a c t i o l 3o fn a t u r a lb e n z a l d e h y d e 1 8 1c i n n a m a i d e h y d e t o i e r a n t e ds in g i es t r a i n sw e r eo b t a i n e dw h e no u i t u r e d i nn o r m a lw a y a n d3 6s t r a in sw e r eo b t a in e dw h e nt h en o r m a ic u i t u r em e d i u mw a s c h a n g e dt of i tf o rb a c t e r i ab e t t e r ino r d e rt oc h e c kt h e irb i o c a t a l y t i c c a p a b iii t y e a c ho ft h es t r a in sw a sp u tt os h a k ef i a s kt e s t t h er e s u i ts h o w e d t h a tw h e nc u i t u r e di nn o r m a lw a y t h ew e i g h tp e r c e n to fb e n z a i d e h y d ei nm o s t p r o d u c t st h a tw e r ec o n v e r t e db yt h e18 1s t r ain sr e s p e c tiv eiyw a sie s st h a n1 o n i y8p r o d u c t se x c e e d e d3 c a i c u i a t in gt h e irc o r r e s p o n d i n gy i e i df o rt h e8 p r o d u c t st h a tw e r ec o n v e r t e db yt h e8s t r a i n s ，t h eh i g h e s to n e sy i e i dw a su p t o1 3 0 2 b u tw h e nt h en o r m a ic u i t u r em e d iu mw a sc h a n g e dt of i tf o rb a c t e ri a b e t t e r t h em o s ta v e r a g ew eig h tp e r c e n to fb e n z aid e h y d ee x c e e d e d2 a n dt h e i i l 广西大掌硕士尊啦隆文 桂油生物皇旧t 诗暗成天然革甲矗 探索反其分析方法构建 h i g h e s to n e sy i e i dw a s1 7 1 9 ( 2 ) t os e tu pas i m p i ea n a i y t i c a im e t h o df o rt h ec o m p ii c a t e ds y s t e m a st h ep r o d u c tt h a tw a sp r o d u c e db yt h ee n z y m a ticr e a c tio nw a sac o m pi ic a r e d m u i t i c o m p o n e n ts y s t e m 。aq u a ii t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a i y t i c a im e t h o dw a s s t u die db yuit r a vi0ie ts p e c t r o p h o t o m e t e ra b o u tcn n a m aid e h y d ea n db e n z aid e h y d e t h a td l s s o l u t e di nw a t e r t h ec a i c u i a t i o nf o r m u i a sa b o u tt h er e i a t i o n s h i pb e t w e e n t h ec o n c e n t r a tio na n dt h eu va b s o r p t io r so fb e n z aid e h y d ea n dcin n a m aid e h y d ein t h e irb i n