（发酵工程专业论文）细菌氨肽酶的产酶条件优化及应用研究.pdf

摘要 捅要 蛋白质水解可产生肽类物质和少量氨基酸，明显改善了其溶解性、热稳定 性以及营养特性，但其水解液往往会呈现苦味，应用受到了极大的限制。氨肽 酶可从氨端切除苦味肽上的疏水氨基酸，从而达到脱苦的目的。本论文主要研究 了氨肽酶的产酶发酵条件、酶学性质以及其在大豆分离蛋白中的应用。 优化后的最佳发酵条件为：玉米淀粉4 0 l ，豆渣3 0 l ，k 2 h p 0 4 3 2 1 6 l ，k h 2 p 0 40 0 7 4g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 3g l ，n a c ll l ，c o c l 2l m l ( 0 1 m o l l ) ， 培养时间2 4 h ，p h 值7 5 ，接种量8 ，装液量2 0 m l 2 5 0 m l ，温度4 0 0 c ，转 速2 0 0 r m i n 。优化后的发酵液酶活为2 6 8 5 6 u m l ，比原配方发酵液酶活提高 了1 7 l 倍，在7 l 发酵罐上扩大培养，酶活达到1 2 0 0u m l 。 粗酶液经2 0 - - 4 0 乙醇分级沉淀，回收率为5 0 3 。研究表明，酶的半衰 期为2 2 天，最适反应温度为5 5 ，最适p h 为8 5 ，温度稳定范围2 0 - - 7 0 ， p h 稳定范围在8 o 1 0 0 左右。甘油、蛋白胨对酶活的影响不大，但在含有明胶 等化合物的溶液中，酶活损失较严重；z n ”、n i 2 + 对酶活有较强的抑制作用， c 0 2 + 对酶活有较强的激活作用；p e p s t a t i n 有轻微抑制，e d t a 有强烈抑制作用， 而c 0 2 + 可解除e d t a 的抑制作用；枯草芽孢杆菌z j 0 1 6 氨肽酶活性中心可能结 合了两个z n 2 + ，每个亚基一个；米氏常数为o 5 3 m m o l l ，最大反应速度甜 为19 2 3 1 x m o l l m i n 。 应用研究表明，氨肽酶与碱性蛋白酶对大豆分离蛋白协同水解的最佳水解条 件为：温度5 0 、p h 8 5 、两酶与底物浓度比均为1 0 0 0 0 u g 、底物浓度6 0 9 l ， 水解时间4 h ，水解度达2 5 0 。对碱性蛋白酶单酶与双酶的水解产物研究结果对 比表明：双酶水解产物的苦味明显低于单酶水解产物，几乎不呈现苦味；两种酶 解产物的分离峰峰型、分子量分布及比例有较大的差异，两酶协同水解产物的疏 水值均低于单酶水解产物的；两酶协同水解产物游离氨基酸含量为1 6 1 0 m g l ， 碱性蛋白酶单酶水解产物游离氨基酸含量为1 2 5 0 m g l 。 关键词：氨肽酶；枯草芽孢杆菌；发酵条件优化；酶学性质；大豆分离蛋白； 酶解；脱苦 a b s t r a c t a b s t r a c t t h es o l u b i l i t y , t h et h e r m os t a b i l i t ya n dt h en u t r i t i o no fp r o t e i na r eo b v i o u s l yi m p r o v e d a f t e rh y d r o l y s i s e d ，b u ti t sh y d r o l y s a t eg e n e r a l l ya p p e a r e db i t t e ra n dw a sl i m i t e di n a p p l i c a t i o no ff o o d a m i n o p e p t i d a s e sc a nb ed e b i t t e r i n ge x o p e p t i d a s e st h a ts e l e c t i v e l y r e l e a s en t e r m i n a lh y d r o p h o b i ca m i n oa c i dr e s i d u e sf r o mb i t t e rp o l y p e p t i d e s i nt h i s p a p e r , t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，t h ee n z y m ep r o p e r t i e sa n dt h ea p p l i c a t i o ni ns p l w e r ei n v e s t i g a t e d o p t i m i z a t i o n so ft h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a sc a r d e do u ta sf o l l o w s ：c o r n s t a r c h 4 0 9 l ，s o y b e a nd r e g s3 0 9 l ，k 2 h p 0 4 3 216 9 l ，k h 2 p 0 40 0 7 4 9 l , m g s 0 4 7 h 2 00 3g l ，n a c i1 l ，c o c l 2lm l ( o 1m o l l ) ，t e m p e r a t u r e4 0 。