（纺织工程专业论文）纳米tio2对丝素蛋白的影响研究.pdf

浙江理t 大学硕l ：学位论文 摘要 丝素蛋白是重要的天然高分予蛋白质，在天然高分了蚕丝中占7 0 - - 一8 0 ，丝素蛋白的特 性是研究、开发利用丝素蛋白资源极其重要的基础理论问题。丝素膜是丝素蛋白应用的新途 径，也是研究丝素蛋白特性的一种可靠手段。本课题组曾采用溶胶一凝胶法制备纳米改性再 生丝素膜，并对其结构及性能进行了研究，结果表明纳米t i 0 2 粒了促使丝素蛋白构象发牛了 转变，宏观上体现为丝素膜的水中溶失率、力学性能及热学性能等得到了较好的改善。在此 基础上，本文进一步研究了超微量纳米t i 0 2 粒予对丝素蛋白构象的影响，取得了国内外未见 报道的新成果，为拓展丝素膜的应用领域和前景做了一些基础性研究。 本课题的丰要工作内容包括： 1 采用溶胶凝胶法制备纳米改性丝素膜，并探讨了其制备机理。 2 采用三因素四水平正交试验法，以应力、应变及溶失率为指标，探讨成膜过程中温度、纳 米t i 0 2 含量、p h 值3 个工艺因素对丝素膜机械性能及水溶解性的影响规律，并寻找其最优 成膜条件参数，结果表明： ( 1 ) 影响丝素膜断裂应力的因素的主次顺序为纳米z i 0 2 含量_ p h 值一成膜温度；影响丝 素膜断裂伸长率的因素的丰次顺序为成膜温度- 纳米t i 0 2 含量_ p h 值：影响丝素膜水 中溶失率的因素的主次顺序为纳米t i 0 2 含量_ 成膜温度_ p h 值。 ( 2 ) 最佳成膜条件为：温度4 0 。c ，m t i 0 2 m s f 为0 0 6 w t ，p h 为6 。 ( 3 ) 最佳成膜工艺为：温度4 0 ，p h 为6 。 3 采用s e m 、u v 、a f m 、f t i r 、x r d 等测试于段对制备的纳米改性丝素膜进行表征，探 讨纳米t i 0 2 对丝素蛋白微细结构的影响。结果如下： ( 1 ) s e m 、a f m 表明纳米t i 0 2 在丝素蛋白膜中实现了良好的分散，进一步通过有效质量 近似模型估算出纳米改性再生丝素膜中纳米粒了粒径在8 0n n l 左右。 ( 2 ) a t r f t i r 结果表明，适量的纳米t i 0 2 的加入，虽然没有改变纯丝素膜的一级化学结 构，但促进了丝素无规卷曲构象向d 折叠构象的转化，从而使得丝素蛋白的结晶结构得到了 加强。 ( 3 ) 采用x r d 技术分析了丝素膜材料的结晶结构，用h e r m a n s 法计算了纳米改性丝素膜 浙江理工人学硕上学位论文 的结晶度。结果表明，在丝素膜样品中加入一定量的无机纳米t i 0 2 颗粒，丝素复合膜的结晶 度有一定程度的提高。 4 测试纳米改性丝素膜的机械性能、热转变温度、表面润湿角、水溶失率等性能，探讨纳米 粒予对丝素膜性能的影响以及性能与丝素蛋白微细结构间的联系。结果如下： ( 1 ) 机械性能测试表明，纳米改性丝素膜的强力有显著提高，弹性略微下降，综合考虑认 为当m t i 0 2 m s f 为0 0 8 时，纳米改性丝素膜的强力及弹性能得到最好的兼顾。 ( 2 ) t g a 表明纳米改性再生丝素膜的起始和终止分解温度都比纯丝素膜的有所提高。 ( 3 ) 润湿角测试表明，加入纳米t i 0 2 后，丝素膜的润湿角呈现先增大后减小的趋势，在 m t i 0 2 m s f 为0 0 8 时丝素膜的润湿角最大。 ( 4 ) j j l l x , 纳米t i 0 2 后，膜的溶失率明显降低。随着纳米t i 0 2 含量的增加，溶失率呈现先减 少后增加的趋势，在m t i 0 2 m s f 为0 0 8 时丝素膜的溶失率最低。 5 采用二维相关红外光谱法探讨了纳米t i 0 2 对丝素蛋白构象转变动力学的影响。结果表明， 丝素分予和纳米粒子首先是弱氢键缔合的n h 键以及自由的n h 键发生了断裂及重组，然后 生成了强氢键，导致丝素分予重排，使丝素分子从无序状态转变为有序排列，同时无规线团 构象及a 螺旋构象向折叠构象发生转变，最后促使丝素蛋白的构象从无规线团或s i l ki 转变 为s i l k i i 构象。 本文的创新点在于：( 1 ) 探讨了超微量纳米粒子对丝素蛋白高级结构的影响。( 2 ) 通过 正交实验找到了溶胶一凝胶法制备纳米改性丝素膜最佳的反应条件，分析了各成膜因素对丝 素复合膜性能的影响。( 3 ) 采用二维相关光谱法对丝素蛋白构象转变进行了动力学分析。 