（水产品加工及贮藏工程专业论文）海洋微生物n2a过氧化氢酶性质、保存稳定性及固定化的研究.pdf

上海海洋大学硕士学位论文 海洋微生物n r a 过氧化氢酶性质、保存稳定性及固定化的研究 摘要 过氧化氢酶是一种能够高效催化分解过氧化氢的酶，广泛应用于食品消毒、 临床分析、医学诊断以及纺织、造纸、制浆等工业。本论文对海洋微生物n 2 a 过 氧化氢酶酶学性质、保存稳定性、应用潜力以及固定化等方面进行了研究。 对该新型海洋微生物n 2 a 过氧化氢酶进行初步纯化，并对n 2 a 过氧化氢酶的 基本酶学性质进行研究，结果表明：过氧化氢酶最适作用温度为3 0 ，p h 在6 - 1 1 时，过氧化氢酶的活性没有显著变化，有较宽且偏碱的最适p h 范围；不同温度恒 温水浴处理2 h 后，3 0 。c 下过氧化氢酶活保留率在9 0 以上，而6 0 时活性仅为初 始酶活的6 8 ；在不同p h 的缓冲体系里于4 下放置4 8h 后，在p h 6 - 8 范围内 酶活性较稳定，该酶在碱性条件下相比在酸性条件下更稳定；m n 2 + 对酶有较好的 激活作用；c a 2 + 、m 9 2 + 、k + 、n h 4 + 对酶无影响；z n 2 + 、l i + 、s r 2 + 、8 a 2 + 、a 矿对 酶有抑制作用；微生物过氧化氢酶与大部分非金属离子配伍性良好；n a c l 浓度为 0 1 0 m o l l 时，对过氧化氢酶的活性没有显著影响，n a c i 浓度为1 0 - 2 0 m o l l 时， 酶活力逐渐下降，n a c i 浓度3 0 m o l l 时，过氧化氢酶失活。 过氧化氢酶较不稳定，在存放过程中酶的活力损失较大。加入明胶、氯化钙、 甘油、氯化钠以及戊二醛等不同稳定剂后，酶活保留率都有明显的提高，其中盐 析后置于t r i s 缓冲液中的酶液加甘油稳定性最好。向其中加入甘油9 0 9 l ，在3 0 保存6 0d 酶活保留率为7 0 3 。 将n 2 a 所产的过氧化氢酶同来源于牛肝的过氧化氢酶进行了热( 6 0 c 、7 0 ) 、 碱( 9 0 、1 0 0 、1 1 0 ) 稳定性的比较。结果显示，n 2 a 所产的过氧化氢酶对高温和强 碱性的耐受性明显优于牛肝过氧化氢酶，在纺织染整工艺中具有良好的应用潜力。 以海藻酸钠为载体采用包埋法制备固定化过氧化氢酶，对其最佳固定化条件 与酶学性质进行了研究。结果表明：海藻酸钠浓度2 ，氯化钙浓度3 ，给酶量 4 0m l ，固定化时间4 5r a i n ，在此条件下制备的固定化过氧化氢酶活性保持率为 3 7 2 。该酶经固定化以后，酶学性质研究表明，热稳定性提高，固定化酶在6 0 保存2h 相对活力为初始的2 7 3 ，而游离酶仅为6 8 ，且其p h 稳定性及贮存稳 定性较游离酶均有所增强，固定化过氧化氢酶还具有良好的可操作性，重复8 次， 酶活力仍能保持在7 5 以上。 t 上海海洋大学硕士学位论文 本结果具有一定的创新性，填补了国内在海洋微生物过氧化氢酶研究领域的 一些空白，对加速开发我国海洋微生物资源的利用及其产业化具有重要的理论和 实际意义。 关键词：海洋微生物，过氧化氢酶，酶学性质，稳定剂，固定化 上海海洋大学硕士学位论文 s t u d yo np r o p e r t i e s ，s t a b i l i t yi ns t o r a g e a n di m m o b i l i z a t i o n o fm a f i n em i c r o b i a ln 2 ac a t a l a s e a b s t r a c t c a t a l a s eh a sh i g h - e f f e c t i v ec a t a l y s i sa n dd e c o m p o s i t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ea n d p o t e n t i a la p p l i c a t i o n s i nt h ef i e l do ff o o dd i s i n f e c t i o n , c l i n i c a la n a l y s i s ，m e d i c a l d i a g n o s i s ，t e x t i l e ，p a p e ra n dp u l p i n gi n d u s t r y p r o p e r t i e s ，s t a b i l i t yi ns t o r a g e ，p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n sa n di m m o b i l i z a t i o no ft h ec a t a l a s ef r o mt h es t r a i nn 2 a w e r es t u d i e d an o v e lm a r i n em i c r o b i a lc a t a l a s ef r o mt h es t r a i nn 2 aw a sp r i m a r i l yp u r i f i e da n d c h a r a c t e r i z e d t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo fc a t a l a s ew a s3 0 。