a r y m i x e ds y s t e m w e r eg i v e n i ts h o w e d t h a t t h es e r v i c e a b i i i t yo fu v v is s p e c t r o p h o t o m e t ri cm e t h o dw a sb e t t e rt h a nt h eg a sc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o di nt h is c o m p ic a t e d m uitic o m p o n e n t s y s t e m s ot h eu v vis s p e c t r o p h o t o m e t r ic d e t e r m i n a t i o nm e t h o dw ii ib em o r ea v a ii a b i et oi a b o r a t o r yt r a c i n gd e t e c t i o ni n c in n a m o no ii f a c t o r y k e yw o r d s ：c i n n a m a l d e h y d e ；n a t u r a lb e n z a l d e h y d e ；b i o c o n v e r s i o n ； u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r y i v 广西大掌硕士掌位论文柱油生物投术法含成天然摹甲醛探索a 其分析方法构建 1 1 苯甲醛 1 1 1 苯甲醛物理性质 第一章绪论 苯甲醛是一种无色或浅黄色，具有强折射率的挥发性油状液体，有强烈的苦杏仁气 味，故又称为苦杏仁油。它广泛存在于杏仁、核桃仁、橙花、风信子、玫瑰、肉桂、依 兰、香茅、樱桃等蔷薇科植物中，主要以苷的形式存在于植物的茎皮、叶和种子内，例 如苦杏仁中的苦杏仁苷“1 。苯甲醛英文名为：b e n z a l d e h y d e ，分子式：c 6 h 。c h o ，分子量 1 0 6 1 2 9 m o l ，沸点1 7 9 ( 1 0 3 3 k p 下) ，熔点- 2 6 ，闪点6 3 ，自燃温度是1 9 2 c ， 折光率1 5 4 5 5 ，粘度1 3 2 1 c p ( 2 5 ) ，密度1 0 4 6 9 c m - 3 ( 2 5 ) ，比热容( 液 体) 1 6 1 5 j g k ，汽化潜热3 6 2j g k ，标准燃烧热一3 1 9 k j g ，在水中的溶解度 ( 2 0 ) 0 6 ( 质量百分含量) o 】。 1 1 2 苯甲醛的用途 苯甲醛是目前国内外用途最为广泛和开发最早的芳香醛产品之一，在数量上，苯甲 醛是第二大主要的香料。它能进行亲核加成、羟醛缩合、康尼察洛反应、潘金反应、硝 化、氯化等系列反应，能衍生成许多化工产品，在医药、香料、农药、染料、化学等工 业中用途甚广。在医药工业中，可以合成卡那霉素、尼群地平、间孢三嗪钠、麻黄碱、 胃复康、间羟胺、三苯乙醇铜苯唬胺等。在香料工业中，用于合成椰子油香料、杏仁油 香料、樱桃油香料等，尤其在西方国家，杏仁香味的食品倍受青睐，仅食品行业天然苯 甲醛年需求量约3 0 0 0 t 0 3 ，其中软饮料业用量最大，如美国可口可乐、百事可乐公司都是 购买天然苯甲醛作配方原料的大客户。在染料工业中，用于合成4 ，4 一二氨基三苯甲 烷、碱性绿、邻磺酸亮蓝等。在化学工业中，苯甲醛是一种重要的精细化学品中间体。 此外，它还是树脂、油类、某些纤维素醚、醋酸和硝酸纤维素的溶剂“，在制造香味化 合物、药物、肥皂、照相化学品、调味料及合成香料“1 等方面有着广泛的用途。 目前苯甲醛的用途又有新的延伸“】：如( 1 ) 用于制油漆消泡剂；( 2 ) 氯乙烯悬浮聚合 釜阻垢剂；( 3 ) 间苯二酚一苯甲醛一甲醛树脂，用于改进橡胶轮胎帘布粘结剂；( 4 ) 抗摩 润滑剂。 随着国民经济的飞速发展，以苯甲醛为原料的相关产业得到不断开发与拓展，苯甲 醛的需求量也越来越大，但目前天然苯甲醛的产量还很低，国际市场上仍处于买方市场， 急需补给，其市场发展前景十分乐观。 广西大掌硕士掌位论文柱油生物技术法合成天然摹甲醛探索a 其分析方法相建 1 2 化学法合成苯甲醛 在化学工业生产领域中，苯甲醛的制取主要分为直接提取和化学合成这两类方法。 第一类化学生产方法是从天然植物中直接提取苯甲醛。其具体做法是以蔷薇科植物 苦扁桃、杏仁及其它含有苦杏仁苷的果仁为原料，经水浸渍、磨碎并压榨除油后，经水 蒸汽蒸馏和碱洗等特殊处理，再重蒸以除去氢氰酸而成“1 。