（农产品加工及贮藏工程专业论文）菜籽肽制备及其抗氧化活性的研究.pdf

菜籽肽制备及其抗氧化活性的研究 摘要 油菜是我国重要的油料作物之一，菜籽粕中含有菜籽蛋白，我国现在多将其用于 饲料和肥料，这造成了一定的资源浪费，因此加强对其的升值加工研究是一项有重要 意义的工作。 本文以脱脂菜籽粕为原料制备菜籽清蛋白，再用碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶对菜籽 清蛋白进行分步水解制备菜籽肽粗品，试验获得了较好的菜籽清蛋白提取条件，并优 化得到了较好的分步水解制备菜籽肽粗品的条件，同时对菜籽肽粗品的抗氧化活性进 行了研究。试验获得的主要结论如下： ( 1 ) 菜籽清蛋白的制备：取1 0 0 9 脱壳脱脂干燥菜籽粕于2 l 的烧杯中，加入1 0 0 0 m l 蒸馏水，4 0 下搅拌浸提l h ，6 0 0 0r p m 、4 。c 离心2 0m i n ，过滤上清液得到沉淀，按 上述步骤再进行相同的浸提操作3 次。合并4 次所得的上清液，用1m o l l h c i 沉淀 上清液，调p h 至4 0 后6 0 0 0r p m 、4 。c 离心1 0m i n 获得沉淀，将沉淀置于蒸馏水中 透析2 4 h ，并在第8 h 、1 6 h 分别更换蒸馏水，然后真空冷冻干燥即可得到蛋白质含量 达8 2 0 5 的清蛋白。 ( 2 ) 菜籽清蛋白主要功能性质如下：吸水性3 2 6 8 8 ，吸油性为4 3 0 m l 油儋清蛋 白，起泡性为6 6 0 0 ，乳化性及乳化稳定性分别为2 9 8 0 和3 5 5 3 。 ( 3 ) 本文选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对菜籽清蛋白进行分步水解研究，在单因素 试验的基础上，结合正交试验得到双酶水解的最佳条件为：取底物浓度3 5 的清蛋 白，先用碱性蛋白酶4 0 0 0 u g 于温度5 5 。c ，p h 8 0 的条件下，水解3 h ，再加入木瓜蛋 白酶3 0 0 0 u g ，在5 0 ，p h 5 5 的条件下水解3 h ，水解度可达到4 0 1 7 。 ( 4 ) 菜籽肽粗品具有较强的还原能力，其还原能力随其浓度的增加而增强。菜籽肽 粗品具有清除超氧阴离子和抑制羟自由基的作用，其对超氧阴离子的的i c 5 0 值为6 6 0 m g m l ，其抗氧化作用均随菜籽肽粗品浓度的增加而增强，并呈现一定的量效关系。 通过灌胃小鼠菜籽肽粗品1 0 0 、2 0 0 、4 0 0m g k g d4 0 天，结果显示可以提高小鼠抗 氧化能力，使小鼠肝和肾中的超氧化物歧化酶( s o d ) 活性提高，丙二醛( m d a ) 含量 显著减少。 关键词：菜籽清蛋白；菜籽肽粗品；碱性蛋白酶；木瓜蛋白酶；抗氧化。 s t u d i e so np r e p a r a t i o na n da n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so f r a p e s e e dp e p t i d e s a b s t r a c t r a p e s e e di sak i n do fi m p o r t a n to i lp l a n t si nc h i n a r a p e s e e dm e a lw h i c hi s o n l yu s e df o ra n i m a lf e e da n df e r t i l i z e r ，t h u sl e a d i n gt ot h ew a s t eo fr e s o u r c e s t h e r e f o r e ，i t ss i g n i f i c a n tt ow o r ko nt h ev a l u e a d d e dp r o c e s so fr a p e s e e dm e a l 。 d e f a a e dm e a lo fd o u b l e z e r or a p e s e e dw a su s e da sm a t e r i a li n t h i ss t u d y r a p e s e e d a l b u m i nw a se x t r a c t e df r o mr a p e s e e dm e a l t h ep a r a m e t e r so fs t e pe n z y m i ch y d r o l y s i s o fa l c a l a s ea n dp a p a i nw e r es t u d i e da n do p t i m i z e db ys i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t sa n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fp a p e s e e dp e p