（法医学专业论文）p物质在过敏性休克家兔体内的表达及法医学意义.pdf

p 物质在过敏性休克家兔体内的表达及法医学意义摘要目的：观察p 物质在过敏性休克家兔胃、小肠、圆小囊组织中随时间变化的规律，探讨其在过敏性休克中的作用，试图为过敏性猝死的法医学鉴定提供可靠的形态学依据。方法：3 0 只家兔随机分为实验组( 2 4 只) 和对照组( 6 只) 。实验组采用多人混合血清致敏家兔，建立过敏性休克模型。休克不同时间段( 猝死即刻、休克o 5 h 、休克1 h 、休克2 h ) 提取家兔肺脏、胃、小肠、圆小囊。( 1 ) 冰冻切片，常规h e 染色；( 2 ) 应用免疫组化( m c ) s p 法进行p 物质染色，b i - 2 0 0 0 计算机图像分析系统进行图像分析，计算阳性积分光密度值( i o d ) ；( 3 ) 应用原位杂交( i s h ) 对p 物质进行染色，b i 一2 0 0 0 计算机图像分析系统进行图像分析，计算i o d 。结果：( 1 ) i h c 结果显示：与对照组相比，实验组各小组胃、肠、圆小囊p 物质蛋白表达明显增加，且随着休克时间的变化逐渐减弱。统计学方差分析结果为：胃组织1 7 = 1 9 8 0 0 8 ，肠组织f = 5 6 7 9 6 ，圆小囊组织f = 6 7 2 3 1 ，全部p 值小于0 0 0 1 ，均有统计学意义。s n k 检验结果为：胃组织各组之间两两比较均有差别；肠组织除对照组与休克2 h 组之间无统计学意义外，其余各组两两比较均有差别；圆小囊除对照组与休克2 h 组之间无统计学意义外，其余各组两两比较均有差别。( 2 ) i s h 结果显示：与对照组相比，实验组各小组胃、肠、圆小囊p 物质m r n a 表达明显增加，且随着休克时间的变化逐渐减弱。统计学方差分析结果为：胃组织f = 6 7 5 0 6 ，肠组织f = 7 2 1 1 7 ，圆小囊组织f = 2 1 6 7 9 8 ，全部p 值小于0 0 0 1 ，均有统计学意义。s n k 检验结果为：胃组织除对照组与休克2 h 组之间无统计学意义外，其余各组之间两两比较均有差别；肠组织各组之间两两比较均有差别；圆小囊各组之间两两比较均有差别。结论：过敏性休克时，家兔胃、小肠、圆小囊组织的p 物质蛋白表达和m r n a 表达明显增加，且随着休克时间的变化逐渐减弱。p 物质可为过敏性休克的法医学鉴定提供客观的形态学依据和参考指标。关键词：过敏性休克，p 物质，免疫组化，原位杂交，法医学山西医科大学硕士学位论文t h ee x p r e s s i o na n df o r e n s i cm e d i c i n es t u d yo fs u b s t a n c epi nr a b b i ta n a p h y l a c t i cs h o c ka b s t r a c to b j e c t i v e ：t os t u d yt h ee x p r e s s i o no fs u b s t a n c epi n r a b b i ta n a p h y l a c t i cs h o c ka n de x p l o r ei t sc o n t r i b u t i o nt oa n a p h y l a c t i cs h o c k , t r y i n gt os e e ko b j e c t i v em o r p h o l o g i c a lr e f e r e n c es u p p o r tt od i a g n o s es u d d e ne r e t h i s t i ed e a t hf o rf o r e n s i cm e d i c i n e m e t h o d s ：3 0r a b b i t sw e r ed i v i d e di n t ot w og r o u p sr a n d o m l y , t h ee x p e r i m e n t a lg r o u pw h i c hc o n t a i n s2 4r a b b i t sa n dt h ec o n t r o lg r o u pw h i c hc o n t a i n s6r a b b i t s r a b b i t si ne x p e r i m e n t a lg r o u pw e r em a d ei n t oa n a p h y l a c a t i cs h o c km o d e sw i t hh u m a ns e r a p l u g ，s t o m a c h ，c o l o n ,s a c c u l u sr o t u n d u sw e r ee x t r a c t e di nd i f f e r e n ts h o c ki n t e r v a l ，i n c l u d i n gs u d d e nd e a t hi n s t a n t l y ,s h o c k0 5h o u r , s h o c k1h o u r , s h o c k2h o u r s ( 1 ) f r o z e ns e c t i o n , r o u t i n eh