（水产品加工及贮藏工程专业论文）鱼肉磷酸酶的特性及其对鲜味降解的影响.pdf

鱼肉磷酸酶的特性及其对鲜味降解的影响 摘要 我国是淡水渔业大国，2 0 0 6 年淡水鱼总产量2 4 0 2 7 万吨，占全国水产品总产 量的4 5 4 ，同比增长6 1 5 ，但淡水鱼加工量仅2 3 0 8 万吨，占总量的9 6 。 随着人们生活水平的提高，调理生鲜水产品已逐渐成为水产品超市销售的一种主 要形式。水产品被宰杀后体内a t p 在自身所含酶作用下降解形成肌苷酸( i m p ) ， 而i m p 在磷酸酶的作用下形成肌苷( h x r ) 和次黄嘌呤( h x ) ，导致鱼肉鲜味下降、 风味变差。本文在检测新鲜草鱼、鲴鱼和鳝鱼肉中基本组成、氨基酸含量和a t p 及其关联化合物含量的基础上，研究了不同贮藏温度下鱼肉a t p 及其关联物含量 的变化、三种淡水鱼肌肉中磷酸酶的特性，开发出对酸性磷酸酶活性有明显抑制 作用的鲜味降解抑制剂。主要研究内容和结果如下： ( 1 ) 测定了新鲜草鱼、鲴鱼和鳝鱼肉中基本组成、氨基酸含量和a t p 及其关 联化合物含量。鲴鱼肌肉的粗脂肪含量为4 3 9 ，明显高于草鱼( 1 5 6 ) 和鳝鱼 ( 1 5 1 ) 的，但其鲜昧氨基酸含量2 6 2 m g 1 0 0 m g 蛋白质，低于草鱼( 3 2 2 3m g 1 0 0 m g 叠 白质) 和鳝鱼( 3 0 6 1m g 1 0 0 m g 蚤白质) 。新鲜鳝鱼肌肉中a t p 含量1 5 1 3 2 p g g ，显著高于 鲴鱼( 8 9 2 1 0 i i g g ) 和草鱼( 7 1 6 2 9 h g g ) 的，而新鲜草鱼肌肉中i m p 含量3 5 2 7 5 p g g ， 明显高于鲴鱼的1 4 9 1 8 p g g 和鳝鱼的8 3 9 7 p g g 。 ( 2 ) 研究了不同贮藏温度下鱼肉中a t p 及其关联物含量的变化。贮藏温度可 显著影响贮藏过程中鱼肉的a t p 、a d p 、a m p 、i m p 、h x r 、h x 等含量的变化， 冰温( 0 5 ) 贮藏时，a t p 及其关联化合物的降解速度较慢，而在冷藏( 4 ) 时期降 解速度较快；冷藏时三种鱼肉的k 值在6 d 左右达到或接近4 0 ，而冰温贮藏时 三种鱼肉的k 值在1 5 d 左右才能达到4 0 。 ( 3 ) 研究了草鱼、鲴鱼和鳝鱼肉中酸性磷酸酶( a c p ) 的特性。三种淡水鱼的 a c p 酶学特性有明显差异。草鱼、鲴鱼和鳝鱼肌肉a c p 的适宜反应温度分别为 6 0 、3 7 和4 3 ，适宜反应p h 分别为5 o 、5 8 和5 6 ；草鱼、鳝鱼肌肉a c p 在 p h 5 - - 一9 范围稳定，而鲴鱼肌肉a c p 在p h 5 - - 一8 范围下稳定。 ( 4 ) 研究了处理方式和抑制剂( 或激活剂) 对鱼肉a c p 的影响。漂洗处理、降 低贮藏温度可显著降低鱼肉中磷酸酶活性。n a + 、k + 、m 矿+ 、白醋、料酒、白砂 糖、味精对酶活力影响不大，z n 2 + 、大蒜汁、生姜汁对酶活有激活作用，而c u 2 + 、 c a s + 、h 9 2 + 、半胱氨酸、磷酸盐、食盐对鱼肉a c p 酶活有较好抑制效果。 ( 5 ) 鱼肉鲜味降解抑制剂的研制与抑制效果检验。根据a c p 抑制试验结果， 选择食盐、味精、白糖、料酒、白醋、磷酸钠、半胱氨酸为原料，经优化研制出 了适合草鱼、鲴鱼和鳝鱼肉的三种鲜味降解抑制剂。结合生鲜水产品的调味处理， 将鲜味降解抑制剂按比例加工生鲜草鱼、鲴鱼和鳝鱼片并于冰温( 0 5 ) 贮藏，可 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 明显抑制i m p 的降解。 关键词：淡水鱼鲜味磷酸酶特性抑制剂 i i 鱼肉磷酸酶的特性及其对鲜味降解的影响 a b s t r a c t c h i n ai sa b u n d a n ti nf r e s h w a t e rf i s h e s ，a n dt h ep r o d u c t i o nw a s2 4 0 2 7m i l l i o nt o n s i n2 0 0 6 ，a c c o u n t i n gf o r4 5 4 o ft h et o t a lo u t p u to fa q u a t i cp r o d u c t s ，i tg r e w6 15 y e a ro v e ry e a r h o w e v e r , t h ea m o u n to ft h ep r o c e s s e d f r e s h w a t e rf i s hw a s2 3 0 8m i l l i o n t o n s ，o n l y9 6 o ft o t a lo u t p u t p r e p a r e df r e s ha q u a t i cp r o d u c t sh a v eb e c o m eam a j o r s a l ef o r mo fs u p e r m a r k e tw i t ht h ei m p r o v e m e n to fl