t i d e sw a sa l s os t u d i e d t h em a i nc o n c l u s i o n so ft h ee x p e r i m e n t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) p r e p a r a t i o no fr a p e s e e da l b u m i n ：f r o m10 0 9d r yd e f a t t e dr a p e s e e dm e a li n 2 lb e a k e r a n dt h e na d d10 0 0 m ld i s t i l l e dw a t e ra t4 0 u n d e rt h ec o n d i t i o n so f e x t r a c t i o nlh ，t h e n6 0 0 0 r p m ，4 cc e n t r i f u g e2 0 m i n ，f i l t e rt h es u p e r n a t a n tt ob e p r e c i p i t a t e d ，b y t h ea b o v es t e p s e x t r a c t i n g 3t i m e s r e p e t i t i o n s m e r g e r t h e s u p e r n a t a n tl i q u i do ff o u rt i m e s ，u s i n glm o l l h c lf o rr a p e s e e da l b u m i nd e p o s i t i o n ， t h ep ha d j u s t e dt o4 0 ，t h e n6 0 0 0 r p m ，4 c c e n t r i f u g e10r a i n ，g o tt h es e d i m e n t ， p l a c e di ti nd i s t i l l e dw a t e ri nd i a l y s i s2 4 h ，a n di nt h e8 h ，16 h ，r e p l a c et h ed i s t i l l e d w a t e r ，a n dt h e nv a c u u mf r e e z e d r y i n gt ob ea l b u m i n ( 2 ) r a p e s e e da l b u m i nt h em a i nf u n c t i o nc h a r a c t e r sa r ea sf o l l o w s ：3 2 6 8 8 f o r t h ea b s o r b e n t ，o i la b s o r p t i o nf o r4 3 0 m lo i l ga l b u m i n ，6 6 0 0 f o rf o a m i n g ， e m u l s i f y i n ga n de m u l s i o ns t a b i l i t yw e r e2 9 8 0 a n d3 5 5 3 ( 3 ) i nt h i sp a p e r , a l c a l a s ea n dp a p a i nw e r es e l e c t e dt oh a v eas t e ps t u d yo f e n z y m a t i ch y d r o l y s i so nr a p e s e e da l b u m i n b a s e do nt h es i n g l e f a c t o r ，t h e nt h r o u g h o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h eb e s tc o n d i t i o n so fd u a l e n z y m a t i ch y d r o l y s i sw e r eg o ta s f o l l o w s ：r a p e s e e da l b u m i no f3 5 c o n c e n t r a t i o nw a sh y d r o l y z e db y4 0 0 0 u go f a l c a l a s ea t8 0o fp hv a l u ea n d5 5 f o r3 h a n dt h e nb y3 0 0 0 u go fp a p a i na t5 5 o fp hv a l u ea n d5 0 cf o r3h t h ed e g r e eo fh y d r o l y s a t ei s4 0 17 ( 4 ) r a p e s e e dp e p t i d eh a das t r o n gd e o x i d i z ea b i l i t y t h ed e o x i d i z ea b i l