（测试计量技术及仪器专业论文）基于ccd的农药光纤荧光光谱测量系统的研究.pdf

摘要 摘要 鉴于化学农药防治方法的便捷、高效、经济，在农业生产中，农药被 大量使用来控制有害生物。我国是农药使用的大国，每年常用农药约为 1 5 0 1 6 0 种，用量8 0 1 0 0 万吨左右。农药被施用到农作物上以后，会在作 物体内会残留极少量的农药。长时间摄食含有残留农药的食品会严重影响 人体的健康，甚至会给后代人带来潜在的危害。因此，对农药残留物及其 代谢物的高灵敏度检测就变得异常重要。 目前，常用的农药残留分析方法都存在样品前处理过程繁琐、消耗试 剂、耗时长等缺点。与之相比，荧光分析法具有灵敏度高、方法简便等优点， 在环境监测领域显示出其独特的优越性。本课题尝试利用荧光光谱检测技 术和光纤传感等技术为蔬菜农药残留的直接检测做基础性研究。 本文分析了荧光分析方法的基本原理及几种常见农药( 氨基甲酸酯类 农药、苯甲酰脲类杀虫剂) 的荧光特性，并通过实验研究了几种典型农药的 荧光光谱。 根据农药的荧光特性，设计了荧光激发、收集和传输的光学系统。选 用脉冲氙灯作激发光源，设计了小型化的光栅光谱仪对农药荧光信号实现 分光，采用线阵c c d 作为光电转换器件探测微弱的荧光信号，设计了相 应的低通滤波、放大电路，通过以单片机为控制核心的高速数据采集电路 实现信号的采集转换，最后将数据串行地输入微机，由微机进一步处理得 到待测农药的荧光光谱。 最后介绍了一种新型仿生类算法- 蚁群算法的基本原理及其实现方 法。将它与导数荧光光谱结合，实现了对农药混合溶液中各组分浓度的同 时测定。 关键词光纤：荧光分析；荧光光谱；c c d ：a d 转换；蚁群算法 茎坐盔兰三堂堡主竺竺兰苎 a b s t r a c t w h e r e a st h ec o n v e n i e n c e ，h i g he f f i c i e n c ya n de c o n o m yo ft h ec h e m i c a l p e s t i c i d ec o n t r o lm e t h o d ，g r e a td e a l so fp e s t i c i d e s a r eu s e dt oc o n t r o lt h e h a r m f u ll i f e f o r mi na g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o n i no u rc o u n t r y , p e s t i c i d e sa r e w i d e l yu s e t h e r ea r e1 5 0t o1 6 0c a t e g o r i e so fc o m m o n l yu s e dp e s t i c i d e sa n d t h ed o s a g ei s8 0t o1 0 0t o n s av e r ys m a l la m o u n to f p e s t i c i d ew i l lr e m a i ni n t h ec r o p s e a t i n gt h ef o o d sw i t hr e s i d u ep e s t i c i d e sf o ral o n gt i m ew i l ls e r i o u s l y a f f e c th u m a n sh e a l t h , a n de v e nm a yb r i n gt h ep o t e n t i a lh a r mt ot h e d e s c e n d a n t s h e n c e ，i tb e c o m e se x t r a o r d i n a r i l yi m p o r t a n tt od e t e c tt h ep e s t i c i d e r e s i d u ea n di t sm e t a b o l i t ew i t hh i g hs e n s i t i v i t y a tp r e s e n t ，t h ec o m m o n l yu s e dp e s t i c i d er e s i d u ea n a l y s i sm e t h o d sh a v e t h ed i s a d v a n t a g e so ff u s s yp r e - t r e a t m e n tp r o c e s s ，r e a g e n tc o n s u m p t i o na n d t a k i n gt i m ee t c c o m p a r e dw i t ht h e m , f l u o r e s c e n c ea n a l y s i sm e t h o dh a sa l l a d v a n t a g eo f h i g hs e n s i t i v i t y , s t r o n gs e l e c t i v i t ya n ds i m p l e n e s s i ts h o w st m i q u e s u p e r i o r i t yi ne n v i r