关键词：丝素蛋白；纳米t i 0 2 ；构象；动力学分析 浙江理t 人学硕：j ：学位论文 s t u d yo nt h ec o n f o r m a t i o na n dp r o p e r t i e so ft h en a n ot i 0 2m o d i f i e d r e g e n e r a t e d s i l kf i b r o i nm e m b r a n e s a b s t r a c t i ti sw e l lk n o w nt h a ts i l kf i b r o i np r o t e i ni si m p o r t a n tn a t u r a lp r o t e i n ，a n di to c c u p i e da b o u t 7 0 - - - 8 0 o ft h es i l kp r o t e i n t h ep r o p e r t yo fs i l kf i b r o i ni st h ee x t r e m e l yi m p o r t a n tb a s i ct h e o r y q u e s t i o no ft h er e s e a r c ha n d t h ed e v e l o p m e n to fu s i n gs i l kf i b r o i np r o t e i nr e s o u r c e s t h es i l kf i b r o i n m e m b r a n e sa r et h en e wa p p l i c a t i o no ft h es i l kf i b r o i na n dt h er e l i a b l em e t h o do ft h es t u d ys i l k f i b r o i n t h er e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i n n a n o t i 0 2m e m b r a n e sw e r ep r e p a r e db ys o l g e lm e t h o d ；i t s c o n f o r m a t i o na n dp e r f o r m a n c ew e r es t u d i e d t h em a i n w o r ka n dc o n c l u s i o n sa r el i s t e da sf o l l o w s ： i t h er e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i n n a n o - t i 0 2m o d i f i c a t i o nm e m b r a n e sw e r ep r e p a r e db yu s i n g s o l - g e lm e t h o da n di t sm e c h a n i s mw a s s t u d i e d 2 t h r o u g ho r t h o g o n a lm e t h o d ，t h em o d i f i e ds i l kf i b r o i nm e m b r a n c e sw e r ep r e p a r e d w i t h i n t e n s i t y , e l o n g a t i o na n dw a t e r - s o l u b i l i t ya st a r g e t s ，t h ef a c t o r sw h i c ha f f e c tt h ee x p e r i m e n tw e r e a n a l y z e d ，t h ed e g r e eo f e a c hf a c t o ra f f e c tt h ee x p e r i m e n tw a so b t a i n e d , a n dt h eo p t i m a le x p e r i m e n t ( 1 ) t h es e c o n d a r yo ft h ef a c t o r sa f f e c t e dt h ei n t e n s i t yi sn a n o - t i 0 2 p h t e m p e r a t u r e ；t h e s e c o n d a r yf o re l o n g a t i o ni st e m p e r a t u r e n a n o t i 0 2 p h ；t h es e c o n d a r yf o rw a t e r - s o l u b i l i t yi s n a n o - t i 0 2 t e m p e r a t u r e p h ( 2 ) t h eo p t i m a le x p e r i m e n tc o n d i t o ni s ：4 0 f o rt e m p e r a t u r e ，o 0 6 w t f o rm t i 0 2 m s fa n d 6f o rp h ( 3 ) t h eo p t i m a lt e c h n i q u ei s ：4 0 f o rt e m p e r a t u r ea n d6f o rp h 3 t h er e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i n n a n o t i 0 