（分析化学专业论文）利塞膦酸钠原料药中有关物质的鉴定及其溶解度研究.pdf

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塞膦酸钠的溶解特性，更好的控制利塞膦酸钠生产过程中有关物质的生成，本 文在研究有关物质的基础上，开展了利塞膦酸钠在不同极性溶剂体系中的溶解 度特征研究，采用激光监视的动态升温法，对水。乙醇二元溶剂中利塞膦酸钠的 溶解度数据进行测定，并采用两参数和三参数方程对实验数据关联拟合： 利塞膦酸钠溶解度随温度上升而增加，随二元溶剂中乙醇含量的增加而显 著减小，当加入乙醇摩尔分数大于0 1 时，利塞膦酸钠的溶解度极低且几乎无变 化；由拟合曲线计算得到的利塞膦酸钠溶解度与实验值吻合良好。测得的利塞 膦酸钠溶解度数据与关联模型可作为基础数据与模型应用于利塞膦酸钠原料药 的结晶过程。 关键词：反相离子对h p l c 法利塞膦酸钠有关物质鉴定来源溶解度 a b s t r a c t a b s t r a c t r i s e d r o n a t es o d i u mi sa d r u gc u r r e n t l yb e i n gs t u d i e df o rl i s t i n gi nc h i n a , t h e r ei s s t i l lw o r kt ob ep e r f e c t e di nq u a l i t yc o n t r 0 1 i nt h i s p a p e r , a ni o n p a i rr p h p l c m e t h o dw a se s t a b l i s h e df o rs t u d yo nt h er e l a t e ds u b s t a n c e si nr i s e d r o n a t es o d i u mr a w m a t e r i a l t h ec o n t e n to ft h em a i nr e l a t e ds u b s t a n c ew a sa b o u t0 14 b o t hi n r i s e d r o n a t es o d i u mb u l km a t e r i a la n dc h e m i c a lr e f e r e n c e b yc h e c k i n g a n d d e t e r m i n a t i o n ，w h i c he x c e e d e d0 1 o ft h er i s e d r o n a t es o d i u ma p i t h e r e f o r e t h e m a i nr e l a t e ds u b s t a n c es h o u l d b ec o n f i r m e d c o m b i n e dr i s e d r o n a t es o d i u ma p ip r o d u c t i o n p r o c e s s ，i t sm a i nr e l a t e d s u b s t a n c ew a sa n a l y z e da n di d e n t i f i e d ： ( 1 ) b yo p t i m i z a t i o no fp r e p a r a t i o nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l cp r e p a r a t i o n m e t h o do ft h ep r i m a rr e l a t e ds u b s t a n c ew a se s t a b l i s h e d t h ep r e p a r a t i o nl i q u i dw a s a n a l y z e db yl c m s ( 2 ) b yi o n - p a i rr p h p l c ，i m p u r i t i e s ( s u c ha si n t e r m e d i a t e s ，e t c ) ，w h i c hm a yb e i n t r o d u c e di nr i s e d r o n a t es o d i u ma p im a n u f a c t u r i n gp r o c e s s ，w e r ea n a l y z e d t h e r e l a t e ds u b s t a n c