o n m e n t a ld e t e c t i n gf i e l d i nt h i sp a p e r , t h ef u n d a m e n t a lw a s d o n eo nu t i l i z i n gt h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r u md e t e c t i n gt e c h n o l o g y a n d o p t i c a l f i b e r s e n s o r t e c h n o l o g y t o d i r e c t l y d e t e c tr e s i d u e p e s t i c i d e i n v e g e t a b l e s t h ef u n d a m e n t a lp r i n t i r ，l eo ff l u o r e s c e n c ea n a l y s i sm e t h o da n dt h e f l u o r e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i co fs o m ec o m m o n l yu s e dp e s t i c i d e sa r ed i s c u s s e di n t h i sp a p e r s e v e r a lt y p i c a lp e s t i c i d e s f l u o r e s c e n c es p e c t r u m sw e r eg a i n e db y t h ee x p e r i m e n t t h eo p t i c a ls y s t e mf o rf l u o r e s c e n c ee x c i t i n g ，c o l l e c t i n ga n dt r a n s p o r t i n gi s d e s i g n e d o nt h eb a s i so ft h ef l u o r e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i co fp e s t i c i d e s p u l s e d - x e n o nl a m pi sa d o p t e da st h ee x c i t i n gl i g h t c c dr e c e i v e dt h ew e a k f l u o r e s c e n c es i g n a l s n l ec o r r e s p o n d i n gl o w - p a s sf i k e ra n da m p l i l y i n gc i r c u i t s w e r ea l s od e s i g n e d d a t aa c q u i s i t i o nc i r c u i t ，w h o s ec o r ei st h e s i n g l e c h i p ， h 垒! ! 坚! ! a c h i e v e dt h es i g n a lc o l l e c t i o na n dc o n v e r s i o n a n dt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f m e a s u r e dp e s t i c i d e sw i l lb ef i n a l l yg a i n e d an e wt y p eo fs w a r mi n t e l l i g e n c em i m i ca l g o r i t h m ，a n tc o l o n ya l g o r i t h m , w a si n t r o d u c e da tt h ee n d i ti sa c h i e v e db yc o n n e c t i n ga r l tc o l o n ya l g o r i t h m w i t ht h ed e r i v a t i v ef l u o r e s c e n c es p e c t r u mt om e n s u r a t et h ec o n c e n t r a t i o no f e a c hc o m p o n e n ti nt h es o l u t i o no f p e s t i c i d es i m u l t a n e o u s l y k e y w o r d sf i b e r , f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s ，f l u o r e s c e n c e s p e c t r u m , c c d ，a d c o n v e r s i o n , a n tc o l o n ya l g o r i t h m i i i 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1引言 化学农药是一类复杂的有机化合物，根据其化学组成及结构可以分为 有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机汞等多种类型。