（动物学专业论文）环境因子与超声辐射对西施舌免疫及生长的影响.pdf

福建帅范大学学位论文使用授权声明 福建师范大学学位论文使用授权声明 本人湿扬亟学号2 q q 5 旦q 垒专业动物堂所呈交的论文( 论文题目：环 境因子与超声辐射对西施舌免疫及生长的影响) 是我个人在导师指导 下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标 注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果。本人了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交的学位论文并允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文 的全部或部分内容；学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名 签名日期 指导教师签名 摘要 摘要 本文研究c u 2 + 、盐度、氨氮胁迫和v c 对西施舌免疫活性及超声波对西施舌生 长、摄食率影响。结果如下 1 当c u 2 + 浓度o 0 3m g l - 1 时，c a t 活性最高为1 4 5 6 7 4 - 6 6 2 比对照组高2 6 4 。当c u 2 + 浓度0 0 6m g l - 1 时，a c p 和削l p 活性最高，其中a c p 活性为8 0 6 9 、2 6 0 比对照组高3 5 4 5 ；a l p 活性为2 8 4 6 8 4 - 4 8 7 比对照组高3 3 2 9 。 2 盐度5 实验组胁迫1 2 h ，c a t 活性最高为3 7 5 7 1 4 7 比对照组高3 1 3 。胁 迫2 4 h ，s o d 活性最高为2 4 4 6 2 1 1 比对照组高8 3 7 。胁迫4 8 h ，a c p 活性最高 为2 9 6 3 _ + 2 1 比对照组高1 1 3 1 。盐度1 5 实验组1 2 h 时，s o d 和c a t 活性均最高， 分别比对照组高2 7 7 7 和1 4 3 8 。 3 c u 2 + 浓度为0 2 0 m g l - 1 时细胞活性氧含量最高为6 5 2 3 4 - 7 3 2 比对照组高3 2 5 倍。盐度1 5 实验组活性氧含量最高为2 8 2 1 3 2 1 比对照组高3 2 0 7 ，盐度5 实验 组活性氧含量为2 0 4 6 2 2 7 比对照组降低4 4 0 4 氨氮为5m g l 1 时，a c p 活性最高为1 9 4 6 4 - 2 2 2 比对照组高6 9 2 0 ；氨氮 为1 0m gm g l 1 时，s o d 、l s z 分别比对照组提高3 0 9 6 、9 6 4 6 ，a l p 活性比对 照组提高1 7 6 倍。 5 注射4 陬g g - 1 和每1 0 0 m l 饵料中加0 2 9 v c 实验组g 盯活性最低，分别比对照组 降低3 2 3 0 和1 8 9 9 。而适宜量的维生素c 能提高西施舌a c p 和a l p 活性。 6 氨氮浓度为2 0 r a g l 1 时，羟自由基最高为0 6 4 o 0 1 比对照组比对照组提高 5 2 3 8 。注射v c 8 0 t g g d 实验组9 6 h 时羟自由基含量摄低，为0 3 2 4 - 0 0 1 比对照组降低 5 9 4 6 。 7 在功率为8 0 w 、频率2 0 4 k h z 条件下，超声辐射3 0 s ，幼虫日生长速率比对 照组高2 2 2 ；多次辐射幼虫生长速率明显减慢；：辐射时间为5 0 s 时幼虫的摄食率 蛾淅( o 7 7 x 1 0 m g h 一) 足对照组的5 1 3 倍。在功率与时| 、i l j 两因素三水平正交实验最佳 条件下，西施舌稚贝的摄食率( 4 5 9 1 x 1 0 一m g h d ) 比对照组提高了2 1 2 倍。 关键词：西施舌环境因子v c 超声波免疫活性生长 a b s t r a c t a b s t r a c t t h i sa r t i c l ei sc o n c e n r e dw i t he f f e c to fi m m u n ea c t i v i t i e sb ye n v i r o n m e n t a l c h a n g e s ( c u “s a l i n i t ya m m o n i a nv c ) a n du l t r a s o n i ci r r a d i a t i o no ng r o w t ha n df e e d i n g r a t e so fc o e l o m a c t r aa n t i q u a t a ，t h er e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 w h e nc u 2 + c o n d e n s a t i o ni s0 0 3m g l - 1 ，t h ea c t i v i t i yo fc a ti st h eh i g h e s t ( 