c ，a n dt h ec a t a l a s ea c t i v i t y w a ss t a b l ew i t h i nt h ew i d ea n da l k a l i n er a n g e t h et h e r m a ls t a b i l i t yo ft h ec a t a l a s ew a s w e l li nt h a tt h e r ew a sa b o v e9 0 o fe n z y m ea c t i v i t ya t3 0 。cf o r2 hw a t e ri n c u b a t i o n w i t ht h et e m p e r a t u r ei n c r e a s i n ge n z y m ea c t i v i t yg r a d u a l l yl o s t t h e mw a so n l y6 8 o f e n z y m ea c t i v i t ya t6 0 。c a n dt h ec a t a l a s ew a ss t a b l ew i t h i nt h er a n g eo fp h6 - 8a t4 c f o r4 8h m 矿a c t i v a t e dc a t a l a s eb u tz n 2 + 、l i + 、s p 、b a 2 + 、g fi n h i b i t e dc a t a l a s e a c t i v i t y t h ec a t a l a s es h o w e dg o o dc o m p a t i b i l i t yt om o s tc o m m o n n o n - m e t a li o n t h ec a t a l a s ei sn o ts t a b l e w h e ns t a b i l i z i n ga g e n tw a sa d d e d ，t h er e s i d u a la c t i v i t y o ft h ec a t a l a s ei n c r e a s e d t h er e s u l to fp r e s e r v a t i o nc o n d i t i o ns t u d ys h o w e dt h a tt h e r e s i d u a la c t i v i t yo ft h ec a t a l a s ee x c e e d e d7 0 e v e ni tw a sc o n s e r v e d6 0d a y sa t3 0 w h e n9 0 9 lg l y c e r o lw a sa d d e di n t ot h es a l t i n g - o u tc a t a l a s ei n t r i sb u f f e r t h e r m a la n da l k a l i n es t a b i l i t yo ft h ec a t a l a s ew a sc o m p a r e d 、 ，i 廿1t h ec o m m e r c i a l a v a i l a b l ec a t a l a s ep r o d u c e df r o mb o v i n e t h ec r u d ee n z y m ef r o mt h es t r a i nn 2 as h o w e d s t r o n g e rs t a b i l i t i e sa t ( 6 0 c 、7 0 c ) a n d ( p h 9 0 、p i l l 0 0 、p m1 0 ) t h a nt h eo t h e rt y p eo f c a t a l a s e ，i n d i c a t i n gag r e a ta p p l i c a t i o np o t e n t i a li n t h ec l e a np r o d u c t i o np r o c e s so f t e x t i l ei n d u s t r y t h eo p t i m u mt e c h n o l o g yo fi m m o b i l i z e dm a r i n ec a t a l a s ew i t hs o d i u ma l g i n a t ea n d s o m ep r o p e r t i e so ft h ei m m o b i l i z e dc a t a l a s ew e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h e o p t i m a lc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z