它是当 前农业生产用于防治病、虫、杂草对农作物危害不可缺少的物质，对促进 农业增产有极重要的作用。 随着农业科学技术的发展，化学农药的品种和数量不断增加，已成为 防治病虫害的主要手段。我国是农药使用的大国，每年常用农药约1 5 0 1 6 0 种，用量8 0 1 0 0 万吨左右，居世界首位。但是，农药是有毒的。农药被施 用到农作物上以后，绝大部分因多种原因而转化，但作物体内会残留极少 量的农药。长时间摄食含有残留农药的食品会严重影响人体的健康，甚至 会给后代人带来潜在的危害，这就是农药残留问题的由来 1 1 。 然而，鉴于化学农药防治方法的便捷、高效、经济，迄今在农业生产 控制有害生物的各项措施中，化学农药防治仍然占主要地位。预计在相当 长的时期内，仍需要用化学农药控制有害生物以发展农业生产。 近年来，农药污染问题经常发生，农药残留量超标相当严重，并逐年 加剧。欧盟、美国、日本、加拿大等西方发达国家或地区，出于维护本国 经济利益和保护人们健康的需要，相继对进口食品中农药残留量等卫生指 标提出了越来越严格的要求。中国已经加入世贸组织，农产品走出国门， 其农药残留量必须达到a 级( 国际w h o 标准) 或允许值范围。鉴于此，为 保障我国人民的身体健康、保证我国农业生产的可持续发展及满足进出口 贸易的需要，大力开展农药残留量检测技术的研究是非常必要的 2 1 。 农药的使用可追溯到公元前1 0 0 年。在古希腊，已有用硫磺熏蒸害虫 及防病的记录。中国也在公元前7 5 世纪用莽草、牡鞠、蜃炭灰等灭杀害 虫。但作为农药大规模发展的历史，大致可从2 0 世纪4 0 年代来划分：在 2 0 世纪4 0 年代以前，以天然药物及无机化合物农药为主的天然和无机药 1 燕山大学工学硕士学位论文 物时代；从2 0 世纪4 0 年代初期开始进入有机合成农药的时代。 农药有广义和狭义两种解释。广义的农药包括所有在农业使用的化学 品，例如，日本早期( 1 9 4 8 年) 公布的“农药管理法”就有这种解释，近年 来甚至把天敌生物商品也包括在内，称为“天敌农药”；英美至今仍有沿用 “农业化学品( a g r i c u l t u r a lc h e m i c a l s 或a g r o c h e m i c a l s ) ”这一名词的，事实 上也把化学肥料包括在内。狭义的农药一般是指用于防治农、林有害生物 ( 病、虫、草、鼠等) 的化学药剂，以及为改善其理化性状而用的辅助剂， 还包括植物生长调节剂口】。目前，在国际交流中，已统一使用农药( p e s t i c i d e ) 一词，其定义和包括的范围也大体趋于一致，即狭义解释的农药。 1 9 9 7 年，国务院颁布的“中华人民共和国农药管理条例”第一次对农 药给出了界定。所谓农药，一般是指用于预防、消灭或控制危害农业、林 业的病、虫、草、鼠害和其他有害生物( 含卫生害虫) 以及能够调节植物生 长或昆虫生长，从而使农业生产达到增产、促产作用的化学物质。在讨论 农药的污染问题时，主要是指化学农药【4 】。化学农药的主要危害是化学农 药在蔬菜作物上未完全降解的残留物对人畜的直接毒害。其中在使用的化 学药剂中，杀菌剂对人体危害较小，而杀虫荆的残留则是化学农药在蔬菜 中的主要危害。 按照农药的主要防治对象、作用方式、来源和化学结构可以将农药分 为图1 1 所示的不同类型【5 】。 由于农药是一类有毒的化学物质，而且是人们主动投放到环境中的， 长期大量的使用，将对环境生物安全和人体健康都将产生较大的不利影响。 在充分肯定农药有利作用的同时，如何充分认识农药对生态环境和人体健 康产生的危害及应该如何防止农药对环境的污染危害，是一个不容回避的 现实问题。 农药污染及其产生的危害后果是严重的，农药环境污染造成的损失是 多方面的。有些学者研究指出，在美国由于农药的使用，对环境和社会每 年造成经济损失达8 1 2 3 亿美元【6 】。 长期接触或食用含有农药的食品，可使农药在体内不断蓄积，对人体 健康构成潜在威胁。有机氯农药已被欧共体禁用3 0 年，而联邦德国一所大 2 第1 章绪论 学对法兰克福、慕尼黑等城市的2 6 2 名儿童进行检查，其中1 7 名新生儿体 内脂肪中含有聚氯联苯，含量高达1 6k g m g 脂肪。1 9 7 5 年美国研究机构 从各州任意挑选出1 5 0 所医院，采集乳汁样品1 4 3 6 份，经检测大多数都含 有狄氏剂、环氧七氯等。我国是世界农药生产和使用大国，且以使用杀虫 剂为主，致使不少地区土壤、水体及粮食、蔬菜、水果中农药的残留量大 大超过国家安全标准，对环境、生物及人体健康构成了严重威胁。1 9 8 3 年 我国哈尔滨市医疗部门对7 0 名3 0 岁以下的哺乳期妇女调查，发现她们的 乳汁中都含有微量的六六六和d d t 。 