c ，r o t a t e s p e e d2 0 0 r m i n ，p h7 5 ，i n o c u l u m s i z e 8 ，v o l u m e 2 0 m l 2 5 0 m l t h e a m i n o p e p t i d a s ea c t i v i t yw a s 2 6 8 5 6 u m la f t e ro p t i m i z a t i o n ，w h i c hi n c r e a s e d1 71 t i m e s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e do na m i n o p e p t i d a s ei n7 lj a r f e r m e n t o rw e r ea n a l y z e d ，t h ea m i n o p e p t i d a s ea c t i v i t yr e a c h e d12 0 0u m l a sf o ra m i n o p e p t i d a s ep r o d u c e db yb a c i l l u ss u b t i sz j 016a f t e ro p t i m i z a t i o n ， t h ep u r i f i c a t i o np r o c e d u r eo fe t h a n o lf r a c t i o n a t i o n ( 2 0 - - 。4 0 ) w a ss t u d i e do n t h e a c t i v i t yw a so p t i m a la tp h8 5a n d5 5 0 c t h et e m p e r a t u r es t a b i l i t yw a s2 0 - - - 7 0 * ( 2a n d t h ep hs t a b i l i t yw a s8 0 - - - 10 0 w h i l ei n h i b i t e db yt h eg e l a t i na n do t h e rc h e m i c a l s ，t h e e n z y m ea c t i v i t yw a sn o ts i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e db yg l y c e r o la n dp e p t o n e i n h i b i t e d b ys e v e r a ld i v a l e n tc a t i o n s ( z n 2 + 、n i 2 + ) a n de d t a a c t i v a t e db yc 0 2 + 1 1 1 e a c t i v a t i o nr e g i o no ft h ee n z y m es e e m e dt oh a d t w oz n 2 + ，a n de a c hs u b u n i th a do n e k mo ft h ea m i n o p e p t i d a s ew a so 5 3 mm o l la n d 觚w a s19 2 3 1 t m o l l m i n t h el i m i t e dh y d r o l y s i so p t i m u mc o n d i t i o n so fs p ib ya m i n o p e p t i d a s ea n db a s i c p r o t e a s ew a ss t u d i e da sf o l l o w s ：h y d r o l y z i n gt e m p e r a t u r e5 0 ，p h 8 5 ，r a t i o so f b o t h e n z y m e s s u b s t r a t e10 0 0 0 u g ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e6 0 9 l ，t o t a lh y d r o l y s i st i m e 4 h ，h y d r o l y s i sd e g r e eo fp r o t e i n2 5 o a n di t sh y d r o l y s i sp r o d u c ti saf e wb i t t e r t h e c o m p a r i s o n so fb i t t e rv a l u e ，d i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t ，h y d r o p h o b i cv a l u ea n d f r e ea m i n oa c i db e t w e e nt h eh y d r o l y s i sp r o d u c tb yt h es y n e r g e t i ch y d r o l y s i sa n dt h e h y d r o l y s i sp r o d u c tb yb a s i cp r o t e a s e ：t h e i rt y p e so fe l u t i o na n dd i s t r i b u t i o na n d p r o p o r t i o no fm o l e c u l a rw e i g h tw e r ed i f f e r e n t t h ef o m e rw a sl e s st h a nt h el a t t e ri n t h eh y d r o p h o b i cv a l u e a n da sf o rf r e ea m n i oa c i d ，t h ef o m e rw a s1610 m g l ，a n dt h e l a r e rw a s12 5 0 m g l k e yw o r d s ：a m i n o p e p t i d a s e ；b a c i l l u s ；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so p t i m i z a t i o n ；e n z y m e p r o p e r t i e s ；s o y b e a r lp r o t e i ni s o l a t e ；h y d r o l y s i s ；d e b i t t e r i n g i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 毖垂篮 日 期： 丛! 