2m e m b r a n e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yu s i n gs e m 、 u v 、a f m 、x r da n df t i rt os t u d yt h ee f f e c to fb l e n d i n gn a n o - t i 0 2o nt h ec o n f o r m a t i o no fs i l k f i b r o i n t h er e s u l t sa r es h o w e da sf o l l o w s ： ( 1 ) f r o m t h es e m 、s e ma n de m a ，w ec a nc o n c l u d e dt h a tn a n o t i 0 2i sb e a e ri nd i s p e r s e s 浙江理t 大学硕i ：学位论文 i nt h en a n o m e t e rm o d i f i e dr e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i nm e m b r a n e st of o r mt h et y p eo r g a n i c i n o r g a n i c n e t w o r ks 仃u c t u r e ，i ta l s os h o w st h es i z eo fn a n o - t i 0 2i sa r o m l d8 0 珈 1 1 ( 2 ) f r o ma t r f t i r ，i ts h o w sd u r i n gt h ep r o c e s so fb l e n d i n gn a n op a r t i c l e st ot h es i l kf i b r o i n , a l t h o u g ht h ep r i m a r ys t r u c t u r eo fs i l kf i b r o i nw a sn o tc h a n g e d ，i t sc o n f o r m a t i o nw a sc h a n g e df r o m r a n d o mc o i lt oi b - s h e e t , w h i c hw o u l ds t r e n g t h e ni t sc r y s t a l l i n i t y ( 3 ) t h ec r y s t a l l i n i t yo fs i l kf i b r o i nw a sa n a l y z e db yx r d ，a n dt h ec y s t a ld e g r e ew a s c a l c u l a t e db yh e r m a n sm e t h o d ，t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h ec r y s t a ld e g r e ew a si n c r e a s e dw h e n b l e n d i n gn a n o - t i 0 2 4 m e a s u r et h et h e r m a lt r a n s i t i o nt e m p e r a t u r e ，m e c h a n i c a lp e r f o r m a n c e 、w a t e rc o n t a c ta n g l e a n dw a t e r - s o l u b i l i t yo ft h em o d i f i c a t i o nr e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i nm e m b r a n e sf o rf u r t h e ri n f o r m a t i o n a b o u tt h ee f r e c to fn a n ot i 0 2t ot h ep r o t e i na n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e s t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ep e r f o r m a n c ec h a n g ei sm a i n l yb e c a u s en a n o - t i 0 2c a u s e st h es i l k f i b r o i np r o t e i nc o n f o r m a t i o nt r a n s f o r m a t i o n ( 1 ) m e c h a n i c a lt e s to fs i l kf i b r o i nm e m b r a n