为了制得合格的产品必须将 有剧毒的氢氰酸和含氯化合物除去，而氰化物分离困难，这就造成了极高的生产成本， 且此法原料来源很有限，故不能得以广泛应用。 第二类化学生产方法主要有以下几种： ( 1 ) 亚苄基二氯水解法 此法是最早生产苯甲醛的方法，先将甲苯在适当条件下进行侧链氯化，得主要产物 亚苄基二氯，再经酸性或碱性水解及精镏可得苯甲醛，其副产物为苯甲酸。其反应式为： c h 3f 邸1 唧i 1 2 c c b l i 。 鲁+ + f 眦“c h o 城。一d 但缺点是收率不高，需要使用催化剂，对设备腐蚀污染严重，需要改进和更新换代。 ( 2 ) 甲苯的气相或液相氧化法0 1 气相氧化法以空气为氧化剂，再添加一定的助催剂来制备苯甲醛。甲苯的气相催化 氧化属于多相催化过程，产物主要有苯甲醛、马来酸、碳氢化合物等，一般采用固定床 工艺。气相氧化法虽可得到无氯苯甲醛，但仍存在反应条件苛刻；苯甲醛的选择性与甲 苯的转化率之间不统一等问题。另外，如何合理应用催化剂中的晶格氧参与反应，以及 利用固定床技术来优化反应生产条件等都是该法需要继续研究的课题。 甲苯液相氧化的工艺过去大多用于羧酸的制备，虽然苯甲醛也是一个中间产物，但 产率很低，而且国内进行的甲苯液相氧化研究，只能得到单程产率约为1 0 的苯甲醛， 因而还有待于进一步改进和研究。 ( 3 ) 苄醇氧化法 苄醇氧化脱氢制苯甲醛常用c r o 。或重铬酸盐( n a 。c r ：0 t 或z n c r ：0 ，3 h ：0 ) 作氧化剂，但 存在分离困难及铬污染等问题。 ( 4 ) 光化学氧化甲苯法 光化学氧化甲苯法是在氧气和氮气存在的情况下用n o z 对甲苯进行光化学氧化的方 法，得到的产物为苯甲醛及硝基苯的化合物。由于该反应中使用了有毒气体n 0 2 ，从而使 这种方法的环保性有所争议。 2 广西大尊峨士掣啦- 沧文桂油生物蝈沭诗暗成天然革甲睦探索及其分析力谤构建 ( 5 ) 电解氧化法 该法用媒质电极氧化甲苯及其衍生物合成苯甲醛。其过程为：作为媒质的电极( 常 用c e ”c e ”、m n 2 + m n ”、c 0 2 + c 0 3 + 等) 由低氧化态被电解氧化至高氧化态，然后被作为氧 化剂参与甲苯的氧化反应。电解氧化法必须使整个反应循环才有实现工业化的价值，从 这一方面来说，反应液如何恢复原状并能长期使用一直是一大难题。 ( 6 ) 还原法 还原法一般以芳香酸或其酯( 如：苯甲酸或苯甲酸甲酯) 为原料，在适宜的催化剂作 用下进行选择性加氢还原反应。其反应式如下： 一h ：0- c h 3 0 h c 洲。c 0 0 h + 地 c 正i s c i o ，或& h 5 c 0 0 c h 3 + h 2 c 6 1 c h o 由于这一工艺产品收率高、质量好，环境污染小且工艺流程简单，还原法开始得到了 人们的重视，但因为生产成本较高，目前还不能与传统的生产方法进行商业竞争。 ( 7 ) “绿色化”氧化方法 朱宪等。1 提出以二氧化锰为原料，通过一次高温焙烧得到三氧化二锰，并以此作为 氧化剂，在硫酸介质中氧化甲苯来制取苯甲醛。此法虽然符合了环保要求，但存在原料 二氧化锰价格昂贵，能耗高，工艺复杂等缺点。 以上提及的这些化学工艺中，许多方法早已在工业上得到应用，并取得了可观的经 济效益，但大部分工艺普遍的缺点是需采用价格昂贵的特殊催化剂，工艺条件较苛刻， 苯甲醛收率低，生产成本高及对环境造成了一定的污染。尽管这些方法生产的苯甲醛价 格低，种类多，但通常需要在高温高压及强酸条件下进行，反应难度大，副反应多，收 率不高，产物分离较困难，且其成分用量受到卫生标准的严格限制，故不能用于食品调 味料及药物的生产，大部分只能用做化工中间体。 随着生活水平的提高，人们对食品的健康标准要求也越来越高，特别是在食品添加 剂行业，人们越来越注重于采用各种天然食品添加剂去替代其化学合成物。因此天然苯 甲醛的制备，在食品添加剂的天然化方面有着重要的地位。消费观念的改变，使得人们 试图寻求新的生产工艺来满足这一需求，因此新的天然苯甲醛生产技术正成为人们研究 的热点。 ( 8 ) 以肉桂油作为原料的研究方法 因肉桂油中富含肉桂醛( 5 5 8 5 ) ，而且更重要的是，以肉桂油为原料加工制得的 苯甲醛在美国、欧共体等发达国家被认可为天然品而可以应用于食品行业，所以用肉桂 油加工合成天然苯甲醛是个可行的办法。 最近又涌现出两种直接由肉桂油加工制苯甲醛的新研究方法： 一种方法是，以肉桂油为原料，利用它的主要成分肉桂醛，经臭氧化还原开裂 反应制取苯甲醛“”，所得苯甲醛不含剧毒的氢氰酸和氯离子，成本低，反应简单，在国 际上可作为天然苯甲醛使用。