i t y i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o ns h o w e dt h a t r a p e s e e dp e p t i d e s a n t i o x i d a n ta b i l i t yi n c r e a s e sw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no ft h ei n c r e a s e r a p e s e e d p e p t i d eh a sac l e a ri n h i b i t i o no fs u p e r o x i d ea n i o na n dar o l eo fr e s t r a i n i n ga c t i o no i l h y d r o x y lr a d i c a l s ，a n ds h o w e dac e r t a i nd e g r e eo fd o s e e f f e c tr e l a t i o n s h i p ，a n di t s a n t i o x i d a t i o nw e r ei n c r e a s e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d ，a n dt h e i r s u p e r o x i d ea n i o ni c 5 0v a l u ew a s6 6 0 m g m l r a p e s e e dp e p t i d e st h r o u g hg a v a g e f o r4 0d a y s ，t e s t sh a v es h o w nt oi m p r o v ea n t i o x i d a n tc a p a c i t yo fm i c et om o u s e l i v e ra n dk i d n e ye n h a n c et h ea c t i v i t yo fs o d ，w h i l em d ac o n t e n ti nm i c e s i g n i f i c a n t l yr e d u c e d k e yw o r d s ：r a p e s e e da l b u m i n ；r a p e s e e dp e p t i d e ；a l c a l a s e ；p a p a i n ；a n t i o x i d a n t 插图清单 图2 1 单宁标准曲线1 1 图2 2 磷标准曲线1 2 图2 3 硫甙标准曲线1 3 图2 4 提取时间对蛋白质含量的影响1 5 图2 5 料液比对蛋白质含量的影响，1 5 图2 6 提取次数对蛋白质含量的影响1 6 图2 7 菜籽清蛋白氨基酸分析图谱1 8 图3 1 酪氨酸标准溶液曲线2 3 图3 2 温度对碱性蛋白酶水解的影响2 7 图3 3p h 对碱性蛋白酶水解的影响一2 7 图3 4 酶用量对碱性蛋白酶水解的影响2 8 图3 5 底物浓度对碱性蛋白酶水解的影响2 8 图3 6 水解时间对碱性蛋白酶水解的影响2 9 图3 7 温度对木瓜蛋白酶水解的影响3 1 图3 8p h 对木瓜蛋白酶水解的影响3 l 图3 9 酶用量木瓜蛋白酶水解的影响3 2 图3 1 0 水解时间对木瓜蛋白酶水解的影响3 2 图3 1 1 菜籽肽粗品氨基酸分析图谱3 4 图4 1 不同浓度菜籽肽粗品对超氧自由基的清除作用4 0 表格清单 表1 1 双低菜籽粕和普通菜籽粕的部分组分含量1 表2 1 菜籽清蛋白提取正交试验因素水平表1 6 表2 2 菜籽清蛋白提取正交试验结果1 7 表2 3 菜籽清蛋白成分1 8 表2 4 菜籽清蛋白的氨基酸组成1 9 表2 5 菜籽清蛋白的功能性质一1 9 表3 1 碱性蛋白酶水解菜籽清蛋白正交试验的因素水平表。2 9 表3 2 碱性蛋白酶水解菜籽清蛋白正交试验结果3 0 表3 3 木瓜蛋白酶水解菜籽清蛋白正交试验结果3 3 表3 4 木瓜蛋白酶水解菜籽清蛋白正交试验方差分析表一3 0 表3 5 菜籽肽粗品成分3 4 表3 6 菜籽肽粗品的氨基酸组成3 5 表4 1 不同浓度菜籽肽的还原能力3 9 表4 2 不同浓度菜籽肽对羟自由基的清除作用4 0 表4 3 对小鼠s o d 活性的影响4 1 表4 4 对小鼠m d a 含量的影响4 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得 金b 墨工些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签字： 袅填缘 签字目期：冲年轳月加日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盒目巴工业太堂 有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权 金b 巴王业太堂可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名： 毳嘎缘 签字日期：砂7 7 年午月幻目 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名 签字日期哆。