c es h o w so b v i o u si n c r e a s ei ns t r e s sa n dal i t t l e d e c r e a s ei ns t r a i no ft h em o d i f i e dm e m b r a n c ec o m p a r e dt op u r es i l km e m b r a n c e a c c o r d i n gt o c o m p r e h e n s i v ec o n s i d e r a t i o n ，t h em o d i f i e ds i l kf i b r o i nm e m b r a n c eh a ss a t i s f y i n gm e c h a n i c a l p e r f o m a n c ew h e nm t i 0 2 m s ri s0 0 8 ( 2 ) f r o mt h ea n a l y z e do ft g a , t h et h e r m a lt r a n s i t i o nt e m p e r a t u r eo f m o d i f i e ds i l kf i b r o i nw a s h i g h e rt h a nt h et h ep u r es i l kf i b r o i n ( 3 ) t h ew a t e rc o n t a c ta n g l ei n c r e a s e db e c a u s eo ft h en a n o - t i 0 2a d d e d ( 4 ) t h ew a t e r - s o l u b i l i t yd e c r e a s e dd u et ot h eb l e n d i n go fn a n o - t i 0 2 5 t h r o u g ht h et w od i m e n t i o n a lc o r r e l a t i o nf t i rs p e c t r u m ，t h ec o n f o r m a t i o nt r a n s l a t i o nd y l l a m i co f s i l kf i b r o i nw a ss t u d i e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t ，b yt h ea d d i n go fn a n ot i 0 2 ，t h es t r o n g h y d r o g e nb o n df o r m e da f t e rn hb o n do f t h ef i b r o i nw e r er u p t u r e da n dr e a r r a n g e d t h es i l kf i b r o i n m o l e c u l a rw e r et u m e dt ob eo r d e r e dp h a s e ，a n di t sc o n f o r m a t i o nc h a n g e sf r o mr a n d o mc o i l a n d a - h e l i xt of l - s h e e t ，w h i c hm a k ei t ss t m c t u r eo fa g g r e g a t i o nf r o ms i l kit os i l ki ia tl a s t k e y w o r d s ：s i l kf i b r o i n ；n a n o p a r t i c l e ；c o n f o r m a t i o n ；d y n a m i ca n a l y s i s v 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：奸本骖 日期：弦彩年1 月9 - f 日+ 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后使用本版权书。 不保密 学位论文作者签名： 日期：年月日 指导教师签名： 日期：年月 日 浙江理工人学硕l ：学位论文 1 1 丝素蛋白的结构和性质 第一章前言 长期以来，人们一直致力于开发各种合成材料以获得纺织纤维材料，但是人造纤维在 很多方面还不能和来自动物植物的天然纤维相媲美。 蚕丝蛋白是研究最广泛的天然蛋白质之一，它不仅具有独特的氨基酸组成和结晶结构 【l 】以及一般合成高分予所不具备的综合力学性能( 如：高拉伸模量( 1 5 c , p a ) 和结构强度 ( 4 0 0 6 0 0 m p a ) 、较大的断裂伸长率和拉伸回复率) ：而且具有多孔性、高的吸水回潮率、优 异的组织相容性【2 1 。因此具备作为食品、化妆品、医用材料、生物材料所需的特殊性能， 目前它不仅作为一种性质优良的纤维应用于纺织品的牛产中，还在牛物应甩【3 】、生物技术 d - s 、医药、精细化工乃至军用材料等领域受到广泛的关注【6 1 1 1 。 