区垂巫匝面巫习匝磊囵 杀虫剂 杀螨剂 杀菌剂 杀线虫剂 植物生长剂 除草荆 杀鼠剂 触杀性农药 胃毒性农药 内吸性农药 熏蒸性农药 特异性农药 矿物源农药卜h 无机化合物 化学合成农药l 叫有机合成农药 生物源农药 有机磷化合物 拟除虫菊酯 氨基甲酸酯 有机硫化合物 有机金属化台物 酰胺类化台物 苯氧羧酸类 酚类化台物 杂环类化台物 脉类化合物 醚类化合物 酮类化台物 三氨苯类 二氨苯类 苯甲酸类 咪类化合物 香豆素类化台物 其他 图l - 1 农药的分类 f i g 1 1 p e s t i c i d es p e c i e s 农药在人体内不断积累，短时间内虽不会引起人体出现明显急性中毒 症状，但可产生慢性危害，如有机磷和氨基甲酸酯类农药可抑制胆碱酯酶 活性，破坏神经系统的正常功能。美国科学家已研究表明，d d t 能干扰人 体内激素的平衡，影响男性生育力。在加拿大e s t e v a n ，由于食用杀虫剂污 染的鱼类及猎物，致使儿童和婴儿表现出免疫缺陷症，他们的耳膜炎和脑 膜炎发病率是美国儿童的3 0 倍m 】。 农药的慢性危害虽不能直接危及人体生命，但可以降低人体免疫力， 3 ；一 燕山大学工学硕士学位论文 从而影响人体的健康，致使其它疾病的患病率及死亡率上升。国际癌症研 究机构根据动物实验确证，1 8 种广泛使用的农药具有明显的致癌性，还有 1 6 种显示潜在的致癌危险性。据估计，美国与农药有关的癌症患者数约占 全国癌症患者总数的1 0 。研究表明，内吸磷、二嗪哝、西维因有致癌作 用，杀虫脒对人有潜在的致癌威胁，对动物有致癌作用。杀草强、羟乙基 肼与灭草隆有致畸作用，滴滴涕、敌百虫、敌敌畏、乐果有致突变作用。 因此，对农药的合理使用以及对其进行有效的监测己成为保护国民健康的 关键问题。 1 _ 2 农药残留分析方法及国内外研究现状 农药给人类和环境带来的危害问题，早已被世人瞩目。1 9 6 2 年，美国 海洋生物学家莱切尔卡逊( r a c h e dc a r s o n ) 撰写了寂静的春天一书，初 步向人们揭示了农药污染对人类的影响和对环境的破坏，给人们敲晌了警 钟，唤醒人们对农药污染问题的重视。我国农业部也于1 9 7 4 年组织开展了 农药安全合理使用标准的试验研究工作。 由于农药品种多、化学结构和性质各异、待测组分复杂，尤其是近年 来，高效、低毒、低残留农药品种不断涌现，在农产品和环境中残留量很 低，给农药残留检测技术提出了更高的要求。这些促进了农药残留速测技 术的迅速开发，使农药残留检测技术朝着快速、方便、灵敏可靠的方向发 展，逐渐以农药残留专业检测机构的少量检测为中心，向现场检测及实验 室的大量检测辐射 9 , 1 0 l 。 2 0 世纪7 0 年代以来，国际上农药残留分析新技术的开发和应用非常 活跃，有些新技术逐步成熟，总的发展主要表现在以下几个方面： ( 1 ) 传统的理化分析手段不断采用物理科学上新的理论和成果，使理化 分析的灵敏度和选择性等大大提高。 ( 2 ) 生物技术与现代理化分析手段相结合不断开发出新的分析技术，发 展迅速，前景诱人。 r 3 ) 基础分析方法发生变化，传统的应用理化手段在实验室进行样品分 析将为二级测试方法所代替。即先应用简便、快捷的分析方法( 如免疫分析、 4 第1 章绪论 生物传感器等) 进行现场快速初级检测，然后对初级检测中呈阳性反应的样 品进行实验室确证，从而可大大减少分析工作量，提高分析效率【l “。 农药残留分析是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术，它要求精 细的微量操作手段、灵敏度高、特异性强。由于各类蔬菜食品样品组成成 分复杂，而且不同农药品种的理化性质存在较大差异，因而没有一种多组 分残留分析方法能够覆盖所有的农药品种。目前对农药残留分析的要求是 多残留分析、回收率高、重现性好、低检出限且操作简单易行。 近年来在农药残留分析领域所取得的重要进展或发展趋势主要是样品 提取和净化方法的简单化、微型化和自动化。国外很多国家，特别是经济 发达国家在这方面投入了大量的技术、资金和人力。农药残留测定之前， 要有适合于各种蔬菜食品和目标物化学性质的萃取、净化、浓缩等前处理 步骤，这些前处理过程在分析中起着决定的作用。农药残留分析大多采用 有机溶剂提取目标分析物，但是溶剂提取存在二次污染问题。近十年来， 操作简便、具有选择性萃取的新技术，高灵敏度的检测方法不断出现，如 超临界流体萃取( s f e ) 、固相萃取( s p e ) 、凝胶渗透色谱法( g p c ) 、吹扫蒸馏、 直接光谱分析、毛细管电泳( c e ) 、免疫分析技术( i a ) 、生物传感器、直接 光谱法等【l2 1 。随着人类对环境和食品质量的要求越来越高，对检测仪器的 灵敏度也提出了更高的要求。水样一般检测到lr t g & g 至1n g k g 级水平， 检测到1p g k g 水平也时有报道。作物、饲料、土壤及其它生物样品一般 在较低的1m g k g 和1i _ t g k g 。 农药残留速测技术可分为化学检测、生化检测和生物检测三大类。目 前这三大类中研究较多的有仪器分析法、免疫分析法、生物传感器法、活 体检测法、酶抑制法等。 1 2 1 仪器分析法 仪器分析法可保证数据的精确性和准确性，相对来说，其流程比较烦 琐。但在农药速测技术中，其地位仍是不可替代的。目前，一向比较烦琐 的样品前处理工作正在向省时、省力、廉价、减少对环境的污染、微型化 及自动化方向的发展。仪器分析法真正用于现场速测的较少，因为仪器投 5 燕山大学工学硕士学位论文 资大，对操作人员要求高，使该方法的应用受到了限制。 1 2 1 1 薄层色谱法( t l c ) 薄层色谱法是以固体吸附剂( 如硅胶、氧化铝 等1 为担体，水为固定相溶剂，流动相一般为有机溶剂所组合的分配型层析 分离分析方法。