ei nr i s e d r o n a t es o d i u ma p lw a sc o n f i r m e da sp h o s p h o r i ca c i do r p h o s p h o r o u sa c i d ，t h r o u g hr e t e n t i o nt i m ec o n t r o la n ds p i k e dc o n t r o lo fd i f f e r e n t c h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o ra td i f f e r e n tw a v e l e n g t h s t os i m p l ya n de f f e c t i v e l yc o n t r o lt h eq u a l i t yo fr i s e d r o n a t es o d i u mi nt h e s p e c i f i cp r o d u c t i o np r o c e s s ，t h es o u r c e so fi t sm a i nr e l a t e ds u b s t a n c ew a sr e s e a r c h e d b ya n a l y s i s ，3 - p y r i d i n e a c e t i ca c i d h y d r o c h l o r i d e ，n e i t h e rp h o s p h o r i ca c i do r p h o s p h o r o u sa c i d ，w a sc o n f i r m e da s t h er e l a t e ds u b s t a n c ei nr i s e d r o n a t ea c i d i t s h o w e dt h a tt h er e l a t e ds u b s t a n c ei nr i s e d r o n a t es o d i u ma p im a yb ei n t r o d u c e d d u r i n g t h es y n t h e s i so fr i s e d r o n a t es o d i u mw i t hr i s e d r o n a t ea c i da n ds o d i u m h y a r o x i d eo rc r y s t a l l i z a t i o n r i s e d r o n a t es o d i u mi so f t e nc h a r a c t e r i z e db yb e t t e rw a t e rs o l u b i l i t ya n dp o o r s o l u b i l i t yi no r g a n i cs o l v e n t s i no r d e rt os t u d yt h ed i s s o l u t i o nc h a r a c t e r i s t i c so f r i s e d r o n a t es o d i u ma n db e t t e rc o n t r o lt h ef o r m a t i o no ft h er e l a t e ds u b s t a n c ei nt h e p r o d u c t i o np r o c e s so fr i s e d r o n a t es o d i u m ，r e s e a r c ho ns o l u b i l i t yc h a r a c t e r i s t i c so f r i s e d r o n a t es o d i u mi nv a r i o u sp o l a rs o l v e n t sw a sc a r r i e do u t ，o i lt h eb a s i so f s t u d yo n i i a b s t r a c t t h er e l a t e ds u b s t a n c e b yd y n a m i c a l l yc a l e f a c t i v em e t h o dw i t hl a s e rm o n i t o r i n g ， s o l u b i l i t yd a t ao fr i s e d r o n a t es o d i