产细 f 电话： 邮编： 致谢 即将完成硕士阶段学业之际，回首过去的每一点成长、每一次进步、每一份收获， 感慨颇多。 本课题的研究和论文的完成是在我的导师姜绍通教授的悉心指导下进行 的。从论文的选题到试验方案的制定、论文的完稿，都得到了姜老师无微不至的关怀 和帮助。姜老师严谨求实的治学作风、对科学的执着追求以及对人生的深刻理解，都 使我受益匪浅。本论文凝集了姜老师的大量心血，在此向姜老师致以最诚挚的谢意和 最崇高的敬意! 在试验过程中，感谢潘丽军教授、郑志副教授、孙汉巨副教授、罗水忠老 师、雷红老师、操丽丽老师、韩卓老师给了我很多指导和帮助。此外潘牧博士、 吴学风博士、罗蕾蕾、蒋连平、章炳谊以及本科生江敏等在试验过程中给予了我 不少启发和协助，向他们表示感谢。同时感谢实验室的张丽、张福建、刘模、胡燕红、 蔡静、罗炳华、冯丽桦、刘靖、桂蕾同学，三年共同的学习生活，使我从他们身上学 到了许多。衷心的感谢他们! 最后感谢我的家人，是他们在生活和精神上给予了我巨大支持和鼓励，他们浓浓 的亲情和殷切的期盼是我学习的强大动力和人生奋斗的源泉! 三年的研究生生活是我人生宝贵的财富，再次感谢所有关心和帮助我的老师、家 人、同学及朋友们! 聂慎德 2 0 0 9 年4 月1 5 日 第一章前言 油菜是重要的油料作物之一，我国油菜产量居世界第一位。安徽省是我 国双低油菜集中优势产区，油菜种植面积和总产量均居全国前列，双低优质油 菜品种比重己达到8 0 以上，常年产量在17 0 万吨以上【z j 。一般情况下，油菜籽 经加工可得约3 5 菜籽油和6 5 左右菜籽粕1 3 l 。菜籽粕的粗蛋白含量般在3 5 4 5 e 4 1 ，为优质的全价植物蛋白【5 1 ，对其进行开发利用具有重要的经济意义与 社会意义。 1 1 菜籽粕、菜籽蛋白及菜籽清蛋白 1 1 1 菜籽粕 双低油菜籽富含油脂，且芥酸、硫甙( 硫代葡萄糖甙) 含量低【6 】。菜籽粕 作为菜籽油加工的主要副产品，我国每年产量近1 0 0 0 万吨l ，j 。 菜籽粕中富含粗蛋白质、粗脂肪、卵磷脂、多种维生素、氨基酸等，其蛋 白质中可消化蛋白质含量可达2 7 8 1 8 1 。此外，菜籽粕中还含有较高胆碱、生 物素、叶酸、烟酸及硫胺素、核黄素等b 族维生素和c a 、p 、f e 、s e 、c u 、z n 、 m n 等多种微量元素【9 】，但是，目前我国对菜籽粕的利用相当有限，仅用作肥料 或按少量比例添加到反刍动物和淡水鱼类的养殖饲料中【l0 。，这造成了一定资源 浪费。 双低菜籽粕和普通菜籽粕的营养成分见表1 1 【1 l 】。双低菜籽粕与普通菜籽粕 相比，干物质、粗蛋白质和钙含量略有提高，而粗脂肪、粗纤维、粗灰分和磷 等常规营养成分的含量稍有下降，但均无明显的差异。双低菜籽粕的s e 和c u 的 含量明显高于普通菜籽粕，其中s e 含量是普通菜籽粕的7 倍；而f e 、z n 和m n 的 含量均低于普通菜籽粕，其中，f e 含量仅为普通菜籽粕的2 0 左右。双低菜籽 粕的组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和色氨 酸含量均高于普通菜籽粕，其中，赖氨酸和蛋氨酸含量分别提高了4 8 4 6 和 1 2 7 0 ，而其他氨基酸含量低于普通菜籽粕。 表1 1 双低菜籽粕和普通菜籽粕的部分组分含量 t a b1 1c o n t e n t so ft h en u t r i e n ti n g r e d i e n t si nd o u b l e l o wr a p e s e e dm e a la n dc o m m o n r a p e s e e dm e a l 项目双低菜籽粕普通菜籽粕 干物质 粗蛋白质 粗脂肪 粗纤维 粗灰分 钙 8 8 7 3 4 0 0 7 1 2 3 1 0 6 6 6 6 3 0 6 8 1 8 8 0 0 3 8 6 0 1 4 0 1 1 8 0 7 3 0 o 6 5 总磷o 9 81 0 2 总能j g 1 17 3 8 6 0 018 3 2 4 0 0 c u m g k g 一 2 0 2 37 1 0 f e m g k g 一 1 3 5 5 66 5 3 0 0 z n m g k g 叫 6 1 5 3 6 7 5 0 mnmgkg4642 8 2 2 0 i m g k g 1 4 4 一 s e m g k g 。1 1 1 2 0 1 6 精氨酸 1 6 8 1 8 3 组氨酸0960 8 6 异亮氨酸 1 3 1 1 2 9 亮氨酸 2 4 9 2 3 4 赖氨酸 1 9 3 1 3 0 蛋氨酸 o 7 10 6 3 胱氨酸0 4 20 8 7 苯丙氨酸 1 6 l1 4 5 酪氨酸o 7 60 9 7 苏氨酸 1 5 3 1 4 9 色氨酸0 4 5o 4 3 缬氨酸 1 7 l1 7 4 1 1 2 菜籽蛋白 植物蛋白质是食品的重要组成部分，是人们所需营养的主要来源，菜籽粕 作为油脂加工的主要副产品，是一种重要的植物蛋白质来源。