臭氧化法虽己应用于生产，但前期的设备投资较大，反应 条件苛刻，且收率不高。 广西大学啊狐士掌位性- 文 桂油生物崮嘲法合成天然苯甲醛探索a 其分析方法榴建 另一种方法是，利用肉桂醛在碱性条件下进行非均相反应( 主要是反羟醛缩合反应) 来合成天然苯甲醛。反应式为： c h o c h 0 + h 2 0 墨c h 3 c h o + 0 此法已有少量报道：国外已有研究从肉桂油出发，在乳化剂存在的条件下通过碱性 水解制备天然苯甲醛的专利报道1 ；国内的崔建国、叶金大等n 2 。1 ”研究了采用相转移催 化反应的方法，由桂叶油通过碱性水解来制备天然苯甲醛。该方法虽然反应过程简单， 设备要求低，但因为是可逆反应，存在反应不完全、生成副产物多、碱催化剂污染大等 缺陷。 1 3 生物法合成天然香料 食品香料香精国际组织1 9 9 7 年1 月出版g u i d e l i n e so nt h ei n t e r p r e t a t i o no ft h e t e r m “n a t u r a l ”对天然食品香料的定义作了更明确的规定“o ，该规定认为： ( 1 ) 作为天然香味浓缩物和天然香味物质资源的天然原料是指精油、油树脂、香料 植物的萃取物或蒸馏物；或指香辛料、水果或果汁、蔬菜或蔬菜汁、可食用酵母、草药、 树木的根、茎、叶、芽或类似的植物材料，肉类、海产类、禽畜、蛋类、奶制品和其它 动物动物产品、乳制品经烘焙、加热或酶法转化的产物；或指上述这些原料的发酵产物。 ( 2 ) 对于分离天然香味浓缩物和天然香味物质可以使用所有物理工艺( 包括压榨、 蒸馏、萃取、浓缩、层析、加热等) ；对于分离酸碱物质可以使用p h 调节剂。 ( 3 ) 制备天然香味浓缩物和天然香味物质的工艺允许用生物体和从生物体得到的酶 来生产天然香味料。 上述“天然的”标记对于利用微生物技术生产香料的研究是非常重要的，因为天然 的和化学合成的香料在价格上差距是巨大的，例如每公斤合成香兰素的价格为1 2 美元左 右，而每公斤从香荚兰豆提取的香兰素是4 0 0 0 美元。 生物技术生产食品香料和风味物质分为植物组织培养法、微生物发酵法、微生物酶 转化法三种。各种方法均见有研究报道及工业生产，如美国利用香荚兰不同部位的组织 培养，可以通过复杂的合成途径生物合成对羟基苯甲醇、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、对 羟基苯甲醛、香草酸等天然香兰素风味物质，香兰素产量达1 6 - 1 8 m g l “”。德国一项专 利介绍用长喙壳( c e r a t o c y s t i s s p 】发酵生产的格烯类化合物发酵液产量为2 9 l ，陈 九武“”等利用固定化酵母生产酯类，产酯速率乙酯占总酯含量的9 0 ，代替化学香精勾 调清香型白酒和小曲酒，感官风味自然协调，对改善酒质有明显作用。美国的u n i l e a e r 公司以5 一十二酮酸为原料，采用面包酵母生产r - s 一十二酮酸，环化生成黄油味的内酯， 已达到3 万升发酵规模；也有利用微生物生产香草醛的报导“”，其实验产量可达6 4 9 l 。 4 广西大掌硕士掌位论文 桂油生物技术法合成天然摹甲醛探索及其分析方法构建 1 3 1 生物法生产天然香料的优点 尽管传统的化学合成和天然提取方法还在起重要的作用，但是利用生物技术生产香 料化合物正受到人们越来越多的重视。生物技术在2 1 世纪会成为带动人类社会经济发展 的关键技术之一。这一点，已在国内外各界人士中得到共识。生物化工即利用生物催化 剂进行化工生产，它同时结合了化学和工程原理进行化学品的加工或提供相关的社会服 务，是实现绿色化学的重要手段之一，而且生物催化剂还被认为是对环境无害的绿色催 化剂。因此，生物催化剂在化学化工生产中必然会有广阔的应用前景。 利用微生物技术生产食品香料和风味物质的特点是需要各种不同的产香微生物或 酶，所以，使用各种新的酶或微生物是生产香料的最重要的一环。 酶作为种特殊催化剂，它在催化一个化学反应时也具有一般催化剂的特征。但是， 酶作为_ 种生物催化剂，它又与一般催化剂不同。酶是生命活动的产物，在物质运动的 形式上处于更高级的阶段，因此，它比一般催化剂更优越，对化学反应的催化作用具有 更显著的特点： 高效性酶具有很高的催化能力。酶的催化效率比一般化学催化剂高1 0 6 1 0 ” 倍。 专一性酶对底物有选择性。酶的专一性是指一种酶只作用于一个或一类底 物。酶作用的专一性具有很重要的生物学意义，而一般无机催化剂对其作用物没有严格 的选择性。 酶促反应条件温和，不须高温、高压，也不须强酸强碱。通常p h 值近乎中性， 温度为1 0 5 0 ，在常压下就可顺利进行。