1 1 1 丝素的蛋白化学组成及主要结构 蚕丝蛋白是由丝素蛋i 兰l ( s i l kf i b r o i n ，简称s f ) 和丝胶蛋白( s e r i c i n ) 两部分组成，疏 水性的丝胶包覆在丝素蛋白的外部，约占总重量的2 5 ，而亲水性的丝素蛋白约占7 0 ， 此外蚕丝中还有5 左右的杂质【1 2 】。 丝素蛋白中包含1 8 种氨基酸，如表1 1 所示【”l ，其中甘氨酸( g l y ) 、丙氨酸( a l a ) 和丝氨酸( s e r ) 三种0 【氨基酸，约占总组成的8 5 ，二者的摩尔比为3 ：2 ：1 。 l u c a s 【1 4 , 1 5 】，k a y l 1 6 1 ，l o t z t l 7 1 等利用酶水解法认为丝素蛋白的主要氨基酸残基序列为 g a g a g s g a a g 【s g ( a g ) 。 8 y ，n 通常为2 。w a r w i c k e r t l 8 】等通过x r d 认为丝素结晶区存 在g a g a g s 重复序列。z h o u 等【i9 】通过基因方法指出丝素蛋白的主要重复单元为g a g a g s 。 因此，丝素蛋白的结晶区域可以认为- 丰要由6 个氨基酸残基( g a g a g s ) n 重复序列组成。 浙江理工人学硕： ：学位论文 表1 1 丝素蛋白的氨基酸组成 k i r i m u r al u e a ss a s a k is h i m u r a q i a n g l y 4 6 1 l4 4 64 5 24 2 94 4 4 9 a l a2 9 4 l2 9 42 9 63 0 02 9 1 8 v a l2 0 92 2 02 1 02 52 2 7 l e uo 4 20 5 30 4 50 60 4 9 i i e0 5 4o 6 6o 6 20 60 6 4 p h c0 5 6o 6 3 o 6 0 o 7 0 6 6 t y r 5 2 75 1 7 4 2 6 4 8 6 6 6 s e r1 1 3 l1 2 18 9 51 2 21 0 2 l t i l ro 7 8o 9 lo 5 7o 90 8 8 c y s o 0 20 2 0 0 0 3 0 0 9 m e t0 0 5o 1 0o 10 0 7 t r y 0 1 4 o 1 l 0 2 0 p r o0 4 40 3 6o 50 3 6 a s p 1 0 51 3 01 6 91 91 6 0 g l u0 9 61 0 21 1 91 41 1 6 a r g 0 4 20 4 70 3 70 50 4 9 l y s o 2 5o 3 2o 2 90 4o 3 3 h i so 1 70 1 4 0 1 5o 2o 2 2 丝素蛋白的分予量早期测定的值差距很大。超速离心法测得分予量为4 0 0 k d a ，沉淀 分析法测得3 7 0 k d a ，光散射法测得4 3 5 k d a l 2 0 1 。导致这种差异的_ 丰要原因，可能是由于溶 解丝素蛋白质的方法从而使得丝素分子量降解程度不同。目前丝素蛋白质分子量比较公认 的值为3 5 3 8 万【2 1 ，2 2 2 3 ，2 4 2 5 之羽，并且认为丝素蛋白是由重链( h 链) 、轻链( l 链) 及p 2 5 糖蛋白组成的复合体。 由丝素h 链基因序列推导的丝素h 链约含5 0 0 0 个氨基酸，分了量3 5 万【2 9 1 ，丰要富含 四种氨基酸，甘氨酸( 4 2 8 ) 、丙氨酸( 3 2 4 ) 、丝氨酸( 1 4 7 ) 、酷氨酸( 1 1 8 ) 。h 2 浙江理工人学硕二 = 学位论文 链包含一个1 5 l 残基的非重复n 末端序列( 信号肽) ，1 1 个短的无定形区( 重复序列编码 4 3 个氨基酸) 和1 2 个1 - 2 k b 长的结晶区交替出现以及一个5 8 残基的c 末端序列。h 链1 2 个低复杂度的结晶域，占链总长的9 4 ，因是此是非常容易结晶的肽链【3 0 1 。 l 链含2 4 4 个氨基酸，分子量为2 5 8 0 0 d a ，链中含有三个胱氨酸残基，其中2 个胱氨 酸形成分子内二硫键，第三个胱氨酸残基位于c 端较亲水区域内，和丝素蛋白h 链第5 2 4 4 号氨基酸形成链间二硫键，组装成丝素蛋白【3 i 】。 p 2 5 蛋白分予量为2 5 k d a 3 2 - 3 5 1 ，是一种糖蛋白，带有8 个半胱氨酸，形成4 个分子内 二硫键。它不与h 链形成共价结合，它作用作为蚕丝蛋白质的微量成分而存在。主要可能 控制丝素蛋白的折叠，通过疏水作用、氢键诱导丝素蛋白进行d 折叠，形成规整的结构， 可能与蚕的液晶纺丝机理有关【3 6 】，与丝素h 、l 链的比例一般认为是l ：6 ：6 ，因此家蚕 丝素蛋白的基本单位是6 h + 6 l + l p 2 5 ，分子量约为2 2 8 6 k d a 。 