菜籽蛋白氨基酸 组成合理，接近联合国粮农组织( w h o ) 和世界卫生组织( f a o ) 推荐的氨基 酸组成模式【1 2 】，但高温榨油工艺会造成蛋白质变性，另外，从菜籽粕中分离得 到的菜籽粗蛋白或多或少存在一些抗营养因子，使其开发利用受到一定限制， 很多菜籽粕只用作廉价的饲用蛋白【13 1 。如何有效利用菜籽蛋白正日益受到人们 的重视。 菜籽蛋白具有多方面功能特性，如吸水性、吸油性、乳化性及乳化稳定性， 这使之在许多食品领域都有广泛的应用1 | 4 - 17 l ： 在肉制品中的应用：菜籽蛋白可作为脂肪替代物、增味剂、乳化剂和组织 改良剂，用于火腿肠或传统香肠、午餐肉和肉脯的生产。利用菜籽蛋白的乳化 稳定性和保持水分的功能特点，可减少制品在加工过程中水分的损失和脂肪的 溢出，使口味、品质和得率提高，而生产肉丸则利用其特殊结构质地能赋予制 品咀嚼感，减少蒸煮损失，降低脂肪含量，增加弹性，延长产品货架期。 在蛋白饮料中的应用：将菜籽蛋白与花生蛋白液混合( 4 ：1 ) ，再加入糖、牛 2 乳、复合乳化剂、矿物质、维生素和香料等物质，经高压均质后可制成具有优 良乳化稳定性的营养饮料。 在面食中的应用：将菜籽蛋白添加到小麦面粉中可提高质量，使氨基酸平 衡互补，提高面粉营养价值，还可添加到快餐食品、面包中，提高面食质量。 在蛋糕中添加磷酸化改性菜籽蛋白，可使蛋糕膨松香软，并延长保质期。 作为保鲜剂应用：菜籽蛋白特别是改性菜籽蛋白具有良好的成膜性，添加 适量的助剂( 如甘油) ，在一定条件下，可制成具有良好隔绝氧能力和抵抗水分 迁徙性能的安全无毒的天然食用保鲜膜。此类膜可广泛地应用于糕点、水果、 蔬菜、肉制品的保鲜及应用于糖果制造和医药领域。 其它应用：菜籽蛋白可替代大豆粉生产酱油。在乳制品方面，菜籽蛋白可 作为添加剂或生产类似乳制品的替代物，增加植物蛋白含量，提高营养价值， 降低生产成本。 1 1 3 菜籽清蛋白 蛋白质有多种分类方法，按照溶解度分类l l 引，可以分为清蛋白、球蛋白、 谷蛋白、谷醇溶蛋白、组蛋白和硬蛋白等。 菜籽蛋白根据蛋白质溶解度分类法可分为四类：首先用蒸馏水提取菜籽粕 中的蛋白质所得到的蛋白组分称为清蛋白；残渣用稀盐溶液提取得到的蛋白组 分为球蛋白；再用7 0 8 0 乙醇溶液提取的组分为醇溶蛋白；最后残渣中蛋白 质只能用酸或碱溶解，分别称为酸溶性蛋白和碱溶性蛋白，二者统称为谷蛋白。 菜籽清蛋白为菜籽蛋白中的主要成分，约占3 7 9 | 。菜籽清蛋白含有亮氨 酸、谷氨酸、天冬氨酸等，营养价值较好，可用于制作健康食品或高级调味料。 1 2 生物活性肽和菜籽肽 1 2 1 生物活性肽 1 2 1 1 生物活性肽来源 肽是氨基酸的线性聚合物，也称肽链，而蛋白质是由一条或多条具有确定 的氨基酸序列的肽链构成的大分子。生物活性肽的主要来源可以分为天然存在 的活性肽、人工合成的活性肽和蛋白质水解产生的活性肽三种【2 。 天然存在的活性肽多分布于陆地和海洋的生物体内。从天然生物体可提取 出生物活性肽，但生物体含量很低，加工成本却很高，而且大量提取会造成物 种资源的萎缩，另外提取的生物活性肽残存的有机溶剂也带来毒性问题。 人工合成活性肽的途径主要有三条：即化学合成、酶法合成和重组d n a 技术。化学合成法常用于合成高营养价值、中等长度的医药用肽，但制取价格 较高，反应过程中也产生有害物质。酶合成法反应温和，酶催化位置有方向性， 但反应副产物多，产率低。d n a 重组技术只能合成大分子肽类和蛋白质，对小 肽的合成有一定限制性。 蛋白质水解产生的活性肽主要由化学法和酶法水解而来。化学法以酸或碱 断开蛋白质肽键，反应环境较极端，酸解或碱解的位点难以确定，产物复杂， 重现性差。酶法生产活性肽是利用蛋白酶将食物蛋白质水解成活性多肽，酶法 条件温和，安全性高、可控性强，可以生产大量的多肽而且制取价格低廉，另 外该方法的反应底物、试剂和环境均没有危害。 1 2 1 2 生物活性肽吸收特点和生理功能 长期以来，游离氨基酸一直被认为是蛋白质主要的吸收形式，直至上世纪 五、六十年代，才由n e w a y 和s m i t h 首先提出了肽可以被完整吸收的证据【2 1 1 ， 随着血液中小肽的发现以及胃肠道能够吸收肽的试验结论的不断增加，肽被完 整吸收的观点及其生理作用才逐渐被人们重视。生物活性肽吸收机制具有以下 特点1 2 2 j ：( 1 ) 不需消化，直接吸收。它表面有一层保护膜，不易受到人体胃蛋白 酶、胰酶、淀粉酶及酸碱物质二次水解，它以完整的形式直接进入小肠，被小 肠所吸收，进入人体循环系统，发挥其功能；( 2 ) 吸收快。吸收进入循环系统的 时间，如同静脉针剂注射一样，快速发挥作用；( 3 ) 它具有1 0 0 吸收的特点。 吸收时，没有任何废物及排泄物，能被人体全部利用；( 4 ) 起载体作用。它可将 人所食的各种营养物质运载输送到人体各细胞、组织、器官。 肽在蛋白质代谢中具有重要意义，并具有多种生理活性功能。 