es t a i n i n g ( 2 ) s pw e r es t a i n e du s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( i h c ) m e t h o d , a n dt h ei m a g e so fs pw e r ea n a l y z e db yb i - 2 0 0 0 ，a n dt h ei n t e g r a lo p t i c a ld e n s i t y ( i o d ) w e r ec a l c u l a t e d ( 3 ) s pw e r es t a i n e du s i n gh y b r i d i z a t i o ni ns i t u ( i s t t ) m e t h o d , a n dt h ei m a g e so fs pw e r ea n a l y z e db yb i 一2 0 0 0 ，a n dt h ei o dw e r ec a l c u l a t e d r e s u l t s ：( 1 ) m er e s u l t s ：t h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fs po ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u p sa r eh i g h e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o lg r o u p ( p 0 0 0 1 ) a n dt ow a k e ng r a d u a l l yf o l l o w i n gt h es h o c ki n t e r v a l ，s t a t i s t i ca n o v ar e s u l t sa r c ：s t o m a c hm u c o s ag r o u pf = 1 9 8 0 0 8 ，c o l o nm u c o s ag r o u pf = 5 6 7 9 6 ，s a c c u l u sr o t u n d u sm u c o s ag r o u pf = 6 7 2 3 1 s n kt e s tr e s u l t sa r e ：t h e r ea r ec o n s p i c u o u sd i f f e r e n c e sb e t w e e ne v e r yg r o u p so fs t o m a c h t h e r ea r en os t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n tb e t w e e nt h ec o n t r o lg r o u pa n ds h o c k2h o u r sg r o u po fc o l o na n ds a c c u l u sr o t u n d u s ，t h e r ea r ec o n s p i c u o u sd i f f e r e n c e sb e t w e e no t h e rg r o u p so fc o l o na n ds a c c u l u sr o t t m d u s ( 2 ) 1 s hr e s u l t s ：t h em r n ae x p r e s s i o no fs po ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u p sa r eh i g h e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o lg r o u p ( p o 0 0 1 )a n dt ow a k e ng r a d u a l l yf o l l o w i n gt h es h o c ki n t e r v a l s t a t i s t i ca n o v ar e s u l t sa r e ：s t o m a c hm u c o s ag r o u pf = 6 7 5 0 6 , e n l o nm u c o s ag r o u pf = 7 2 1 1 7 ，s a c c u l u sr o t u n d u sm u c o s ag r o u pf = 2 1 6 7 9 8 s n kt e s tr e s u l t sa r e ：t h e r ea r ec o n s p i c u o u sd i f f e r e n c e sb e t w e e ne v e r yg r o u p so fc o l o n ，s a e e u l u sr o t u n d u sa n ds t o m a c hw h i c hh a sn os t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n tb e t w e e nt h ec o n t r o lg r o u pa