竺：三 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名：迎耷 日 期： 全鐾：垒：三 第一章绪论 第一章绪论 1 1 立题意义 蛋白质水解产生肽类物质和少量氨基酸，其溶解性、热稳定性以及营养特性得到 明显改善，是现代食品加工过程中重要的原料。但水解液中往往产生呈苦味的苦味 肽，这种苦味肽一般是氨端带有单个或多个疏水氨基酸的多肽链，有时也可能是羧端 带疏水氨基酸，苦味限制了蛋白质水解物的应用【l 】。因此，减少、阻止及去除蛋白质 水解物的苦味，成为当今研究的重要课题。 脱苦方法有理化及酶法脱苦，理化脱苦包括分离、提取、吸附、掩盖、蛋白质改造 以及酸碱水解等【1 1 。但这些方法脱苦不彻底，会破坏一些氨基酸，尤其是必须氨基酸， 使蛋白质的营养价值降低。相比，酶法具有水解效率高、条件温和、不会使蛋白多肽的 营养成分丢失、水解过程易于控制、不改变蛋白肽的各种重要特性( 如溶解性、低抗原 性) 等优点2 1 。利用酶控制肽的苦味，有氨肽酶法，羧肽酶法，碱性中性蛋白酶法【3 1 ，相 对来说氨肽酶比后两种方法作用范围更为广泛，脱苦效果更好。国内关于微生物产羧肽 酶的研究已有报导，冯红霞等筛选到了一种产羧肽酶的曲霉，并进行了酶的纯化及酶学 性质的研究【4 1 ，而关于微生物产氨肽酶的报导则较少。另外，氨肽酶还可广泛用于肉制 品加工、乳品业等，减少苦味增加游离氨基酸，提高食品营养价值。氨肽酶还可用作蛋 白序列测定的分子工具及重组蛋白或融合产物的固化剂【5 】。 1 2 研究背景 1 2 1 氨肽酶的分类 氨肽酶是一种外肽酶，一般作用范围都较为广谱，根据最易反应的底物不同可分为 亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶等，它们 可切除苦味肽氨端的疏水氨基酸从而脱除苦味。 善毒善 掣一x l x 2 一x 3 一x 4 一x 5 一x 6 一c o 饼l 辑g 1 p + p t i d s l mc i a s i 磊c 毓i ，孵。n d o p e 移i d 秘婚c l e a v ep e r ai d i c b o u n d ki n i d e 弘，l y 弦弘i d c s i 。e x o l x i a a j a s e sc l e a v er e s i d u e s l o c a l e d 锹1 堍n t c n n i a a lp o 、i t i o i l 2 。a t n i n o f j c p l i d a g - s ) o io i c r n l i n a lp o s i t i o n 执c a r h o x y p e p t 馥艟lo f 弦l 弦弘i 妇 氨肽酶有单体酶也有复合酶，( 一般为相同的单体构成，但也有不同单体的) 。根据 催化机制可分为金属氨肽酶、半胱氨酸氨肽酶及丝氨酸氨肽酬引。三分之二的氨肽酶都 为金属酶，z n 2 + 是最常见的结合离子，其他的结合离子有c 0 2 + 及m n 2 + ，一般每个单体 结合一个金属离子，但也有每个单体结合两个的，如a p r o t e o l y t i c a 所产的亮氨酸氨肽酶 ( 每个单体上结合两个距离很近的z n 2 + ) 【6 】，l a c t o c o c c u sl a c t i s 所产的丙氨酸氨肽酶( 结 合两个c 0 2 + ) 【5 】。金属离子不仅与金属氨肽酶的活性有关还与三级结构的稳定性有关。 半胱氨酸氨肽酶和丝氨酸氨肽酶在细菌中较为少见，各占2 0 不到。 江南人学硕j 二学位论文 1 2 2 氨肽酶的来源 氨肽酶广泛存在于动物组织及植物中，l a u r ag i l m a r t i n 等在猪脑中得到了氨肽酶 p 【7 1 ，m 6 n i c af l o r e s 等利用猪肌肉中提取出来的a l a a p 水解含a l a 的寡肽链【8 】，c h a o j u n g t u 等从西红柿中克隆出了两种中性l e u a p 的基因，并使其在e c o l i 中得到表达。 ( w w w p l a n t p h y s i 0 1 o r g c g i d o i 1 0 1 1 0 4 p p 1 0 2 0 1 3 8 5 4 ) 。 动植物中氨肽酶含量较少，一般都采用微生物发酵生产氨肽酶。产氨肽酶的微生物 种类繁多，细菌酵母霉菌都可产。 1 2 3 氨肽酶的测定方法及纯化方法 氨肽酶的测定方法有硝基苯胺( p n a ) 法及荧光底物法。荧光底物法以a a a m c 为 底物，反应一定时间，测定水解产物的荧光性，该法迅速灵敏，可用于在线的连续测定， 但成本较高。硝基苯胺是黄色物质，硝基苯胺法是以不同的a a 对硝基苯胺作为底物， 利用水解出的p n a 4 0 5 n m 显色测定，常用的底物为l e u p n a 。