a t i o n ：t h eo p t i m a ls o d i u ma l g i n a t ec o n c e n t r a t i o nw a s 2 ，t h eo p t i m a lc a c hc o n c e n t r a t i o nw a s3 ，t h eo p t i m a lc a t a l a s ed o s a g ew a s4 0m l ， i 上海海洋大学硕士学位论文 a n dt h eo p t i m a ls o l i d i f i c a t i o nt i m ew a s4 5m i n , o nt h i sc o n d i t i o n , t h er e c o v e r yo f e n z y m ea c t i v i t yw a s3 7 2 v a r i o u sc h a r a c t e r i s t i c so fi m m o b i l i z e dc a t a l a s es u c ha s t h e r m a ls t a b i l i t y , p ns t a b i l i t y , s t o r a g es t a b i l i t y , a n do p e r a t i o n a ls t a b i l i t yw e r ee v a l u a t e d t h et h e r m a ls t a b i l i t yo ft h ei m m o b i l i z e dc a t a l a s ew a sb e t t e rt h a nt h ef r e ee n z y m e t h e r e w a sa b o v e4 5 3 o fr e l a t i v ea c t i v i t yw h e nt h ei m m o b i l i z e dc a t a l a s ew a sh e a t e da t6 0 ( 2 f o r2l l ，w h i l et h ef r e ee n z y m ew a so n l y16 8 a sc o m p a r e dw i t hf r e ec a t a l a s e ，t h ep h s t a b i l i t ya n dt h es t o r a g es t a b i l i t yo ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew e r ei n c r e a s e d m o r e o v e r , t h ei m m o b i l i z e dc a t a l a s eh a d g o o do p e r a t i o n a ls t a b i l i t y ，w h i c hc o u l db er e p e a t e d l yu s e d f o r8t i m e sa n dt h er e l a t i v ea c t i v i t yo f t h ec a t a l a s ew a sa b o v e7 5 n l er e s u l t ss h o w e dac e r t a i ni n n o v a t i o n , w h i c hf i l l e di nd o m e s t i cb l a n ki nt h ef i e l d o fm a r i n em i c r o b i a lc a t a l a s e t h e yh a di m p o r t a n tt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e o na c c e l e r a t i n gt h ed e v e l o p m e n t ，u t i l i z a t i o na n di n d u s t r i a l i z a t i o no fm a r i n em i c r o b i a l r e s o u r c e si nc h i n a k e yw o r d s ：m a r i n e m i c r o b e s ，c a t a l a s e ，p r o p e r t i e s ，s t a b i l i z i n ga g e n t ，i m m o b i l i z a t i o n i v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：易6 范 日期：2 彤b 年石月乃日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口 学位论文作者签名：穆0 嚣 日期：二噼石仍日 指导教师签名：翻、篮 日期：孤睥多月琴日 上海海洋大学硕士学位论文 引言 海洋中生活着大量生物，它们占了地球上整个生物物种的8 0 。如此众多的 海洋生物资源是我们开发医药、食品、化工产品的巨大宝库。