n ds h o c k2h o u r sg r o u p c o n c l u s i o n ：t h ep r o t e i na n dm r n ae x p r e s s i o no fs u b s t a n c epw a ss i g n i f i c a n t l ys t r o n g e ri ng a s t r o i n t e s t i n a lt i s s u ea n ds a c c u l u sr o t u n d u so fr a b b i ta n a p h y l a c t i cs h o c k t h ee x p r e s s i o no fs pw a st ow e a k e ng r a d u a l l yf o l l o w i n gt h es h o c ki n t e r v a l i tc a nb ea sa no b j e c t i v em o r p h o l o g i c a lr e f e r e n c es u p p o r tf o rd i a g n o s i n gs u d d e ne r e t h i s t i cd e a t hi nf o r e n s i cm e d i c i n e k e yw o r d s ：a n a p h y l a c t i cs h o c k , s u b s t a n c ep i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , r l y b r i d i z a t i o ni ns i t u ，f o r e n s i cm e d i c i n ef |山西医科大学硬士学位论文前言过敏性休克( a n a p h y l a c t i cs h o c k ) 属于i 型超敏反应，又称速发型超敏反应，当人体首次接触过敏原后，体内通过浆细胞产生特异性的抗体i g e ，这些特异性的l e e 抗体有很强的亲细胞性，可以通过其f c 片断选择性地结合在肥大细胞和嗜碱性粒细胞的f cer 上，此时机体处于致敏状态，一旦再次接触相同的过敏原时，肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的i g e 即和过敏原结合，通过i g e 交联触发效应细胞活化并脱颗粒，以释放生物活性介质的方式参与反应，其特点是发作迅速、强烈，若不抢救及时可致死亡，极易引起医疗纠纷等一系列法律问题。而目前尸体检验鉴定过敏性休克死亡还缺乏一种客观、准确的诊断方法，因此，研究和寻找过敏性休克死亡的客观标准就显得尤为重要和必要。p 物质( s u b s t a n c ep , s p ) 是发现最早，也是近年来研究最多的一种神经肽。在脊椎动物，这种肽广泛分布在中枢和外周神经系统中。s p 在核糖体内以大蛋白合成，然后通过酶修饰，转变成有活性的十一肽，可以诱发炎症，参与免疫调节、痛觉传导、感觉信息的传递、唾液分泌、胃肠道和心血管活动，也可参与神经内分泌、造血、神经营养等活动 i - 4 1 。s p 也可以参与多种疾病的发生发展过程，如关节炎、肠炎，过敏性哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹等皮肤过敏性疾病中i s - 6 。随着神经一内分泌一免疫网络学说的发展，研究发现s p 不仅是一种神经递质，而且还可以作为三者之间共同的化学语言 7 】。过敏性休克发病过程中肥大细胞可以释放组胺，1 、i l - 3 、儿- 4 、i l - 6 、g m c s p 引，这些调节因子一方面可参与i g e 介导的过敏反应，影响其周围的神经元释放s p ，另一方面s p 引起的神经源性炎症也可以激活i 姬，引起其它的免疫反应【9 】。可见，在过敏性休克猝死的发展过程中，不仅免疫系统被激活，发挥生理病理学效应，神经系统也被激活，释放神经肽，调节免疫反应。相关资料显示，正常家兔圆小囊中分泌大量的s p 。圆小囊是家兔特有的器官，位于小肠末端，回肠和盲肠之间，开口于盲肠，是一个中空壁厚的圆形小囊，灰白色，囊壁内富含淋巴滤泡【l o l 。研究发现圆小囊不仅含有大量的淋巴细胞，而且含有大量的神经内分泌细胞，在正常家兔的圆小囊粘膜层和黏膜下淋巴组织中存在有大量s p 免疫组化阳性反应信号；原位杂交结果也显示圆小囊淋巴组织的各个部位均有s p m r n a 阳性反应信号，表明兔i 员i d , 囊淋巴组织中确实存在着产s p 的细胞【l ”。所以它是研究神经一内分泌一免疫网络调控难得的靶器官。本实验试图通过建立家兔过敏性休克模型，检测s p 在家兔胃、肠、圆小囊中的分布及随休克时间变化的规律，探讨s p 在过敏性休克中的作用，从而为过敏性休克的法医学诊断提供客观的形态学指标。山西医科大学硕士学位论文材料和方法1 、材料1 1 动物健康成年家兔，雌雄不限，体重1 5 0 0 2 0 0 0 9 ，由山西医科大学实验动物中心提供。1 2 试剂r a tm o n o e l o n a lf n c i 3 4 h l t os u b s t a n c ep ( a b 6 3 3 8 ) 购自英国的a b c a m 公司，s p - 9 0 0 0 试剂盒和h r p d a b 底物显色试剂盒购自河北博海生物工程有限公司，p 物质寡核苷酸探针及原位杂交试剂盒均购自天津灏洋生物技术公司。