1 1 2 丝素蛋白的构象 1 1 2 1s i l ki i 结构 许多学者通过x r d 研究了蚕丝纤维中丝素蛋白的结晶结构【1 7 3 7 删。m a r s h ，p a u l i n g 和 c o r e y t 4 5 】首次详细分析了丝素蛋白中s i l ki i 构象的x 射线衍射并提出如图1 1 所示的模型，多 肽链几乎是伸展的，2 i 螺旋轴是它的骨架，在反平行的链间存在着氢键，晶胞参数为： a = 9 4 0 a ，b = 6 9 7a ，c = 9 2 0a 。在层与层之间，甘氨酸与甘氨酸相对或丙氨酸与丙氨酸相 对。 l a z o 4 6 】通过能量优化的方法提出了一种称为1 3 螺旋的s i l ki i 构象，如图1 2 。这种p 螺旋 结构中所有氨基酸的侧链都在螺旋外侧，比以前观察到的一般螺旋结构更加紧凑。无论是 单股的p 螺旋还是三股的螺旋堆积，都比对应的伸展链结构的平均氨基酸的能量来得低， 并且作者还详细分析了c d 和x 衍射的数据，认为这种结构是合理的 但是近年来随着x 谤t 线衍射技术和分析于段的提高，以及模型计算模拟的发展，对于 m a r s h 等提出的这一经典模型的结构提出了一些不同的看法。例如t a k a h a s h i 4 7 1 根据氢键结 合的不同层状结构分为极化反平行( p a ) ，极化平行( p p ) ，反极化平行( a p ) ，反极化一反平 浙江理t 大学硕l 学位论文 r ( 从1 四种不同的模型，如图l3 所币。极化年反极化分别指阿氨酸的甲筚足都位于崖状 面的一侧或两侧，平行和反平行分别指相邻的多肽链是以相同方向或相反方向排列。m a r s h 的模掣就属于p a 型的。 图1 _ 1s i l k 模型囤( m a m h 提出) 圈1 2 由能量优化法算得的睢螺旋s i l k 构盟横型图 5 7 3 5 浙 t 理r 人学硕i 学位论文 手电 专 f ， 分哥 簿 1 1 2 2s i l k l 结构 手一电 、f 、? 专3 图1 3s i l k l l 分子构睾的四种模型圈 s i l k i 晶体可以从蚕丝腺体中取出，在没有机械力作用下于空气中干燥得到，也可以用 盐溶液把脱胶丝溶解后透析得到。s i l k i 在溶剂( 如甲酵，乙醇) 、温度、剪切力等的作用下 很容易转变为s i l k i i 。s i l k i 对于机械力的敏感性和向s i l k i i 转变的很大的倾向性使得对 它结构的研究十分围难。 l o t z 等删通过对1 i 型p o l y ( a g 一) 和s i l ki 衍射图谱的比较认为它们有类似的构象( 图 i4 ) 。在这种构象中，两个氧基酸的肽链是重复单元，丙氢酸和甘氧酸的构蒙完全不同，分 别对应着p 一折叠构象和。一螺旋构象，叫以用d 。- 吨。h 表不。 k o n i s h i 等i ”通过对在蚕丝素蛋白l i b r 稀溶液中析出的层状晶体进行x 一射线衍射分析 得知该晶体属于正交晶系，并把这种构象归为态，即s i l k ，晶胞参数为：a - 45 9 a ，b - 72 0 a ，c - 90 8 a 。 f o s s e y 等o “通过对聚【l a 1 a q y ) 的构蒙能量计算的方法提出了类折聋模型，认为a 1 a 残基采用右螺旋，g l y 残摹采用左螺旋的类折叠构象。 、，t，、， ，r 墨，一十?rf ， 。，f f ，f；) ，亍)多0，o， h o 互 f 浙江理t 大学项l 学位论文 l a z o 5 1 通过分予力学能量计算的方法提出，一种b - 转角的s i l ki 构象，如图l5 ，用透 射电镜和电了衍射确定的s i l k i 的晶胞参数为2 26 5 7 0 x 2 08 2 a ，并认为这一模型可以解 释c d 及核碰数据。 三：釜 擎 一一一 ：_ 入 ， 圈1 4 s i l k i 模型在8 b 平面的投髟圈 是近，a s a k 啪等【5 2 】根据。3 c 高分辨率n m r l ， 图1 6 弘转角模型图( a s a k u r a 等提山) 也驴卜步露 浙江理r 人学硕i 学位论文 1 1 2 3s i l k 结构 v a l l u z z i i s 35 5 1 等利用t e m 及单晶电予衍射的方法，通过分析在水和空气的界面得到的 晶体发现了种被称为s i l k i i i 的晶体，如图17 所不。它是构象为3 2 一螺旋的六角型堆积， 并认为可能是在s i l ki 向s i l ki i 转变的一种中间体，也就是说吐丝过程中丝素蛋白分子链 由无规线团或螺旋态的s i l k l 构象先形成这种s i l k l i i 的过渡态，然后再形成b 晰叠态的s i l k i i 。s i l k i l l 在丝素蛋白中含量低，且涮s i l k i 一样稳定度低极易在机械力、甲醇溶剂、热的 作用下转变为s i l k l l 结构。 髓 丝素可以根据不同的研究甘的和制备条件被制作成纤维、粉末、凝腔及丝素膜等多种形 式，其中以丝素膜制作简单方便j 们开究较多。