（基础兽医学专业论文）鸡体内氯霉素残留的检测方法及消除规律研究.pdf

摘要 氯霉素是第一个人工合成的广谱抗生素，因其效高价廉，在我国畜牧业中得到广 泛应用，对畜禽疾病的控制和治疗起到了重要的作用。随着氯霉素的广泛应用及研究 的深入，发现其有许多毒、副作用，因此，必须控制氯霉素在动物性食品中的残留， 保障消费者健康与安全。为了了解鸡体内氯霉素残留情况和建立一种准确、可靠的检 测鸡体内氯霉素的残留方法以监控鸡体内氯霉素残留，本文研究了鸡体内氯霉素残留 的高效液相色谱检测方法及消除规律。 血液月乙酸乙酯萃取及净化，将肌肉、肝脏制成匀浆，用乙腈、乙酸乙酯、正己 烷萃取净化后，流动相或2 0 的乙腈溶液重新溶解定容。紫外检测波长为2 7 8 n m ，流 动相为乙腈：水( 2 0 ：8 0 ，v v ) ，流速为l m l m i r n 进样量为2 0 9 l ，最低检测限为o 0 1 9 9 m l ， 用a g i l e n tc l s ( 4 6 2 5 0 m m ，填料粒度5 p m ) 色谱柱分离检测。在上述条件下，氯霉 素在组织( 血液、肌肉、肝脏) 中的最低检测限为0 0 l b “g m l ，标准曲线的线性范围 为o 0 1 4 0 0 9 m l 。氯霉素浓度为o 0 5 、0 5 、5 、2 0 0 9 m l 时血液的日内变异系数分别 为3 7 4 、1 7 9 、1 2 0 、o 7 1 ：日间变异系数分别为4 8 3 、3 7 7 、2 5 4 、1 7 8 ： 肌肉的日内变异系数分别为3 4 5 、1 8 2 、1 4 7 、0 9 2 ；日间变异系数分别为 4 5 4 、3 5 0 、2 - 3 9 、1 2 3 。肝脏的日内变异系数分别为3 9 6 、2 3 9 、1 6 1 、 o 8 7 ；日间变异系数分别为5 0 7 、3 6 3 、2 7 7 、1 5 3 。将氯霉素以0 0 5 、0 5 、 5 、2 0 “g m 1 分别添加到空白血液、肌肉和肝脏中，测得血液中氯霉素回收率标准误 分别为8 3 9 8 3 6 9 、8 5 2 3 2 6 8 、8 4 7 1 3 1 l 、8 5 6 3 1 5 7 ，肌肉中 氯霉素回收率标准误分别为8 5 8 3 3 1 5 、8 7 6 9 2 9 1 、8 8 6 2 2 1 0 、 8 7 4 1 2 8 7 ，肝脏中氯霉索回收率标准误分别为8 4 5 6 2 9 5 、8 8 1 2 2 7 4 、8 5 3 8 1 7 6 、8 7 9 6 2 3 7 。结果表明，本文所建立的高效液相色谱方 法是一种灵敏、可靠的检测鸡体内( 血液、肌肉、肝脏) 氯霉素残留的分析方法。 单剂量( 3 0 m g k g ) 给药后药物在组织中的消除可以用以下方程描述： c m = 1 3 。8 2 。o ，1 5 0 豇cn 自= 4 4 4 7 8 e o 0 9 4 孔ch m = 4 1 9 4 6 e 。o0 8 1 4 按照消除方程，计算出 氯霉素在组织中达到0 0 1 u g m l 所需要的时间，血液、肌肉、肝脏分别为4 8 0 6 、8 8 8 9 、 1 0 2 4 8 h 。 关键词：氯霉素，鸡，残留，高效液相色谱，消除 a b s t r a c t c h l o r a m p h e n i c o l ( c a p ) w a s a h i g h e f f e c t i v eb r o a d - s p e c t r u m a n t i b i o t i c su s e di n a n i m a l s b u ti th a sb e e nf o u n dt h a tc a p r e s i d u e si na n i m a lt i s s u e sa n d o ra n i m a lp r o d u c t s h a dt o x i ce f f e c t st oh u m a n b o d y t h e r e f o r e ，i tw a sn e c e s s a r y t os t u d ya l la n a l y t i c a lm e t h o d f o rt h ee l i m i n a t i o no f m o n i t o r i n gc a pr e s i d u e si nt i s s u e so f c h i c k e n s a l l i g h p e r f o r m a n c e - l i q u i d - c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ! ) m e t h o d f o r m e a s u r i n g c a p r e s i d u e si nt i s s u e so fc h i c k e n sw a se s t a b l i s h e d c a pr e s i d u e sw e r ee x t r a c t e da n dp u