i v i n gs t a n d a r d s i nt h ep r e s e n c eo f e n d o g e n o u se n z y m e ，a t pw a sd e g r a d e di n t oi n o s i n i ca c i d ( i m p ) a f t e rt h ef i s hw e r e s l a u g h t e r e d s u b s e q u e n t l y , t h ee n d o g e n o u sp h o s p h a t a s ed e g r a d e dt h ei m p t oi n o s i n e ( h x r ) a n dh y p o x a n t h i n e ( h x ) ，w h i c hw o u l dl e a dt ot h ed e c r e a s ei nu m a m ia n db a d f i a v o u r i nt h i sp a p e r , b a s e do nt h et e s t i n go fb a s i cc o m p o s i t i o n s ，t h ec o n t e n to fa m i n o a c i d sa n dt h ec h a n g eo fa t pa n di t sr e l a t e dc o m p o u n d sf r o mt h em u s c l eo fg r a s sc a r p ， c h a n n e lc a t f i s ha n dm u de e l ，t h ec h a n g e so fa t pa n di t sr e l a t e dc o m p o u n d sa td i f f e r e n t s t o r a g et e m p e r a t u r e sa n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fp h o s p h a t a s ef r o mt h em u s c l e so ft h r e e t y p e so ff r e s h w a t e rf i s hw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n d t h ef r e s hf l a v o rd e g r a d a t i o ni n h i b i t o r so f f i s hm u s c l ew e r ed e v e l o p e dw h i c hc o u l di n h i b i tt h ea c i dp h o s p h a t a s ea c t i v i t yo b v i o u s l y t h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t h eb a s i cc o m p o s i t i o n ，t h ec o n t e n to fa m i n oa c i d sa n dt h ec h a n g eo fa t pa n di t s r e l a t e dc o m p o u n d sw e r ed e t e r m i n e df r o mt h ef l e s hm u s c l eo fg r a s sc a r p ，c h a n n e l c a t f i s ha n dm u de e l t h ef a tc o n t e n ti nc h a n n e lc a t f i s hw a s4 3 9 ，s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h a to fg r a s sc a r p ( 1 5 6 ) a n dm u de e l ( 1 5 1 ) ，b u ti t sf l a v o ra m i n oa c i d sw a s 2 6 2 0m e , 10 0 m gp r o t e i n ，l o w e rt h a nt h a to fg r a s sc a r p ( 3 2 2 3m g 10 0 m gp r o t e i n ) a n d m u de e l ( 3 0 6 1m g 1 0 0 m gp r o t e i n ) t h ea t pc o n t e n tw a s1 5 1 3 2g g gi nf r e s hm u s c l e o fm u de e l ，h i g h e rt h a nt h a to fc h a n n e lc a t f i s h ( 8 9 2 10p g ) a n dg r a s sc a r p ( 71 6 2 9 p e g g ) ，a n dt h ei m p c o n t e n tw a s35 2 7 5r t g gi nf r e