p 物质探针序列为5 g g a a tc t g t tt t a t gc c t t tt g t g ag - - 37。将多人混合血清混合后用无菌生理盐水稀释2 0 制成初次过敏原注射液；稀释5 0 制成再次过敏原注射液。多人混合的正常人血清，由山西武警总队医院检验科提供。1 3 实验仪器生物洁净工作台苏州市苏信净化设备厂电热恒温隔水式培养箱黄石恒丰医疗器械有限公司电热恒温干燥箱湖北省黄石市医疗器械厂b l - - 2 0 0 0 图像分析系统成都泰盟科技有限公司格兰仕1 7 升机械型微波炉广东格兰仕集团有限公司精密天平( a r 2 1 3 0 c )美国o h a u s冰冻切片机( c m l 8 5 0 )德国l e i c a2 、方法2 1 过敏性休克家兔模型的制备参照家兔过敏性休克模型“4 ，并加以改进。取3 0 只健康成年家兔随机分成对照组( 6只) 、实验组( 2 4 只) 。实验组家兔于皮下注射2 0 多人混合血清l m l ，隔1 周加注1 次。致敏后以普通饲料喂养，3 周以后于耳缘静脉快速注入制备好的5 0 的多人混合血清5 m l ，诱发过敏性休克，其中6 只家兔5 分钟之内发生过敏性猝死，其余的1 8 只家兔在注射过敏原即刻出现呼吸急促、爬伏、软瘫、大小便失禁等休克症状，3 0 m i n 未见死亡。未死亡者再随机分成3 小组，每组6 只。分别于过敏性休克发生0 5 h ，l h 、2 h 空气栓塞致死。对照组由生理盐水代替致敏原，处理过程与实验组相同，均未见死亡，行空气栓塞致死。各组检材的提取均在家兔死后即刻进行。2 2 检材的处理及切片的制作提取家兔肺，胃、小肠、圆小囊固定于含i d e p c 的4 多聚甲醛中，固定2 h 后，放入1 5 9 6 蔗糖溶液中脱水，过夜。次日制作冰冻切片，片厚1 0pm 。2 3 眶染色选取肺脏、胃肠和圆小囊组织，进行常规的h e 染色。2山西医科大学硕士学位论文2 4s p 免疫组化和原位杂交染色选取胃、小肠和圆小囊组织，分别各做两张冰冻切片，一张进行i h c 染色，一张进行i s h 染色。s p 免疫组化染色过程如下：( 1 ) 冰冻切片，室温干燥，放入丙酮固定1 5 m i n 。( 2 ) 室温挥干后，p b s 液浸泡5 r a i n 。( 3 ) 微波炉修复1 5 m i n ，p b s 冲洗，3 m i n x3 次。( 4 ) 3 h z o z 去离子水孵育l o m i n ，以消除内源性过氧化物酶的作用。( 5 ) 滴加封闭用的正常山羊血清工作液孵育l o m i n , 倾去，勿洗。( 6 ) 滴加l ：5 0p 物质单克隆抗体，4 。过夜。( 7 ) p b s 冲洗，3 m i n 3 次。( 8 ) 滴加生物素标记的山羊抗大鼠i g g ，3 7 。孵育1 5 m i n 。( 9 ) p b s 冲洗，3 m i n x 3 次。( 1 0 ) 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，3 7 。孵育1 5 m i n 。( 1 1 ) p b s 冲洗，3 m i n 3 次。( 1 2 ) d a b 显色，室温染色1 0 r a i n 左右后，自来水冲洗。( 1 3 ) 脱水，透明，中性树胶封片。s p 原位杂交染色过程如下：( 1 ) 冰冻切片，室温干燥，放入丙酮固定1 5 m i n 。( 2 ) 室温挥干后，p b s 液浸泡l o m i n 。( 3 ) 滴加打孔液，室温l o m i n 。( 4 ) 3 h ：魄室温孵育2 0 m i n ，以消除内源性过氧化物酶的作用，0 1 mp b s 冲洗三次。( 5 ) 滴加复合消化工作液，3 7 。孵育l o m i n 。0 1 lp b s 冲洗三次，0 2 s s c 冲洗，3 m i n 1 次。( 6 ) 滴加预杂交工作液，盖上原位杂交专用盖玻片，3 7 。过夜。( 7 ) 揭去盖玻片，0 2 s s c3 7 。冲洗，5 m i n x 3 次。( 8 ) 滴加杂交工作液，盖上原位杂交专用盖玻片，3 7 。孵育4 h 。( 9 ) 揭去盖玻片，2 x s s c3 7 。冲洗，5 m i n 3 次：0 2 s s c3 7 。冲洗，5 m i n 3 次：0 i mt b s3 7 。冲洗，5 m i n 3 次。( 1 0 ) 滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，3 7 4 孵育4 5 m i n 。( 1 1 ) 0 i mp b s 冲洗，3 m i n 3 次。( 1 2 ) 滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液，3 7 。孵育4 5 m i n 。( 1 3 ) 0 1 mp b s 冲洗，3 m i n 3 次。( 1 4 ) d a b 显色。细胞浆呈棕黄色颗粒为阳性反应，显微镜下控制染色时间。( 1 5 ) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。