r i f i e d b ya c e t o n i t r i l e ，e t h y la c e t a t e ，a n dn - h e x a n ef r o mt h ep l a s m a ，m u s c l ea n dl i v e r , a n dt h e n r e d i s s o l v e db ym o b i l ep h a s e ( a c e t o n i t r i l e ：w a t e r ，2 0 ：8 0 ) o r2 0 a c e t o n i t r i l es o l u t i o n r e s p e c t i v e l ya t1 m l m i nf l o wr a t ea n d4 0 c d e t e c t i o nw a v el e n g t ho f u v w a ss e t2 7 8 n m u n d e rt h ea b o v ec o n d i t i o n s t h ed e t e c t i o nl i m i to fc a pi nt i s s u e sw a s0 0 1 l _ t g m 1 t h e c a l i b r a t i o nc u r v ew a sl i n e a ri nt h er a n g eo f0 0 1 4 0 9 9 m 1 a t 0 0 5 ，0 5 ，5 ，2 0 9 9 m l c o n c e n t r a t i o n ，t h ec v w i t h i nd a yw a s3 7 4 ，1 7 9 ，1 2 0 ，0 7 1 f o rp l a s m a ，3 4 5 ， 1 8 2 ，1 4 7 ，o 9 2 f o rm u s c l ea n d3 9 6 ，2 3 9 ，1 6 1 ，0 8 7 f o rl i v e rr e s p e c t i v e l y ； t h eb e t w e e n d a yc v w a s4 8 3 ，3 7 7 ，2 5 4 ，1 7 8 f o rp l a s m a ，4 5 4 ，3 5 0 ，2 3 9 1 2 3 f o rm u s c l ea n d5 0 7 ，3 6 3 ，2 7 7 ，1 5 3 f o rl i v e rr e s p e c t i v e l y t h er e c o v e r i e s o fc a pa d d e dt ot h ep l a s m a ，m u s c l ea n dl i v e ra tl e v e l so f0 0 5 ，0 5 ，5 ，2 0 9 9 m lw e r e 8 3 9 8 3 6 9 ，8 5 2 3 2 6 8 ，8 4 7 1 3 1 i ，8 5 6 3 1 5 7 f r o m p l a s m a 8 5 8 3 3 1 5 ，8 7 6 9 2 9 1 ，8 8 6 2 2 1 0 ，8 7 4 1 2 8 7 f r o mm u s c l e ， 8 4 5 6 2 9 5 ，8 8 1 2 2 7 4 ，8 5 3 8 1 7 6 。8 7 9 6 2 _ 3 7 f r o m1 i v e r r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e d t h i sm e t h o dw a ss e n s i t i v ea n dr e l i a b l et om e a s u r i n gc a p r e s i d u e si nt i s s u e so fc h i c k e n s 1 1 1 ee l i m i n a t i o n c h a r a c t e r i s t i c so f s i n g l e - d o s e a d m i n i s t r a t i o n r 3 0 m g k g ) c a n b e d e s c r i b e db yt h ee q u a t i o n s 鹤f o l l o w s ：c b 1 0 0 d = 1 3 8 2 9 e 。o l5 0 5 i ，c m u s c l e = 4 4 4 7 8 e _ 0 0 9 4 5 c = 4 1 9 4 6 e 。