1 4 5 6 7 - - + 6 6 2 ) ，a n di n c r e a s e s2 6 4 c o m p a r e dt oc o n t r o l l e d w h e nc u 2 + c o n d e n s a t i o n i s0 0 6 m g l 1 ，b o t ht h ea c t i v i t i e so fa c pa n da l pa r et h eh i g h e s t ，t h ea c t i v i t yo fa c pi s 8 0 6 9 2 6 0a n di n c r e a s e s3 5 4 5 c o m p a r e dt oc o n t r o l l e d ，t h ea c t i v i t i yo fa l pi s 2 8 4 6 8 - + 4 8 7a n di n c r e a s e s3 3 2 9 c o m p a r e dt oc o n t r o l l e d 2 t h ec a t a c t i v i t yo fs a l i n i t y5g r o u pi st h eh i g h e s t ( 3 7 5 7 - + 1 4 7 ) a f t e r1 2 h ，a n d i n c r e a s e s3 1 3 c o m p a r e dt oc o n t r o l l e d t h ea c p a c t i v i t yo fs a l i n i t y5g r o u pi st h e h i g h e s t ( 2 9 6 3 - + 2 1 0 ) a f t e r4 8 h ，a n di n c r e a s e s1 1 3 1 c o m p a r e dt oc o n t r o l l e d b o t h a c t i v i t i e so fs o da n dc a to fs a l i n i t y1 5g r o u p sa r et h eh i g h e s ta f t e r1 2 h ，a n di n c r e a s e 2 7 7 7 a n d 1 4 3 8 i n d i v i d u a l l yc o m p a r e dt oc o n t r o l l e d 3 w h e nc u “c o n d e n s a t i o ni s 0 2 0 m g l - 1 ，r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) o fc a n t i q u a t ai st h eh i g h e s t ( 6 5 2 3 - + 7 3 2 ) a n di n c r e a s e s3 2 3t i m e sc o m p a r e dt oc o n t r o l l e d r o so fs a l i n i t y5g r o u pi st h eh i g h e s t ( 2 0 4 6 - - + 2 2 7 ) a n dd e c r e a s e s4 4 0 c o m p a r e dt o c o n t r o l l e d 4 w h e na m m o n i a - nc o n d e n s a t i o ni s5m g l - 1 ，t h ea c t i v i t i e so fa c pi st h eh i g h e s t ( 1 9 4 6 2 2 2 ) ，a n d i n c r e a s e s6 9 2 0 c o m p a r e dt oc o n t r o l l e d w h e na m m o n i a - n c o n d e n s a t i o ni s1 0m g l - 1 ，a c t i v i t i e so fs o da n dl s zi n c r e a s e3 0 9 6 a n d9 6 4 6 i n d i v i d u a l l y ，a n da c t i v i t yo fa l pi n c r e a s e s1 7 6t i m e sc o m p a r e dt oc o n t r o l l e d 5 。t h ea c t i v i t yo fc a to fc a l l t t q u a ti st h el o w e s tw h e ni n j e c t e dw i t ht h ed o s a g e so f v c4 0 t g g ，w h i c hd e c r e a s e d3 2 3 0 a f t e r8 h a c t i v i t yo fc a ti st h el o w e s tw h e nf e d w i t ht h el a t y m o n a ss u b c o r d i f o r m i sc o n t a i n e d0 2 9 m l 1 0 0 - 1v c ，w h i c hd e c r e a s e d18 9 9 c o m p a r et oc o n t r o l l e d c o m p a r ew i t hc o n t r o l l e d ，c e r t a i nc o n c e n t r a t i o n sv cc o u l d e n h a n c et h ea c t i v i t yo fa c pa n da l p 6 w h e na m m o n i a nc o n d e n s a t i o ni s2 0 r a g l l 。