3山西医科大学礤士学位论文3 、统计学处理应用b i - 2 0 0 0 图像分析系统，分别对免疫组化、原位杂交结果进行分析。每张切片的粘膜层随机取5 个高倍视野，测定一定面积内的积分光密度值( i o d ) 。数据处理采用s p s s l l 5 统计软件进行方差分析，s n k 检验，p 0 0 5 具有统计学意义。4结果1 、过敏性休克模型的观察实验组家兔在抗原攻击后大约3 0 s 出现意识模糊、活动减少、四肢松弛、爬伏，l m i n左右出现呼吸急促、躁动、软瘫。其中有6 只出现大小便失禁、全身抽搐、口唇和鼻尖部皮肤粘膜紫绀，3 m i n 左右死亡，其余家兔未见死亡。休克发生0 5 h 、l h 、2 h 行空气栓塞致死。死后解剖，胸、腹腔内各脏器充血、淤血，肺气肿。2 、s p 免疫组化测定结果各组织的空白对照片s p 免疫组化染色均未见阳性结果。胃组织：实验组胃粘膜底部强阳性，肌层弱阳性，且随着过敏性休克时间的变化阳性强度减弱( 见图3 - 1 ) 。对照组阳性面积和强度均小于实验组( 见附图卜3 至卜7 ) 。对粘膜层s p 阳性结果进行方差分析，f = 1 9 8 0 0 8 ，p 0 0 0 1 ，各组总体均数有显著性差异；s n k检验( 见表4 3 ) ，两两之间比较均有统计学意义。肠组织：实验组肠粘膜底部和顶端强阳性，肌层阳性，且随着过敏性休克时间的变化阳性强度减弱( 见图3 一1 ) 。对照组阳性面积和强度均小于实验组( 见附图卜8 至卜1 2 ) 。对粘膜层s p 阳性结果进行方差分析，f = 5 6 7 9 6 ，p 0 0 0 1 ，各组总体均数有显著性差异；s n k 检验( 见表4 - 4 ) ，尚不能说明对照组与休克2 h 组之间有差别，其余两两之间比较均有统计学意义。圆小囊：实验组圆小囊粘膜层、圆顶和腺泡区呈强阳性表达，且随着过敏性休克时间的变化阳性强度减弱( 见图3 1 ) 。对照组阳性面积和强度均小于实验组( 见附图卜1 3 至1 - 1 6 ) 。对粘膜层s p 阳性结果进行方差分析，f = 6 7 2 3 1 ，p 0 0 0 1 ，各组总体均数有显著性差异；s n k 检验( 见表4 - 5 ) ，尚不能说明对照组与休克2h 组之问有差别，其余两两之间比较均有统计学意义。注；1 对照组口猝死组；3 休克o 5 h 组；4 休克l h 组；5 休克2 h 组图3 - 1 不同组织s p 免疫组化染色平均i o d 直方图3 、s p 原位杂交测定结果各组的空白对照片s p 原位杂交染色均未见阳性结果。胃组织：实验组胃粘膜底部强阳性，肌层弱阳性，且随着休克时间的变化阳性强度减弱( 见图3 - 2 ) 。对照组阳性面积和强度均小于实验组( 见图2 1 至2 5 ) 。对粘膜层s p 阳性结果进行方差分析，f = 6 7 5 0 6 ，p o 0 0 1 ；s n k 检验( 见表4 - 6 ) ，尚不能说明对照组与休克2 h 组之间有差别，其余两两之间比较均有统计学意义。肠组织：实验组肠粘膜底部强阳性，肌层弱阳性，且随着休克时间的变化阳性强度减弱( 见图3 - 2 ) 。对照组阳性面积和强度均小于实验组( 见图2 6 至2 - 1 0 ) 。对粘膜层s p阳性结果进行方差分析，f = 7 2 1 1 7 ，p o 0 0 1 ；s n k 检验( 见表4 7 ) ，两两之间比较均有统计学意义。圆小囊：实验组圆小囊粘膜层、圆顶、腺泡区呈阳性表达，且随着休克时间的变化强度减弱( 见图3 2 ) ，对照组阳性面积和强度均小于实验组( 见图2 1 1 至2 - 1 8 ) 。对粘膜层s p 阳性结果进行方差分析，f = 2 1 6 7 9 8 ，p o 0 0 1 ；s n k 检验( 见表4 8 ) ，两两之间比较均有统计学意义。注：1 对照组2 猝死组；3 休克0 5 h 组；4 休克l h 组；5 休克2 h 组图3 2 不同组织s p 原位杂交染色平均1 0 0 直方图6山西医科大学硕士学位论文讨论3 1过敏性休克动物模型的制备本实验观察到过敏性休克家兔模型在发病过程中先后出现爬伏、不安、竖毛、搔鼻、喷嚏、呼吸困难、抽搐，大小便失禁，痉挛性跳跃等症状，严重者数分钟内死亡，未死亡家兔在休克不同时间段行空气栓塞处死，解剖可见肺水肿，肺出血，咽喉、胃和肠水肿，中小静脉淤血，呼吸道及消化道分泌物增多符合过敏性休克的临床表现，证明此次实验的模型成功。关于过敏性休克模型的制备，国内外已经有了系统的研究和报道，豚鼠、家兔，大鼠、小鼠、猫、狗、猴、牛、羊、马、猪和鸡等啮齿类动物均可引发过敏性休克“”。小鼠是目前研究速发型过敏反应机制和i g e 抗体应答调节的主要实验动物；其次是豚鼠，休克率几乎达j 0 0 ；再次是家兔、大鼠、狗等，这些动物虽也发生过敏性休克，但症状较轻，常不致死。过敏性休克症状与过敏原无关，但与致敏动物的种类有关，在常用动物中，狗和兔休克症状的与人较为相似“”。本实验参照家兔模型的制备“”，通过预实验，采用隔周加注法以提高家兔对过敏原的反应性，家兔休克率明显提高，但死亡率仍然很低。故此模型是研究过敏性休克早期发生发展过程良好的动物模型。3 2s p 在过敏性休克中的作用近年来，随着神经系统、内分泌系统和免疫系统的发展，研究发现s p 不仅是一种神经递质，而且还可以作为三者之问共同的化学语言，s p 作为一种具有多种生物活性的神经肽已成为人们新的研究热点。