0 _ 0 8 14 t a c c o r d i n gt ot h ee q u a t i o n s ，恤t i m et a k e nb yt h ec o n c e n t r a t i o n so f c h l o r a m p h e n i c o ld r o p p i n g t oo o lg g m li n b l o o d ，m u s c l e a n dl i v e rw a s 4 8 0 6 ，8 8 8 9 ，1 0 2 4 8h o u r sr e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：c h l o r a m p h e n i c o l ，c h i c k e n s ，r e s i d u e s ，h p l c ，e l i m i n a t i o n l i 中文全称 氯霉素类药物 氯霉素 甲砜霉素 氟甲砜霉素 美国食品药物管理局 气相色谱 高效液相色谱 质谱 气质联用 液质联用 液液萃取 液固萃取 固相萃取 酶联免疫吸附 天 小时 分钟 秒钟 甲醇 乙腈 乙酸乙酯 三氯甲烷 正己烷 中英文对照表 英文全称 缩略词 c h l o r a m p h e n i c o l s c a p s c h l o r a m p h e n i c o l c a p t h i a m p h e n i c o l t a p f 1 0 r f e n i c o l f f f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n f d a g a sc h r o m a t o g r a p h y g c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c m a s ss p e c u o m e t r y m s g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y g c m s l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y l c m s l i q u i d l i q u i d e x t r a c t i o n l l e l i q u i d - s o l i de x t r a c t i o n l s e s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n s p e e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y s e l i s a d a y d h o u r h m i n u t e r a i n s e c o n d m e t h a n o lc h 3 0 h a c e t o n i t r i l ec h 3 c n e t h y la c e t a t e c h l o r o f o r mc h c l 3 n h e x a n e v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特另加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 选蕴也 时间：删y年易月印日 | 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在鳃密居应遵守此协议) 研究生签名 第一导师签名 蝴：彬年占月毋 时i 司：棚7年f 月刃日 | 盆严 参红 稍 班哗 第一章文献综述 1 氯霉素残留研究概况 兽药残留( a n i m a ld r u gr e s i d u e s ) 是指给动物使用药物后蓄积或储存在细胞、组 织或器官内的药物原形、代谢产物和药物杂质。近年来食品中兽药残留在国内外已成 为一个影响广泛和颇具争议的问题，其与公众的健康息息相关，也直接关系到产业界 的经济利益。尽管食品中残留水平通常很低，发生急性中毒的可能性很小，但这种长 期、低水平的接触方式主要产生各种慢性、蓄积毒性，对健康和环境的危害往往具有 隐蔽性，易造成实质性和难以逆转的危害。 1 1 氯霉素简介 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c a p s ) 属于兽药中的一类，是由e h r l i c h 等在1 9 4 7 年首次 从微生物代谢物中分离的一种抗生素。目前用人工方法合成，己广泛用于动物各种传 染疾病的治疗【”。它的化学结构为d 一苏阿糖型一1 一对硝基一2 一二氯乙酰氨基一l ，3 一丙二醇，如图卜1 所示脚 圈卜1 氯霉素结构式 f i g 1 - 1s w a e t u r e o f c a p 氯霉素能导致严重的再生障碍性贫血，并且其发生与使用剂量和频率无关。人体 对氯霉素较动物更敏感。婴幼儿的代谢和排泄机能尚不完善，对氯霉素更敏感，可出 现致命的“灰婴综合症”。由于上述毒性使氯霉素成为第一个被禁止用于食品动物的 抗生索。因此建立残留分析方法对其监控是非常重要的。 1 2 样品前处理方法 由于所研究的对象均为生物样品，而生物样品一般比较复杂，含有成千上万种化 合物，如蛋白质、脂肪、糖类、核酸、维生素、无机盐、水分等。这些物质的结构、 分子大小和理化性质备异，其中许多化合物的性质目前尚不明确，它们任何一种物质 的含量可能是兽药残留组分的数百倍至数万倍以上。这些样品基质的存在不但干扰对 残留物的检测，而且污染仪器和降低设备使用寿命。