o ho fc a n t q u a t ai st h eh i g h e s t i i a b s t r a c t ( 0 6 4 + 0 0 1 ) a n di n c r e a s e s5 2 3 8 c o m p a r e dt oc o n t r o l l e d o ho fc 口肋u a t ai st h e l o w e s t ( o 3 2 - t - 0 o i ) w h e ni n j e c t e dw i t ht h ed o s a g e so fv c4 0 z g 百1 ，a n dd e c r e a s e s5 9 4 6 c o m p a r e dt oc o n t r o l l e d 7 u n d e rt h ec o n d i t i o n so fu l t r a s o n i cp o w e r8 0 w , f r e q u e n c y2 0 4 k h z a n du l t r a s o n i c e x p o s u r e3 0 s ，t h eg r o w t hr a t eo fv e l i g e rl a r v a eo fca n t t q u a t ar a i s e d2 2 2 c o m p a r e d t o c o n t r o l l e d r e p e a t e du l t r a s o n i ci r r a d i a t i o nc o u l dc l e a r l ya f f e c to ng r o w t hr a t eo fv e l i g e r l a r v a eo fc a n t t q u a t a , w h e nu l t r a s o n i ce x p o s u r et i m eo f5 0 s ，t h ei n g e s t i o nr a t eo f v e l i g e rl a r v a eo fca n t i q u a t ac o u l db e0 7 7 x 1 0 5m g h 。1 a n d5 1 3t i m e sg r e a t e rt h a nt h a to f t h ec o n t r o l l e d u n d e rt h eo p t i m u mu l t r a s o n i ci r r a d i a t i o nc o n d i t i o n so fu l t r a s o n i cp o w e ro f 6 0 wa n du l t r a s o n i ce x p o s u r et i m eo f2 0 s ，t h ei n g e s t i o nr a t eo fc a n t t q u a t al u v e n i l ec o u l d b e4 5 9 1 1 0 m g h - 1 a n d2 1 2t i m e sg r e a t e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o l l e d k e y w o r d s ： c o e l o m a c t r aa n t i q u a t ae n v i r o n m e n t a lf a c t o r s u l t r a s o n i ci m m u n ea c t i v i t y i i i v c g r o w t h 中文文摘 中文文摘 1 研究目的 西施舌营养丰富，滋味鲜美，甘脆嫩滑，是久负盛名的筵席珍品佳肴，具有较 高的经济价值。由于人为破坏及环境污染等原因，导致西施舌自然资源匮乏，在人 工育苗已取得重大突破的情况下，通过西施舌人工养殖可以减轻自然资源短缺的压 力，满足人们的需求。 由于西施舌自身对环境极度敏感，在增养殖技术方面尚存在不少问题需要解决。 如高密度集约化养殖导致养殖环境的恶化，导致个体对疾病的易感性增加，疾病滋 生，严重阻碍西施舌养殖业发展。因此，了解西施舌免疫学特性，提高西施舌自身 免疫活性和对环境的抗逆性，对促进人工育苗和增养殖以及病害防治具有重要意义。 超声波对生物体活组织具有较强的穿透力，一定强度的声波能量可较好地渗入 生物体，到达内部组织器官和神经敏感区，从而影响生物体的某些机能而产生各种 生物效应。