它减少了能耗，减轻了设备的腐蚀，对设 备的材质及制造要求大大降低。、 使用香精香料的产品( 如方便食品、饮料、化妆品、去污剂等) 不断增长的市场份 额要求业内企业要有全新的策略来生产芳香化合物。全世界约有8 0 的香精香料是由化 学法合成的，然而在德国( 1 9 9 0 ) 约有7 0 的食用香料是天然的“”，这一趋势要归功于 新型营养健康生活观念的建立。随着生物技术的发展和分离技术的提高将有越来越多 的食品香料采用微生物技术法生产，以满足消费者对天然香料不断增长的需求。 生物催化法生产天然香料具有以下优点： ( 1 ) 采用的催化剂酶，可在温和的反应条件下进行，催化效率高，具有很强的 立体专一性和区域、对应体选择性； ( 2 ) 微生物技术生产的食品香料属于天然食品添加剂，可生物降解，对环境无污染， 易于被消费者接受，具有市场竞争力，而且香料生成过程中的副产物少，易于分离纯化； ( 3 ) 生物催化法能生产品种多样的香料，几乎所有的细胞成分都能通过分解和合成 反应产生香料物质。 ( 4 ) 独立于农业之外，可不受地方不利环境条件所限制： ( 5 ) 可利用工程技术方法进行放大和工业化生产，产品易于回收： 广西大掌硕士掌位论文桂油生物技术法合成天然革甲醛挥索反其分析方法构建 ( 6 ) 可为发展中国家保护天然资源； 1 3 2 生物法合成天然苯甲醛的研究进展及意义 目前，生物技术法生产天然苯甲醛的研究报道较少。最近科学家发现利用微生物转 化苯丙氨酸可合成出苯甲醛啪1 ，其主要过程为：苯丙氨酸通过两个不同的氧化降解途径 可完全转化为香料化合物苯甲醛和苯丙醇。而且，通过l 一苯丙氨酸的微生物代谢过程的 研究有助于避免副反应而提高苯甲醛的生物转化效率。还有一种方法是，使用b 一糖苷 酶和苯乙醇腈酶作催化剂来生产苯甲醛，这两种酶都存在于杏仁粉中。“。以上两种过程 的研究开发虽然进展顺利，但就广西的地方资源而言，杏仁来源少、价格贵；苯丙氨酸 需另外合成，成本也较高；因此两者都不及桂叶油充足廉价。 肉桂醛( a r c f l = c h - c h o ，简写c m a ) 化学命名为苯丙烯醛，又名桂皮醛、桂醛，为淡 黄色油状液体，有特殊的肉桂芳香气味，广泛应用于香料、化妆品、食品和药物合成中 “1 。肉桂醛是我国桂皮油和锡兰桂桂油的主要成分，其含量高达5 5 8 5 。由于我国桂 油含肉桂醛最多，因此肉桂醛又称作中国肉桂醛。我国肉桂产量占世界总产量的7 0 ， 桂油主要产于我国广西、广东的西江流域，据统计，两广的种植面积已超过3 0 0 万亩。 显而易见，桂油生产是广西的重要产业之一，但目前桂油大部分均以初级加工品供应市 场，价值较低。近年来，随着桂树种植面积的不断增加和国际市场竞争日益激烈，桂油 的销售面临越来越大的市场压力。因此，从桂油中分离提纯肉桂醛，并积极开发肉桂醛 高附加值的下游产品已势在必行，这种研究趋势对开发利用广西资源优势和发展地方经 济有重要的现实意义。 为发挥区域优势，若能以肉桂醛为原料，借鉴其他微生物法生产天然香料的成功方 法，找到所产酶能利用肉桂油直接转化成苯甲醛的微生物，培养并驯化，将是一个很有 潜力的生产天然苯甲醛的方法。 1 4 紫外一可见吸收光谱分析法 在仪器分析中紫外可见分光光度法是历史悠久、应用最为广泛的一种光学分析方 法。它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的选择性吸收作用，对物质进行定 性、定量分析和结构分析，所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产 生的吸收光谱。按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法， 合称为紫外一可见分光光度法。 用紫外一可见分光光度法进行定性定量分析，具有快速、灵敏度高及分析混合物中 各组分有时不需要事先分离等优点，目前广泛应用于微量或痕量分析中。 6 广西大掣哑士掌位惋文桂油生物技术亭毫暗成天描苯甲睦探索a 其分析力诘相建 1 4 1 蜚，卜一可见分光光度法的发展 紫外一可见分光光度法是在经典的比色法基础上逐步完善而发展起来的，但分光光 度法和比色法所依据的原理基本上是相同的。由于分光光度法采用了更为先进的单色系 统和光检测系统，使得分光光度法在灵敏度、准确度、精密度及应用范围上都大大的优 于比色法。 一般认为比色法起源于1 8 5 2 年，即当比耳发现比耳定律时开始。在十九世纪中叶， 仍然只能采用目视比色法在比色管中进行分析测定。至十九世纪末才开始使用带有滤光 片的目视比色计。1 9 3 0 年，第一台光电比色计和分光光度计引进实验室。