u mi nw a t e r e t h a n o ls o l v e n tw e r em e a s u r e d t h e e x p e r i m e n t a ld a t aw e r ef i t t e db yt w o p a r a m e t e ra n dt h r e e p a r a m e t e re q u a t i o n s t h er i s e d r o n a t es o d i u ms o l u b i l i t yi n c r e a s e dw i t ht e m p e r a t u r ei n c r e a s i n g , a n d s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fe t h a n o lc o n t e n ti nt h eb i n a r ys o l v e n t w h e nt h em o l ef r a c t i o no fe t h a n o lw a sg r e a t e rt h a n0 1 ，t h es o l u b i l i t yo fr i s e d r o n a t e s o d i u mw a sv e r yl o wa n dh a da l m o s tn oc h a n g e t h er i s e d r o n a t es o d i u ms o l u b i l i t y v a l u e sc a l c u l a t e db yf i t t i n gc u r v ew e r ei ng o o da g r e e m e n tw i t he x p e r i m e n t a lv a l u e s t h em e a s u r e dr i s e d r o n a t es o d i u ms o l u b i l i t yd a t aa n dc o r r e l a t i o nm o d e lc a nb eu s e da s b a s i cd a t aa n dm o d e la p p l i e dt or i s e d r o n a t es o d i u ma p i c r y s t a l l i z a t i o np r o c e s s k e yw o r d s ：i o n p a i rr e v e r s e dp h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y r i s e d r o n a t es o d i u mt h er e l a t e ds u b s t a n c ei d e n t i f i c a t i o ns o u r c e s o l u b i l i t y i i i 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章绪论一1 1 1抗骨质疏松药利塞膦酸钠的研究背景1 1 2 利塞膦酸钠及其有关物质的分析方法概述2 1 3 1 4 第二章 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 第三章 1 2 1 药品中双磷酸盐及其有关物质的分析方法综述2 1 2 2 利塞膦酸钠的分析方法概述3 本论文的选题依据3 1 3 1 利塞膦酸钠原料药中有关物质鉴定：3 1 3 2 利塞膦酸钠溶解度研究4 本论文的研究内容和方法5 1 4 1 利塞膦酸钠原料药中有关物质鉴定5 1 4 2 利塞膦酸钠溶解度的测定与关联5 利塞膦酸钠有关物质检查和含量分析7 引言7 仪器与试药。7 方法与结果7 2 3 1 色谱条件与系统适用性试验7 2 3 2 利塞膦酸钠原料药有关物质检查和含量分析8 2 3 3 利塞膦酸钠对照品有关物质检查和含量分析1 0 2 3 4 进样精密度试验1 l 讨论1 2 2 4 1流动相组成对利塞膦酸钠及其有关物质色谱行为的影响1 2 2 4 2 固定相对衬塞膦酸钠及其有关物质色谱行为的影响1 3 小结1 4 利塞膦酸钠有关物质液相色谱法制备研究1 5 i v 目录 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 第四章 4 1 4 2 4 3 4 4 第五章 5 1 5 2 5 3 5 4 引言1 5 仪器与试药1 5 方法与结果：1 5 3 3 1 色谱条件1 5 3 3 2 利塞膦酸钠有关物质制备1 6 3 3 3 有关物质制备液纯度测定1 6 3 3 4 有关物质制各液液一质联用分析1 7 讨论1 8 3 4 1 有关物质制备条件的优化1 8 3 4 2 有关物质制备液的质谱分析2 0 小结2 0 利塞膦酸钠原料药有关物质确认分析2 1 引。