与药品分析相比，残留分析的主 要特点是样品基质复杂、待测物含量低和需要繁琐的样品处理过程。 样品处理的最终目的是将待测组分从样品基质中分离出来，并达到分析仪器能够 检测的技术。其主要作用包括将药物从样品中释放出来、除去样品中的干扰杂质、将 待测物组分转换为可检测的形式、达到可检测的浓度范围和溶于可进行分析的介质。 样品处理过程通常包括以下四项基本内容：提取、净化、浓缩和衍生化。设计样品处 理方法必须考虑到待测组分的理化性质、存在状态、样品基质的化学组成、可能干扰 物类型、处理方法对药物稳定性的影响和采用的测定方法。 分离或组分转移是贯穿整个样品处理过程的基本问题。一般根据待测组分与杂质 分配率的差异使它们转移到可用机械方法分离的两个或几个物相中( 液一液或液一固体 系) 。由于残留样品的复杂性，必须结合各种提取和净化方法多梯次的扩大待测组分 与样品之闾理化性质( 分子的极性、离子性质、分子大小及位阻) 的差别，才能达到待 测组分与杂质分离的目的。 样品分离或组分转移方法可分为两令基本类型，即液一液萃取( 1 i q u i dl i q u i d e x t r a c t i o n ，l l e ) 和液一固萃取( 1 i q u i d s o l i de x t r a c t i o n ，l s e ) 。根据组分转移的方向划分， l s e 可以是组分从固体中转移到液相中，如经典的固体样品提取方法：也可以是组分从 液体向固体的转移，即用固体固定相萃取或富集液相中的组分( 吸着过程) ，这就是常 用的固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o ns p e ) 。 1 2 1 提取方法 提取即用物理的或化学的手段破坏待测组分与样品成分间的结合力，将待测组分 从样品中释放出来并转移至易于分析的溶液状态。这种结合力可以是分子间作用力或 共价键组分的化学键。提取方法的设计应考虑样本基质的种类、待测物溶解性和提取 溶剂，并顾及下一步可能采用的净化方法。提取过程应首先保证最大回收率，其次是 减少样品基质的共萃取。提取过程常与一些样品制备过程一同进行，如匀浆、抑制样 品降解等。 在肝脏中，氯霉素快速代谢成葡萄糖醛酸轭合物口 。试验发现，在一2 0 储存条 件下，切成薄片的肝和肾中的氯霉素发生了降解，而切成块状的样品中氯霉素则保持 稳定。在猪的肝、肾和血清中，一半以上的氯霉素是以轭合物形式存在，氯霉素的葡 萄糖醛酸化物的轭合物可以用b 葡萄醛酸糖1 4 苷酶降解葡萄糖醛酸化物后进行测 定，但在鸡、牛和猪的肌肉组织中未发现氯霉素轭合物。对葡萄糖醛酸轭合物可用b 一葡萄醛酸糖酸苷酶水解后测定，或与原形药物一同直接分析。 在气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 和液相色谱( 1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，l c ) 测定方法中主要采用乙酸乙酯、甲醇或乙腈从样品中提取氯霉素类药物。有人用饲 养的黄尾鱼研究了这些溶剂对这三种药物提取效率的影响，取l o g 样品，分别加入5 u g 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜素混匀，放置冰箱过夜。然后分别用5 0 r a l 醇、乙腈或乙 2 酸乙酯提取这三种药物，再用乙酸乙酯把被测药物反萃回有机相，浓缩至近干，残留 物用甲醇一水( 1 + 1 ) 溶解，用l c 测定。从表卜1 看出，用甲醇和乙腈的提取效率没有乙 酸乙酯高，因此乙酸乙酯最适合作为这三种药物的提取溶剂。 表1 - 1 提取溶剂对黄尾鱼中氯霉素类药物回收率的影响 t a b l ei - it h ee f f e c to f e x t r a c t i n gs o l v e n to nr e c o v e r yo f e h l o r a m p h e n i e o l si ny e l l o w t a i lf i s h 针对不同的样品，样品提取方式也有很大的不同，通常采用的提取方法有：组织 捣碎法、振荡法、索氏提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取等。对动物组织 而言，含水量约7 5 ，主要固形物为1 9 o 的蛋白质、2 5 的脂肪、1 2 的糖类，其 它成分包括无机盐、维生索和一些酶类，p h 5 7 。与其它样品的供应情况不同，肌肉 样本的来源众多。不同种类动物的食物构成和肌肉的成分存在差异，如家禽和牛的肌 红蛋白和脂肪含量，这些变化会影响分析方法的回收率或干扰检测，因此一种动物组 织的残留分析方法对其它动物组织样品不一定适用。所以需要针对不同样品对样品提 取条件进行改进。 1 2 2 样品净化 高浓度的样品经去蛋白质处理后可直接测定【孔，但对低浓度的样品则需适当的净 化步骤。所谓净化是将待测组分与杂质分离的过程。提取过程一般可以除去9 9 以上 的样品基质。这些不到1 的共萃取物是主要的干扰杂质，如干扰光谱检测、降低柱效、 污染色谱柱和检测器等。