海洋微生物是海洋 生物的重要成员，而且海洋微生物的代谢类型极其多样化，可以完全在人工控制 条件下以惊人的速度生长繁殖，且海洋微生物种源丰富，未知者众多，变异性大， 容易选育出高产菌株，所以海洋微生物是获得生物活性物质的新来源。海洋微生 物的活性物质作为海洋药物越来越引起人们的高度重视，开发海洋微生物资源是 海洋药物工业化可持续发展的新途径。 过氧化氢酶又称触酶，是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧 化酶，酶分子结构中含有铁卟啉环，一个分子酶蛋白中含有四个铁原子，专一分 解过氧化氢，溶于水，几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚。过氧化氢酶是在生物演化 过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧 化氢分解，防止脱脂过氧化。过氧化氢酶的研究可追溯到1 9 世纪初，广泛用于生 物、医药、临床和食品中的某些分析测定，在食品和乳制品工业、纺织工业、制 浆和造纸工业、医疗器械的消毒、葡萄糖酸的生产等方面也有越来越多的应用。 本论文对一种新型的海洋微生物过氧化氢酶进行了酶学性质、保存稳定性、 应用潜力及固定化等方面的初步研究，为海洋微生物过氧化氢酶的研究和应用奠 定了基础，同时对海洋资源的可持续发展也具有重要的意义。 上海海洋大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1过氧化氢酶的研究概况 过氧化氢酶( h y d r o g e np e r o x i d e ：h y d r o g e np e r o x i d eo x i d o r e d u c t a s ee c1 1 1 1 6 ) u 1 以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气。 因为所有的好氧生物在进行氧代谢时均会产生有害的氧自由基，这其中就包括 h 2 0 2 ，因此，过氧化氢酶是生物抗氧化体系中的重要成员酶。 学术界对过氧化氢酶的研究历史比任何其他酶类都要悠久【2 3 】：t h e n a r d ( 1 8 1 1 ) 首先发现过氧化氢( h 2 0 2 ) 可以被动、植物组织分解产生氧气，s c h o n b e i n ( 18 6 3 ) 认为 是某种酶在起作用。1 9 0 1 年，l o e w 将该酶命名为过氧化氢酶( h y d r o g e n p e r o x i d a s e ) ，又称触酶( c a t a l a s e ，简称c a t ) 1 4 。s t e m ( 1 9 3 6 ) 证明卟啉环是c a t 活 性中心，其后s u m m e r 等( 1 9 3 7 ) 得到了牛肝c a t 结晶，h e r b e r ta n dp i n s e n t ( 1 9 4 8 ) 则从藤黄微球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 获得了原核c a t 。随后大量研究发现c a t 广 泛存在于动物、植物和微生物中，动物肝脏、红细胞、植物叶绿体以及细菌和真 菌等中含有大量c a t 。迄今c a t 已经成为农业以及与之相关的食品与乳制品业、 纸浆和造纸业以及农业环保产业中有应用价值的酶之一。 1 1 1 过氧化氢酶的类型划分 早期按来源不同把c a t 划分为真核c a t 和原核c a t 。真核c a t 主要来源 于动植物组织中，其中哺乳动物组织中c a t 含量差异很大，肝脏中含量最高，结 缔组织中含量最低，在上述组织细胞内，c a t 主要与细胞器如线粒体和过氧化物 酶体结合形式存在，而在红细胞中则以可溶状态存在。原核c a t 主要来源于细菌， 研究发现，几乎所有需氧微生物中都存在c a t ，但也有少数好氧菌，如过氧化醋 杆菌( a c e t o b a c t e rp e r o x y d a n s ) 不存在c a t 。 1 9 8 9 年，g o l d b e r ga n dh o c h m a n 按照不同理化特性，将c a t 划分为典型性 ( t y p i c a l ) 、非典型性( a t y p i c a l ) 和c a t - 过氧化物酶( c a t a l a s e - p e r o x i d a s e s ，c a t - p o d ) ， 通常认为这也是一种符合进化关系的划分。按催化中心结构差异可分为两类：一、 含铁卟啉结构c a t ，又称铁卟啉酶，典型性c a t 和c a t p o d 属于此类；二、含 2 上海海洋大学硕士学位论文 锰离子代替铁的卟啉结构，又称为锰过氧化氢酶( m n c a t ) 【5 】，非典型性c a t 属于此 类。 1 1 2 过氧化氢酶的结构特点和功能 1 1 2 1典型c a t 典型c a t ，又称单功能血红素c a t ，几乎存在于所有需要呼吸组织，包括 真核生物和原核生物，大部分典型c a t 尽管来源不同，但在结构上具有高度相似 性。它们都是由4 个具有相同多肽链的亚基组成，每个亚基含有一个血红素辅基 作为活性位点，该辅基的形式为铁卟啉。