占2 1 仪器、试药及色谱条件2 1 4 2 1 仪器与试药2 l 4 2 2 色谱条件2 2 利塞膦酸钠有关物质的确认。2 2 4 3 1中间体与利塞膦酸钠有关物质对照分析2 2 4 3 2 磷酸盐与利塞膦酸钠有关物质对照分析2 5 4 3 3 亚磷酸盐与利塞膦酸钠有关物质对照分析2 7 4 3 4 磷酸与利塞膦酸钠有关物质对照分析2 7 4 3 5 亚磷酸与利塞膦酸钠有关物质对照分析3 1 4 3 6 利塞膦酸钠原料药和对照品中有关物质对照分析3 5 小结j ：3 7 利塞膦酸钠有关物质来源分析3 8 引言3 8 仪器、试药及色谱条件3 8 利塞膦酸及其有关物质色谱行为测定? 3 8 磷酸、亚磷酸与利塞膦酸有关物质对照分析3 9 v 目录 5 53 一吡啶乙酸盐酸盐与利塞膦酸有关物质对照分析4 2 5 6利塞膦酸钠有关物质与利塞膦酸有关物质对照分析4 4 5 7 小结4 4 第六章利塞膦酸钠在水一乙醇二元溶剂中的溶解度研究4 5 6 1 引言4 5 6 2 仪器与试药4 5 6 3 方法与结果4 5 6 3 i 利塞膦酸钠溶解度测定方法4 5 6 3 2 溶解度关联模型4 6 6 3 3 利塞膦酸钠溶解度数据测定与关联结果4 7 6 4 小结5 1 第七章结论5 2 参考文献5 3 致j 谢5 7 个人简历5 8 v i 第一章绪论 第一章绪论 1 1 抗骨质疏松药利塞膦酸钠的研究背景 随着社会老龄化进程加快，老年人的医疗保健正日益引起人们的重视。目 前，骨质疏松症已成为危害老年人健康最为常见的疾病之一。国际骨质疏松基 金会的统计数据显示，骨质疏松症目前危害着全球大约三分之一5 0 岁以上的女 性和五分之一5 0 岁以上的男性。随着世界人口的增加和平均寿命的提高，骨质 疏松症的发生率势必迅速上升，由此而发生的病理性骨折也会相应增加，严重 影响患者的生命及生活质量。骨质疏松症的防治工作对保障人类健康和生活质 量具有十分重大的意义。 双膦酸盐，见图1 1 【，作为一类有效的骨吸收抑制剂，因其显著疗效和良 好安全性应用于骨代谢疾病，是目前防治骨质疏松症的最主要药物之一。其中，一 阿仑膦酸钠和利塞膦酸钠是最流行的一线药物【2 , 3 】。 什i 1什 、 i if i_i 、 ii i o hr zo h 图1 1双膦酸盐的基本化学结构 ，7 利塞膦酸钠，是由美国宝洁公司研制开发的第三代双膦酸盐类药物，为西 药二类新药，用于预防和治疗绝经后妇女的骨质疏松症，同时办获准治疗由类 固醇引起的男性骨质疏松症【4 】。1 9 9 8 年首次经美国食品药物管理局( f d a ) 批 准用于变形性骨炎的治疗，2 0 0 0 年4 月f d a 批准用于防治绝经后妇女的骨质 疏松症和类固醇性骨质疏松症。其化学名为：1 - 羟基2 ( 3 一吡啶基) 亚乙基一 1 ，1 双膦酸单钠盐，结构式为： 图1 2 秘塞膦酸钠的结构式 第一章绪论 利塞膦酸钠是新一代吡啶基含氮双膦酸盐，在r 2 侧链上加j 二含氮的杂环， 其药物活性和结合力更强，能有效抑制破骨细胞介导的骨重吸收和调节骨代谢 【5 7 1 。利塞膦酸钠的靶标是参与甲羟戊酸途径的法尼基焦磷酸酶( f p p s ) 【8 1 。 利塞膦酸钠和其他芳香基含氮双磷酸盐能抑制法尼基焦磷酸酶( f p p s ) 的活性 【9 1 。它是目前证明既能减少椎骨骨折风险又能预防绝经后妇女非椎骨骨质疏松 性骨折的唯一骨质疏松症治疗药物【1 0 , 1 1 】。另外利塞膦酸钠也能有效治疗变形性 骨炎f 1 2 , 13 1 。 与其他双膦酸盐类相比，利塞膦酸钠具有疗效更显著，耐受性更好， 胃肠 道副作用更小等优点【1 4 16 1 。临床上可作为一线用药用于骨质疏松症的防治，有 着良好的应用前景。目前利塞膦酸钠已在世界上很多国家和地区上市，未来几 年内利塞膦酸钠在国内外市场将具有更广阔的发展前景。 1 2 利塞膦酸钠及其有关物质的分析方法概述 1 2 1药品中双磷酸盐及其有关物质的分析方法综述 双磷酸盐分子中的两个磷酸基团使其具有易离子化、极性强的特征。另外， 这个家族的大部分成员都缺乏生色团，无法直接进行紫外检测【lj 。 双磷酸盐的特点之一是它们的主要杂质也是离子化的( 磷酸盐和亚磷酸 盐) ，这就限制了传统r p h p l c 的使用。而离子色谱法( i c ) 可以解决这一分 析难题。