有时这些杂质可能不直接干扰检测，但大量的杂质会干扰色 谱分离过程，导致待测物峰形异常和保留值变异增加。有些杂质会影响衍生化反应。 为了保证测定的正常进行，必须在净化过程中除去这些杂质。样品净化方法主要是液 一液分配法。乙酸乙酯比其它有机溶剂能更有效地从水溶液中萃取氯霉素、甲砜霉素 和氟甲砜霉素。在水溶液中加k n a c l ，用有机溶剂可以有效地把这三种抗生素反提出 来。但加入盐的浓度不宜过高，通常n a c l 的浓度为3 4 。为了除去脂类，常用正 己烷、石油醚或异辛烷与含有这三种药物的水溶液进行液一液分配。 另一常用的净化方法是固相萃取。液一液分配之后通常需用固相萃取进步净化。 常用的固相萃取柱包括：c 1 8 、硅胶柱、氧化铝柱、硅藻土柱、s e p h a d e xl h 2 0 w o f a t i t y 2 9 乖l e x t r e l u t e 柱。 在净化步骤中，c ，8 固相萃取柱最常用，回收率高。但在许多情况下，用c 1 s 柱净 化后，再通过c 。8 分离柱用l c 进行分析，这样可能会发生某些干扰杂质不能与被测物 分开，因此人们进一步研究f l o r i s i l 和氧化铝固相柱净化效果。 在黄尾鱼肌肉中分另0 3 1 a 5 u g 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉索，该试样用乙酸乙 酯提取两次，提取液浓缩后，在残渣中加入4 氯化钠水溶液，然后用正己烷进行液 液分配，去掉正己烷相，再用乙酸乙酯把残留的药物反萃出来，把乙酸乙酯萃取液浓 缩至近干，用正己烷或乙腈一水( 9 5 + 5 ) 溶解残渣，再分别用f l o r i s i l 或氧化铝固相柱净 化。前一种方法中固相柱先用正己烷洗涤后再用乙醚洗涤，残留的药物用乙醚甲醇 ( 7 3 ) 洗脱。后一种方法中，残留的药物用乙腈水( 9 5 5 ) 洗脱。试验结果表明，使用 f l o r i s i l 作为净化柱，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的回收率分别为8 2 6 ，7 5 。4 ， 7 9 1 。而使用氧化铝作为净化柱，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的回收率分别为 7 5 8 ，6 5 6 ，6 3 4 。从试验结果看出，使用f l o r i s i l 得到的回收率要比氧化铝高， 并且更能有效地去除脂类的干扰。 l o n g 等【4 】采用基质固相分散技术( m s p d ) 净化牛奶中的氯霉素，将牛奶9 n 至, j c l8 填料的颗粒上，混匀后，把混合物填充到玻璃柱中进行净化，这种处理方法对避免柱 子堵塞可能有用，但由于使用的c ls 填料的量非常小，所用的样品的量受到了限制。 为了降低溶剂的消耗，简化样品前处理过程，p e n s a b e n e 等【5 1 用超临界流体萃取( s f e ) 技术，对鸡蛋中的氯霉素残留进行了提取与净化，提取液用液相色谱测定。结果明该 方法的提取与净化效果很好，当添加浓度为0 0 1 m g k g 时，回收率在7 7 4 8 6 6 ， 相对标准偏差为4 3 。 1 2 3 浓缩与富集 在残留分析中，经过提取和净化后待测物组分的存在状态经常不能满足检测仪器 的要求，无法直接测定，如浓度低于检测器的响应范围、待测物的溶剂与液相色谱仪 器不兼容等。这时必须对组分进行浓缩和富集，使供测定的样品达到仪器能够检测的 浓度，或进行溶剂转换。 溶剂挥发是常规的浓缩方法，常见减压蒸馏和气流吹蒸两种方式。 1 3 氯霉素检测方法 多年来，国内外食品分析工作者一直十分关注氯霉素的残留检测技术，发展了一 些氯霉素残留分析方法，如微生物学方法、放射免疫法、色谱法和酶免疫分析法等。 1 3 1 微生物学方法和放射免疫法测定氯霉素残留 ( 1 ) 微生物擎法 微生物学方法是氯霉素测定的最常用的方法 6 】。该方法用拭子采取动物体内的组 织液，然后将其放置于涂满枯草杆菌的培养基体中保温过夜。观察是否在拭子周围出 4 现抑菌环，若有即表明组织液中有大量抗生素存在，如果该动物只用过氯霉素进行治 疗，则可以认为该组织中存在氯霉素残留。有报道认为该方法不能检出牛肌肉组织中 3 m g k g 以下氯霉素的残留【“。 微生物学法特点： 易操作，费用低，可用于大量样品的筛选。 灵敏度低( 3 m g k g ) ，特异性差，般抗生素类药物都有此反应。 ( 2 ) 放射免疫法 放射免疫法也可用于测定动物性食品中氯霉素残留。a r n o l d 等报道了在蛋，肉， 奶中氯霉素的放射免疫的痕量分析【8 l 。对于用氯霉索治疗的动物组织和其它可食用产 品，此方法检出限量约为0 2 u g k g ，l u g k g 以上的氯霉素残留能被准确定量，在蛋、 肉中平均回收率为8 5 ，在奶中平均回收率高于9 5 。 放射免疫法特点： 检出限高( 1 p g k g ) ，回收率比较高。 同位素半衰期短，存在放射性污染，并且需要复杂仪器设备。 