s hg r a s sc a r pm u s c l e ，h i g h e rt h a nt h a t o f c h a n n e lc a t f i s h ( 1 4 9 18g g g ) a n dm u de e l ( 8 3 9 7g g g ) s i g n i f i c a n t l y ( 2 ) t h ec h a n g e so fa t pa n da t p r e l a t e dc o m p o u n d sc o n t e n t si nf i s hm u s c l e sw e r e i n v e s t i g a t e di nd i f f e r e n ts t o r a g et e m p e r a t u r e s t h ec o n t e n t so fa t p , a d p , 岫i m p , h x r , h xi nf i s hm u s c l e sc o u l db ei n f l u e n c e ds i g n i f i c a n t l yb ys t o r a g et e m p e r a t u r e t h e d e g r a d a t i o n v e l o c i t i e so fa t pa n da t p r e l a t e dc o m p o u n d sw e r el o w e rd u r i n g c o n t r o l l e df r e e z i n g - p o i n ts t o r a g e ( - o 5 ) t h a nd u r i n gt h ec o l ds t o r a g e ( 4 ) t h ek v a l u e si nt h r e et y p e so ff r e s h w a t e rf i s hm u s c l ei n c r e a s e dd u r i n gs t o r a g e ，r e a c h e d a p p r o x i m a t e l y4 0 i nc o l ds t o r a g ea r o u n d6 d ，a n dr e a c h e dt h es a m ev a l u ea t15 di n c o n t r o l l e df r e e z i n g p o i n ts t o r a g e 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 ( 3 ) t h ec h a r a c t e r i s t i c so fa c i dp h o s p h a t a s ei ng r a s sc a r p ，c h a n n e lc a t f i s ha n dm u d e e lm u s c l e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nt h ec h a r a c t e r i s t i c s o fa c i dp h o s p h a t a s ea m o n gt h r e et y p e so ff i s hm u s c l e s t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e so f a c pf r o mg r a s sc a r p ，c h a n n e lc a t f i s ha n dm u de e lm u s c l e sw e r e6 0 ，37 a n d4 3 ， r e s p e c t i v e l y , a n do p t i m a lp hv a l u e sw e r e5 0 ，5 8a n d5 6 ，r e s p e c t i v e l y a c po fg r a s s c a r pa n dm u de e lm u s c l e sw e r es t a b l ea tp h 5 - 9 ，w h i l ea c po fc h a n n e lc a t f i s ha t p h 5 8 ( 4 ) e f f e c t so f 仃e a t m e n tm e t h o da n di n h i b i t o r s ( o ra c t i v a t o r s ) o na c i dp h o s p h a t a s ei n f i s hm u s c l e sw e r es t u d i e d w a s h i n gt r e a t m e n ta n dl o w e rs t o r a g et e m p e r a t u r ec a n s i g n i f i c a n t l yr e d u c et h ep h o s p h a t a s ea c t i v i t yi nf i s hm u s c l e n a + ，k + ，m 孑+ ，w h i t e v i n e g a r , c o o k i n gw i n e ，s u g a r , m o n o s o d i u mg l u t a m a t eh a v en oe f f e c to nt h ee n z y m e s ， w h e r a s ea c pa c t i v i t yw a ss t i m u l a t e db yz n + ，g a r l i cj u i c e ，g i n g e rj u i c ea n dw a s i n h i b i t e db yc u + ，c a 2 + ，h 9 2 + ，c y s t i n e ，p h o s p h a t e ，s a l t ( 5 ) t h ed e v e l o p m e n to fi n h i b i t o r so fd e g r a d a t i o no fd e l i c a t ef a v o r si nf i s hm u s c l e a n dt h e i rv e r t i f i c a t i o nt e s t s a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so fa c pi n h i b i t i o nt e s t s ，t h es a l t ， m o n o s o d i u mg l u t a m a t e ，s u g a r , c o o k i n gw i n e ，w h i t ev i n e g a r , s o d i u mp h o s p h a t e ， c y s t e i n ea sr a wm a t e r i a l s ，t h r e ei n h i b i t o r sw e r ed e v e l o p e db yo r t h o g o n a lt e s tf o rg r a s s c a r p ，c h a n n e lc a t f i s ha n dm u de e l c o m b i n a t i o no fs e a s o n i n gt r e a t m e n t ，t h ea d d i t i o no f t h ei n h i b i t o r sa n dc o n t r o l l e df r e e z i n g p o i n ts t o r a g e ( - 0 5 ) o ft h ef i s hs l i c e s ( g r a s s c a r p ，c h a n n e lc a t f i s ha n dm u de e l ) c o u l do b v i o u s l yi n h i b i tt h ed e g r a d a t i o no fl m e k e yw o r d s ：f r e s h w a t e rf i s h ；d e l i c a t ef l a v o u r ；p h o s p h a t a s e ；c h a r a c t e r i s t i c ；i n h i b i t o r i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：王弱让时间：矽叮年 6 月f 孑日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 糊黼始王鹏使名夕墨扣 签名e l 期：刀哆年参月俘日签名日期： 口罗年多月，g 日 | 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 鱼肉磷酸酶的特性及其对鲜味降解的影响 1 前言 鱼肉是人类所需蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素等多种营养物质的重要来源， 是人们膳食的重要组成部分，独特的鲜味是深受消费者喜爱的重要原因之一( 任仙娥 和张水华，2 0 0 3 ；邓后勤等，2 0 0 6 ) 。在鱼肉的各种鲜味物质中，肌苷酸( i n o s i n i ca c i d ， i m p ) 是主要的鲜昧化合物( 3 5 述柏，2 0 0 4 ) 。研究表明，动物组织中的i m p 主要来自 能量物质三磷酸腺苷( a t p ) 的降解，而i m p 的降解反应主要来自5 核苷酸酶、磷酸 酶的催化( 吕东坡和朱仁俊，2 0 0 7 ) 。目前尚缺乏对动物组织中5 核苷酸酶的研究， 有关磷酸酶对肉类特别是鱼肉i m p 的降解作用报道较少( 3 5 述柏，2 0 0 4 ) 。因此就需 要从磷酸酶的特性出发，研究其对鱼肉i m p 降解的影响。 1 1 鱼肉中的鲜味物质 近年来，人们研究发现，对肉类及其制品的鲜味贡献最大的有两类物质：一类 是氨基酸，其中以谷氨酸、甘氨酸效果最为明显；另一类是核苷酸，其中鲜味最强 的是i m p ，也称次黄嘌呤核苷酸( 陈国宏等，2 0 0 0 ；刘旭等，2 0 0 8 ) 。 