离子交换柱结合电导检测的方法简单、不需衍生化步骤、灵敏，且能 实现离子化杂质的同时分离。可供选择的检测方法包括间接紫外或荧光检测和 电感耦合等离子体质谱( i c p m s ) 检测，后者在大多数实验室的可行性受到限 制。可替代离子色谱法进行双磷酸盐杂质分析的方法是毛细管电泳法( c e ) 。 毛细管电泳的高分离效能使离子化合物和经简单修饰的中性物能够得到有效分 离。例如，通过在背景电解液中加入合适的具生色团的化合物，进行间接紫外 检测【1 ”。 电导和间接紫外检测器已分别用于毛细管电泳( c e ) l l 引和离子色谱( i c ) 【1 9 ，2 0 】中双磷酸盐的检测。使用衍生化方法进行荧光和分光光度检测也有报道 【2 1 。2 3 1 ，为得到精密准确的结果，必须严格控制衍生条件尤其是时间。蒸发光散 射检测器【2 4 1 和电喷雾检测器【2 5 】也被用于双膦酸盐的检测。大多数分离方法基于 毛细管电泳( c e ) 、阴离子交换色谱或离子对色谱【1 9 , 2 0 , 2 2 , 2 3 】。 2 第一章绪论 。文献中也出现了少数使用质谱法( m s ) 检测双膦酸盐的报告。使用g c m s 进行了三甲基硅烷基氯屈膦酸衍生物的分析【2 6 1 。阴离子交换色谱结合i c p - m s 检测用于分析阿仑膦酸钠和依替膦酸钠【27 1 。电喷雾离子化( e s i ) 一质谱( m s ) 结合c e 被用于负离子模式并探讨双膦酸盐的荷电状态和裂解方式【2 8 ，2 9 1 。正离 子模式i c e s i - m s - m s 用于检测含氮双膦酸盐利塞膦酸钠和阿仑膦酸钠的重氮 甲烷衍生物州。 1 2 2 利塞膦酸钠的分析方法概述 目前己报道的利塞膦酸钠分析方法包括：( 1 ) 采用有机破坏后比色法测定分 子中磷的含量，再转换成利塞膦酸钠的含量，该方法操作烦琐，误差较大1 3 l j ； ( 2 ) 离子对高效液相色谱法结合直接紫外检测”卜3 3j ，分别以庚烷磺酸钠、四丁基 溴化铵和四丁基氢氧化铵为离子对试剂；( 3 ) 测定尿液中利塞膦酸钠的自动柱切 换紫外检测离子对色谱法【3 4 】，以1 辛基三乙基磷酸铵为离子对试剂；( 4 ) 基于酸 性和碱性介质中利塞膦酸钠的紫外吸收差异建立的批处理分光光度法5 j ；( 5 ) 经 酰化和硅烷化形成挥发性衍生物后的气相色谱一质谱法【3 6 】；( 6 ) 非常灵敏但极为复 杂的酶联免疫吸附测定、法i 】。 1 3 本论文的选题依据 1 3 1利塞膦酸钠原料药中有关物质鉴定 f d a 尤其关注原料药生产中药物的纯度和剂量的安全性，要求药品生产者 对杂质进行全面分析，并尽可能提供较多的杂质结构信息【3 8 】。通常，超过o 1 的 杂质需进行定性分析，确定其化学结构，并且用选择性好的方法进行定量分析。 原料药的杂质限度见表1 1 【3 9 1 。 表1 1 原料药的杂质限度 最大日剂量 报告限度8鉴定限度b质控限度。 q g 0 0 5 0 1 0 或1 0 m g 0 1 5 或1 0 m g ( 取最小值)( 取最小值) 2 9 0j03005005 注：a ，超出此限度的杂质均应在检测报告中报告，并应报告具体的检测数据：b ，超 出此限度的杂质均应进行定性分析，确定其化学结构；c ，质量标准中一般允许的杂质限度， 如制订的限度高于此限度，则应有充分的依据。 3 第一章绪论 原料药中含有有关物质可能会降低药物的疗效、影响其稳定性，对人体健 康有害或产生其他副作用。因此，原料药中有关物质的分析是确保用药安全、 有效，保证药物质量的一个重要方- 面【4 0j 。 利塞膦酸钠作为我国目前正在研究上市的药物，在建立质量控制方面，尚 有工作需要完善，本论文就是结合某企业的实际研究需要，建立了用于利塞膦 酸钠有关物质研究的反相离子对h p l c 分析方法，通过对利塞膦酸钠原料药和 对照品中有关物质的定量分析和检查，主要有关物质的含量已超过主成分的 0 1 ，因此须对该有关物质进行定性分析，鉴定其化学结构，以确保利塞膦酸 钠原料药的质量和安全性。 国内外关于利塞膦酸钠质量控制方面的研究已有报道，但是对利塞膦酸钠 原料药中有关物质的定性和定量分析是直接与生产工艺和生产环境的控制密切 相关的，各国药典收载有关物质控制指标，但是对于具体企业生产的产品，尚 需要根据生产工艺来进行研究和确认。建立简便有效、特异性好和适用性强的 有关物质定性定量分析方法，结合利塞膦酸钠原料药的生产工艺，研究和确认 其有关物质，可以为利塞膦酸钠的质量控制提供重要的参考依据，对保证人们 用药安全具有重要的实际意义。 1 3 2 利塞膦酸钠溶解度研究 结晶化是制药工业中分离和纯化最有力的手段之一。