1 3 2 酶免疫测定法检测氯霉紊残留 酶免疫测定法是以酶学和免疫学为基础发展起来的一种新技术 9 1 ，近年来有许多 关于应用此技术测定农药及兽药残留的报道【卧m 】。用酶免疫测定法检测食品中氯霉素 的残留是一个成功的范例f 8 j 。由于氯霉素是半抗原，它不能刺激机体产生抗体，因而 要使半抗原性物质具有免疫原性就需使其与大分子载体物质( 蛋白质) 相结合制备人 工抗原，而后将其作为抗原进行免疫，动物体内即可产生特异性抗体。然后建立酶免 疫竞争法测定氯霉素含量。 1 9 8 4 年g w e n d o l y n s 等用竞争酶免疫法测定牛肌肉组织中氯霉素残留，最低检出限 量可达l ug k g ，特异性也很好例。另外还有采用单克隆抗体竞争酶联免疫法测定猪肌 肉组织中氯霉素残留报道踊】。随着研究工作的深入发展己有测定氯霉素的试剂盒投放 市场，如x x 公司的e m i t 试剂盒，它用于经氯霉素治疗后人血清中氯霉素含量的分析， 此试剂盒主要是用于医用日常分析。经大量试验d j b e r r y 等曾提出用e m l t 试剂盒酶 免疫法代替高效液相色谱法，但它灵敏度不高，只能检n 2 5 m g k g n 上氯霉素的含量 悼j 。后来荷兰推出了测定氯霉素残留的酶联免疫测定试剂盒q u i k c a r d ，现又称l a c a r t t e s t 试剂盒，该试剂盒可测定牛、羊、猪等肌肉中氯霉素残留，检出限量为1 - 3 u g k g ， 也有人用它检测牛奶中氯霉素的残留，试样不经预处理检出限量5 1 0 u g k g ，样品经预 处理及浓缩后检出限量可达l u g k g 以下，此外还有用它检测鸡蛋，尿液中氯霉索的报 道【g j 。另外，还有用单克隆抗体亲和素一生物素酶联免疫法测定猪肌肉组织中和牛奶 中氯霉素残留的方法【8 】。 酶免疫测定法特点： 试样预处理简单、特异性强、灵敏度高( 最高1ug 唱) 。 由于抗体的批次不同，测定结果可能出现微小差异。 酶免疫测定法非常适合对氯霉素残留筛选的需要，它能在短短的几个小时检测几十 到上百个试样，它在现场监控和基层实际检测上有着广阔的应用前景。 测定氯霉素可以使用生化方法，但这些方法的灵敏度一般为0 5 1 m g k g 。如果样品 中含有其它抗菌素，灵敏度会更低。氯霉素是较旱采用理化测定技术的抗生素，主要 是g c 和h p l c 分析法，也有采用t l c 分析的报道。 1 3 3 色谱法测定氯霉素残留 ( 1 ) 薄层色谱法 t l c 测定食品中氯霉素类抗生索的方法报道较少。2 1 a b e a m 1 1 1 建立一个猪肉 中氯霉索残留的t l c 测定法。样品用乙酸乙酯提取，离心分离，正己烷脱脂，然后用 硅胶柱净化，分别用乙酸乙酯一正己烷( 3 + 1 ) 乙腈一甲醇( 9 5 + 5 ) 洗涤净化柱，用丙酮一 正己烷( 2 + 1 ) 洗脱。洗脱液浓缩后，用5 0 u l 甲醇溶解，点样，用乙酸乙酯一正己烷( 2 + 1 ) 溶剂体系展开。斑点进行衍生化：先喷氯化锶溶液，烘干后再喷氢氧化钠溶液，烘干， 喷硼氢化钠，烘干，最后喷荧光胺，氯霉素斑点在3 6 6 n m 紫外灯下呈黄色。该方法测 定低限为( o 0 1 m g k g ) 。 薄层色谱法特点： 仪器设备简单。 样品处理比较繁琐，显色过程比较复杂，检出限低( o 0 1 m g k g ) 。 ( 2 ) 气相色谱法 近2 0 年来，氯霉素一般采用液相色谱法测定，但过去绝大多数实验室都采用气相 色谱法”氆1 测定。从氯霉素的结构上看，它含有羟基、亚氨基，有很强的极性，很难 挥发。须对它的极性官能团进行酯化、硅烷化或酰化，生成热稳定和易挥发的衍生物， 才能用g c 或g c m s 进行测定。选择的衍生化反应要简单，能快速完成且少有副反应。 含有羟基的化合物通过三甲基硅烷化( t m s ) 可以定量衍生，生成易挥发和热稳定的 化合物。 要得到理想的衍生化结果，选择硅烷化试剂和衍生化条件非常重要。硅烷化试剂、 溶剂、反应温度和时间对氯霉素衍生化位置影响很大。要定量测定氯霉素，推荐使用 六甲基二硅氧烷( h m d s ) 和三甲基氯硅烷的混合物作为硅烷化试剂，这样完全得到 双一硅烷化衍生物( 2 个经基均被取代) 。 氯霉索分子含有硝基和两个氯原子，有很强的电子亲和性，因此常用电子捕获检 测器测定氯霉素，j a c a s o n 等 1 3 】采用乙酸乙酯提取动物组织中的药物，用含4 n a c l 溶 液的正己烷去除脂类物质，通过硅藻土色谱柱提纯净化，加入四甲基硅烷( t m s ) 衍生 化，最后进样检测。肌肉、肾脏和肝脏的回收率均大y - 8 0 ，检测限为小于1 u g 值g 。色 谱条件：电子捕获检测器( e c d ) ，g a s ，c h r o mq 色谱柱( 含有4 s e 一3 0 ) ，流动相为氨一 甲烷( 9 5 ：5 ，v v ) 。 氢火焰离子化检测器( f i d ) 也可用于氯霉素的检测，但灵敏度低且专性差，通 常仅作为g c 灯s 的辅助检测手段【2 4 j 。 气相色谱法特点： 采用专属检测器( e c d ) 灵敏度高，检出限可达0 。