薄层色谱法不需要特殊设备和试剂，方法简单、快速、直 观、灵活，但是灵敏度不高。近年来，薄层色谱法较少使用，多把它作为 分离方法。 1 2 1 2 气相色谱法( o c ) 气相色谱法是一种经典的分析方法。它具有操 作简单、分析速度快、分离效能高、灵敏度高以及应用范围广等特点。使 用气相色谱法，多种农药可以一次进样，得到完全的分离、定性和定量测 定，再配置高性能的检测器如电子捕获器( e c d ) 、火焰光度检测器( f p d ) 和 氮磷检测器( n p d ) 等，使分析速度更快，结果更可靠。3 0 多年来，电子捕 获器( e c d ) - - 直是常用的检测器，特别适用于有机氯农药的检测，其检测 限可达1 0 。1 1g m l ，但是由于它对其他杂原子如卤素、氮、磷、硫等也有 很高的灵敏度，因此它的选择性并不是很好。氮磷检测器o 妤d ) 对氮和磷 具有良好的选择性，是测定有机磷和氨基甲酸酯等农药的常用检测器。但 因其技术含量高，操作程序相对复杂，且需要特定的实验条件和具有一定 专业技术人员进行操作，一般不适用现场检测。另外，沸点太高的物质或 热稳定性差的物质都难以应用气相色谱法进行分析 1 4 , 1 5 】。 1 2 1 3 高效液相色谱法( h p l c ) 高效液相色谱法是2 0 世纪7 0 年代急剧 发展起来的一项高效、快速的分析分离技术。它是以高压输出的液体为流 动相的一种新色谱技术，具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高和 应用范围广等特点。对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的农药原 则上都可用高效液相色谱法进行分离、分析。它与气相色谱法两者互相取 长补短，成为农药残毒检测的有效手段之一，特别适用于氨基甲酸酯类、 苯氧乙酸类农药的分析。该方法对乳品中速灭威、西维因、异丙威、呋喃 丹、涕灭威5 种农药分离效果好，最低检测限0 7 5 3 醒。 现在，一种热喷雾和粒子流式接口技术把l c 和m s 联接起来，成功 地用于分析那些对热不稳定、分子量较大而难以用g c m s 分析的化合物。 l c m s 具有良好的灵敏度和选择性、几乎通用的多残留检测能力、进行阳 6 第1 章绪论 性结果的在线确证及简化样品检测前净化过程等优点。但l c m s 使用的仪 器相对昂贵，而且与常规分析方法相比需要更高的专业技能培训【l 5 。1 ”。 1 2 ，1 4 超临界流体色谱法( s f c )超临界流体色谱法就是以超临界流体 作为流动相的色谱分析技术。它是由k l e s p e r 等于1 9 6 1 年首次提出的，8 0 年代以来得到迅速发展。其可在较低温度下分析分子量较大、对热不稳定 的化合物和极性较强的化合物，可与各种气相、液相色谱检测器匹配，还 可与质谱联用。它可以通过调节压力、温度、流动相等组成多重梯度，选 择最佳色谱条件。超临界流体色谱法综合利用了气相色谱法和高效液相色 谱法的优点，克服了气相色谱不适宜分析高沸点、低挥发性试样的缺点， 又比高效液相色谱有更快的分析速度和柱效率，成为一种强有力的分离和 检测手段u “。 w h e e l e r 等用超临界c 0 2 提取土壤中c 标记的立谷隆和敌草隆的时 间大大缩短，只需3 5 分钟，1 4 c 回收率达9 9 。l e h o t a y 等提出了在蔬菜 水果多残留分析的样品制备中应用h y d r o m a t r i x ( h n x ，一种小粒状硅藻 土) ，解决了超临界萃取要求样品的水分含量不能太高，以保证样品的均一 性、代表性和方法的准确度的问题。j o b l a s k a 和m u r u g a v e r l 等分别报道了 用毛细管s f c 测定有机氯及氨基酸酯类农药的残留，此方法为真正意义上 的自动化分离分析体系的建立提供了切实可行的技术基础。由于超临界流 体萃取需要一定的特殊设备，使目前广泛应用受到限制。 1 2 1 5 色谱一质谱联用色谱一质谱联用技术既发挥了色谱法的高分离 能力，又发挥了质谱法的高鉴别能力。这种技术适用于多组分混合物中未 知组分的定性鉴定。它不仅根据样品中待测组分在图谱上的保留时间，更 主要是根据在此保留时间内残留农药裂解的特征离子碎片，由质谱仪按其 分子量和分子结构对农药准确定性，并以此作为定量的根据，从而克服了 由于未净化掉的杂质峰与农药保留时间重叠而造成将杂质峰误判为农药的 缺点 1 9 】。 色谱一质谱联用的新进展主要是在毛细管气谱与离子阱质谱和串联质 谱联机方面，这进步提高了灵敏性和特异性，因此日益受到重视。现在， 几乎全部先进的质谱仪器都具有进行联用的气相色谱仪，并配有计算机f 化 7 燕山大学工学硕士学位论文 学工作站) 。但因一般样品中( 如蔬菜、水果、茶叶等) 的背景干扰较大，导 致样品预处理的周期较长，而且回收率较难保证。可见，随着农药残留限 量要求的进一步提高以及样品基质的影响，这种技术的应用会受到一定的 限制。色谱一质谱联用技术主要包括气相色谱一质谱联用( g c m s ) 和液相 色谱一质谱联用( l c m s 、。 ( 1 ) 气相色谱一质谱联用( g c m s ) 气相色谱仪是质谱法的理想“进样 器”，试样经色谱分离后以纯物质形式进入质谱仪，就可充分发挥质谱法的 特长。