生物活性肽的生理功能有【2 3 。”j ：( 1 ) 类吗啡活性肽( 神经活性肽) ：可起到镇 痛及调节人体情绪、呼吸、脉搏和体温的作用；( 2 ) 具有激素或调节激素的功能， 这些肽通过自身作为激素或调节激素反应而具有多种生理作用；( 3 ) 具有免疫活 性；( 4 ) 做为酶的调节剂；( 5 ) 促进矿物质的吸收利用：酪蛋白磷酸肽可作为无机 离子的载体促进肠膜对钙、铁、硒、锌等元素的吸收；( 6 ) 具有抗氧化作用：谷 胱甘肽在体内与过氧化物酶共轭，使体内的过氧化氢和过氧化脂质还原，防止 体内生成过氧化脂质。文献报道生物活性肽还有很多其它功能【2 8 3 3 】，例如腐乳 中的水不溶性肽类有很强的与胆酸结合的能力；乳酪蛋白酶解产生的肽类对乳 酸链球菌和双歧杆菌有生长促进作用：动物试验证明c p p s ( 酪蛋白磷酸肽) 体 外可促进精子进入卵细胞和体外精卵细胞融合；水解胶原产生的胶原多肽具有 美容效果，能有效抑制皮肤老化及各种损伤；大豆多肽能降低人体血清胆固醇， 阻碍肠道胆固醇再吸收，促使其排出体外；从肌肉组织中分离的生物活性肽对 辐射造成的免疫功能损伤有改善作用等等。 生物活性肽的研究开发为利用蛋白质资源来生产保健食品提供了可能。加 强对生物活性肽，尤其植物蛋白活性肽的研究与开发，对有效利用我国的植物 蛋白资源，提高我国人民的营养水平，具有重要意义。 1 2 2 菜籽肽的制备及国内外研究概况 菜籽肽是菜籽蛋白经蛋白酶作用，再经特殊处理后得到的蛋白质水解物， 由许多分子链长度不等的低分子小肽混合物组成，还含有少量游离氨基酸、糖 类和无机盐等成分。菜籽肽不仅具有良好的酸溶性、低黏度、抗凝胶形成性， 在体内消化吸收快，蛋白利用率高等特点，而且具有低抗原性，不会产生过敏 反应，还具有良好的理化性质及生理活性，可作为运动营养剂、减肥食品、老 年食品的添加剂。 目前，对菜籽肽的研究主要集中在菜籽蛋白酶解条件方面，对菜籽肽生物 活性的研究比较少。万楚筠等【3 4 】对菜籽肽的制取、分离和纯化工艺进行了介绍。 郭涛等 3 5 1 利用经脱皮冷榨、低温浸出脱溶得到的菜籽粕提取菜籽蛋白，用中性 蛋白酶a s l 3 9 8 水解菜籽蛋白得到菜籽多肽，通过正交试验得到最佳酶解条件： p h 7 2 、温度4 5 、加酶量5 ( 酶与原料液的质量比) 、酶解时间2 h ，酶解 后有7 5 左右的蛋白质转化为可溶性肽，所得到的菜籽多肽流动性好，黏度低， 热稳定性较好。郭兴风等1 36 j 用响应面分析法( r s m ) 对影响菜籽蛋白酶水解的因 素进行分析，得到a s l 3 9 8 的最佳酶水解条件为温度4 9 6 ，p h 7 6 ，酶与底物 浓度l i , ( e s ) 7 4 2 0p u g ，底物浓度9 4 ，水解时间6 h ，最佳水解条件下的水解 度达到1 6 2 0 。他们还对最佳水解条件下水解度和时间的关系进行了研究，证 实了预测值和实测值是一致的。熊善柏等【37 j 用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对脱脂 菜籽粕中蛋白质进行了分步酶水解研究，结果表明：在中性蛋白酶、木瓜蛋白 酶的最适作用温度和起始p h 下，先用2 0 0 0 u g 中性蛋白酶a s l 3 9 8 水解3 h 后， 再添加3 0 0 0 u g 木瓜蛋白酶水解4 h ，水解产物的氮收率可达到8 9 5 0 、水解 度达到4 3 8 0 。刘海梅等【3 引对脱脂菜籽饼粕中的蛋白质用碱性蛋白酶与木瓜蛋 白酶进行了分步水解研究，在碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最适作用温度和起始 p h 值下，先用3 0 0 0 u g 碱性蛋白酶水解3 h 后，再用3 0 0 0 u g 木瓜蛋白酶水解 3 h ，水解度可达3 0 9 5 。薛照辉等【39 】对菜籽肽的制取工艺进行了研究，并且利 用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对菜籽清蛋白进行分步水解，将水解度由单酶的 1 4 7 2 提高至2 8 1 0 。v i o q u el 等【4o 】以菜籽分离蛋白为底物，依次用碱性蛋 白酶和风味蛋白酶水解菜籽蛋白，水解产物在p h 2 5 7 之间完全可溶，最终的 水解度为6 0 0 0 。p e d r o c h e 等【4 i 】用蛋白酶a l c a l a s e 水解菜籽分离蛋白，获得了 具有降血压活性的菜籽肽，进一步研究发现，酶水解3 0m i n 的产物对高血压抑 制活性最大。 最近的研究表明，通过新的蛋白水解酶的运用和双酶法水解菜籽蛋白工艺 的改善，水解度能得到很大的提高，提高菜籽肽的得率，并最终获得具有特定 功能特性的酶解产物。随着双低油菜的培育成功和推广种植，对菜籽蛋白和菜 籽多肽的研究引起了众多学者的兴趣，菜籽肽生物活性的开发和利用逐步成为 植物多肽研究领域的一大热点。 1 3 菜籽肽抗氧化活性 1 3 1 自由基简介 人体内自由基约9 5 以上为氧自由基，在正常情况下，氧自由基处于一种 动态平衡状态。