1 1 1 鲜昧氨基酸 氨基酸是维系人体生命活动的重要物质，它不仅具有各种生理功能，还在食品 的呈味方面扮演着十分重要的角色( 武彦文和欧阳杰，2 0 0 1 ) 。在各种天然的呈味氨 基酸中，l 谷氨酸和l 天冬氨酸的钠盐和酰胺是具有鲜味的物质，d 型氨基酸普遍 具有甜味，其中d 色氨酸的甜度为蔗糖的3 5 倍( 3 5 军，2 0 0 6 ；武彦文和欧阳杰，2 0 0 1 ) 。 氨基酸类鲜味剂中最主要的就是l 谷氨酸一钠( m s g ) ，即味精( 袁亦丞，1 9 9 7 ) 。除 此之外，l 丙氦酸、甘氨酸、蛋氨酸、l 口蘑氨酸及l 鹅膏覃氨酸也是具有鲜味的 氨基酸( 刘树兴和唐孟忠，2 0 0 5 ) 。鱼肉中谷氨酸的钠盐与肌肉中蓄积的一磷酸肌苷 产生相乘作用而呈现鲜味，精氨酸有提鲜的作用，蛋氨酸、缬氨酸则是不可或缺的 海胆风味的呈味物质( 须山三千三和鸿巢章二，1 9 9 2 ) 。甘氨酸是一种甜味氨基酸， 而组氨酸则对某些海产品的“肉香味”有贡献( 任仙娥和张水华，2 0 0 3 ) ，胱氨酸和半胱 氨酸被认为是形成肉香味的必需氨基酸( 李诚等，2 0 0 8 ) 。目前普遍认为天冬氨酸、 谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸是鱼肉中的鲜味氨基酸( 张林达等，2 0 0 8 ) 。少量的游离氨 基酸对肉类的风味有贡献，但是如果蛋白质水解过度，导致游离氨基酸降解产生胺 类物质，就会对消费者造成危害( 李诚等，2 0 0 8 ) 。 1 1 2 肌苷酸 鲜味核苷酸主要有5 肌苷酸( 简称5 - i m p ) 、5 鸟苷酸( 简称5 - g m p ) 和5 黄 苷酸，鱼肉中主要的鲜味核苷酸是5 - i m p ( 3 5 军，2 0 0 6 ；乔世伟，2 0 0 1 ) 。肌苷酸型 鲜味剂化学结构中的嘌呤环上6 位上的羟基和核糖部分5 位上的磷酸酯化是产生 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 鲜味的必需基团( k u n i n a k ae ta 1 ，1 9 6 4 ；w a g n e re ta 1 ，1 9 6 3 ) 。亲水的核糖骨架和磷酸是 肌苷酸型鲜味剂必不可少的定位基，失去磷酸的肌苷和失去核糖的次黄苷味苦，而 助味基为芳香杂环上2 位和6 位的疏水取代基( y a m a g u c h ie ta 1 ，1 9 9 8 a ；孟绍风， 2 0 0 6 ) 。由于具有较弱的磷脂键和糖苷键，i m p 在受热时可能发生降解。k u c h i b a 等 报道，0 0 0 5 的肌苷酸在p h 为6 8 的水溶液中加热1 5 h ，i m p 浓度仅降低1 6 ，肌 苷浓度为0 0 0 0 6 2 ，远低于肌苷阈值( 0 0 0 6 ) ，因此一般认为在通常烹调条件下( 加 热时间低于3 h ，接近中性) ，肌苷酸热降解对食物滋味影响不大( k u c h i b ae ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 肌苷酸在普通食品中所存在的p h 环境中，即使经过较长时间的加热，对其破坏程 度较小，加热后它们仍能很好地表现出其新鲜美味来( 毛羽扬，2 0 0 1 ) 。 在对最具风味的淡水鱼、野生鲤鱼的风昧组成分析中，i m p 占总核苷酸的6 0 ， 而a t p 、a d p 、肌苷、次黄嘌呤的含量很低，i m p 被认为是相当重要的风味指标( 李 慧芳等，1 9 9 9 ) 。i m p 作为鲜味物质，主要是由于5 - i m p 与谷氨酸钠之间有强正相 关，5 - i m p 和谷氨酸钠以1 ：5 至1 ：2 0 的比例混合，可以使谷氨酸钠的鲜味增加 6 倍，同时i m p 对甜味、肉味有增效作用，对咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用， 即有味觉缓冲作用( m a r i k oe ta 1 ，1 9 9 1 ；张海燕等，2 0 0 4 ；吕东坡和朱仁俊，2 0 0 7 ) 。 另外，i m p 还是产生肉香味的重要前体物，i m p 的降解产物核糖或5 磷酸核糖 在加热过程中与氨基酸发生m a i l l a r d 反应，可产生多种挥发性风味化合物( c a m b e r o e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 在食品工业中，已将i m p 作为鲜味增强剂使用( 陈继兰等，2 0 0 4 ) 。国内对i m p 的研究起步较晚，自二十世纪八十年代以来研究逐渐增多，主要集中在不同种类畜 禽肌肉中i m p 含量的测定，其它方面较少，与国外有很大差距( 王述柏，2 0 0 4 ) 。 1 2i m p 的生成和降解 在活体动物中，i m p 主要参与核苷酸类物质的合成和代谢，动物被屠宰后，这 些生化反应仍会继续发生，但是途径被打乱( n a o k oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。