质谱仪是气相色谱法的理想“检测器”，色谱法所用的检测器都有其 局限性，而质谱仪能检出几乎全部化合物，灵敏度又高。由于g c m s 所 具有的独特优点，目前已得到广泛的应用。一般来说，凡能用气相色谱法 进行分析的样品，大部分都能用g c m s 进行定性及定量测定。 ( 2 ) 液相色谱一质谱联用( l c m s ) 对于高极性、热不稳定性、难挥发 的大分子有机化合物，使用g c m s 有困难。液相色谱的应用不受沸点的 限制，并能对热稳定性差的试样进行分离、分析，但其定性能力较弱。因 此液相色谱与质谱的联用，其意义是显而易见的。液相色谱一质谱联用对 分析技术和仪器的要求高，但它是一种很有利用价值的高效率、高可靠性 分析技术。 1 2 1 6 毛细管电泳法( c e ) 毛细管电泳法非常适用于那些难以用传统的 液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析。它操作简便，具有很大的灵 活性。许多分离参数，如缓冲液的组成和p h 值、毛细管的类型以及所使 用电场的波形等都是可以调节的【2 0 l 。k a m i a n s k y 等运用c z e ( 毛细管区带电 泳) 分离出了浓度为1 0 。9 m o l l 的季铵盐除草剂。b e n z 和g a r r i s o n 对烷基取 代芳酸盐除草剂进行衍生，结合m e c c ( 胶束电动色谱法) ，采用激光诱导 检测器进行c e 分离，进样4n l 时，检测限达到2 f g 。d i n e u i 等在测定自 来水中杀虫剂含量时，可做到定性分离o 1 1p g 的m e t s u l f u r o n 和 c h l o n s u l f u r o n 。 目前，毛细管电泳尚缺乏灵敏度很高的检测器，可利用的紫外检测器 能检测几个皮克0 9 ) ，但因样品量只用几个i l l 体积，故所用样品浓度限制 在m g l 或m l l 级【2 ”。因此，只有研究开发灵敏度更高的检测系统，毛 8 第l 章绪论 细管电泳法的优势才能充分发挥出来。 1 2 2 免疫分析法 近年来，免疫分析法用于农药残留快速检测的研究也十分活跃。免疫 分析法是将抗体抗原反应与现代测试手段相结合的超微量分析法。它集测 定的高灵敏度和抗性反应的强特异性于一体，在某些重要生物活性物质的 痕量检测方面取得了很大成就。免疫分析法具有操作简单、快速、灵敏度 高、特异性强、检测费用低等优点，只需要很少的仪器设备和专业培训， 是初筛测定致癌物和一些剧毒农药的好方法，其灵敏度与常规的仪器分析 一致，且适合现场筛选。但它的开发过程需要投入较多资金、较长时间、 抗体制备难度较大、抗体有特异性只适用于单一农药残留量的检测分析。 若开发成试剂盒，可广泛用于现场样品和大量样品的快速检测。对于大分 子量的极性物质，如生物农药苏云金杆菌毒素蛋白等，免疫分析比常规生 物测定和理化分析更具有准确可靠、方便快捷的优点 2 2 , 2 3 。 1 2 2 1 酶免疫法( e l a ) 酶免疫法是用酶标记抗原、半抗原或抗体而建立 的方法。e i a 在农药分析中的应用日益增多，近年来，国内外已经开发出 4 0 多种常见农药的e i a 方法，其中用于田间快速筛选的e i a 试剂盒己商 品化。欧、美、日、巴西、印度等1 0 多个国家运用这一技术开展了对农产 品中有毒物质残留的监测研究。最近，英国研制的通用型有机磷杀虫剂免 疫检测药盒可对8 种以上有机磷农药进行同时检测【2 4 - 2 6 。在农药残留分析 中，使用最多的是酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) ，k u a n f m a n 等先后综述了 e i a 在农药分析中的研究和应用概况。g o h k 等用酶联免疫法测定土壤中的 西玛津和莠去津，检出度为1 5i _ t g k g 。 酶免疫法具有特异性强、灵敏度高、方便快速、分析容量大、分析成 本低、安全可靠等优点。但它也有其局限性和不足之处，如开发需要投入 较多的资金和时间，得到一个好的抗原并不容易，对试剂的选择性高，很 难同时分离多种成分，对结构类似的化合物有一定的交叉反应等。 1 2 2 2 放射免疫法( r t a ) 放射免疫法是将抗血清与待测农药在试管中， 培养一定的时间后，加入同位素标记的待测农药，该同位索标记农药即和 9 燕山大学工学硕士学位论文 待测农药竞争与抗体发生反应，采用适应的方法将被抗体结合的和未被抗 体结合的标记农药分离，未被抗体结合放射性标记农药留在溶液中。 1 2 2 3 荧光免疫法( f i a ) 荧光免疫法是将抗血清、待测农药、荧光标记 的待测农药混合在聚苯乙烯管中，经培育后加入了球蛋白和分子量6 0 0 0 的聚乙二醇，使与之结合的待测农药和荧光标记的农药留在上清液中。当 抗血清与荧光标记农药的量一定时，含待测农药多的试管中，抗体结合的 荧光标记农药就少，上清液中游离的荧光标记的农药就多。即待测物含量 与游离的荧光标记物含量成正比，测定上清液的荧光强度，就可算出待测 物的含量。 1 2 2 4 流动注射免疫分析法( f i i a ) 流动注射免疫分析法是农药残留分 析中较为先进的技术。它是由免疫分析与流动系统相结合而形成的，抗农 药的抗体固定在可更换柱芯的膜上。