典型性c a t 亚基由四个结构域组成，大 约4 6 0 个氨基酸残基。一个酶分子中含有四个铁原子，其作用基团是血红素，相 对分子量一般为2 0 0 3 4 0 k d t 6 1 。目前几种获得晶体结构的c a t 分别来自牛肝 ( b l c ) 、微紫青霉( p e n i c i l l i u mv f t a l e ) 、溶壁微球菌( m i c r o c o c c u sl y s o d e i k t i c u s ) 、奇异 变形菌( p r o t e u sm i r a b i l i s ) 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i , h p i i ) 、啤酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，c a t a ) 、人红细胞( h e c ) 等【7 1 。从其晶体数据来看，非同 源c a t 亚基结构有很大的相似性，如在水溶液中，黑曲霉c a t 和牛肝c a t 的二 级结构含量基本一致【引。 天然典型性c a t 活性位点处于高度自旋f e 3 + 状态，它可以在h 2 0 2 的2 一电子 氧化下形成复合物i ，在此过程中铁原子失去一电子从而与h 2 0 2 的氧原子形成氧 代铁部分，卟啉环失去另一电子形成i i 一阳离子基，然后复合物i 又在另一分子 的h 2 0 2 的2 一电子还原下转变成天然的状态，即f e ”状态，从而完成一个催化循环。 1 1 2 2非典型性c a t 目前从生物体内发现的非典型性c a t 非常少，b e y c r 等( 19 8 5 ) 及b a r y n i n 等 ( 1 9 8 6 ，1 9 9 7 ) 分别从乳酸菌和嗜热菌中获得【6 】。通过电子光谱与电子自旋共振( e s r ) 谱证实其中含有两个紧邻的锰离子，存在混合价态物种m n 2 ( i i ，i i i ) 和m n 2 ( i i i ，i v ) ， 还原态物种显示弱的反铁磁性偶合，而氧化态物种m n 2 ( i i i ，) 显示较强的反铁磁性 偶合，截至目前，己知m n c a t 有四种物种：( ，i i ) 、( i i ，) 、( ，) 、( i n ，i v ) ， 其中只有m n 2 ( i i ，i i ) 和m n 2 0 i i ，i ) 物种显示了极高的催化歧化效率，而活性m n c a t 用n h 2 0 h 和h 2 0 2 处理后则失活，认为是形成了非催化活性物种m t l 2 ( 1 ，) 和 l n 2 ( t u ，i v ) 。 1 1 2 3c a t p o d 该类c a t 广泛存在于动、植物组织中，微生物中仅在真菌里有发现。可以说 c a t p o d 在自然界中是典型性c a t 的衍生物，是c a t 同p o d 产生的可逆聚合 3 上海海洋大学硕士学位论文 体。他们的分子量大约为1 2 0 一3 4 0 k d ，通常该酶属于同型二聚体，也有一部分属 于四聚体。同典型性c a t 相比，c a t p o d 具有更为庞大的结构单元，它包含至 少7 0 0 个氨基酸残基。 c a t p o d 的典型特点是具有两种不同催化行为。由于同样含有铁血红素结 构，所以具有同典型性c a t 相同催化功能，不同于典型性c a t 的是c a t - p o d 催 化能力要低1 个数量级，在生物体中，这种差别几乎可以忽略不计。c a t - p o d 对 于有机组织中过氧化反应具有更宽底物范围。典型性c a t 对p h 变化不敏感，与 之相比，c a t p o d 对于温度、p h 、i - 1 2 0 2 含量变化表现更为敏感。对于典型c a t 抑制剂3 氨基1 ，2 ，4 一三唑( a t ) ，c a t p o d 不受抑制，仅血红素铁发生暂时性 变化【9 l 。 1 1 3 过氧化氢酶的生理功能和环境胁迫的关系 过氧化氢酶作为生物体内重要物质，具有非常重要的生理功能，其中最为主 要的就是参与活性氧代谢过程。氧分子对生物体是无毒性的，一旦氧分子的电子 分布发生改变，就变成活性氧。活性氧的种类包括h 2 0 2 、羟自由基( o h ) 、超氧 阴离子( 0 2 ) 3 种【1 0 1 。在活性氧代谢过程中，c a t 可以使n 2 0 2 发生歧化生成水和 氧分子。 在环境胁迫等逆境情况下，生物体内广泛存在活性氧爆发现象，导致自由基 增多，使细胞膜产生过氧化，导致细胞膜的破坏和损伤。c a t 与超氧化物歧化酶 ( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 共同组成了生物体内活性氧防御系统，在清除超氧自由 基、h 2 0 2 和过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥重要作用。据国 外资料报道，动、植物体内c a t 对多种环境因子均有明显的生态效应( 紫外光，二 氧化硫，氮氧化物，氨气以及重金属等等) ，其研究成果的应用价值在于抗毒、防 癌及环境生物学监测等诸多方面【n 】。多种环境因子对生物生理生化过程的影响， 可以通过生物体内c a t 表现出来。 