宰后短时间内，动 物肌肉组织中能量物质三磷酸腺苷( a t p ) 的含量变化较小，一方面依靠糖原酵解释放 能量，使二磷酸腺苷( a d p ) 生成a t p ：另一方面，肌肉中的贮能化合物磷酸肌酸提 供高能磷酸键与a d p 在肌酸激酶的催化下生成a t p 和肌酸( 王述柏，2 0 0 4 ) 。当磷酸 肌酸耗尽时a t p 合成反应终止，开始迅速分解，生成i m p ( 张海燕等，2 0 0 4 ) 。a t p 分解产生的能量使肌动蛋白和肌球蛋白结合成不可解离的肌动球蛋白，引起肌丝收 缩，肌肉失去延展性，此时被认为肌肉进入僵直状态( n a o k oe ta 1 ，2 0 0 5 ；张海燕等， 2 0 0 4 ) 。僵直状态持续一段时间后，a t p 分解完全，肌肉开始缓解，肉的硬度降低， 保水性能恢复，变得柔软多汁，具有良好的风味( 熊善柏，2 0 0 7 ：张泓，2 0 0 6 ：张海 燕等，2 0 0 4 ) 。i m p 在一定条件下继续降解，生成肌苷( n x r ) 和次黄嘌呤( h x ) ，h x 具 有难以接受的苦味( 莫意平等，2 0 0 5 ) ，因此h x 的形成会导致肉的鲜味下降，苦味增 2 鱼肉磷酸酶的特性及其对鲜味降解的影响 多，总体风味变差。畜、禽、鱼类降解a t p 的途径如图1 所示( 熊善柏，2 0 0 7 ) 。 ( 蕊 a t p 酶腺苷酸激酶i 2 2 脚叫i j a m p 脱氨酶 磷酸酶 核糖水解酶 l a m p i m p h x r - t 核糖+ h x 上 核糖1 磷酸+ h x 图1a t p 的降解途径 f i g 1t h ed e g r a d a t i n gw a y o f a t p 由图1 可以看出，i m p 是由a t p 经一系列反应而生成的，同时在磷酸酶的作用 下降解的。由于这个过程中生成快，降解慢，因此肌苷酸经历一定时间后达到高峰( 陈 继兰等，2 0 0 4 ；刘旭等，2 0 0 8 ) 。叶春艳等( 1 9 9 5 ) 研究表明，在室温2 0 。c 条件下松花 江鲤鱼存放3 h 时出现肌苷酸含量的峰值，而在低温下i m p 在鱼死后1 2 d 内达到 其最高浓度。也有研究认为5 核苷酸酶对i m p 也有催化作用，但是目前尚缺乏对 动物组织，特别是鱼肉组织中5 核苷酸酶的特性研究( 吕东坡和朱仁俊，2 0 0 7 ) 。 研究表明，i m p 的含量与前体物水平( 即a t p 的含量) 、降解酶、遗传因素、屠 宰方式、储藏温度、饲料组成等多种因素有关( 李慧芳等，1 9 9 9 ；罗桂芬等，2 0 0 4 ： 王述柏，2 0 0 4 ；n a o k oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。研究表明，肌苷酸在0 。c 、5 c 、1 0 。c 下贮存， 随温度升高，肌苷酸降解速度加快。另外，低温贮存还能延长肉的成熟时间，肉成 熟时间越长则肉中氨基酸含量增j n ( 包括谷氨酸和寡肽) ，因而肉味会更加鲜美( 罗桂 芬，2 0 0 4 ) 。研究表明i m p 降解酶活性是在很大程度上对肌苷酸的稳定性造成影响的 重要因素之一( 王述柏，2 0 0 4 ) 。因此在控制贮藏温度的同时，添加能抑制磷酸酶活 性的外源物可有效抑制磷酸酶活性，从而减缓i m p 的降解。可食性外源添加物对磷 酸酶的影响的研究至今未见报道。 1 3 磷酸酶的分类及其特性 1 3 1 磷酸酶的分类 磷酸酶又称磷酸单脂水解酶，存在于各种生物组织中，对大量的磷酸单酯化合 物中的磷酸单酯键均有水解活性。根据最适p h 的不同，可分为碱性磷酸酶( a l p ， e c3 1 3 1 ) 和酸性磷酸酶( a c p ，e c3 1 3 2 ) ( 詹付凤和赵欣平，2 0 0 7 ；陈素丽等，2 0 0 0 ； 吕东坡和朱仁俊，2 0 0 7 ；k u d ae ta l ，2 0 0 4 ) 。a l p 的最适p h 为8 1 0 ，a c p 最适p h 为为4 9 5 o ( 王述柏，2 0 0 4 ) 。 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 3 2 磷酸酶的特性 表1 几种动物中a l p 的部分特性 t a b 1t h ec h a r a c t e r i s t i c so fa l pi ns e v e r a la n i m a l ( a ：廖金花和陈清西，2 0 0 5 ：b ：许敏，2 0 0 7 1c ：张辉，2 0 0 0 ；d - 陈清西，1 9 9 8 ： e ：陈清西等，1 9 9 6 1f 陈定福，1 9 9 5 1g ：陈定福，1 9 9 4 ；h ：赵赣等，2 0 0 3 ：i - 谢莉萍等，2 0 0 0 ) 表2 几种动植物中a c p 的部分特性 t a b 2t h ec h a r a c t e r i s t i c so f a c pi ns e v e r a la n i m a la n dp l a n t ( j ：陈素丽等，1 9 9 7 ：k ：陈素丽等，1 9 8 5 ；h 杨立红等，2 0 0 8 1m ：杨杰，2 0 0 7 1 n ：江琰，2 0 0 31o ：陆珊，2 0 0 6 1p ：魏炜等，1 9 9 9 ) 。 