这样，基于光 电效应的检测器代替了人的眼睛，单色器代替了滤光片，使分析的灵敏度和准确度大为 提高。由于单色器材料的改进，导致这种古老的分析方法由可见光区扩展至紫外和可见 光区。紫外一可见分光光度法就是人们在反复实践、不断认识的基础上逐步发展和完善 起来的。 这里，应着重指出的是：自二十世纪五十年代开始至1 9 8 6 年的近三十年中，由于有 机试剂和络合物化学的迅速发展以及仪器的不断改进，使紫外可见分光光度法的面貌 也为之焕然一新。据有关资料统计，在六十年代初，分光光度法在整个分析方法中所占 的比重约为4 5 。此后，尽管由于其他近代仪器分析方法的发展而使其有所下降，但近 年来分光光度法所占的比重仍然稳定在3 0 左右。由此可见，分光光度法并未失去其重 要地位。 在经典的分光光度法基础上，紫外一可见吸收光谱法又进一步发展和派生了许多新 型吸收光谱法。例如在五十年代就已经出现而最近又有进一步发展的双波长分光光度 法，一阶导数吸收光谱法和二阶导数吸收光谱法等。此后，又发展了光声光谱法和相干 光谱法。新型的光声光谱分析技术能直接用于固体薄板的测定，它为固体试样的直接测 定开辟了新的前景。 激光及电子计算机技术在六十年代的飞跃发展也使得分光光度计大为改善。七十年 代，这两种新技术引入经典的分光光度仪器获得了较大成果，例如，以激光作为光源制 成了激光光声光谱仪。1 9 7 7 年在美国克立夫兰市举行的匹兹堡分析化学会议上首次展出 了m 6 0 0 0 a 型和r 1 0 0 0 型光声光谱仪。利用激光技术生产的全息光栅已作为单色元件安 装于紫外一可见分光光度计上。电子计算机的引入，使原有的经典分光光度向自动化方 向大大发展了一步。微处理机控制的紫外一可见分光光度计，可自动调零、自动筛选波 长、参数自动设定、自动报警、自动显示故障、自动进行功能检查。这类仪器还可用外 部终端装置进行远距设定和控制，亦可根据需要由操作者随时输入其他操作指令。因此， 分光光度计与其他仪器联用也是紫外一可见吸收光谱法发展的方向之一。 广冒r 大d 乌醑士掌位论文柱油生物毋沭法合成天然革甲葡 探索a 其- 分斩方法构建 1 4 2 紫外一可见分光光度法的应用 就仪器分析的范畴而言，与各种近代仪器分析方法相比较，紫外一可见分光光度法 是一种较为古老的方法。紫外一可见分光光度法能发展至今而且在整个分析化学领域仍 占有重要位置，这与它本身具有许多特点是分不开的。紫外一可见分光光度法的主要特 点有： ( 1 ) 具有较高的灵敏度、精密度和一定的准确度。分光光度法测定物质的最低浓度 可达1 0 。6 1 0 o l l ，相对误差通常为2 5 ，例如在紫外区直接检测抗坏血 酸时，其最低检出浓度可达到1 0 1 9 m l 。虽然相对误差比重量法和滴定法大，但 对于微量组分的测定，这样的误差己完全可以满足测定的准确度要求。 ( 2 ) 适用范围广。近年来，由于分光光度法的选择性和灵敏度都有所提高，几乎所 有的无机物质和大部分有机化合物的微量成分都能用此法进行测定。从而使这 类方法已发展成工业生产、环境保护、科学研究工作中测定微量组分的常用方 法之一。 ( 3 ) 手续简便，分析速度快，适用于控制分析。分光光度法的操作过程，主要包括 试样的溶解，待测组分的显色等内容，操作简便，完成分光光度分析的全过程 一般只需几十分钟，甚至可在几分钟内完成，适用于实时控制分析。 ( 4 ) 有较好的选择性。通过适当的选择测量条件，一般可在多种组分共存的体系中， 对某一物质进行测定。 ( 5 ) 仪器简单，容易掌握。相对其他光谱分析方法来说，紫外一可见分光光度计的 仪器设备和操作都比较简单，费用少，易于普及推广。 由于分光光度法具有以上一些优点，它已被广泛地应用于许多生产和科研领域中， 尤其是在医药、化工、冶金、环境保护、地质等诸多领域，紫外一可见分光光度法不但 可以进行定量分析，还可以对被测物质进行定性分析和结构分析，进行官能团鉴定、相 对分子质量测定、配合物的组分及稳定常数的测定等。 定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱，应用紫外吸收光谱来定性鉴定有机化合物，特 别是具有共轭体系的有机化合物很有用，它可以反映分子中发色基团和助色基团的结构 特征。从紫外吸收光谱的数据，可使我们了解化合物中的共轭程度、分子内或分子间是 否存在氢键、顺反异构、互变异构、空间位阻效应等。在定性鉴定方面，对于许多有机 化合物而言，紫外一可见分光光度法常常用于进一步证明红外光谱、激光拉曼光谱、核 磁共振波谱、质谱等定性技术得出的结论。 