l u g k g 。 需要衍生化，样品前处理复杂：由于采用保留时间定性，容易误判，需进一步确证。 ( 3 ) 高效液相色谱法 国外研究现状 氯霉素有很强的紫外吸收，因此可直接采用i - i p l c u v d ；雯! 定【2 5 。2 。在多数方法中都 用c 1 8 柱作为分析柱，但也有采用c 8 柱进行分离的。由于c l s 分析柱可以将氯霉素和基 质很好的分离，所阻多数方法都使用这种柱子进行分析。采用的流动相主要是甲醇或 乙腈与磷酸盐缓冲液、酯酸盐缓冲液或水。氯霉素的检测波长一般选择2 7 8 n m 。 w a lj m 等1 2 5 l 首次报道了牛奶中氯霉素残留测定的液相色谱法，但方法繁琐费时， 并且不适于动物组织中氯霉素的测定。向2 5 m l 牛奶中加入7 5 m l 乙酸乙酯，取出3 7 。5 m l 乙酸乙酯提取液，浓缩干后用5 m l 乙腈分两次洗涤残留物，异辛烷脱脂，浓缩干乙腈 相。加入0 2 m l 氯仿和0 2 m l 丙二醇一水( 1 ：1 ) ，丙二醇一水相进行分析。采用5 u mc i 8 s p h e r i s o r b0 d s ( 2 5 c m x 2 1 m m ) 柱进行色谱分析，流动相为3 0 甲醇水溶液，检测波 长为2 8 0 n m ，方法的回收率为7 2 9 9 5 ，检测限量5 u g k g 。 b o r i e s 2 6 】等采用液相色谱法对家禽组织中的氯霉素残留进行了测定并采用g c - m s 法予以确证。将2 0 9 动物组织匀浆，加入5 0 m l 水混合后分层，再加入2 0 m l 用乙腈饱和 的异辛烷。取乙腈相浓缩，用0 2 5 m l 氯仿溶解残留物，再加入0 2 5 m l 丙二醇一水( 1 ：1 ) ， 将丙二醇一水相进行色谱分析。采用5 u mc 1 8s p h e r i s o r bo d s ( 2 5 c mx 2 i m m ) 色谱柱， 流动相为3 5 n 醇水溶液，检测波长2 8 0 h m 。当氯霉素为2 0 u g k g 时，回收率为7 5 ， c - c - m s 法能完全确证5 u 眺g 以上的氯霉素。 s c h w a r t z 等【2 7 1 报道了柱色谱在净化和富集氯霉素过程中的应用。将含有氯霉素的 牛奶通过c h r o m o s o r b1 0 2 柱来吸附氯霉素，用水洗涤杂质，然后用甲醇洗脱氯霉素， 洗脱液直接通过氧化铝柱和阳离子交换树脂( h + 型) 柱，并继续用甲醇洗脱，用氮气吹 千甲醇，最后将氯霉素还原和冲淡化后进行测定，检测限量为4 u g k g 。 k e u k e n s 等【2 8 】报道了用高相液相色谱法筛选和确证在可食用的动物组织中的氯霉 素残留。筛选方法是将试样用蒸馏水提取，提取液通过e x l r e l u t 柱( m e r c k1 1 7 3 7 ) 。用 二氯甲烷洗残，氮气吹干洗脱液，用水溶解残留物并与甲苯分配，水相用于色谱分析。 检出限量为5 u g k g ，在1 0 ug k g 时的回收率为5 8 ；确证方法：用乙酸钠缓冲液提取， 加入葡糖酸酶和芳基磺酸酶于3 7 。c 孵育1 6 h ，然后加入2 0 0 m l 乙酸乙酯和2 0 9 氯化钾， 将有机相浓缩后溶于二氯甲烷一石油醚( 1 ：1 ) ，通过硅胶s e p p a k ； ! j z ，用5 m 1 石油醚以 及5 m l 乙酸乙酯一正己烷( 1 ：1 ) 洗涤层析柱，然后用2 5 m l z + 酸乙酯一正己烷( 7 ：3 ) 洗脱，将洗脱液浓缩后溶z j a t r is 缓冲液( p h10 4 ) ，用乙醚萃取氯霉素，浓缩后溶于 水和甲苯，水相用于色谱分析。该方法能确证1 0 ug k g 以上的氯霉素残留，回收率为 8 5 。 h a a g s m a 等1 2 9 峙艮道了一种高效液相色谱法测定猪肌肉中氯霉素的简单方法。该方 法采用超声波辅助乙酸乙酯提取，无水硫酸钠脱水，将一定量正己烷与提取液混合后 过小硅胶柱，用少量正己烷洗涤，再用甲醇洗脱氯霉素。浓缩后用流动相溶解并进行 色谱分析。色谱柱为5 u mc h r o m s p h e rc 8 柱( 1 0 0 o m m 3 o m m ) ，流动相为乙腈一乙酸 钠缓冲溶液( 0 0 1 m o l l ，p h4 3 ) ( 2 5 ：7 5 ，体积分数) ，检侧波长2 8 0 h m 。在氯霉素为 i 0 - 5 0 u g k g 时，回收率为7 9 。 t j a d e n 等【3 0 报道了采用阀切换技术，采用双柱反相液相色谱法测定猪肾中的氯霉 素残留。用乙醚对样品进行提取，提取液用氮气吹干。2 m 1 7 , 腈和3 m l 石油醚溶解残留 物，乙腈相用氮气吹干，用流动相溶解后进行色谱分析。色谱条件：柱一为5 u r n c h r o m s e pc l s 柱( 1 0 0 o m m 3 o m mi d ) ，柱二为5 u mp r p 一1 柱( 10 0 o n t m 3 o m mi d ) ， 检测波长2 8 0 n m 。流动相为9 0 乙腈水溶液。