研究应用超声波对西施舌生长、摄食率的影响，探讨超声波不同功率和 不同辐射时间对西施舌产生的生物效应，寻求提高西施舌面盘幼虫生长发育的适宜 超声波剂量，为将超声技术应用于西施舌人工育苗具有重要意义。 2 研究方法 本实验研究t c u 2 + 、盐度、氨氮胁迫和v c 对西施舌免疫活性的影响，以及超声 波对西施舌生长、摄食率影响。 ( 1 ) 研究不同浓度c u 2 + 胁迫对西施舌过氧化氢酶( 、酸性磷酸酶( a c p ) 和碱 性磷酸酶( a l p ) 3 种酶活性及血细胞活性氧含量的影响。将西施舌分5 组，分别放入 c u 2 + 浓度为0 0 0m g l - 1 ( 对照) 、0 0 3m g l 1 、o 0 6m g l - 1 、o 1 2m g l 1 、0 2 0m g l - 1 的培育箱，7 天后检测c a t 、a c p 、m 活性以及血细胞活性氧含量。并在最佳c u 2 + 浓度0 0 6m g l 1 下，分别于o h 、1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 检测a c p 和舢l p 活性变化。 ( 2 ) 研究低盐度胁迫对西施舌免疫活性的影响。将西施舌分成3 组，分别放入盐 皮浓度为2 9 ( 对照) 、1 5 、5 的培育箱中，分别于4 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、9 6 h 检测西施舌 s o d 、c a t 、a c p 、a l p 和溶菌酶( l s z ) 活性。7 天后从闭壳肌取血检测活性氧含量。 ( 3 ) 研究氨氮胁迫对西施舌免疫活性的影响。将西施舌分成6 组，分别加入氨氮 浓度为0m g 。l 1 ( 对照) 、2m g l 1 、5m g l - 1 、1 0m g l 1 、2 0m g l 1 、4 0m g l 1 培养箱。 i v 中文文摘 7 d 后取其血清，测定羟自由基含量和s o d 、l s z 、c a t 、a c p 、6 衄活性。 ( 4 ) 研究维生素c 对西施舌c a t 、a c p 和a l p 3 种酶活性以及o h 自由基含量的影 响。将西施舌分成4 组( 3 个实验组和个对照组) ，实验组按每克体重4 吮g 、8 0 a g 、 1 2 0 2 9 齐u 量注a v c 注射液，对照组注射等量生理盐水。分别于0 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 钡, 0 定c a t 、a c p 、p 凹活性以及羟自由基含量。同时另将西施舌分成6 组( 5 个实验组 和个对照纽) ，实验组按每1 0 0 m l 饵料藻液中添加v c 为0 1 、0 2 9 、0 4 9 、0 8 9 、1 6 9 ， 对照组不添j j i v c ，于以上条件下饲养7 d 后测定c a t 、a c p 、a l p 活性。 ( 5 ) 研究超声波对西施舌面盘幼虫生长速率及成活率的影响。于超声功率8 0 w 、 频率2 0 4 k h z 时，按以下5 个时间：1 0 s 、3 0 s 、5 0 s 、7 0 s 、9 0 s ；对面盘幼虫进行超 声处理。设一组不用超声波处理作为对照。测量面盘幼虫壳长作为其生长发育的判 断指标并计算幼虫成活率。 ( 6 ) 研究超声波对西施舌面盘幼虫和稚贝摄食率的影响。于超声功率8 0 w 、频 率2 0 4 k h z 时。按以下5 个时间：1 0 s 、3 0 s 、5 0 s 、7 0 s 、9 0 s ；对面盘幼虫进行超声处理。 设两个对照实验组，一组加西施舌面盘幼虫，但不用超声处理，其他条件与实验组 相同：另一组既不加幼虫，也不用超声处理，其他条件也与实验组相同，此组为消除 藻类自身繁殖产生影响，测定幼虫摄食率。 在超声功率4 0 w 时，设5 个时间梯度：1 0 s 、2 0 s 、4 0 s 、6 0 s 、8 0 s ，研究超声辐射 时间对西施舌稚贝摄食率的影响。在辐射时间时间为2 0 s 时，超声功率设四个梯度： 4 0 w 、6 0 w 、8 0 w 、1 0 0 w 研究超声辐射功率对西施舌稚贝摄食率的影响。并设计功率 和时间两因素三水平正交实验，研究超声波对西施舌稚贝摄食率影响。 3 研究结果 1 当c u 2 + 浓度0 0 3m g l 1 时，c a t 活性最高为1 4 5 6 7 4 - 6 6 2 比对照组提高2 6 4 。而c u 2 + 浓度0 0 6m g l - 1 时a c p 和a l p 活性最高，其中a c p 活性为8 0 6 9 + 2 6 0 比对照组提高3 5 4 5 ：a l p 活性为2 8 4 6 8 4 8 7 比对照组提高3 3 2 9 。 2 盐度5 实验组胁迫1 2 h ，c a t 活性最高为3 7 5 7 + 1 4 7 比对照组提高3 1 3 。 胁迫2 4 h ，s o d 活性最高为2 4 4 6 + 2 1 1 比对照组提高8 3 7 。胁迫4 8 h ，a c p 活性 最高为2 9 6 3 4 - 2 1 比对照组提高1 1 3 1 。