但流动注射免疫分析法的不足之处是 变异系数大，需要一次性装膜的柱，抗体和酶标记的半抗原使用量大，一 次只能检测一个样品，然而它仍是农药残留检测的有效方法 2 7 1 。 1 2 3 生物传感器法 生物传感器法( b i o s e n s o r ) 是将传感技术与农药免疫技术相结合而建立 起来的，可以说它是免疫分析技术的一种延伸或分支。生物传感器法是目 前农药残留分析技术研究热点，在测定方法多样化、提高测量灵敏度、缩 短反应时间、提高仪器自动化程度和适应现场检测能力等方面已取得了长 足进步。利用农药对靶标酶活性的抑制作用研制的酶传感器和利用农药与 特异性抗体结合反应研制的免疫传感器都可用于对相应农药残留进行快 速、定性和定量检测。生物传感器法是由一种生物敏感部与转换器紧密配 合的分析装置，这种生物敏感部件对特定化学物质或生物活性物质具有可 逆响应，通过测定p h 、电导等物理化学信号的变化，即可测定农药残留量。 n g e h - n g w a i n b i 等晟早研制成功了对硫磷的生物传感器，以后又有人制成 了光导纤维免疫传感器，利用荧光标记抗体产生的反应，对对硫磷在溶液 中含量进行了分析测定。微型化的免疫传感器对分析样品的用量少、响应 速度快，甚至可插入生物组织或细胞内实现超微量在线快速跟踪分析。 1 0 第1 章绪论 生物传感器相对于酶免疫吸附测定法的优点是简单、快速且减少了样 品的前处理。目前，生物传感器存在的主要问题是分析结果的稳定性差、 重现性差、使用寿命短和使用成本高。但是，生物传感器的作用，特别是 现场测试方面将扩大使用的趋势是不容置疑的。 1 2 4 活体检测法 活体检测法是使用活的生物直接测定。如农药与细菌作用后可影响细 菌的发光程度，通过细菌发光情况，则可测出农药残留量。但该法只对少 数药剂有反应，无法辨别残留农药的种类，准确性较低。使用家蝇检测蔬 菜中的农药残留，过程简单，无需复杂仪器，农户便可自行检测，缺点是 检测时间较长，仅适用于田间未采收的蔬菜。 1 2 5 酶抑制法 酶抑制法是相对成熟的一种对部分农药进行残留速测技术。它适用于 有机磷与氨基甲酸酯类农药。根据有机磷与氨基甲酸酯类农药可特异性地 抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 的活性，破坏神经的 正常传导，使昆虫中毒致死这一毒力学原理，将乙酰胆碱酯酶与样品反应， 根据乙酰胆碱酯酶活性受到抑制的情况，可判断出样品中是否含有有机磷 与氨基甲酸酯类农药。酶抑制法广泛应用对现场检测成效显著，成为仪器 分析法的有效补充，但仪器的功能和酶的性能还需要改进。酶抑制法操作 简便、易行、成本低、前期投入少，但只能对有机磷与氨基甲酸酯类农药 进行测定，且不能给出准确的定性定量结果，而只能作为田间生产检8 , , j j s p n 市场初级检测。 近年来，薄层一酶抑制法技术( t l c e 1 ) 综合了薄层分析和酶抑制技术 的优点，灵敏度高，适应性广泛。对某些用化学显色法检不出或不易检出 的农药亦可灵敏检出，是一种很有发展前途而又实用的残留量测定技术。 1 2 6 紫外一可见分光光度法 有机化合物的紫外一可见吸收光谱是由分子中价电子的跃迁产生的， 1 1 燕山大学工学硕士学位论文 因此也称为电子光谱。紫外一可见分光光度法就是利用物质的电子光谱进 行分析的。当紫外一可见光照射吸光分子时，分子中的价电子从低能级分 子轨道跃迁到高能级分子轨道，使照射光的强度减弱。吸光分子对照射光 的吸收程度称为吸光度。吸光度与吸光物质浓度的关系服从l a m b e r t b e e r 定律。 紫外一可见分光光度法灵敏度高，一般可测定u g 量级或浓度为 1 0 - 4 1 0 4m o l l 的物质，在某些条件下，可以测定浓度为1 0 。7m o l l 甚至n g 量级的物质。另外，该方法的选择性也较好，一般可在多种组分共存的溶 液中不经分离而测定某种欲测定的组分。因此，紫外一可见分光光度法广 泛用于痕量组分、超痕量组分、常量组分的测定以及混合物中多组分的同 时测定。随着有机试剂的开发，只要经过适当的化学处理，绝大多数元素 都可以用分光光度法进行定量测定。 我国的农药残留分析技术始于2 0 世纪8 0 年代，那时的农药残留分析 技术方法仅限于化学法、比色法和生物测定法，检测方法单一，灵敏度也 不高。随着科学的进步，我国的技术人员逐渐掌握了上述多种农药残留分 析新技术，并在实践中不断完善口8 1 。 在有机氯农药残留检测方面，采用t l c 法测定粮食蔬菜中有机氯农药 残留量，六六六的最低检测限为o 0 2u g ，d d t 为o 0 6 斗g 。采用微量化学 法处理样品，g c e c d 测定蔬菜酱中有机氯残留，方法回收率为 8 0 0 一9 2 5 ，r s d r 的时刻衰变。 粒子数容易增加的电子激发态，处于该电子态的粒子数也将是容易衰 减的。荧光分子的平均寿命与跃迁的许可性两者问的关系如下： f 1 0 。6 , 。 ( 2 - 3 ) 式中g 。为最大吸收波长下的摩尔吸光系数。 如果s o s l 是许可跃迁，一般情况下，s 。值约为1 0 3m 2 m o l ，因而 荧光分子的平均寿命大致为10 s 。 没有非辐射去活化过程存在时，荧光分子的寿命称为内在的寿命，用“ 表示： = l _ j ，( 2 4 ) 荧光强度的衰减遵从如下公式： l n l o l i l = 一f f( 2 - 5 ) 式中：j 。