s p 在过敏性鼻炎、过敏性哮喘等i 型超敏反应中的作用已经有了深刻的研究和广泛的报道，但在过敏性休克中的作用报道较少。本实验通过检测过敏性体克家兔体内的s p的变化，发现过敏性休克发生以后家兔胃肠道s p 在休克后一段时间内( 2 h ) 均增高，从而推测s p 在过敏性休克中发挥了一定的作用。肥大细胞是过敏性休克发生过程的主要参与细胞，它广泛分布于皮肤、粘膜下层结缔组织中的微血管周围以及内脏器官的包膜中。过敏性休克发病过程中肥大细胞可以释放组胺、，l 、i l - 3 、，4 、i l - 6 、g m c s f ，这些调节因子可参与i g e 介导的过敏反应，影响其周围的神经元释放s p ，再者s p 引起的神经源性炎症也可以激活i r e ，引起其它的免疫反应f l 孓1 6 1 。可见，在过敏性休克猝死的发展过程中，不仅免疫系统被激活，发挥生理病理学效应，神经系统也被激活，释放神经肽，调节免疫反应。许多物质可以诱导肥大细胞释放组胺，包括s p 、缓激肽、毒素，如黄蜂毒液。研究表明，s p 可以促使肥大细胞释放组胺，5 h t 、白三烯、前列腺素和一些细胞因子，此种机制不同与i g e 介导的肥大细胞激活，因为s p 介导的肥大细胞激活不需要细胞外的c a 2 + 存在，也不能事先脱敏所阻断【m ，s p 刺激肥大细胞释放储备介质的同时，也可以合成并释放新的炎性介质，如白三烯和前列7山西医科大学磺士学位论文腺素，肥大细胞释放的这些炎性介质与局部血管扩张、血浆外渗和炎细胞浸润密切相关，可导致局部充血水肿，构成过敏性休克的病理基础。s p 促进肥大细胞释放颗粒的同时，肥大细胞也释放出s p ，而释放出的s p 又可以作用于肥大细胞，形成一个双向的“反馈通路”。体外实验研究证实，s p 与肥大细胞相互作用存在着时间依赖性和剂量依赖性，随时间延长，肥大细胞释放组胺率明显上升，s p 对肥大细胞的作用效果在3 0 m i n 内基本完成，达到稳定u 8 - 1 9 。本实验观察到家兔随休克时间的延长，症状逐渐缓解，s p 的表达也在此期间存在差异，两者之间可能存在着某种联系，具体机制有待进一步的探讨。n i e r ip 【2 0 】等在豚鼠的过敏性休克模型中发现，对麻醉后致敏的豚鼠利用抗原气雾剂诱发过敏性休克，随后气道对a c h 和s p 的反应性明显增高。白吉伟等 2 1 1 发现在过敏性休克猝死豚鼠血浆、咽喉、气管以及肺组织中，实验组s p 含量明显高于对照组。支气管收缩，分泌物增加是引起过敏性气道疾病最主要的原因，在过敏性休克中也是同样存在相同的反应。当机体受到物理、化学，生物等各种刺激时，s p 可逆向释放到气管局部，而通过n k 2 r对呼吸道平滑肌产生很强的收缩作用。c a n n i n gbj 发现豚鼠和小鼠气道内含有速激肽的传入神经外周激活后，释放的s p 和神经肽a 可引起气道痉挛1 2 2 1 。胃肠道组织中含有大量的肽能神经和大量的免疫细胞，是神经系统和免疫系统相互作用、相互影响比较活跃的部位。s p 在胃肠道的浓度仅次于脑组织，与外周血单核细胞相比，人肠粘膜的单核细胞n k - 1 r 增多，表明s p 在肠组织的免疫调节中有着重要的作用。孙宏伟瞳3 1 等对过敏性休克人体胃肠组织进行免疫组化染色，结果表明s p 在胃肠道的表达明显增加。提示s p 作为一种能够被神经系统和免疫系统共同识别的信号物质参与了胃肠道的免疫调节活动，在过敏性休克的发生发展中起了一定的作用。研究表明，s p 增多可以导致大、小肠分泌亢进1 ；微量注射s p 拮抗剂或n k - 1 r 拮抗剂到迷走神经背侧运动神经核可以抑制胃的活动，导致胃部放松“1 ；m c r i t c h i ed a 等啪1 证实了人的脑干中与呕吐有关的区域中存在着s p 应用n k 一1 r 拮抗剂可以明显减轻呕吐，这提示s p 可能与过敏性休克时发生的呕吐、腹泻等胃肠道症状有关。本实验着重从过敏性休克家兔胃肠道对s p 进行研究，发现发生过敏性休克家兔胃肠道中s p 的表达无论是在转录水平上还是在翻译水平上均高于正常对照组，且随着过敏性休克症状的缓解，s p 表达呈下降趋势，但其具体的作用和机理尚有待进一步的研究证实。3 3s p 在家兔体内的分布焦金菊等”1 采用放射免疫方法对不同性别家兔各脏器的s p 含量进行测定，研究发现，s p 在家兔体内各脏器是不均匀的，以神经系统、腺组织内含量最高，肝脏、脾脏及肺脏中含量次之，心脏和肾脏组织中含量最低；而在胃肠道内，食管、胃内s p 含量最低；十二指肠、空肠含量高；而结肠、直肠含量居中，且分布于胃肠的各层组织中，其中以肌肉、粘膜层含量最多。但性别不同家兔的相同脏器中测得s p 无明显差异。圆小囊是家兔集神经内分泌一免疫为一体的多功能组织，位于回肠和盲肠之间。是其特有组织，所以它是研究神经一内分泌一免疫网络调控难得的靶器官。胃肠道中含有大量的消化腺，故本次实验选取8家兔胃、肠、圆小囊，观察s p 在过敏性休克发生前后的变化。3 4 原位杂交技术与免疫组化的对比研究根据中，t x , 法nd n a 一薹；誓一m r n a 一蛋白质，i s h 与i h c 原理基本相似，两者都也符_ 求是在组织、细胞原位检测基因及基因的表达，但两者有本质的区别：i s h 是利用碱基互补原理，检测组织、细胞中的r n a 、d n a ( 主要是m r n a 表达量) ，是在转录水平上研究基因；而i h c 是依据抗原和抗体特异性结合原理，检测组织，细胞内的蛋白质抗原成分，是在翻译水平上研究基因表达。