盐度1 5 实验组1 2 h 时，s o d 和c a t 活性 均最高，分别比对照组提高2 7 7 7 和1 4 3 8 。 3 氨氮浓度为5m g l 1 a c p 活性最高为1 9 4 6 + 2 2 2 比对照组1 1 5 6 + 0 3 5 提高 v 中文文摘 6 9 2 0 ；氨氮浓度为1 0m gm g l 1 时s o d 、a l p 和l s z 活性最高，其中s o d 为3 1 9 8 1 5 7 比对照组2 4 4 2 3 2 1 提高3 0 9 6 。l s z 活性为1 0 5 3 0 5 3 比对照组5 3 6 0 4 3 提高9 6 4 6 。a l p 活性最高为4 1 2 9 4 1 6 8 比对照组1 4 9 6 2 2 1 提高1 7 6 倍。 4 注射4 吮g g j 和每1 0 0 m l 饵料中加0 2 9 v c 实验组c 盯活性最低，分别比对照组 降低3 2 3 0 和1 8 9 9 。注射8 毗g g - 1 实验组a c p 和6 岫活性最高，其中a c p 活性为为 3 1 4 1 0 6 1 比对照组2 7 0 7 0 9 3 提高1 6 0 3 ，j 6 曲活性为为3 1 4 1 o 6 l 比对照组 2 7 0 7 0 9 3 提高1 6 0 3 。 5 c u 2 + 浓度为0 2 r a g l - 1 时细胞活性氧含量最高为6 5 2 3 7 3 2 比对照组1 5 3 6 4 - 4 2 3 提高3 2 5 倍。盐度1 5 实验组活性氧含量最高为2 8 2 1 3 2 1 比对照组2 1 3 6 4 - 4 2 3 提高3 2 0 7 ，盐度5 实验组活性氧含量为2 0 4 6 2 2 7 比对照组降低4 4 0 6 氨氮浓度为2 0 r a g l _ 1 时，羟自由基最高为0 6 4 o 0 1 比对照组0 4 2 0 0 1 比对 照组提高5 2 3 8 。注射v c 8 即g g - 1 实验组9 6 h 时羟自由基含量最低为0 3 2 4 - 0 0 1 比对照 组0 5 7 0 0 3 降低5 9 4 6n 。 7 适宜条件超声辐射可提高面盘幼虫的生长速率和摄食率。在功率为8 0 w 、频 率2 0 4 k h z 条件下，超声辐射3 0 s ，幼虫日平均生长速率比对照组提高2 2 2 。重复 的超声辐射对幼虫的生长速率产生明显影响，多次辐射幼虫生长速率明显减慢。 在超声功率为8 0 w 、频率为2 0 4 k h z 条件下，辐射时间为5 0 s 时幼虫的摄食率 最高为0 7 7 1 0 一m g h 一，是对照组0 1 5 1 0 m g h d 的5 1 3 倍。在功率与时间两因素 三水平正交实验确定的最佳条件下( 超声功率为6 0 w 、超声辐射时间为2 0 s ) ，西施 舌稚贝的摄食率4 5 9 1 l f f 5m g h 一，比对照组2 1 6 3 x1 0 - 5m g h - 1 提高了2 1 2 倍。 v i 第1 章绪，苦 第1 章绪论 1 1 诛。背景 西施舌( c o e l o m a c t r a a n t i q u a t as p e n g l e r ，1 8 0 2 ) ，俗名“海蚌”，属于软体动 物门( m o l l u s c a ) 、瓣鳃纲( l a m e l l i b r a n c h i a ) 、帘蛤目( v e n e r o i d a ) 、蛤蜊科( m a c t r i d a e ) 、 腔蛤蜊属( c d e 胁历口c r r a ) 【，栖息在浅海沙滩内，属广温性种类，分布于太平洋西部、 印度支那半岛、r 本和中国沿海。我国福疋习江口长乐梅花穿山行以南至文武沙一 带，资源量最大，而且产品质量最优。因其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，现己 成为福建特优海珍贝类。 从上世纪6 0 年代开始，国内学者便开始对西施舌的生物学、人工育苗及人工增 养殖进行研究【2 1 。齐秋贞【3 4 1 等系统地研究，西施舌自受精卵至幼虫、稚贝与幼苗整 个生活史中各个发育阶段的形态变化及区别特征以及西施舌幼虫至幼贝器官的发生 与形成的细微、渐变的全过程；刘德经等【5 。1 对西施舌的繁殖生物学、人工育苗及稚 贝培育技术等进行了研究；高如承等【8 】研究了盐度对西施舌幼虫和贝苗生长发育的 影响。特别是西施舌附着变态诱导技术的突破，西施舌人工养殖取得突破性进剧9 1 1 。 但由于西施舌自身对叫：境极度敏感，在增养殖技术方面尚存在不少问题需要解决。 如高密度集约化养殖导致养殖环境的恶化，导致个体对疾病的易感性增加，疾病滋 生，严重阻碍西施舌养殖业发展。因此，了解西施舌免疫学特性，提高西施舌自身 免疫活性和对环境的抗逆性，对促进入工育苗和增养殖以及病害防治具有重要意义。 对各种养殖动物而言，免疫生物学研究的主要目的是病害防治。在软体动物由 于不存在免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫反应，因而它不可能象脊椎动物那样通 过接种来达到自我免疫的目的【1 2 】。尽管如此，由于贝类的防疫系统具有非特异性免 疫的性质，适当的诱导可提高贝类血细胞的吞噬能力及多种免疫因子的数量和活性。 