然而，随着年龄的增长，或者人体处于某些病理状态下以及机 体受到创伤时，体内抗氧化酶活性就会下降，这时过多的氧自由基就不能被及 时清除而堆积在人体细胞内，这样它们就有机会与机体内的一些生物大分子( 蛋 白质、核酸、脂质等) 发生反应【42 1 ，生成大量氧化物或过氧化物，从而影响细 胞内物质和能量代谢的正常进行，这就会导致多种疾病的发生、发展及人体的 衰老。 超氧阴离子自由基与多种疾病有密切联系【4 弘45 ，它是所有氧自由基中的第 一个自由基，可以经过一系列反应生成其它氧自由基。和其他活性氧相比，超 氧阴离子自由基不是很活泼，因此曾经有人认为超氧阴离子自由基毒性可能不 大，其实，由于它寿命较长，可以从其生成位置扩散到较远的距离，达到靶位 置，从这种意义上讲，超氧阴离子自由基具有更大的危险性。超氧阴离子自由 基既可以接受一个电子氧化其他物质而被还原，又可以提供一个电子还原其他 物质而被氧化，这就构成了超氧阴离子自由基的主要化学性质，如氧化作用( 质 子化作用) 、还原作用( 亲核取代) 、歧化作用、电子转移及h a r b e r w e i s s 反 应等。 羟基自由基是已知的最强的氧化剂，它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性还 强，是氧气的三电子还原产物，反应性极强，寿命极短，在水溶液中仅为6 - 1 0 s ， 只要一产生，就会和缓冲溶液反应。它几乎可以和所有细胞成分发生反应，对 机体危害极大，但是由于它的作用半径小，所以它仅能和与它邻近的分子反应。 羟基自由基可以参与抽氢、加和及电子转移等三类反应。 1 3 2 自由基与脂质过氧化、疾病和衰老 脂质过氧化过程是一个自由基参与的链式反应，可分为链起动，链扩展和 链终止，每一步都有氧自由基中间物的产生和参与【4 * 4 。 所谓脂质过氧化的链起动是指不饱和脂肪酸最初过氧化的起动，也就是不 饱和脂肪酸被一个反应性足够强的物质进攻，从其亚甲基上抽取一个氢原子的 反应。脂过氧自由基能够从邻近另一个脂分子抽氢形成新的脂类自由基，这样 就形成循环，这就是脂质过氧化链式反应的扩展阶段，形成的脂类自由基再同 氧气反应生成一个脂过氧自由基，这样脂质过氧化就形成了链式反应。脂类自 由基，脂过氧自由基相互作用生成非自由基产物，称为链终止反应。 氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ， p u f a ) ，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。如：醛基( 丙二醛 m a l o n d i a l d e h v d e ，m d a ) 、酮基、羟基、羰基及新的氧自由基等。脂质过氧化 作用不仅把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通 过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。因此，初始的一个活性氧能导致 很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另一些则能引起 细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但能通过生物膜中p u f a 的过氧 化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。机体 6 内脂质过氧化的程度可以通过测试丙二醛( m d a ) 的量来反映，从而间接反映 细胞损伤的程度。 氧自由基与疾病有重要的关系。从目前研究结果揭示的证据表明，氧自由 基几乎和人类常见的几种主要疾病都有关系。在神经系统，早老性痴呆症 ( a l z h e i m e rd i s e a s e ) ，震颤麻痹症( p a r k i n s o nd i s e a s e ) ，癫痫等疾病都有氧自由基 的参与【4 驯；在循环系统，动脉粥样硬化，血栓的形成，心肌缺血再灌注损伤的 发病过程中氧自由基都起着重要作用；肝炎和糖尿病与氧自由基密切相关；致 癌、促癌和癌的形成的每一步都有氧自由基的产生和参与；在免疫反应的炎症 中，巨噬细胞呼吸爆发释放大量氧自由基；白内障的形成和视网膜的损伤是氧 自由基和脂质过氧化的直接结果 4 9 1 ： 衰老的自由基理论是h a r m a n 【5 0 1 于1 9 5 5 年在美国的原子能委员会提出的， 概括起来主要有以下几点： ( 1 ) 衰老是由自由基对细胞成分的有害进攻造成的。 ( 2 ) 这里所说的自由基，主要就是氧自由基，因此衰老的自由基理论，其实质 就是衰老的氧自由基理论。 ( 3 ) 维持体内适当水平的抗氧化剂和自由基清除剂水平，可以推迟衰老和延长 寿命。 1 3 3 菜籽肽抗氧化活性研究 研究表明，氧化损伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉硬化以及h i v 感染等均 有密切关系。