而溶解度是决定结晶 模型、过饱和、相图和收率的非常重要的热力学参数。另外，溶解度也能影响 由过饱和控制的结晶动力学、晶粒大小和形状。因此，建立利塞膦酸钠的溶解 度曲线很有必要。 利塞膦酸钠为白色结晶性粉末，溶于水，不溶于醇类等有机溶剂。利塞膦 酸钠产品结晶工艺为溶析结晶，所用的溶剂为水，溶析剂为乙醇或异丙醇。截 止到目前，只有少数利塞膦酸钠在纯水中的溶解度数据报道【l 。因此，测定利 塞膦酸钠在水乙醇二元溶剂体系中的溶解度数据对于利塞膦酸钠结晶条件的选 择和结晶工艺的优化至关重要，同时所测定的溶解度数据与关联模型可作为基 础热力学数据和模型在利塞膦酸钠的生产过程中应用。 4 第一章绪论 1 4 本论文的研究内容和方法 1 4 1 利塞膦酸钠原料药中有关物质鉴定 利塞膦酸钠的分析方法国内外虽有文献报道，但都不尽完善，方法特异性 较差，或步骤繁琐复杂、分析时间长、精密度低、分析成本高、需要专门的分 析仪器而在普通实验室的可行性较差，这些都导致了方法的应用有一定局限性 【4 ，不宜作为利塞膦酸钠理想的常规质控手段。 本文以四丁基溴化铵为离子对试剂，建立测定利塞膦酸钠原料药有关物质 的离子对h p l c 法，对利塞膦酸钠原料药和对照品中的有关物质进行定量分析 和检查。 其次，对有关物质进行定性分析：( 1 ) 采用液相色谱法制备有关物质，并 对制备液进行液质联用分析；( 2 ) 采用离子对h p l c 法，对利塞膦酸钠原料药 生产工艺中可能引入的杂质( 中间体、磷酸盐、磷酸、亚磷酸盐和亚磷酸) 进 行分析，利用它们与有关物质保留时间和不同波长下色谱行为的差别，确认原 料药中的有关物质；( 3 ) 通过对利塞膦酸有关物质的分析，确认利塞膦酸钠有 关物质的来源。 1 4 2 利塞膦酸钠溶解度的测定与关联 针对利塞膦酸钠水溶性好，其他有机溶剂溶解度差的特点，为了深入研究 利塞膦酸钠的溶解特性，更好的控制利塞膦酸钠生产过程中有关物质的生成， 本文在研究有关物质的基础上，开展了利塞膦酸钠在不同极性溶剂体系中的溶 解度特征研究，采用水乙醇二元体系为模型体系，着重测定了常压下、2 8 3 1 5 k 3 1 8 1 5 k 的温度范围内、乙醇摩尔分数在0 - - 0 1 2 范围内的水乙醇二元溶剂体系 中利塞膦酸钠的溶解度数据，并采用两参数和三参数方程对实验测量数据进行 了关联。 对于固液平衡，没有统一的测定方法，不同的固体和液体组成的固液体系 其性质也有很大差别，在测定溶解度数据时，所采用的测定方法也不相同。但 总的来说，固体在液体中溶解度的测定方法主要有平衡法和动态法两种： ( 1 ) 平衡法 5 第一章绪论 平衡法是将过量的固体溶质放置在液体溶剂中，在恒温下搅拌，静置后采 用适当的分析方法分析上层饱和清溶液的组成作为该温度下的溶解度。分析方 法有色谱法，分光光度法，化学滴定法和重量法。 ( 2 ) 动态法 动态法是通过观察物系中固相的消失来测定溶解度，又分为两种：一种是 在一定量溶质和一定量溶剂的条件下，逐渐改变体系的温度使物质完全溶解， 记录溶解度的数据。另一种是溶剂的量一定，测量某一温度下的溶解度，逐渐 增加溶剂里的溶质含量达到平衡，根据固体溶质的消失来判断该温度下固体溶 质的溶解度。 动态法测定溶解度过程中，可以用高精度的仪器判定溶解终点，得到准确 可靠的溶解度数据。近年，多采用激光监视的动态法【4 2 , 4 3 】和差热扫描量热法【4 4 】。 激光监视的动态法实验设备简单且易于安装。 升温法是通过样品中的固体消失来确定溶解温度，将样品在无限接近于平 衡的状态下缓慢升温，当观察到最后一个颗粒溶质消失或溶液从雾状变成透明 时的温度，即为溶解温度。 本文采用激光监视的动态升温法测定利塞膦酸钠的溶解度数据，即溶剂的 量一定，逐渐增加溶剂里的溶质含量达到平衡，测量某一温度下的溶解度，在 无限接近于平衡的状态下再缓慢升温，采用激光测示仪判定溶解终点。 目前固液相平衡中溶解度的关联模型有很多种。在满足一定精度的前提下， 为使计算方便，本文采用简化的两参数和三参数方程，对利塞膦酸钠的溶解度 数据进行关联拟合。 6 第二章利塞膦酸钠有关物质检查和含量分析 第二章利塞膦酸钠有关物质检查和含量分析 2 1引言 据文献报道，离子对高效液相色谱法【3 31 操作简便、经济、特异性好，是 测定利塞膦酸钠的首选方法。利塞膦酸钠有关物质含量分析和检查方法各国药 典尚未收载。因此开发出利塞膦酸钠有关物质含量分析和检查的简便方法，对 利塞膦酸钠原料药的质量控制非常有意义。 本文采用四丁基溴化铵为离子对试剂，建立了利塞膦酸钠有关物质含量分 析和检查的反相离子对h p l c 法，对利塞膦酸钠原料药和化学对照品中的主要 有关物质进行了和检查含量分析。 