因此，研究选择合适的免疫增强剂来提高贝类机体的防御功能，将成为今后贝类病 害及防治的重要方向1 1 3 】。 超声波对生物体活组织具有较强的穿透力，一定强度的声波能量可较好地渗入 生物体，到达内部组织器官和神经敏感区，从而影n 向生物体的某些机能而产生各种 生物效应。近年来，研究超声波对水生生物的影响与作用，以寻求对水生生物生长、 繁殖的有利条件已取得很多成果f 1 4 】。王清池等1 1 5 。6 】研究了超卢波诱导对虾无1 了幼体变态 利超声波对牛午三：野孵化的影响。薛领展等f 1 7 】研究了超声波改善西施舌人工育苗水质应 福建师范j f = = ? 二婴学颤一i 学位论文 用。研究超声波对西施舌生长、摄食率的影响，探讨超声波不同功率一i 射时间y 西施舌产生的生物效应，寻求提高西施舌面盘幼虫生长发育的适宜超声波剂量，! f j 将超声技术应用于西施舌人工育苗具有重要意义。 1 2 贝类免疫学研究进展 s t a u b e r 等1 9 5 0 年丌始跟踪观祭颗粒和可溶性外源物质在美洲牡$ ：j ( c r a s s o s t r e a v i r g i n i c a ) 体内的变化，开创了贝类免疫学研究领域。2 01 纪6 0 7 0 年代，贝类免疫 学主要是对贝类血细胞分类和各种免疫过程中体液因子的功能进行研究。2 01 廿纪8 0 年代以后，除继续对贝类血细胞的结构和功能进行研究之外，血淋巴中各种参与免 疫防御的体液因子相继被识别和分离，发现了高等动物r f i 细胞凼子类似物。这些工 作深化了： 类的体液免疫研究【1 8 】。2 0 世纪9 0 年以来，国内外对贝类血细胞的分类、 血细胞中与免疫有关的细胞结构、血细胞的培养和凋亡、免疫因子及六o 氐御j 丙原 生物入侵时所起的作用、与贝类免疫相关的基因研究、! j j 类免：哆的细胞曩1 分孑， 三物 学机制及免疫凋节机理等方面取得重大进展f 1 9 】。贝拳龟疫包括细胞免疫和体液免疫。 1 2 1 贝类细胞免疫 1 2 1 1 贝类血细胞分类 贝类血细胞的分类一直存在较大分歧，多数学者根据叭缈勉大小和胞内颗粒有 无，将贝类血细胞分为有颗粒细胞膏：i 颗粒细胞，而许多贝类还存在其它的一些亚 型。随着研究的深入，近年来不少研究者运用新技术，新方法对贝类血宝：，t ，匀分类 进行研究，如密度梯度离心、单克隆抗体、植物凝集素、免疫磁力分离、酶匀i j 胞化 学、流式细胞技术等方法1 2 0 】。 1 2 1 2 贝类血细胞免疫功能 血细胞是贝类防御系统的最重要部分，血细胞的功能与维持体内爷种生理环境 的稳定性有密切关系，可进行炎症、伤口修复、呼吸爆发、吞噬和包堤、j ，l 用。 1 2 。1 2 1 吞噬作用 吞噬作用的功能主要是清除侵入机体的外源异物如生物大分子、无机物颗粒、 细菌、真菌，以及自身的坏死细胞及绝胞碎片等。同时也是提供营养的一种手段。 在大多数报道的贝类中，吞h 筮作用主要由粒细胞：0 弋，透明细胞也具有一定的各噬 能力。从免疫防御角度讲，血细胞可活跃地趋化到炎症和掺伤鞠5 位进行吞啭j 免 藩1 章绪论 疫防御的主要细胞类型f 2 1 】。 ，吞噬作用的过程大致可以分为趋化、黏附、内吞以及杀伤消化四个阶段。研究 证明贝类血细胞可以向外源颗粒趋化靠近。血细胞靠近异物后首先发生黏附。随后， 血细胞伸出伪足对异物进行包裹，伪足相接触后细胞质膜融合，形成吞噬体进入细 胞。粒细胞完成对异物的吞噬后，通过两条途径对其进行处理。一是吞噬体与溶酶 体融合，其内容物被溶酶体中的水解酶类消化降解。另一条途径通过伴随吞噬作用 的呼吸爆发产生大量活性氧自由基，杀伤吞入的微生物【2 2 】。 1 2 1 2 2 呼吸爆发 呼吸爆发伴随着吞噬作用产生过程中，可产生大量的活性氧中间体来杀灭和消 化病原微生物。适当的刺激后，吞噬细胞经历呼吸爆发并制造大量的细胞毒氧化剂， 即胞毒活性氧，这一现象最初是在哺乳动物嗜中性白细胞和巨噬细胞中观察到的l 矧。 现已证明呼吸爆发的第一个反应是氧还原一个电子形成超氧阴离子( o 玉) ，是出吞噬 细胞膜上l ij n a d p h 氧化酶催化的超氧阴离子( 0 2 。) 被胞质酶超氧化物歧化酶( s o d ) 催 化转换成过氧化氢( h 2 0 2 ) 。过氧化氢活性很高，是有毒的r i o s 之一，与过氧化物酶 及卤素形成了强力杀菌系统的基础。另外还可产生羟基自由基【o h 和单线态氧( 1 0 z ) 等毒性r i o s ，这些r l o s 能够参与细胞介导的杀灭细菌、真菌和原生动物过程1 2 粥。 1 2 1 2 3 包裹作用 如果异物比血细胞大得多，例如寄生虫、坏死组织、外源植入物等，则血细胞 对该异物的吞噬动员了全部勺细胞膜表面积，表现为盘细胞在异物表面上完全伸展， 扁平化，f i 若干吞噬细胞共同将异物包裹起来，这称为包裹作用。最初血细胞对异 物的包裹比较疏松，随着越来越多的细胞聚集到异物处，与异物直接接触的细胞变 扁平，并充分伸展，形成包裹异物的连续的细胞层。最后，包裹变得越来越坚固，血 细胞通过细胞内和细胞外消化将被包裹的异物消除1 2 2 1 。 