郭兴凤等【5 1 1 的研究表明，菜籽蛋白的酶水解产物表现出一定的抗 氧化活性，且枯草杆菌中性蛋白酶水解产物的抗氧化活性大于枯草杆菌碱性蛋 白酶酶水解产物的抗氧化活性，且氧化活性随酶水解产物添加量的增加而增强。 y o s h i e s t a r k 等 5 2 1 通过测定菜籽蛋白水解产物对l ，1 二苯基2 苦肼基自由基 ( 1 ，1 - d i p h e n y l 一2 - p i c r y l h y d r a z y l ；d p p h ) 自由基的清除能力来研究其抗氧化活性， 结果表明菜籽蛋白经过胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，其抗氧化能力显著增强，对 d p p h 的半有效剂量e d 5 0 ( m e d i a ne f f e c t i v ed o s e ) 为1 3 1 m g m l ，且半有效剂量随 着菜籽蛋白水解度的升高而降低。薛照辉等1 53 j 用碱性蛋白酶和复合风味酶分步 酶解菜籽清蛋白得到菜籽清蛋白粗品肽( r s p r ) ，再经s e p h a d e xg 2 5 柱层析分 级，冷冻干燥得到各多肽级分( r s p 1 、r s p 2 和r s p 3 ) ，通过对各多肽级分进行 抗氧化研究，结果表明菜籽肽具有较强的还原能力，且具有明显抑制羟自由基 的作用。 菜籽蛋白水解产物和菜籽肽的抗氧化作用的机理，现在还没有完全弄清 楚。一些学者认为【”】，菜籽蛋白水解产物中所含有的多酚类物质对抗氧化活性 有贡献。另有研究学者认为f 55 1 ，菜籽肽可能富含供氢体，具有提供氢质子的能 力，可使具有高度氧化性的自由基还原，从而能终止自由基连锁反应，起到清 除或抑制自由基的目的。菜籽肽具有的抗氧化作用，还可能与菜籽肽共价结合 的糖类物质有关。 1 4 课题研究背景、目的、意义及主要内容 1 4 1 课题研究背景、目的与意义 随着蛋白质生物化学、生理学与营养学的发展，人们研究发现，某些低肽 不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，而且同时具有防病治病、调节人 体生理机能的功效，且具有一些原蛋白质或其组成氨基酸所没有的独特的生物 活性。加强对菜籽肽的研究及开发，并使之工业化，可以使我国的植物蛋白资 源得到有效利用，同时提高我国人民的营养水平。 本课题以科技部“十一五”国家科技支撑计划项目双低油菜制油新技术与 系列产品开发及产业化示范为依托，选择安徽省丰富低廉的菜籽粕为原料， 提取清蛋白，进而对其分步酶解，探究更好的工艺条件，提高菜籽肽的得率， 以提高菜籽粕的附加值，实现产业利益最大化。 1 4 2 主要研究内容 课题主要研究内容如下： ( 1 ) 提取菜籽粕中的菜籽清蛋白，通过单因素和正交试验，获得从菜籽粕中提 取菜籽清蛋白的最佳工艺条件。 ( 2 ) 对菜籽清蛋白中的基本组分进行分析，测定其中的蛋白质、灰分、水分、 植酸及硫甙等的含量，测定菜籽清蛋白的功能性质和氨基酸组成。 ( 3 ) 研究碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解菜籽清蛋白制备菜籽肽的工艺条 件，通过单因素和正交试验，获得分步水解的最佳工艺条件。 ( 4 ) 测定酶解所得菜籽肽粗品的灰分、水分、植酸和硫甙等的含量。 ( 5 ) 研究菜籽肽粗品的抗氧化能力，设计试验测定其清除羟基自由基和超氧阴 离子自由基的能力，并做小鼠试验，测定其对小鼠超氧化物歧化酶( s o d ) 和 丙二醛( m d a ) 的影响。 第二章菜籽清蛋白的制备 蛋白质是人类赖以生存的重要的物质基础。菜籽粕富含蛋白质，可作为蛋 白质来源之一，但是由于菜籽粕中抗营养因子的存在及高温榨油的影响，导致 目前对菜籽粕中蛋白质的开发研究较少，除部分菜籽粕经脱毒后作饲用蛋白外， 绝大部分尚未很好地加以利用。 随着双低油菜品种的广泛种植及低温冷榨制油技术的应用，菜籽粕中的抗 营养因子大量减少，同时有效避免了菜籽粕中蛋白质的变性。 本研究以粉碎过筛、脱脂后的双低冷榨菜籽粕为原料，通过单因素和正交 试验研究料液比、提取时间和提取次数对菜籽清蛋白中蛋白质含量的影响，确 定最佳提取工艺条件，并测定菜籽清蛋白部分功能特性及其基本组成成分。 2 1 材料与方法 2 1 1 试验原料与主要试剂 试验原料：双低冷榨菜籽粕 主要试剂： 药品名称规格 盐酸分析纯 氢氧化钠分析纯 硫酸分析纯 硼酸分析纯 硫酸钾分析纯 硫酸铜分析纯 碳酸氢钠分析纯 硝酸分析纯 磷酸二氢钾分析纯 硝酸分析纯 偏钒酸铵分析纯 铝酸铵分析纯 丙酮分析纯 羧甲基纤维素钠分析纯 氯化钯分析纯 2 1 2 试验主要仪器 设备、仪器名称 h h s 恒温水浴锅 p h s 一2 5 数显p h 计 9 生产厂家 广东汕头市西陇化工厂 广东汕头市西陇化工厂 宜兴市辉煌化学试剂厂 宿州化学试剂厂 广东汕头市西陇化工厂 天津市博迪化工有限公司 广东汕头市西陇化工厂 宿州化学试剂厂 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