本方法检出限量小于0 o l m g k g ，在 0 1 2 5 m g k g 时回收率为4 1 7 。 a e r t s 等【3 i 】研究了鸡、牛、猪肉中氯霉素残留的液相色谱法并在几个实验室进行 了验证”1 。用蒸馏水进行提取，取一半滤液通过e x t r e l u _ t 柱，用二氯甲烷洗脱，浓缩后 用水溶解，与甲苯进行液液分配，水相进行色谱分析，检测波长为2 8 5 n m 。氯霉素为 1 0 u g k g 时，平均回收率只有5 5 1 ，检测限量为1 5 u g k g 。 n a g a t a 等【3 2 1 报道了用液相色谱法同时测定动物肌肉和养殖鱼肌肉中的甲砜霉素 和氯霉素残留方法。试样用乙酸乙酯提取，提取液浓缩干后，将残留物溶于3 氧化 钠溶液，正己烷脱脂，水相用乙酸乙酯萃取，浓缩干后用正己烷溶解，采用s e p - p a k f l o r i s i l 柱净化后。用o d s 色谱柱进行色谱分离，检测波长2 2 5 n m 或2 7 0 n m ，当氯霉素 为0 1 m g k g 时平均回收率大于7 4 1 ，检出限量为0 0 1 m g k g 。 国内研究概况 王秉栋【3 3 1 报道了动物性食品中氯霉素残留测定的高效液相色谱法。将l o g 试样用 一定量的无水硫酸钠研成千粉状，力n m o l l 乙酸钠缓冲溶液2 0 m l ，乙酸乙酯1 0 m l ，振 荡提取，过滤。残渣用乙酸钠缓冲溶液1 0 m l 洗涤，并入提取液，分出有机层，水相再 用乙酸乙酯萃取两次。将乙酸乙酯提取液用饱和氯化钠洗涤两次，乙酸乙酯浓缩后用 1 0 m 1 2 0 乙腈水溶液溶解，再用2 0 m l 石油醚脱脂，水相进行色谱分析。检测波长 2 8 0 m n ，采用h y p e r s i lh 5o d s 柱进行分离，流动相为水一乙腈- l m o l l z 酸钠缓冲液 ( 8 0 ：2 0 ：1 ) 。 陈家华1 3 4 t 报道了高效液褶色谱法快速测定家禽组织中氯霉素残留的研究。采用乙 酸乙酯对样品进行提取，用氮气吹干提取液。用0 5 m o l l 高氯酸溶液净化提取液，正 己烷脱去脂溶性杂质。采用1 1 b o n d a p a kc 1 b ( 3 0 e r a 4 r a m ，1 0 u r n ) 柱进行分离，流动相 为3 5 甲醇水溶液，流速为1 m l m i n ，检测波长2 8 0 n m 。该方法的平均回收率为9 2 5 ， 检测灵敏度为0 7 3 n g ，检测极限为7 3 u g k g 。 李兰生等 3 5 埔高效液相色谱法对对虾体内氯霉素的残留量进行了测定，并对氯霉 素在对虾体内的动力学进行了研究。对虾组织中加入与试样等量的蒸馏水，匀浆，加 入4 倍量甲醇，振摇提取，离心后上清液分析。采用u b o n d a p a kc 1 8 柱进行分离，流动 相为3 0 甲醇水溶液。在氯霉素浓度为2 5 m g k g 时，回收率为9 1 2 。 谢君等口q 报道了用反相高效液相色谱法同时测定动物血浆中氯霉素含量。血样由 甲醇一氯仿混合液提取，采用o d s 柱进行分离，以甲醇一乙腈一醋酸钠溶液为流动相，检 测波长为2 7 8 n m 。在氯霉素浓度5 m g k g 时，回收率为9 7 8 ，r s d 为2 1 2 。 李荚伦等【3 7 】用高效液相色谱法测定猪血浆中氯霉素的含量。血样用甲醇提取，采 用0 d s 柱进行分离，流动相为5 0 甲醇醋酸水溶液，紫外检测波长为2 5 4 n m 。其回收率 为9 5 8 ，r s d 为2 0 1 。 另外，还有人【3 8 】采用单克隆抗体制备的亲和层析柱对试样中氯霉素进行特异性提 取和富集，再用高效液相色谱法测定其含量。该方法在牛奶中检出限量可达0 0 2 u g k g 。 在国外学者报道的方法中，前处理的净化步骤相对较多，因而回收率有些偏低。 国内学者对前处理技术加以改进，回收率有所提高，但国内的检出限偏高。 液相色谱法特点： 仪器操作简单，样品前处理过程简单。 灵敏度低( 1 0 u g k g ) ，无法满足现在检测水平的要求。 随着现代检测水平的提高，对分析仪器也提出了更高的要求。采用g c 5 l i s 和l c m s 方法对氯霉素残留进行测定的报道也越来越多。 ( 4 ) 气质联用分析法 气一质联用【3 9 4 2 】分析法用于食品中氯霉素抗生素残留的确证已成为一种较成熟的 方法。用硅烷化试剂对氯霉素进行硅烷化后，氯霉素产物( 分子离子峰为4 6 6 ) 的质谱 中主要碎片离子是4 5 3 和4 5 1 ，3 6 3 ，3 6 1 ，2 2 5 ，2 0 8 和1 7 8 。氯霉素的质谱图中有几个 丰度较大的碎片离子，为定性鉴别提供了便利。 气质联用方法特点： 灵敏度高，检出限可达0 1 u g k g 以下。 样品前处理复杂，需要衍生化，仪器操作复杂，造价高。 9 ( 5 ) 液质联用分祈法 用液相色谱法测定氯霉素使用的定性手段有二极管阵列检测器和质谱检测器。尽 管用二极管阵列检测器定性简便，但在测定或鉴别样品中残留的痕量氯霉素时，其专 一性与检测限并不理想。质谱检测器具有灵敏度高、选择性