i s h 有其优越性：研究水平深入、灵敏度高、特异性强、探针易于合成。而单克隆抗体的制备非常困难，且价格昂贵。在检测只有m r n a ，而无m r n a表达时，i s h 更有i h c 无法比拟的优越性，如果这两种技术结合使用，既能揭示细胞内的基因或该基因转录的m r n a ，又能证明是否有由该基因指导下合成的蛋白质，作两张连续切片，一张作i s h ，一张作i h c ，进行对照研究，可得出如下结果2 8 l ：本实验应用i s h 与i h c 结合方法，对s p 在过敏性休克家兔体内的表达进行研究，结果均呈阳性，且均高于正常对照组。证实了过敏性休克发生时，胃肠组织细胞内s p m r n a和蛋白表达均升高。胃组织各组之间的蛋白表达均有统计学意义，尚不能说明对照组与休克2 h 之间m r n a 的表达存在着差异，其余各组之间的m r n a 表达均有统计学意义。小肠和圆小囊各组之间m r n a 的表达存在着差异，尚不能说明对照组与休克2 h 之间蛋白表达存在差异，揭示s p 基因表达和蛋白表达在不同程度上参与了过敏性休克的发病过程。近年来随着i s h 技术的发展和方法的不断完善，它已广泛被应用于遗传学、病毒学、病理学、免疫学、神经内分泌学以及法医学的各个领域。在法医学上，i s h 已被用于人体性别的检验 2 9 1 。大鼠皮肤切创原位杂交研究发现，e d a 、e d b 在大鼠正常皮肤几乎不表达，而在损伤后6 h 内表达量呈逐渐上升趋势。因此通过检测它们的表达，可以为损伤时间推断提供有效的参考指标1 。贺力文等洲应用地高辛随机引物法标记的c d n a 探针检测实验性大鼠皮肤切创中细胞因子( t n f 、i l - 6 ) m r n a 的表达，发现其可以准确鉴别生前伤和死后伤，并在短时间内推断损伤时间。由于m r n a 在细胞内会受到多种成分的作用而发生降解，同时周围环境中也存在着大量的r n a 酶，在取材、切片、试剂配置、杂交过程中均需要防止r n a 酶，这给原位杂交的实际应用带来了困难。考虑到蛋白质不易被降解，实际工作中原位杂交与免疫组化两种方法结合使用。可以为过敏性休克的法医学诊断提供客观的指标。9结论本实验应用免疫组化和原位杂交技术对过敏性休克家兔p 物质进行研究，并应用b i 2 0 0 0 图像分析系统对染色结果进行分析，得出以下结论：( 1 ) 对照组和实验组家兔胃肠组织中均有p 物质表达。( 2 ) 实验组家兔胃肠道p 物质无论在转录水平还是在翻译水平上的表达，均明显高于对照组，p 0 0 0 1 ，具有统计学意义；且随着时间的变化逐渐减弱。( 3 ) 实验组中猝死组与休克不同时间段组家兔胃肠道p 物质i h c 染色两两比较，均有统计学意义。( 4 ) 实验组中猝死组与休克不同时间段组家兔胃肠道p 物质i s h 染色两两比较，均有统计学意义。本实验从转录水平和翻译水平上研究了p 物质在过敏性休克家兔中的表达，证实了p物质参与了过敏性休克的过程，应用免疫组化和原位杂交技术对p 物质进行染色，可以为法医学诊断过敏性猝死提供客观的诊断依据。1 0山西医科大学硕士学位论文【1 1【2 】【3 】【4 11 5 【6 】【7 】1 8 【9 】【1 0 【“】 1 2 1【1 3 】【1 4 】 1 5 】【1 6 】 1 7 】 1 8 】参考文献s e l e n ah ，p i e r a n g e l og s u b s t a n c e “j 1 i n t e r n a t i o n a lj o u m a lo fb i o c h e m i s t r ya n dc e l lb i o l o g y ，2 0 0 1 ，3 3 ：5 5 5 5 7 6 d u v i l a n s k ibh , p i s e r ad ，s e i l i c o v i c ha ，e ta 1 i n t e r a c t i o nb e t w e e ns u b s t a n c e spa n dt r hi nt h e c o n t r o l o f p r o l a c t i nr e l e a s e j j 0 1 1 m a l o f e n d o c r i n o l i g y ，2 0 0 0 ，1 6 6 ( 2 ) ：3 7 3 - 3 8 0 s u z u l is 。h a b a r ay k a l l n ot e f f e c t so fs u b s l a r l c epo i ln i c o t i n e i n d u c e di n t r a c e l l u l a rc a ，d y n a m i c si nb o v i n ea d r e n a lc h r o m a f f mc e l l s j j a p a n e s ej o u r n a lo fv e t e r i n a rr e s e a r c h ，1 9 9 9 ，4 7 ：i - 1 2 w e i n s t o c kj v t h er o l eo fs u b s t a n c ep , h e m o k i n i na n dt h e i rr e c e p t o ri ng