2 2 仪器与试药 戴安高效液相色谱仪系统：由p 6 8 0h p l cp u m p 、a s i 1 0 0a u t o m a t e ds a m p l e i n j e c t o r 、t h e r m o s t m t e dc o l u m nc o m p a r t m e n tt c c 10 0 、u v d l7 0 及c h r o m e l e o n 色谱工作站组成( 美国戴安公司生产) ；1 0 0 肛lh a m i l t o n 微量进样器( 美国) ； 移液枪( d r a g o n ，芬兰) ；a l1 0 4 型电子天平( 梅特勒托利多仪器有限公司) ； p h s 3 c 型p h 计( 上海精密科学仪器有限公司) ；k q 1 0 0 e 型超声波清洗器( 昆 山市超声仪器有限公司) ；x k 9 6 a 型快速混匀器( 姜堰市新康医疗器械有限公 司) ；d p 0 1 微孔过滤装置( d o c h r o m 公司) 等。 利塞膦酸钠原料药( 批号：0 7 11 0 0 0 1 0 ) ，由河南省某药业公司提供；利塞膦 酸钠化学对照品( 批号：1 0 0 6 1 3 2 0 0 4 0 1 ) ，购自中国药品生物制品检定所；磷酸 二氢铵、四丁基溴化铵、乙二胺四乙酸二钠和氢氧化钠均为分析纯，试验用水 为重蒸去离子水，甲醇为色谱纯( 天津市彪仕奇科技发展有限公司) 。 2 3 方法与结果 2 3 1色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为t h e r m ob d sh y p e r s i lc 1 8 柱( 2 5 0 r a m 4 6 m m ，5 岬) ，流动相为甲 醇一水( 含5m m o l l 磷酸二氢铵，2m m o l l 四丁基溴化铵，1 5m m o l l7 - - 胺 四乙酸二钠) ( 2 5 ：7 5 ，v v ) ，用l m o l l 氢氧化钠溶液调p h 至7 9 。流动相在 7 第二章利塞膦酸钠有关物质检查和含量分析 使用前经0 4 5 1 t m 微孔滤膜抽滤，超声脱气。流速为o 8 m l m i n ，柱温为3 0 。c ， 检测波长为2 6 2n m 。 取适量利塞膦酸钠原料药，加流动相配制成约lm g m l 的供试溶液，取2 0 1 t l 进样，记录色谱图。图2 1 和图2 2 为上述色谱条件下得到的空白流动相和供试 溶液的色谱图。 图2 1 流动相色谱图 图2 2l m g m l 利塞膦酸钠供试溶液色谱图( 1 流动相，2 有关物质，3 利塞膦酸钠) 由于组成较为复杂，流动相在4 9 m i n 附近出峰。利塞膦酸钠及其有关物质 的保留时间分别约为5 9 m i n 和8 3 m i n ，二者分离情况良好，分离度大于1 5 。有 效理论塔板数大于2 0 0 0 。 2 3 2利塞膦酸钠原料药有关物质检查和含量分析 根据化学药物杂质研究的技术指导原则【3 ，对于未知杂质的定量，可采用 不加校正因子的主成分自身对照法和峰面积归一化法。为得到较为可靠的结果， 8 第二章利塞膦酸钠有关物质检查和含量分析 本试验在采用不加校正因子的主成分自身对照法的同时，与峰面积归一化法得 到的信息进行比较。溶液配制如下： 利塞膦酸钠原料药供试溶液( 1 m g m l ) ：精密称取利塞膦酸钠原料药5 0 2 m g ， 置5 0 r a l 容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得。 利塞膦酸钠原料药对照溶液( o o l m g m l ) ：精密量取供试溶液l m l ，置1 0 0 m l 容量瓶中，用流动相溶解定容，摇匀，即得。 照上述色谱条件，取对照溶液2 0 此，注入液相色谱仪。再精密量取供试溶 液2 0 p l ，注入液相色谱仪，二者均重复进样5 次，记录色谱图至主成分峰保留 时间的4 5 倍。 图2 3 和图2 4 分别为利塞膦酸钠原料药对照溶液和供试溶液的色谱图。对 照溶液和供试溶液中利塞膦酸钠及其主要有关物质的峰面积见表2 1 。 图2 3o o l m g ，m l 利塞膦酸钠原料药对照溶液色谱图( 1 流动相，2 利塞膦酸钠) 图2 4l m g ，m l 利塞膦酸钠原料药供试溶液色谱图( 1 流动相，2 有关物质，3 利塞膦酸 钠) 9 第二章利塞膦酸钠有关物质检查和含量分析 表2 1利塞膦酸钠原料药对照溶液和供试溶液中利塞膦酸钠及其有关物质的峰面积 由上述不加校正因子的主成分自身对照法计算，有关物质含量约为o 1 4 ； 同时以面积归一化法计算，有关物质含量也约为0 1 4 。