1 2 1 2 4 其它免疫功能 贝类血细胞除了上述的免疫功能外，它们还可以在伤口修复、炎症反应、神经免 疫反应过程中发挥重要作蹋。贝类血细胞参与这些免疫功能的基础是血细胞的异己 识别和吞噬功能。o t t a v i a n i 等【2 5 | 在贝类血细胞膜上发现促肾上腺激素释放因子，并 将贝类血细胞用含促肾上腺素释放因子血清孵育1 5 r a i n 后，可刺激血细胞向血清中释 福建师范大学理。謦顶十孑 - 3 7 ：二全文 放。肾上腺素。s u z u k i 笺 2 6 】通过研究珍：l7 p ! 聪纽如野l 甜：g 辨s 斌+ 勺伤1 - 5 修复2 - m t v 发现， 无颗粒细胞是伤口修复关键细胞，它分泌的胞外基质影响上皮细胞迁移和再生。 1 2 1 3 血m l l g 培养与细胞凋亡 研究人员把目光投注在与免疫机能相关的贝类血细匏的培养，可为贝类免疫机 制研究以及筛选免疫增强药物提供手段，有助于建立较完善的贝类免疫知谚j 体系， 为解决贝类疾病防治开辟新途径。石安静等【2 7 】经电镜观察到圆背角无齿蚌翻j z o d o t t t a w o o d i a n ap a c i f i c a ) 醮j 颗粒细胞、透明细胞均能伸出伪足并贴壁，培养特征i je 南孑l ：爿 物的巨噬细胞类似，另外还有一种不能繁殖、与高等动物淋巴细胞培养特征类似的 细胞。c a o 等【2 8 】则在k e i b o v i t z l - 1 5 培养基中加入盐和抗生素，将地中海贻贝血细胞灼 培养时问延长至2 0 d 。 血细胞凋亡的特点是染色质降解，d n a 迅速裂解，该死亡过程形成凋1 ：小体， 不导致溶酶体及胞膜破裂，不出现内容物外泄，也不产生炎症反应，与般的细胞 坏死有显著区别。t e r a h a r a 等【2 9 l 用精氨酸甘氨睃天冬酰胺形成的三肽殳! = 理太平洋牡 蛎血细胞，结果血细胞出现细胞收缩、细胞膜起皱、染色质浓绺和d n a 断裂等典型 凋亡特征。g i e l a z v n 等用彗星试验结合甲酰胺嘧啶糖苷酶检测基因毒污势物f 如过 氧化氢1 引起美洲牡蛎和硬壳蛤( m e r c e n a r i am e r c e n a r i a ) 的d n a 损伤，探讨岁凋亡机 理，认为d n a 损伤可以导致2 种海洋双壳类的血细胞凋亡。 1 2 2 贝类体液免疫 体液机制主要包括溶酶体酶、凝集素和抗茵肽等体液囚子。越来越多的研究表 明体液因子在机体防御反应中起着十分重要的作用。 1 2 2 1 溶酶体酶 贝类的溶酶体酶二二要存在于颗粒细胞的溶酶体中有溶卤酶、p 一葡萄糖p 知尊黔， 酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脂肪酶、氨鉴肽酶和q 岩藻糖酶等。颗粒细胞在吞食异 物脱颗粒时这些酶被释放到血清中，发挥免疫防御、消化分解食物及调节代谢等作 用。1 9 7 9 年第一次在海洋贝类体内发现溶菌酶，以后又陆续往多种贝类体内发现溶 菌酶，如冰岛扇贝( p e c t e n ) 、贻9 1 ( m y t i l u se d u l i s ) 等。在缺少特异性免疫的无脊椎动 物的防御体系中，溶菌酶是一个非常重要的环节。它不仅能够溶解杀灭多种细菌， 防御病害还有滤食海洋细菌的作用【3 1 1 。细菌的攻击会改变溶茵晦的活性，这种改变 第1 章绪论 依赖于贝类和细菌的种类及其感染部位。 1 2 2 2 凝聚素 凝集素是一类可与表面具有糖链结构起凝集反应的物质，广泛存在于动植物、 微生物体内。n o g u c h i 从无脊椎动物雹体腔液中证实血细胞凝集素的存在【32 1 。在栉孔 扇( c h l a m y s f a r r e i ) 、虾夷扇贝( p e c t e n y e s o e n s i s j a y ) 、贻贝等多种贝类体内也提取到 了凝集素【3 3 1 。f i s h e r f 等- - 3 4 1 对牡蛎( 西北口) 、蛤等贝类体内的凝集素进行了研究，发现能 凝集多种脊椎动物的红细胞。凝集素被认为可能在识别异物方面起重要作用，具有 特异性调理功能，能选择性凝集不同脊椎动物的红细胞、病原微生物沉淀、某些复 杂碳水化合物和清除杂物。尤其是它拥有专一性识别因子，对血细胞和细菌的糖缀 合物有特异性，从而促进了贝类血淋巴对外源细胞的识别。通过与糖蛋白或糖脂相 互作用凝集细胞或沉淀复杂碳水化合物。依靠凝集素完成抗原与防御系统识别的p 孔。 1 2 2 3 抗菌肽 抗荫肽是在诱导的条件下，动物免疫防御系统产生的一类防御性活性肽类物质， 对抗外源性病原体致病作用，是动物体液防御系统的一个重要组成部分，迄今有五 百多种被分离鉴定。m i t t a 等【3 6 】从两种贻贝( 协f f 肠se d u l i s 、m y t i l u s 肜f 卸r o v i n c i a l i s ) 中分离到多种抗菌肽，分为四炎：防御素、贻贝素、贻贝肽和贻贝霉素。防御素主 要作用于一些微生物细胞以及生长旺盛的癌细胞。试验表明，防御素的攻击目标屉细 胞质膜。引起，胞内外渗透压改变，细胞内含物如k + 大量漏出，内膜发生部分去极化作 用，胞质a 个p 减少。