1 1 4 过氧化氢酶的应用 1 1 4 1在造纸行业的应用 氯作为漂白剂已经使用了一个多世纪，但它能够产生有毒和致癌的化学品二 恶英等副产物。自2 0 世纪8 0 年代以来，织物和纸张的生产者以及其他工业就已经 开始使用过氧化氢代替有毒的氯气来漂白和消毒产品。尤其是在漂白废水中发现 剧毒二苯并二恶英p c d d s ，氯代二苯并呋喃p c d f 类物质后，世界各国相继采取 措施，禁止在纸浆和造纸工业上采用含氯漂白剂。在纺织和制浆造纸工业用过氧 4 上海海洋大学硕士学位论文 化氢替代含氯产品进行漂白已经成为趋势，目前漂白工艺已经向更为环保的过氧 化氢漂白工艺转变，这也意味着需要去除的过氧化氢随之增多，过氧化氢漂白废 水的处理手段之一是用清水稀释，但随之而来的是成本问题和产生更多的废水； 另一个废水处理的传统方法是用s 0 2 和亚硫酸氢钠去除漂白后的h 2 0 2 ，进行化学 法处理，但其产生的有害残余物本质上又抵消了使用过氧化氢的环境效益。随着 世界各国对环境和安全问题考虑，促进了寻找替代s 0 2 和亚硫酸氢钠去除h 2 0 2 方法研究。最直接的废水处理方法是使用过氧化氢酶分解过氧化氢。为去除工业 废水中漂白残留的过氧化氢，化学家将注意力转向过氧化氢酶。大范围地使用过 氧化氢酶可以使工业漂白的环境成本降低数十倍。而用过氧化氢酶不仅可以完全 去除过氧化氢，节约用水和能源，缩短工艺时间，而且不会生成硫酸盐或氯盐等 有害物质，酶本身又是生物可降解材料，有利于保护环境。 1 1 4 2在纺织和印染行业的应用 近年来，随着绿色环保意识与要求的不断加强，过氧化氢酶得到广泛应用，特 别是印染行业，在棉针织物氧漂染色工艺中，采用过氧化氢酶生物除氧。过氧化氢酶 在棉织物前处理过程中的主要作用是去除织物漂白废液中残余的h 2 0 2 ，以免给后 续染色工序带来问题。应用过氧化氢酶实现漂染同浴，与传统的高温水洗工艺相 比，不仅能节省大量的水、电、气和人工，大幅度降低成本，提高生产效率，还 能减少废水的排放，有利于环保。水的消耗和工业生产废水的处理正在变得越来 越昂贵，因此大多数染色和整理工厂正密切注视着减少水的消耗和废水排放的节 约潜力。过氧化氢酶在染色前处理漂白浴液，可实现水和能源相当大的节省。 张瑞萍( 2 0 0 0 ) 、何照兴等( 2 0 0 1 ) 研究了过氧化氢酶在棉针织物漂染工艺中的应 用，认为采用酶除氧代替传统的高温水洗除氧，对织物的强力无损伤，且能降低能 耗开支，缩短了生产周则1 2 , 1 3 】。徐冈1 ( 2 0 0 5 ) 研究了过氧化氢酶在染纱生产中的应用， 认为在染纱前处理后的水洗过程中使用过氧化氢酶去除残余的双氧水，可以节约生 产成本约1 2 7 1 7 6 元t 纱，提高设备利用率3 ，同时可减少废水排放，降低环境污染， 而且不会影响纱线的强力和染色效果【1 4 】。巴西a m o r i m 等( 2 0 0 2 ) 研究了过氧化氢酶 在棉织物漂染工艺中的应用，获得了和国内研究者相同的结果i l5 。对埃及的一个 纺织厂调查显示，使用过氧化氢酶可以在许多方面实现节约：能量节省2 4 ，化 学药品成本节省8 3 ，用水量节省一半，工艺流程省时3 3 i l6 。奥地利p a a r 等 ( 2 0 0 1 ) 、f r u h w i r t h 等( 2 0 0 2 ) 、葡萄牙c o s t a 等( 2 0 0 1 ) 研究固定化过氧化氢酶处理印 染废水使之循环使用，p a a r 等( 2 0 0 3 ) 还研究了固定化产过氧化氢酶的细菌细胞处理 5 上海海洋大学硕士学位论文 印染废水【1 7 之o l 。除去过氧化氢的漂白水循环使用与以前用淡水的工艺相比，染色 后织物的色泽差异很小( 视觉上无差异) 。过氧化氢酶在纺织行业中将有广阔的应用 前景。 1 1 4 3在食品与乳制品行业上的应用 过氧化氢酶可作为一种食品添加剂，主要用于干酪，牛奶和乳制品等的生产，以 消除由紫外线照射产生过氧化氢而造成的特异臭味。在牛奶保存和奶酪制造前用 过氧化氢对牛乳和干酪原料乳进行杀菌消毒，然后再用过氧化氢酶去除残余过氧 化氢。与加热杀菌不同，这种杀菌消毒可以在低温下进行，不仅不会杀灭有用的 乳酸菌，而且不会影响到脂肪酶、蛋白酶及磷酸酶的作用。在食品保藏中利用葡 萄糖氧化酶去除食品中残留的葡萄糖或氧时，生成的过氧化氢用过氧化氢酶分解， 分解时产生的氧有杀菌和漂白作用。范孝用等( 1 9 9 9 ) 研究了葡萄糖氧化酶和过氧化 氢酶体系在牛奶保鲜中的应用，认为这个体系制成的保鲜酶制剂能使消毒的牛乳 常温下保存一周质量不变，保鲜效果显著【2 l 】。t a r h a n ( 1 9 9 5 ) 用d e a e 纤维素固定化 过氧化氢酶处理牛奶中的残留过氧化氢取得理想的结果【2 2 】。固定化过氧化氢酶技 术保鲜奶制品的方法已被世界粮农组织和世界卫生组织批准，并确认不会对健康 带来任何危害【2 1 1 。过氧化氢酶也是牛乳质量检测指标【2 3 1 。利用过氧化氢酶分解过 氧化氢放出0 2 的性质，可以在烘烤食品过程( 如面包制作) 中同时添加过氧化氢和 过氧化氢酶作为疏松剂洲。过氧化氢酶和过氧化氢联合使用，还可用于橡胶成型、 塑料和多泡性粘合剂。这也是利用其分解过氧化氢放出0 2 的性质。 