m a g o s h i 等5 “9 愫用d s c 、i r 及x r d 谱研 究了丝素蛋白膜的热学性能，结果表明丝素蛋白膜中存在无归构象；在1 0 0 。c 附近蚕丝开 始脱水，2 8 0 c 时观察到样品分解。对于无定形态的丝素蛋白膜，它的玻璃化转变出现在 1 7 5 c ，当温度超过2 1 2 以后，无规线团向b 折叠结构转变。 蚕丝素蛋白的力学性能与其构象及聚集态结构密切相关。以纤维形式存在的丝素虽白会 呈现其出色的力学性能，而以膜形式存在的丝素蛋白则显得较为脆弱。从常见的两种结构 嘲鞋 浙江理丁大学硕士学位论文 来看，s i l kl 部分分了链排列较为松散而无序，因而为丝素蛋白具有良好的弹性模量提供了 必要的条件；s i l k i i 部分分予链排列较为紧密且有序，所以也不难理解丝素蛋白纤维的力 学强度为何如此出色。 y a m a u r a 删和m a g o s h i 6 i 】等人发现再牛丝素蛋白和丝腺体中天然丝素蛋白的纤维化过 程是应力条件下的蛋白质变性过程。s h a o 等人【蚓发现改变蚕的吐丝速度，将使蚕丝的力学 性能发牛较大的变化。这说明，在高分子链一级结构确定的前提下，外界加工条件会对材 料的力学性能产生巨大的影响。这个结论对丝素蛋白的模拟合成具有非常重要的意义，从 某种意义上说，人们只需要合成与丝素蛋白氨基酸序列相似( 即使有较大的差别) 的材料， 配之以一定的加工条件，就可以得到足以与丝素蛋白纤维的力学性能相抗衡的人工合成材 料。 1 3 丝素蛋白折叠机理的研究 蚕丝优异力学性能一直是科学家们关注的课题。虽然各国科学家都在尝试用各种丝蛋 白溶液( 天然的或再生的) 进行人工模拟纺丝，但是纺出的人工丝的力学性能依然无法和天 然丝相比【9 】。高分予材料的物理性能取决于其结晶尺寸及结晶序列。在蚕的腺体中丝素蛋 白的构象为s i l ki ( 主要是无规线团为主，还有少量的转角，螺旋等) ，而在纤维状的丝中为 s i l ki i ( 主要是p 折叠) 。蚕丝成丝的过程主要是蛋白质构象转变的过程，因此研究丝素蛋白 的d 折叠机理及结晶序列对掌握其吐丝机理，从而成功进行模拟生物纺丝、获得高强度的人 造纤维无疑具有非常重要的作用。 对于较小的蛋白分了( m w 小于1 5 k d a ) ，可以通过多维多核n m r 谱或x r d 表征其 分了结构及构象的转变。但对如丝素这种大分子( m w 约为4 0 0 k d a ) 来说，却是相当困 难的。因此，长期以来，仅在宏观范围研究丝素蛋白的b 折叠结构。近年来，在蚕丝蛋白 结构及其构象方面的研究取得了许多进展。 许多学者研究了剪切力对丝素蛋白折叠结构的影响 6 3 - 6 6 】。l i z u k a 6 3 删定性指出丝素蛋白 成纤化的剪切速率，并指出该速率随着丝素蛋白浓度的增加而增大。 m a g o s h i 等【6 5 】通过平均扩散速率解释丝素蛋白的折叠机理。扩散速率在1 0 0 - - 4 5 0 m m m i n 范围内，丝素蛋白的分_ 了沿着扩散方向取向，但无归构象仍然存在。当扩散速率增至 浙江理工人学硕：l ：学位论文 5 0 0 m m m i n 以上时，丝素蛋白的构象由无归线团向d 折叠构象转变。y a m a u r a 等【6 6 】则认为 是流动致使丝素蛋白结晶。 近年来，金属离子在蚕吐丝过程中的作用逐渐成为人们关心的热点。 在牛物体内，金属离子可以选择性地与蛋白质分子主链上的碳基和亚胺基，以及侧基 的轻基、胺基、琉基、竣基、咪哇基等供电子基团配位从而稳定或改变蛋白质的高次结构 【6 7 】。同时，金属离子还能有效地破坏或促进蛋白质分予链内和分了链间的氢键作用。金属 离了囚具有不同的离了半径、离- 了价电、空间立体取向、特定的软硬度以及还原电位而显 示其在牛物过程中的选择性【6 9 】。对于有生理活性的活性蛋白来说，金属离予的牛理作用有： 与蛋白形成具运载功能的配合物( 如血红蛋白) 、组成金属酶或作酶的激活剂( 金属酶即活性 部位上含金属原子的酶，约占酶总数的3 0 ) 、传递信息以及调节体液等等【6 8 】；而对于不具 生理活性的结构蛋白( 如蜘蛛丝蛋白1 7 0 】、家蚕丝素蛋白【7 l 】等) 来说，金属离予的作用往往体 现在它对蛋白质分子构象转变过程的影响上。 m a g o s h i 等t 7 2 】在上世纪9 0 年代就提出钾离子可能在桑蚕丝的形成过程中起作用，并报道 了钾离子和钙离子对桑蚕成丝作用的影响【7 3 铘】；李贵阳旧曾用1 3 c 交叉极化魔角旋转( c r o s s p o l a r i z a t i o nm a g i ca n g l es p i n n i n g ，c p m a s ) n 体核磁共( n m r ) 谱及r a m a n 光谱分析了再生 丝素蛋白膜的构象组成，结果也表明一定浓度的金属离了( c a ( i i ) ，k ( i ) ，c u ( i i ) ，z n ( i i ) ) 的 存在有利于s i l ki i 结构的形成；c h e n 等【7 8 】在研究丝胶时发现，在一定p h 条件下，n i 离子通 过四配位的螫合作用诱导丝素蛋白p 折叠的形成；v m e y 等【6 7 】根据电感耦合等离- - r ( i c p - - m s ) 技术推测c 璃了的增加能使p 折叠的形成加速。