提纯的a l p 常被应用于核酸、毒物学、医学研究，是遗传工程常用的工具酶。 4 鱼肉磷酸酶的特性及其对鲜味降解的影响 添力i a l p 的药用化妆品有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢( 陈定福，1 9 9 5 ) 。组织学 研究表明，a c p 广泛分布于动物的多种组织中，从而表明a c p 与有机体的消化、免 疫、生殖、细胞凋亡和神经病理学变化有关( 孙建梅等，2 0 0 6 ) 。就a l p 来说，m 矿 和m n 2 + 是其激活剂，磷酸、z n 2 + 、b e 2 + 、a s 和、c n 草酸盐及巯基化合物等是其抑制 剂；a c p 的抑制剂则为：酒石酸、氟化物、草酸、c u 2 + 等( 王述柏，2 0 0 4 ) 。不同的动 物，磷酸酶的最适温度、最适p h 、米氏常数k m 值等均有差异( 张辉和张海莲，2 0 0 3 ) 。 近些年来，对于一些动植物体内磷酸酶部分特性的研究如表l 、2 所示。 由表1 、2 可以看出，不同的物种，其磷酸酶酶学特性不同。除上述一些磷酸酶 的抑制剂外，巯基化合物也能有效地抑制磷酸酶的活力( 洪燕飞等，2 0 0 4 ) 。磷酸酶 是降解鱼肉中鲜昧物质( i m p ) 的重要酶类，就目前的研究来看，大多集中在动物疾病、 作为工具酶用于医学研究等方面，对鱼类磷酸酶的研究也都集中在对内脏a l p 的研 究，对鱼类肌肉组织中磷酸酶的研究很少见报道，特别是一些可食用的外源添加物 对磷酸酶的抑制作用的研究几乎未见报道。 1 4 三种重要淡水鱼的原料特性 草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 俗称鲩鱼、油鲩、草鲩、白鲩、草根( 东北) 、混 子等，属鲤形目，鲤科，雅罗鱼亚科( 刘忠义，2 0 0 7 ) 。栖息于平原地区的江河湖泊， 一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域，草鱼属食草鱼类，广泛分布在亚、欧、 美、非洲地区( 刘珂珂和王华朗，2 0 0 8 ；杨小林和林万明，2 0 0 9 ) 。草鱼肉质细嫩， 骨刺少，营养丰富( 张黎，2 0 0 9 ) 。我国对草鱼的营养与饲料的研究从2 0 世纪7 0 年 代后期开始( 林鼎等，1 9 8 0 ) ，并在2 0 世纪8 0 年代陆续开展对草鱼蛋白质、脂肪、 碳水化合物、矿物质和维生素等各种营养素的研究工作( 赵智勇，2 0 0 7 ) 。 鲴鱼即斑点叉尾鲴( i c t a l u r u sp u n c t a t u s ) ，又称沟鲶，属鲶形目、鲴科( 周进，2 0 0 3 ) 。 因其身体两侧有明显不规则的黑色斑点而得名( 王利琴和汪之和，2 0 0 2 ) 。斑点叉尾 鲴具有生长快、肉质细嫩、无肌间刺、营养丰富、味道鲜美、食性广、产量高、易 饲养、肉质鲜美、适合加工等优点而受到广大养殖者和消费者的欢迎( 黄钧等，2 0 0 9 ； 张林等，2 0 0 7 ) 。我国于1 9 8 4 年首次由湖北省水产科学研究所从美国引进，目前斑 点叉尾鲴的养殖在湖北、江西、四川、重庆等省市迅速发展( 张林等，2 0 0 7 ) 。目前 对斑点叉尾鲴的研究主要集中在养殖、疾病控制、胶原蛋白、含肉率及营养成分等 方面( 卢亚和李子文，2 0 0 6 ；张林等，2 0 0 7 ；吴缇和陈舜胜，2 0 0 9 ) 。 鳝鱼( m o n o p t e r u sa l b u s ) 又名黄鳝、田鳝、蛇鱼，隶属合鳃目、合鳃科，为底栖 肉食性鱼类，其肉味鲜美，营养丰富，且有滋补强身和药用功能( 舒妙安等，2 0 0 0 ) 。 黄鳝在我国分布很广，由于肉质细嫩，美味可口，是我国淡水鱼中的上品，其肉质 细腻，入口滑嫩，并具有高蛋白、低脂肪、营养平衡性好的特点( 吕凯波，2 0 0 7 ) 。 鳝肉中含大量的蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、维生素等多种营养素，因此黄鳝是一 5 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 种淡水养殖优良品种，具有较高的开发价值和广阔的市场前景( 钱辉跃，2 0 0 4 ) 。长 期以来，对黄鳝的研究领域主要集中在对黄鳝生物学的观察、性逆转规律的探讨及 营养方面( l i ue ta 1 ，1 9 5 1 ；c h a r te ta 1 ，1 9 7 6 ；杨代勤，2 0 0 2 ) 。 生鲜鱼制品在贮藏过程中会发生一些列生化反应，导致其鲜味下降，影响其商 品价值及食用价值，进而影响到食品安全( n a o k oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。目前对草鱼、鳝鱼和 鲴鱼肉的保鲜及加工方面的研究较少，仅吕凯波( 2 0 0 7 ) 和龚婷( 2 0 0 8 ) 分别对鳝鱼、草 鱼生鱼片的冰温气调保鲜技术进行了研究，而对鲴鱼保鲜的研究至今尚未见报道。 