1 1 4 4在医学及其他方面上的应用 由于过氧化氢酶重要的生理功能，所以它在生物界广泛分布。又由于过氧化 氢酶活性易于定性或定量地测出，所以它可以用于环境生物学监测1 2 副。出于同样 的原因，过氧化氢酶检测已成为微生物分类鉴定的常规指标【2 6 j 。过氧化氢酶还可 以用于医学检测诊断闭。对于消化系统、泌尿系统和血液疾病以及肿瘤检测，过 氧化氢酶活性是参考指标之一。过氧化氢酶作为公认的抗氧化酶，在医学上还有 很大的应用潜力。土耳其a l a c a m 等( 2 0 0 0 ) 利用明胶作为载体将过氧化氢酶用于促 进牙髓组织愈合，效果很显著i 2 引。在头孢菌素( e e p h a l o s p o f i n ) - - ! l k 生产中，戊二酰 基7 氨基头孢烷酸( g l u t a r y l 7 a c a ) 是重要的中间体。在利用酵母t r i g o n o p s i s v a r i a b i l i s 细胞破碎液中的d 氨基酸氧化酶生物合成g l u t a r y l 7 a c a 的反应中，过 氧化氢酶是生物转化的干扰因素1 2 9 1 。而在利用乳酸氧化酶氧化乳酸生产丙酮酸的 工艺中，过氧化氢酶是促进因梨3 0 1 。 6 上海海洋大学硕士学位论文 1 1 4 5过氧化氢酶制剂的应用概况 近年来过氧化氢酶在纺织印染、造纸制浆、食品和废水处理等行业广泛使用。 产业对过氧化氢酶制剂的需求日益增长。随着过氧化氢酶制剂的广泛使用，许多 问题也暴露出来。国内有十几家企业生产过氧化氢酶的液体酶制剂，主要用于纺 织印染，其次用于食品行业。过氧化氢酶来源于动物脏器或常见微生物，主要在 中性( p h 6 至9 ) 和中温条件( 3 5 c 至4 5 。c ) 起作用，制剂技术含量低，产品活性低于 1 0 万u m l ，对过氧化氢的耐受能力低( 小于1 0 0 0 p p m ) ，对保藏条件要求高( 低温或 低于2 5 c ) 。如果这些过氧化氢酶制剂在工业( 如印染) 常用的高温、高碱、高盐和 高氧化剂条件下使用，效果很不理想。造成这一问题的主要原因是国内过氧化氢 酶生产企业缺乏自主知识产权，未掌握核心技术，过氧化氢酶的生产存在低水平 重复现象。国外企业过氧化氢酶制剂用于食品行业的有g e n e n c o r 公司的f e r m c o l a s e 和e n z y m ed e v e l o p m e n t 公司的e n z e c o c a t a l a s e 等；用于纺织行业的有 n o v o z y m e s 生产的t e r m i n o x u l t r a 、上海有田酵素有限公司的r e y o n e ts ，g e n e n e o r 生产的g e n e n c o r c a t a l a s et 1 0 0 和o x y g o n et 4 0 0 等。这些酶使用成本高，同样 存在上述国产过氧化氢酶的问题。扩大酶制剂应用范围，提高酶催化效率，解决 过氧化氢酶制剂应用难题的出路在于筛选新酶和采用新制备与制剂技术。s h i x u r d o n g 等构建了分泌表达芽孢杆菌过氧化氢酶的b a c i l l u s s u b t i l i s 重组菌株，用于 大规模制备过氧化氢酶【3 1 1 。海洋中微生物资源丰富，长期以来研究关注较少。开 发海洋微生物资源，寻找新型酶是应用生物技术研究的前沿。l o r e n t z e n 等纯化了 海洋细菌v i b r os a l m o n i c i d a 的高活性过氧化氢酶，但未进行应用研列3 2 j 。国内也 尚未见海洋微生物过氧化氢酶方面的基础与应用研究报道。 1 1 5 国内外过氧化氢酶研究现状 目前，国内、外对微生物过氧化氢酶的研究主要停留在不同来源过氧化氢酶 的性质上，真正将其进行工业化生产并用于棉、纺织行业的不多。现在国外研究 集中于用x 射线分析过氧化氢酶的立体结构及活性中心【3 3 1 、过氧化氢酶去除染织 中残留的过氧化氢的应用 3 4 1 、强磁场及超声波和辐射对过氧化氢酶酶活的影响等 1 3 5 】。动物肝脏是过氧化氢酶的一个很大来源，国内外均已实现这一工艺的工业化 生产。巴西研究者最近又开发了从人胎盘中提取医用过氧化氢酶的技术【3 6 j 。现在 市售商品过氧化氢酶基本为牛肝过氧化氢酶，纺织用商品过氧化氢酶基本由丹麦 n o v o z y r n e 垄断，产自经基因改性后的黑曲霉。国内外关于过氧化氢酶的制备技术 方面的研究现状见表1 1 。 7 上海海洋大学硕士学位论文 表卜l 过氧化氢酶制备技术国内外研究现状跚一3 1 t a b l e1 - 1r e s e a r c h e sh a v eb e e nd o n ei nc a t a l a s ep r o d u c t i o n 国外研究现状国内研究现状 国外报道的产过氧化氢酶的细菌有溶壁微球菌、球形红假单孢菌、已报道黑曲霉、乳酸 足球菌属、链球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、大肠杆菌及嗜热性薯：勰墨羹 细菌；真菌有粗糙脉孢霉、微紫青霉、嗜热链霉菌和黑曲霉； 链霉菌、溶壁微球菌和 日本在过去2 0 年间有9 项专利用霉菌、酵母、细菌和重组菌生产重组大肠杆菌生产过 过氧化氢酶( 包括固态发酵和液态发酵) ，其中涉及过氧化氢酶在纺织氧华氢酶，但产酶水平 工业中的应用。