由此可见，金属离子可能在动物吐丝过程 中起着重要的作用。 1 4 课题的研究意义和主要的工作内容 蚕丝及丝素蛋白由于其在材料方面优异的性能，而在纺织品的牛产、生物技术、医疗、 精细化工等领域受到广泛的关注。t h 是，与天然丝素蛋白相比，再生丝素蛋白普遍存在机 械性能差、易溶解的缺点。为了探究蚕丝为何具有如此优异的性能以及以此为基础开发新 材料，蚕的吐丝机理、丝素蛋白的结构和功能之间的关系以及如何合成性能兼具天然丝和 合成高分了性质的新型材料己成为目前国际上研究的热点。 9 浙江理t 大学硕。i ：学位论文 结构与性能间的关系是高分了科学重要的领域，人们提出高分予材料的性能不仅仅取 决于分了链一级结构，而其分子链的聚集过程及成型条件也许更为重要。研究丝素蛋白材 料在无机纳米颗粒作用下微观结构的变化，蛋白构象变化的机理以及蛋白微观结构与宏观 性能的关系，将对丝素蛋白的加工处理及应用具有重要的意义。 关于蚕丝素蛋白的结构和成丝机理己经有很多报道，然而什么原因真正导致吐丝过程在 常温常压下得以进行还不十分明确，仍有许多工作有待进行更加深入地探讨，比如关于蛋 白质与金属离子相互作用及蛋白质折叠解折叠的研究。 本课题组曾采用溶胶一凝胶法制备纳米改性再生丝素膜，并对其结构及性能进行了研 究，结果表明纳米t i 0 2 粒子促使丝素蛋白构象发生了转变，宏观上体现为丝素膜的水中溶 失率、力学性能及热学性能等得到了较好的改善。在此基础上，本文采用溶胶一凝胶法制 备了纳米改性丝素膜。测定了纳米改性丝素膜的机械性能、热学性能、耐水溶性、抗紫外 辐射性能等性能的变化，并计算分析了复合丝素膜的聚集态结构，以进一步讨论丝素蛋白 膜的构象与性能之间的内在关系以及超微量纳米粒子对丝素蛋白构象转变的机理，得到了 一些尚未见报道的结果。 本课题的主要工作内容包括： 1 ) 采用溶胶一凝胶法制备纳米改性丝素膜，并应用正交实验法确定改性丝素膜的最佳 成膜条件。 2 ) 采用s e m 、a f m 、a t r f t i r 、x r d 等分析手段表征了纳米改性丝素膜的形貌及微 细结构，研究了纳米粒子对丝素蛋白构象的影响。 3 ) 测试纳米改性丝素膜的机械性能、热学性能、丝素膜表面水润湿性、丝素膜水中溶 失率等性能，探讨纳米改性丝素膜的性能与丝素蛋白构象之间的内在关系。 4 ) 采用二维红外相关光谱研究了丝素蛋白膜构象转变的动力学，研究丝素蛋白构象转 变的微观过程。 本研究有助于理解纳米粒子与丝素蛋白复合的过程，有利于拓展丝素蛋白的应用领域。 本文对丝素蛋白在无机纳米颗粒作用下应用性能和聚集态结构变化的研究，为用无机纳米 颗粒对丝素蛋白进行改性提供了理论依据。 1 0 浙江理工人学硕士学位论文 第二章纳米改性丝素膜的制备 丝素膜作为生物材料必须具备一定的强度，弹性及耐水溶性能。一方面，常规方法制备 的改性丝素膜在水溶液中溶失率高，膜的强度低，这对其应用极为不利；另一方面，丝素 一t i 0 2 纳米复合材料丰要采用溶胶凝胶法制备，但在制备工艺参数优化设计方面的研究较 少。因此本实验通过正交设计法，推导制膜过程中温度、纳米t i 0 2 含量、p h 值3 个工艺 因素对丝素膜机械性能及耐水溶性的影响规律，确定制备丝素一t i 0 2 纳米复合膜的最佳工 艺参数，以期使丝素一t i 0 2 纳米复合膜具有较高的强度、弹性及耐水溶性。 2 1 实验部分 2 1 i 主要的材料、试剂和仪器 ( 1 ) 无水乙醇( c h 3 c h 2 0 h ) 分子量4 6 0 7 ；含量 9 9 7 ；密度( 2 0 c ，g m 1 ) 0 7 8 9 0 7 91 ；分析纯。 ( 2 ) 钛酸丁酯( t i ( o c 4 h 9 ) 4 ) 分子量3 4 0 3 5 ；密度0 9 9 2 1 0 0 0 ：性状：淡黄色油状液体，遇水分解，能溶于除酮类 外大部分有机溶剂；化学纯。 ( 3 ) 氯化钙( c a c l 2 ) 分了量1 1 0 9 9 ；含量9 6 o ；白色粒状物；分析纯。 ( 4 ) 纤维素透析膜( s e a m l e s sc e l l u l o s et u b i n g ) 透析膜3 6 3 2 ( 商品名) ，直径2 7 m m ，壁厚0 0 2 0 3 m m ，透过分子上限为分子量1 0 0 0 0 ， 制造商s k a s es a l e sc o r p ，销售商一三光纯药株式会社( 日本) 。 ( 5 ) p h 试纸 杭州特种纸业有限公司制造，用于测定和调节溶液的p h 值。 ( 6 ) j b _ 3 型定时恒温磁力搅拌器 利用放置在溶液中的磁力转子与转轮之间的同步转动搅拌溶液，使其均匀混合。 浙江理t 大学硕t 学位论文 ( 7 ) s a r t o r i u s 制造的b s l l 0 s 型电了天平，精确到0 0 0 1 9 ； ( 8 ) 1 0 1 i a 型电热鼓风干燥箱 ( 9 ) s p x 1