o v e r n i n gm u c o s a li n f l a m m a t i o ma n dg r a n u l o m a t o u sr e s p o n s e s j f r o n tb i o s c i ，2 0 0 4 ，9 ：1 9 3 4 - 1 9 4 3 n i e b e rk ，b a u m g a r t e nc r ，r a t h s a c kr ，e ta 1 s u b s t a n c epa n db e t a - e n d o r p h i n l i k ei m m u n o r e a c t i v i t yi nl a v a g ef l u i d so fs u b j e c t sw i t ha n dw i t h o u ta l l e r g i ca s t h m a j a l l e r g yc l i ni m m u n o l ，1 9 9 2 。9 0 ( 4p t1 ) ：6 4 6 - - 6 5 2 l i uj y ，h uj h , z h uq o ，e ta 1 e f f c e to fc e t i r i z i n eh y d r o c h l o r i d eo nt h ee x p r e s s i o no fs u b s t a n c epi n 蟮m e d i a t e dt r i p h a s i cc t l t a n e o b sr e a c t i o n j 1 y a ox u ex u eb a n ，2 0 0 5j u l , 4 0 ( 7 ) ：6 4 9 6 5 3 方富贵，章孝荣p 物质研究进展【j 】动物医学进展，2 0 0 5 ，2 6 ( 1 ) ：6 8 a n s e lj c , b r o w n 瓜，p a y a nd g 。e a 1 s u b s t a n c eps e l e c t i v e l ya c t i v a t e s1 n f - a i p h ag e n ee x p r e s s i o ni nm u r i n em a s tc e l l s j ji m m u n o l ，1 9 9 3 ，1 5 0 ( 1 0 ) ：4 4 7 8 - 4 4 8 5 o t t a w a yc a n e u r o i m m u n o m o d u l a t i o ni nt h ei n t e s t i n a lm u c o s a j 】g a s t r o e n t e r o lc l i nn o r t ha m , 1 9 9 1 2 0 ( 3 ) ：5 1 1 5 2 9 苗明三实验动物和动物实验技术【m 】北京，中国中医药出版社，1 9 9 7 ：1 0 3 1 0 4 刘玉如，余锐萍，靳红，等p 物质及其m r n a 在家兔圆小囊组织内的表达【j 】科学技术与工程，2 0 0 5 ，5 ( 3 ) ：1 4 7 1 5 1 王革新，罗小萌，罗新华两种过敏性休克实验比较 j 包头医学院学报，2 0 0 4 ，2 0 ，( 3 ) ：1 8 5 - 1 8 6 周光炎免疫学原理【m 】上海，上海科学技术文献出版社，2 0 0 0 ：2 0 8 2 1 1 肖风，孙朝越，刘继志速发型过敏反应的研究进展【j 】井冈山医专学报，2 0 0 5 ，1 2 ( 1 ) ：1 牛1 6 l a ij p ，d o u g l a ss d ，h ow z h u m a nl y m p h o c y t e se x p r e s ss u b s t a n c epa n di t sr e c e p t o r【j 】jn e u r o i m m u n o l ，1 9 9 8 ，8 5 ：8 0 - 8 5 路长林神经肽基础与临床 m 】第一版，上海，第二军医大学出版社，2 0 0 0 ：1 3 1 张万会，朱运龙p 物质的免疫调节效应【j 】生物科学进展，1 9 9 2 ，2 3 ( 2 ) ：1 1 6 1 2 1 陈亮，李世荣，丛林p 物质对增生性瘢痕中肥大细胞组胺释放的影响 j 第三军医大山西医科大学磺士学位论文学学报，2 0 0 6 ，2 8 ( 8 ) ：8 4 1 8 4 3 【1 9 】陈亮，流沙，李世荣，等p 物质对人增生性瘢痕组织中组胺释放的影响【j 】中华烧伤杂志，2 0 0 6 ，2 2 ( 3 ) ：1 9 2 1 9 4 【2 0 1n i e r ip d a f f o n c h i ol o m i n ic ，e ta 1 c h a n g e si na i r w a yr e a c t i v i t yt oe x o g e n o u sa n de n d o g e n o u sa c e t y l c h o l i n ea n ds u b s t a n c epa f t e ra n a p h y l a c t i eb r o n c h o c o n s t r i c t i o ni na n a e s t h e t i z e dg u i n e a - p i g s ja u t o