从生物学分类上看，草鱼、鲴鱼、鳝鱼种属各异；从形态上看，鳝鱼和鲴鱼都属于 无鳞鱼( 刘会和姜浩文，2 0 0 3 ) ，而草鱼则属于有鳞鱼；从食性上看，草鱼属于食草 鱼类，鲴鱼属于食肉鱼类，而鳝鱼则属杂食鱼类。选择三种差异较大的淡水鱼，便 于比较分析不同种类的鱼肉中降解鲜味物质( i m p ) 的磷酸酶的特性，为淡水鱼的保鲜 及加工提供科学依据。 1 5 研究目的意义及内容 我国是淡水渔业大国，2 0 0 6 年淡水鱼总产量2 4 0 2 7 万吨，占全国水产品总产量 的4 5 4 ，同比增长6 1 5 ( 中国渔业年鉴，2 0 0 7 ) 。淡水鱼加工量仅2 3 0 8 万吨，占 总量的9 6 。与世界水平相比差距还十分明显，世界水产品产量的7 5 左右是经过 加工而后销售的，鲜销的比例只占总产量的1 4 。随着人们生活水平的提高，调理生 鲜水产品已逐渐成为水产品超市销售的一种主要形式。人们的消费观念已经从营养 需求向口感需求上转变，对于鱼肉的鲜味要求也越来越高。研究表明，i m p 是畜禽 和鱼肉中的主要鲜味化合物( 王述柏，2 0 0 4 ) ，目前已成为评价肉类品质的重要指标 之- - ( i s o n o 1 9 9 0 ) 。由于鱼肉经过加工之后，其i m p 下降较快，容易产生等苦味 物质，影响其商品价值及食用价值，如何更好的保留鱼肉的鲜味将是亟待解决的问 题之一。i m p 的降解反应主要由5 核苷酸酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶催化( 吕东 坡和朱仁俊，2 0 0 7 ) 。其中5 。核苷酸酶主要应用于医学领域，国内尚缺乏对动物组 织中5 核苷酸酶的特性研究( 王述柏，2 0 0 4 ) 。磷酸酶是降解i m p 的重要酶类，但是 国内外尚缺乏磷酸酶对鱼肉m p 降解的影响的研究( 吕东坡和朱仁俊，2 0 0 7 ) ，大多 数集中在对鱼类内脏中的研究( 黄毅等，2 0 0 5 ；张继平等，2 0 0 5 ) 。 鉴于此，本课题以草鱼、鲴鱼、鳝鱼三种具有代表性的鱼为研究对象，在研究 三种淡水鱼基本组成成分的基础上，研究淡水鱼肌肉a c p 的特性以及外源添加物( 抑 制剂或激活剂) 对鱼肉磷酸酶活性的影响，设计单因素和正交试验，配制鱼肉鲜昧降 解抑制剂，对有效控制鲜鱼片的品质、延缓i m p 降解速度从而延长鱼片的保鲜期具 有重要意义。课题主要研究内容如下： ( 1 ) 鲜鱼肉的基本成分分析。研究几种鲜鱼肉中的基本理化指标、氨基酸组成、 a t p 关联物含量及k 值，从而得出不同鱼种基本组成成分之间的差异。 6 鱼肉磷酸酶的特性及其对鲜味降解的影响 ( 2 ) 鲜鱼肉在贮藏期间a t p 及其关联物含量的变化。通过测定不同贮藏条件下 鱼肉a t p 及其关联物的含量，研究贮藏过程中鱼肉k 值及a t p 及其关联物含量的 变化，以得到不同种类鱼肉中i m p 的最大生成量及生成时间。 ( 3 ) 鱼肉a c p 的特性研究。研究不同种类的鱼肉a c p 的酶学特性，从而确定抑 制酶的活性外在条件。 ( 4 ) 抑制剂( 或激活剂) 对淡水鱼肌肉a c p 活性的影响。以每种外源添加物的单 因素为试验基础，并设计正交试验确定最佳抑制剂的添加量配比。 ( 5 ) 鱼肉鲜味降解抑制剂的开发及抑制效果检验。将正交试验得出最佳配比的 抑制剂应用于鱼片中，并对鱼片的品质进行检验。 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 原材料 草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) ，个体重约15 0 0 9 ，购于华中农业大学菜市场； 鳝鱼( j ) l 如，z 印 铲淞a l b u s ) ，个体重约1 0 0 9 ，购于华中农业大学菜市场； 触鱼( i c t a l u r u sp u n c t a t u s ) ，个体重约15 0 0 9 ，由德炎水产公司提供； 食盐( 加碘) 、白砂糖、味精、生姜等调味料，购于武汉中百超市。 2 1 2 主要试剂 a d p - n a 2 a m p - n a 2 a t p - n a 2 次黄嘌呤 高氯酸 肌苷 肌苷酸 甲醇 其余试剂均为国产分析纯 2 2 主要仪器 p h 计 冰箱 低温恒温培养箱 电热干燥箱 电热鼓风干燥箱 电子天平 定氮仪 分光光度计 分析天平 高速分散均质机 高速冷冻离心机 高效液相色谱仪 恒温水浴锅 马弗炉 h p l c h p l c h p l c h p l c g r h p l c h p l c h p l c s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 上海桃浦化工厂 s i g m a 公司 s i g m a 公司 国药集团化学试剂有限公司 8 l8 型 美国奥力龙 b c d 1 8 0 a 型新飞电器 m i r - 2 5 3 型日本三洋集团 h n 3 0 3 4 s 型上海实验仪器总厂 1 0 1 1 a b 型天津市泰斯仪器有限公司 b l 2 2 0 0 h 型北京赛多利斯天平有限公司 k d n 0 b e 型上海精隆科学仪器有限公司 7 2 2 型上海第三分析仪器厂 b s 一210 型s a r t o r i u