用紫外分光光度计绘制出吸收曲线后，可根据吸收曲线的特征吸收位置，对被鉴定 的化合物作出初步的判断： 若化合物在2 2 0 4 0 0 n m 内无吸收峰，则该有机化合物可能是直链烷、烯、炔烃、脂 肪烃、醇、醚、羧酸、氟或氯代烃、胺、腈等，而不会是含有共轭双键的苯环、醛基、 广西大学硕士掌位论文桂油生物技术法古成天赫摹甲醛探索反其分析方法相递 酮基、溴取代基、碘取代基等。 若化合物在2 1 0 2 5 0 n m 内有强吸收峰， 1 o x1 0 4 ，则可能含有两个共轭双键； 若强吸收峰在2 6 0 3 0 0 n m ，则表明含有3 5 个共轭双键；若吸收峰进入可见光区( 4 0 0 7 6 0 n t o ) ，出现多个吸收峰，表明含有长链共轭体系或稠环芳烃。 若化合物在2 5 0 3 0 0 n m 内有中等强度吸收峰，表明有苯环，在2 3 0 2 7 0 n m 有精细 结构是芳香环的特征吸收。 如果在2 7 0 3 5 0 n m 区域内产生一个很弱的吸收峰，并且在2 0 0 2 7 0 n m 无任何吸收 时，则可能含有带孤对电子的简单非共轭发色基团，如羰基、硝基。 洗涤剂中常含有如十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠等阴离子表面活性剂和辛基酚 聚氧乙烯醚、烷基醇酰胺等非离子型表面活性剂，以及烷基苄基氯化铵、烷基吡啶氯化 铵等阳离子表面活性剂。它们在2 2 0 n m 2 4 0 n m 和2 6 0 n m 2 8 0 n m 范围有吸收峰，因此可 利用这些吸收峰对表面活性剂进行定性鉴定和定量分析。 用紫外吸收光谱法还可分析化妆品防晒剂中的二苯酮衍生物、肉桂酸酯等；祛臭剂 中的苯磺酸锌、六氯苯、卤代水杨酰苯胺等；食品防腐剂中的苯甲酸、山梨酸，抗氧化 剂中的抗坏血酸、没食子酸丙酯以及多种维生素：香料工业中的各种香料，如柠檬油、 香茅草油、留兰香油、杏仁油等。可见，紫外吸收光谱法己在轻工和化工产品分析中获 得广泛的应用。 另外，有时还可以用紫外吸收光谱对未知试样进行检定或对己知试样进行纯度检查。 通常把未知试样的紫外吸收光谱图与标准试样( 或与标准图谱) 比较，当浓度和溶剂相 同时，若两者的谱图相同，即最大吸收峰 。相同时，则可检定它们是同一个化合物。 如果某化合物在可见光区或紫外区有较强的吸收峰，则可通过比较样品与标准品的吸光 值来检查其纯度。如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用a m a 。的比值，鉴定其纯度。 络合物组成的测定 紫外一可见分光光度法是研究溶液中络合物组成( 配位比n ) 的最常用方法之。 定量分析 紫外一可见分光光度法进行定量分析的理论基础是朗伯比耳定律，它的数学表达 式为：a = bc 。 式中：e 为摩尔吸光系数，l m o l c m - 1 ；b 为液层厚度，c m lc 为被测组分的浓度， m o l l 。该式表明在一定条件下，溶液的吸光度a 与被测物质的浓度和液层厚度的乘积 成正比。但必须满足入射光是单色光、被照射物质是均匀的非散射性物质等条件。 对于单组分体系，试样中只有被测组分产生对光的吸收，且符合朗伯一比耳定律时， 只需选择入。为单色光，测定吸光度，用比较法( 即在相同条件下配制样品溶液和标准 溶液，在最大波长入 处测得二者的吸光度a # 和a 镕进行比较，按公式c # = a # a # c 镕可计算样品溶液中被测组分的浓度c # ) 或标准曲线法( 也叫工作曲线法) 测定试液的 浓度即可。 对于多组分体系，若试样中各组分的吸收光谱互不重叠，即表示在每个组分的最大 9 广西大学硕士掌位论文柱油生物技术法合成天然革甲醛探索a 其分析方法构建 吸收波长处各组分的吸收曲线互不干扰，则可采用单组分测定方法进行定量分析。若试 样中各组分的吸收光谱有部分互相重叠，则可利用下式进行计算： a 总= a l + a 2 + a 3 + + 九 即混合物的总吸光度等于各个组分吸光度的加和值。对含有2 个以上组分且吸收光 谱相互重叠的样品，可利用在2 个不同的( 或数量与组分数相同) 吸收波长下进行吸光 度的测定，在获得每种组分于各个吸收波长下的摩尔吸光系数之后，可用解二元联立方 程的方法求出各组分的含量。此外，还可应用双波长分光光度法或使用化学计量学中的 多元统计分析( 如多元线性回归、主成分回归、偏最小二乘法、因子分析、卡尔曼滤波 法、改进矩阵法等) 来进行多组分混合物的定量测定。原则上对任何数目的组分都可以 用此方法建立方程求解，但在实际应用中，通常仅限于两个或3 个组分的体系。混合物 中如果有更多的组分，可利用计算机技术设计适当的程序去求解。 目前，已有许多关于紫外一可见吸收光谱法定量测定药物的报道。