为仁o 时的荧光强度：j 。为f 时的荧光强度。 通过实验测量不同时刻r 所对应的，值，并做出h l r 的关系曲线， 其结果为一条直线，由该直线的斜率可求得荧光寿命的数值。利用荧光分 子寿命的差别可以进行荧光物质混合物的分析。 2 4 2 荧光效率 荧光效率一般用荧光量子产率表示，有时也用荧光的能量产率或荧光 量子效率表示。 荧光量子产率( 耳) 定义为荧光物质吸收光后所发射的荧光的光予数与 所吸收的激发光的光子数的比值。由于激发分子的去活化过程包括辐射跃 迁和非辐射跃迁，因而荧光量子产率还可表示为 七， 耳2 南( 2 - 6 ) 式中：女，为荧光发射的速率常数；k 为各种单分子的非辐射去活化过 程的速率常数的总和。 2 6 第2 章荧光测量的基本理论 假如非辐射跃迁的速率远小于辐射跃迁的速率，即k o o s a 时，荧光强度不再增加，因为荧光物质发射荧光必须先吸 收能量。测定某一荧光物质时，占及，是确定的，c 增大时，1 0 一“变小。当 c 很小时，荧光强度，随溶液浓度c 的增加而增大，二者成线性关系：当 浓度继续增大，1 0 刊趋近于零，则式( 2 9 ) 变成，= 耳。a ，此时荧光强度 与溶液浓度无关。荧光物质浓度增大到某一限度后，溶液浓度再增大荧光 强度也不再增加吲。 2 5 2 环境因素对荧光的影响 2 5 2 1 溶剂的影响同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位 置和强度都会有显著的差别。因此进行荧光分析实验时，需选择合适的溶 2 8 孕 学。 第2 章荧光测量的基本理论 剂，且要求溶剂达到足够的纯度，以避免溶剂中杂质对被测试样荧光光谱 的影响。 溶剂的影响可分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应。一般的溶剂效 应是普遍存在的，指溶剂的折射率和介电常数的影响；特殊的溶剂效应取 决于溶剂和荧光物质的化学结构，指荧光物质和溶剂分子的特殊化学作用， 如溶剂和荧光物质形成了化合物或溶剂使荧光物质的电离状态发生了改 变。特殊的溶剂效应所引起的荧光光谱移动值往往大于一般的溶剂效应所 引起的移动值。 2 5 2 2 温度的影响温度对分子的扩散、活化、分子内部能量转化以及 对于溶液中各种平衡均有一定的影响。通常，随着温度的降低，荧光物质 溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大。 溶液的荧光强度随温度的上升而下降的主要原因是分子的内部能量转 化作用。多原子分子的基态和激发态的位能曲线可能相交或相切于一点， 其内部能量转化的位能曲线如图2 3 所示。当激发态分子接受到额外热能 而沿激发态位能曲线a c 移动至交点c 时，则转换至基态的位能曲线n c ， 使激发能转换为基态的振动能量，随后又通过振动松弛而丧失振动能量。 溶液的荧光强度和温度的关系曲线可用下列方程表示 ff 半= r e e ”1( 2 - 1 2 ) ， 式中五为激发分子转移至基态曲线时所必须得到的额外热能。 激发热能e 值大小相当于图2 3 中a 至c 的高度，实验求得的e 值通 常为4 7 千卡摩尔，约为由分子的红外光谱所求得的振动能量的两倍。 当溶液中没有猝灭剂时，由式( 2 6 ) 可知，荧光量子产率大小与辐射过 程及非辐射过程的相对速率有关。辐射过程的速率不随温度而变，因此荧 光量子产率的变化反映了非辐射过程速率的改变。随着溶液温度的降低， 介质的粘度增大，从而使荧光物质分子与溶剂分子的碰撞猝灭机会减小。 当溶液中有猝火剂时，若荧光猝灭作用是由于荧光物质分子和猝灭剂 分子之间的碰撞引起的，则荧光强度将随温度升高而降低；若荧光猝灭作 用是由于荧光物质分子与猝灭剂分子组成化合物引起的，则荧光强度将随 2 9 燕山大学工学硕士学位论文 温度升高而增强。 船 疆 图2 - 3内部能量转换的位能曲线 f i g 2 - 3 p o t e n t i a le n e r g yc u l v go fi n t e r n a le n e r g yc o n v e r s i o n 2 5 2 3 p h 的影响大多数芳香族化合物都具有酸或碱的功能团，因此它 们对p h 值的变化非常敏感。当荧光物质具有弱酸或弱碱性时，溶液的p h 值改变将对荧光光谱和荧光强度产生很大的影响，可用来提高荧光分析法 的选择性。 由于弱酸或弱碱分子和它们的离子在电子构型上有所不同，对于荧光 性质而言可视为不同的型体，各自具有自己特殊的荧光量子产率和荧光光 谱，它们的荧光强度呈现显著的差异。对于金属离子与有机试剂形成的荧 光络合物，溶液p h 值的改变将会影响到该发光络合物的稳定性和组成， 从而影响到它们的荧光性质。 2 5 2 4 氢键的影响荧光物质和溶剂或其他溶质之间发生的氢键有两种 情况：一种是在激发之前基态的荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子产生 氢键配合物，此时吸收光谱和荧光光谱都受氢键的影响；另一种是在激发 之后由激发态的荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子产生激发态的氢键配 合物，此时只有荧光光谱受氧键的影响。 2 5 2 5 重原子效应纯粹的单重态(