有f i 勺防御素使细菌呼吸或d n a 的生物合成受抑制，细胞质膜栅栏 ( 屏蔽) 彻底瓦解，细菌死亡【3 7 1 。 1 2 2 4n o 和硝酸盐超氢化物 硝酸盐超氧化物是n o 与超氧化物阴离子反应生成的利，强氧化剂，可损坏亚细 胞结构的细胞器和酶类，是贝类免疫细胞产生的r o s 成员之一，通过破坏蛋白、脂 类和d n a 而使本身受损伤同时也破坏人侵的病原。t o r r e i l l e s - 等t 3 8 】终i 呼究发现地中海 贻贝( m y t i l u sg a l l o p r o v i n c i a l i s 口川口，c 尼) m 细胞中硝酸赫超氧化物阴离子的化学发光 作用可以被重碳酸盐和酵母聚糖所促进而被乙半胱氨酸和尿酸抑制；n o 合成酶抑制 剂和超氧化物岐化酶的加入可增加酵母聚糖的刺激作用，使贻贝血细胞化学发光加 强，认为n o 仑成骢和s c d 是合成和调节硝酸祭超氧化物生成的五要成分。 福建师范人学理学硕七学位论文 n o 是脊椎动物免疫应答的重要调节毽子，不少学者在无脊动：饧对细茬i 即i 弓? 物的免疫应答中均检i 贝, u n n o 。s m i t h 等【3 9 】建议把n o 在贝类血淋巴中含量的测定做为 评价环境受三丁基锡等污染物影响的生物学指标。t a f a l l a 4 0 】在实验中发现，佛波醛 和s 亚硝基，n 一乙酰化青霉胺等化学物质能刺激n o 的产生但并不能改变血细胞的噬 菌活力，因此n o 对贝类免疫体系的影响机制和作用还需要进一步的研究。 1 2 2 5 蛋白酶抑制剂 对于细菌和寄生虫等贝类常见的病原生物来说，蛋白酶是它们入侵的武器，而 蛋白酶抑制剂是贝类对特定病原具抵抗力并保护自身蛋白免受损害决定因素之一。 a v e r y 等1 4 1 l 证实对派会虫( p e ，足i ，s “sm a r i n u s ) 有抗性的美洲牡蛎l f l l 淋巴能强烈抑制来 自寄生虫体内的丝氨酸蛋白酶，对购买的蛋白酶制品半胱氨酸蛋白酶和木瓜蛋白酶 也有抑制效果；而来自对该寄生虫敏感的美洲牡蛎血淋巴刘丝氨酸蛋白酶的活性不 起作用，只降低胃蛋白酶酶制品活性。a d h a m 等4 2 l 还从对派金虫具有抗性的太平洋 牡蛎血淋巴中分离到另一种蛋白酶抑制剂a 巨球蛋白。因此有理由认为蛋白酶抑制 剂是贝类体液免疫重要成员。 1 2 3 贝类免疫基因相关研究进展 1 2 3 1 免疫相关基因的筛选 贝类免疫相关基因的研究是免疫防治贝类疾病的理论基础。g u e g u e n 等1 4 3 l 采用 表达序列标记程序分析了太平洋牡蛎的血淋巴，发现其中3 个基医在牡蛎对细菌感染 应答的诱导中表达，说明这3 个基因与牡蛎的免疫有关。e s e o u b a s 等1 44 l 则采用m r n a 差异显示技术筛选出在牡蛎免疫系统被激活的过程中特异表达的m r n a 序列，用这 种技术检测细菌l p s 和佛波酯处理后初级培养的牡蛎血细胞以及拨细菌感染的牡蛎 血淋巴中有关m r n a 序列，找到3 条差异条带可能与牡蛎免疫应答有关。 1 2 3 2 免疫相关基因的克隆和表达 近年来，越来越多的贝类免疫相八基因逐渐获得克隆和表达，克隆并分析了贝 类血淋巴中存在的类似高等动物免疫相关基因片段，证实该基因与贝类免疫的密切 关系。b a r r e a u 等1 4 5 】克隆和分析了太平洋牡蛎的c g t a l 基因，发现该基因编码的2 2 9 个氨基酸残基中还包含1 个与脊椎动物和无脊椎动物的t a l i c l 具有高同源性功能区 b h l h 。s o n g - 等1 4 6 】用表达序列标签e s t _ ； hr a c e 技术克隆栉孑l 扇贝饿结合蛋白的 第1 章绪论 c d n a ，并用半定量r t p c r 技术证实了经微生物感染后栉孔扇贝血细胞中硒结合 蛋白显著高于未经诱导的扇贝血细胞。 1 2 3 3 免疫相关基因的转移 基因转移技术已广泛地应用于动植物的研究，但极少应用于海洋贝类原因是： 贝类的各种细胞株、同源的启动子和合适的转移载体不易获得，而且很难将外源基 因导入贝类胚胎。但双脐螺的胚胎细胞株( b g l a b r a t ae m b r y o n i c ，b g e ) 却因其具有 底物吸附机制及吞噬活性、可以粘附和包被血吸虫幼体的特性两被作为贝类转基因 系统的细胞株。y o s h i n o 等【4 7 】把7 0 k u 的双脐螺热休克蛋白启动子) - y yj j 插入上游带有荧 光素酶报告基因的兀启动子序列的表达载体p c d n a 3 ，并将构建的基因通过d o t a p 介导的转染方法导入双脐螺b g e 获得表达所获得的双脐螺人造血细胞可用于血细 胞的生化和功能分析，或通过与血吸虫幼体起培养来测定b g e 细胞所分泌的免疫 因子在血吸虫幼体存活中发挥的作用。 1 2 3 4 免疫榍关基墨的重组和基因疫苗 与传统的疫苗摺比，基因工程疫苗具有免疫效果好、免疫应答持久、可多途径 接种和制备方法简币的特点，因此贝类基因疫苗研究也丌始为学者所重视。鲎肽是 类分离自美州鲎概“缸5 p d 幼如绷“s ) 的广谱抗茵肽。p i e r c e 等【4 8 l 将带有鲎肽基因的 重组