美国、丹麦各有1 项用霉菌生产过氧化氢酶的专利。台湾申请了重组大 现在市售商品过氧化氢酶基本为牛肝过氧化氢酶，价格相对较高。肠杆菌生产过氧化氢 目前对研究主要停留在不同微生物来源的过氧化氢酶性质上，真正酶并用于隐形眼睛消 将其进行工业化生产并用于棉、纺织行业的没有报道。 翥芸喜? 余过氧化氢 目前已用于生产过氧化氢酶的菌株及合成水平见表1 2 ： 表卜2 过氧化氢酶主要生产用菌株及合成水平。4 3 1 t a b l e1 - 2s t r a i nf o rc a t a l a s ep r o d u c t i o na n di t sa c t i v i t yi nm e d i u m 1 2 固定化酶的研究概况 8 上海海洋大学硕士学位论文 1 2 1 固定化酶的概述 固定化酶技术是2 0 世纪6 0 年代发展起来的一项生物工程技术，是使生物酶 得到广泛而有效利用的重要手段。酶的固定化( i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e s ) 是用固体 材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行其特有的催化反应，并可回收及重复利 用的技术m 。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特 性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现了储存稳定性高、分离回收容易、 可重复多次使用、操作连续可控、工艺简便等优点。固定化酶的研究不仅在化学 生物学、生物工程学及生命科学等领域异常活跃，而且因为具有节省能源、减少 污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求【4 5 闱。 1 2 2 固定化酶的方法 现在酶的固定化方法大致可以分为4 类：吸附法( a d s o r p t i o n ) 、共价法 ( c o v a l e n t b i n d i n g ) 、交i 激( c r o s s 1 i n k i n g ) 、包埋法( e n c 印s u l a t i l l 曲h 7 1 。 1 2 2 1吸附法 吸附法包括物理吸附和离子吸附。物理吸附法是使酶直接吸附在载体上的方 法，常用的载体有有机载体( 如面筋、淀粉等) 和无机载体( 如氧化铝、活性炭、多 孔玻璃、硅胶等) ；离子吸附法是将酶与含有离子交换集团的水不溶性载体结合， 酶与载体结合相对牢固，常用的载体有阴离子载体( 如二乙氨基乙基一纤维素、 d e a e 葡聚糖凝胶、i r a 9 0 0 等) 和阳离子载体( 如羧甲基一纤维素、i r - 1 2 0 、 d o w e x 5 0 等) 。吸附法主要依靠蛋白质和载体间的结合力联结，缺点是作用力较弱， 酶易脱落，优点是载体选择范围较广，固定化操作过程简单。 m a r t i nn o r i n 等【4 8 】用亲水性载体玻璃羊绒( g l a s s w 0 0 1 ) 、多孔玻璃( p o r o u sg l a s s ) 和漂白土( b l e a c h i n ge a r t h ) 以及疏水性载体c 1 8 漂白土和l i c h r o s o br p 1 8 吸附法固 定化脂肪酶，得到最大固定化酶活力为0 9 m o l ( g m i n ) 。t s u n e o 等 4 9 1 研究了两亲性 凝胶( o c t y l - s e p h a r o s ec l - 4 b 和p h e n y l s e p h a r o s ec l - 4 b ) 吸附法固定化脂肪酶，其固 定化效率为9 6 8 9 9 6 ，用该固定化酶催化水解脂肪酸使用5 次( 6 4 h ) 后其水解率 由4 8 降到3 0 。 1 2 2 2共价结合法 酶蛋白分子上功能基团和固相支持物表面上的反应集团之间形成化学共价键 结合，结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。缺点是载体的 活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件 9 上海海洋大学硕士学位论文 才能获得活力较高的固定化酶。共价结合法是固定化酶研究中最活跃的一类方法。 德国的r o c h m g m 公司报道【5 0 】了青霉素酰化酶的共价结合，用含有甲基丙烯 酰胺、烯丙基缩水甘油醚、甲基丙烯酸缩水甘油酯( 6 m a ) 、亚甲基双甲基丙烯酰 胺等的反应混合物，经偶氮化合物引发，在6 5 7 5 下进行反相悬浮聚合，可得 到珠状环氧乙烷丙烯酸类多孔树脂，其键合青霉素酰化酶后的活性为2 5 2 u g 湿球。 此载体的产品名为e u p e r g i t e ，它不仅引入了g m a ，而且还通过反相悬浮技术引入 了亲水性好的丙烯酸胺，使青霉素酰化酶共价结合到载体上，发挥了良好的催化 性能。