如s o l i m a n 等 用紫外吸收法测定了在乙酰氨基苯酚、苯比巴妥、咖啡碱、可待因磷酸盐、强的松、抗 坏血酸和氯喹啉喹酸盐存在时止痛片中的水杨酰胺。k e l l y 嘲评述了用紫外一可见吸收 光谱法测定水杨酸和阿司匹灵。 紫外一可见吸收光谱法还广泛应用于生物试样中蛋白质的分析。测定蛋白质含量通 常有两种方法即2 8 0 n t o 处测量的直接法和测定2 1 5 n m 与2 2 5 n m 处吸光度之差的间接法 ”1 。此外，在酶法分析中，通过测量2 8 2 n m 处青角甾醇的吸收可测定水解酶的活性m 1 。 1 4 3 肉桂醛和苯甲醛的紫外一可见分光光度法测定 肉桂油是樟科植物肉桂的干燥枝、叶经水蒸汽蒸馏得到的一种成分复杂的芳香精 油，主要成分为肉桂醛，含量在8 0 左右。水蒸汽蒸馏法所得肉桂油中还含有其他成分， 主要为肉桂酯、丁香酚、苯甲醛等“。至今为止，仍没有对肉桂油生产过程进行跟踪 检测的简便方法，以至于对桂枝叶、中肉桂油的残留量、肉桂油质量高低等问题还没有具 体的数字资料。因此，生产企业迫切要求有快速分析肉桂油混合体系的分析方法。 文献曾报道用气相色谱法、薄层扫描法、高效液相色谱法和紫外光谱法 等方法来测定肉桂醛含量；苯甲醛含量的测定已见有使用气相色谱法、高效液相色谱法 和紫外吸收光谱法“”等方法的研究报道，但对肉桂醛一苯甲醛双组分体系中肉桂醛和苯 甲醛含量的同时测定目前还未见文献报道。气相色谱法虽灵敏度高，结果可靠，但对含 水体系需要复杂的萃取工作。所以建立种快速、简便、价廉、准确的检测方法对肉桂 油提取过程中肉桂醛浓度进行实时监测，对控制肉桂油生产进程将具有很好的实际应用 价值。 1 0 广西大掌硕士掌位论文柱油生物技术法合成天然苯甲醛探索a 其分析方法构琏 1 5 主要研究内容、研究方法及技术路线 本课题来源于广西基金项目，项目名称为：肉桂油生物技术法合成天然苯甲醛。 ( 1 ) 主要研究内容有： 菌株筛选：筛选出对肉桂醛具有耐受性的菌株； 对初筛所得菌株进行肉桂醛转化为天然苯甲醛的酶催化反应研究： 进行目的酶催化合成天然苯甲醛的工艺条件探索实验； 对肉桂油、肉桂醛一苯甲醛复杂体系建立一种简单的定性、定量分析方法。 ( 2 ) 研究方法： 在筛选到所产生的酶能够催化或转化合成天然苯甲醛的菌株的基础上，在水相中使 微生物酶与底物充分反应，然后用气相色谱仪检测产物，以确定转化是否成功。 ( 3 ) 本课题拟采用的技术路线如下所示： 匿垂壅亟i 亟j 圃一匡重壅亟噩j j i 囹一匿亟疆区亘囵j i i 圈一匿噩亟匣i i 圈一l i i i 羽 恰成天然苯甲醛的影响因素实剃 广西大掌司n b 掌位论文桂油生物彗沭法古成天热革甲 探索a 其分斩曩n 每构建 第二章实验设计与相关原理 2 1 产酶菌种的筛选 菌种筛选是酶生产过程的关键一步，菌种性能的优劣、产量高低，直接影响到微生 物发酵生产的成本。一般情况下，新酶可从市场供应的各种酶中进行筛选，从已经建立 的各类菌种库、基因克隆库中筛选，或从有关研究部门获得，但科研和生产所用的新酶 主要还是从自然界采集、分离、筛选和遗传育种获得。自然界是产酶菌种的主要来源， 土壤、深海、温泉、森林、边远地区都是菌种采集地。 产酶菌种在自然条件下常与各种菌混杂在一起，所以采样以后要进行分离筛选才能 获得目的菌株。筛选分离胞外酶产生菌，常用平板透明圈法，即在分离培养基上添加与 酶作用的底物，观察底物变化情况可定性地确定酶活性的高低，该法可用来大量的筛选 菌种。而筛选胞内酶只能将分离到的菌种逐个进行摇瓶实验，分别测定产酶情况。 众所周知，酶的底物特异性与其结构和酶的活性中心有关。酶的来源不同，其底物 特异性亦不同。此外，不同来源的微生物酶对底物的不同立体结构也表现出立体特异性。 所以，为了从平板分离初筛得到的菌种中筛选到高产菌株，初筛后，需要对每一个菌株， 用接近于生产的培养条件进行复筛试验，最后筛选出l 2 株菌，进一步做培养基选择 和发酵条件等试验。接下来，收集该菌株所分泌的酶进行催化合成目的产物的实验，以 校验筛选到的菌株产生的酶是否具有催化或转化的能力。 本实验选用在琼脂培养基上添加一定量肉桂醛作为碳源，进行富集培养和平板生长 实验的方法筛选菌种。 2 2 发酵实验 微生物的转化发酵是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相 关的更有经济价值产物的过程，它是整个实验的重要环节。 要利用微生物，首先是要培养微生物，即要给微生物提供各式各样丰富的营养基质， 以期微生物发酵后得到尽量多的菌体或其代谢产物。而为了使微生物大量生长繁殖和合 成代谢产物的目的能实现，当然离不开