两种计算方法得到的 结果一致。原料药中该有关物质含量已超过主成分的0 1 ，因此须对该有关物 质进行确认。 2 3 3 利塞膦酸钠对照品有关物质检查和含量分析 色谱条件和具体检查方法同2 3 2 。 采用不加校正因子的主成分自身对照法，溶液配制如下： 利塞膦酸钠对照品供试溶液：精密称取利塞膦酸钠化学对照品2 4 9 m g ，置 2 5 m l 容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得。 利塞膦酸钠对照品对照溶液：精密量取供试溶液l m l ，置1 0 0 m l 容量瓶中， 用流动相溶解定容，摇匀，即得。 利塞膦酸钠对照品对照溶液和供试溶液的色谱图分别见图2 5 和图2 6 。对 照溶液和供试溶液中利塞膦酸钠及其主要有关物质的峰面积见表2 2 。 图2 5o o l m g m l 利塞膦酸钠对照品对照溶液的色谱图( 1 流动相，2 利塞膦酸钠) 1 0 第二章利塞膦酸钠有关物质检查和含琏分析 图2 6l m g m l 利塞膦酸钠对照品供试溶液的色谱图( 1 流动相，2 有关物质，3 利塞膦酸钠) 表2 2 利塞膦酸钠对照品对照溶液和供试溶液中利塞膦酸钠及其有关物质的峰面积 由上述不加校j 下因子的主成分自身对照法计算，有关物质含量约为0 1 4 ； 同时以面积归一化法计算，未知峰含量也约为o 1 4 。可见，对照品有关物质与 原料药有关物质保留时间和含量均一致，需要对该有关物质进行确认。 2 3 4 进样精密度试验 分别取浓度为o 0 1m g m l 和1m g m l 的利塞膦酸钠原料药和对照品对照溶 液和供试溶液，分别连续进样5 次，记录色谱图，分别以利塞膦酸钠和有关物 质的峰面积计算，得原料药r s d 分别为o 9 5 和7 4 ，对照品r s d 分别为1 2 和3 6 ，可见进样精密度良好。分别见表2 3 和表2 4 。 表2 3 利塞膦酸钠原料药对照溶液和供试溶液进样精密度( n = 5 ) 第二章利塞膦酸钠有关物质检布和含量分析 表2 4 利塞膦酸钠化学对照品对照溶液和供试溶液进样精密度( n = 5 ) 2 4 讨论 2 4 1流动相组成对利塞膦酸钠及其有关物质色谱行为的影响 使用h y p e r s i lb d sc 1 8 色谱柱，在流速( o 8 m l m i n ) 、柱温( 3 0 ) 和检 测波长( 2 6 2n m ) 不变的前提下，测试了不同流动相p h 值、四丁基溴化铵浓度、 甲醇比例、磷酸二氢铵浓度和乙二胺四乙酸二钠浓度5 个因素对利塞膦酸钠及 其有关物质色谱行为的影响。改变其中的1 个因素，其他4 个因素固定不变， 将2 0 x l1m g m l 的利塞膦酸钠原料药供试溶液注入h p l c 仪进行分析。 ( 1 ) 流动相p h 值的影响 固定四丁基溴化铵浓度( 2 m m o l l ) 、甲醇体积分数( 2 5 ) 、磷酸二氢铵 浓度( 5m m o l l ) 和乙二胺四乙酸二钠浓度( 1 5m m o l l ) ，改变流动相p h 值。 分别测试了p h 5 4 0 、5 9 6 、6 4 8 、7 0 5 、7 5 6 、7 9 2 的流动相对利塞膦酸钠 及其有关物质保留行为的影响。随流动相p h 值的升高，利塞膦酸钠及其有关物 质保留时间均增加，p h 为7 9 时二者峰形和响应较好且能达到良好分离。 ( 2 ) 四丁基溴化铵浓度的影响 固定流动相p h 值( 7 9 ) 、甲醇体积分数( 2 5 ) 、磷酸二氢铵浓度( 5m m o l l ) 和乙二胺四乙酸二钠浓度( 1 5r e t o o l l ) ，改变四丁基溴化铵的浓度。 分别考察了o 、1 、2 、3 、4m m o l l 四丁基溴化铵对利塞膦酸钠及其有关物 质保留行为的影响。随四丁基溴化铵浓度增加，利塞膦酸钠及其有关物质保留 时间均增加。浓度为2m m o l l 时，二者出峰时间合适、分离效果较好。 ( 3 ) 甲醇比例的影响 固定流动相p h 值( 7 9 ) 、四丁基溴化铵浓度( 2 m m o l l ) 、磷酸二氢铵浓 度( 5r e t o o l l ) 和乙二胺四乙酸二钠浓度( 1 5m m o l l ) ，改变甲醇的比例。 分别考察了5 、15 、2 0 、2 5 和3 0 的甲醇比例对利塞膦酸钠及其有 关物质保留行为的影响。随甲醇比例增加，利塞膦酸钠及其有关物质保留时间 均降低。甲醇比例为2 5 时，二者出峰时间较为合适且分离良好。 1 2 第二章利塞膦酸钠有关物质检查和含量分析 ( 4 ) 磷酸二氢铵浓度的影响 固定流动相p h 值( 7 9 )