氨肽酶的纯化方法包括i e c 离子交换色谱、g f c 凝胶过滤色谱、h i c 疏水色谱、a c 亲和层析、h p l c 等。 1 2 4 氨肽酶的应用 目前，氨肽酶主要应用于食品工业，如乳酸菌的内外肽酶水解系统水解牛奶蛋白， 释放小肽和游离氨基酸，一方面获得了菌自身生长所需氨基酸，另一方面使牛奶制品水 解物无苦味。氨肽酶在肉类、鱼类加工中可增加游离氨基酸的量，改善风味，提高营养 价值，缩短加工周期。可作为酱油、酱料等调味料的添加剂。另外，氨肽酶还可应用于 营养食品、保健食品、蛋白饮料等大豆肽产品的研制。 氨肽酶可用作蛋白序列测定的分子工具及重组蛋白或融合产物的固化剂，目前尚处 于研究阶段，未应用于实际。 1 3 国内外研究现状 1 3 1 国外研究现状 国外对氨肽酶的研究较早，七十年代初，氨肽酶因其脱苦效用在乳品业受到重视， t a d a n o b u 等首次从米曲霉中提纯了三种亮氨酸氨肽酶【9 】，m b a l e m a 等从嗜热芽孢杆菌 中分离到了一种耐热氨肽酶【1 0 】，自此对氨肽酶的研究不断深化，从不同菌中分离纯化 出各种不同氨肽酶，并鉴定了其纯度和分子大小，研究了底物特异性、稳定性、温度、 p h 、动力学参数、抑制剂和各种二价金属离子的影响等各种酶学性质。随着近年 基因工程的迅速发展，对氨肽酶的研究也已深入到基因序列的分析，重组克隆等。2 0 0 0 年，a l e x a n d e rm b l i n k o v s k y 等通过异源法重组a s p e r g i l l u s o r y z a e 得到了一种底物作 用非常广泛的氨肽酶，除了x p r o 键几乎能降解所有的肽键，使其在食品工业中的 应用更为广泛 1 1 1 。2 0 0 3 年，s a l l yx u e y i n gn i 和d o u g l a sc o s s a r , 纯化并鉴定了重组灰色 链霉菌氨肽酶s g a p ，所用载体为c a n g e n e ss 1 i v i d a n s 表达系统，p c a n 4 6 穿梭质粒， 采用原生质体转化法转化至s 1 i v i d a n s 使s g a p 基因得到表达l l2 1 。 自9 0 年起，采用电磁共振e p r ，x 射线晶体衍射，核磁共振对氨肽酶进行了结构 分析，确定金属离子结合位点及活性中心结构。已鉴定出多种氨肽酶的晶体结构，牛晶 状体l a p ( b u r l e y e ta 1 ，19 9 0 ，19 9 2 ) ，m a p ( m a p ；r o d e r i c k & m a t t h e w s ，19 9 3 ) ，a e r o m o n a s 2 第一章绪论 p r o t e o l y t i c a 氨肽酶( a a p ；c h e w i e re ta 1 ，19 9 4 ) ，s t r e p t o m y c e sg r i s e u s 氨肽酶( s g a ph m g r e e n b l a t t ，1 9 9 7 ) 。2 0 0 2 年，d a n i e l aj o z i c 等鉴定了l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i 的氨肽酶 晶体结构【b 】。2 0 0 4 年，vr e i l a n d 等克隆了b a c i l l u ss u b t i l i s 的胞外氨肽酶，在e c o l i 中 表达，纯化该酶并进行了晶体结构的鉴定【l 引。 1 9 9 9 年h i r o s h is a k i y a m a 等报导合成了氨肽酶活性中心的功能模拟物： 【z n 2 ( b o m p ) ( m e c 0 2 ) 2 b p h 4 h ( b o m p ) ：2 ，6 - b i s b i s ( 2 - m e t h o x y e t h y l ) a m i n o m e t h y l - 4 - m e t h y l p h e n 0 1 ，但该模拟物活性较低，仅为天然氨肽酶的1 1 0 0 0 ，2 0 0 3 年，又合成了新的双核配 提体b o n p 及 b o c p 得到了两种新的模拟物 【l5 】 ： z n 2 ( b o n p ) ( m e c 0 2 ) 2 b p h 4 h ( b o n p ) ：2 ，6 一b i s b i s ( 2 一m e t h o x y e t h y l ) a m i n o m e t h y l - 4 一n i t r o p h e n o l 【z n 2 ( b o c p ) ( m e - c 0 2 ) 2 b p h 4 h c o o c p ) ：4 - c h l o r o 一2 ，6 一b i s b i s ( 2 - m e t h o x y e t h y l ) a m i n o m e t h y l p h e n o l ，活性分别提高了2 5 0 倍和l o 倍，对底物的亲和能力较天然氨肽酶也有所提高，但双核 结构的稳定性有所下降。 另外，苯丙氨酸氨肽酶和脯氨酸氨肽酶因其特殊的脱苦效果受到关注，2 0 0 3 年 b a s t e n 等在黑曲霉c b s l 2 0 4 9 中，分离提纯了一种新的苯丙氨酸氨肽酶，专门水解氨基 末端苯丙氨酸和其他有芳基侧链的的氨基酸【l6 】。2 0 0 4 年，a m u r a i 等从a r i m a 温泉土壤 中筛选到了一株能产脯氨酸氨肽酶的a n e u r i n i b a c i l l u st h e r m o a e r o p h i l u sd s m l 0 1 5 4 t ，该 菌所产的氨肽酶能与其它溶胶原蛋白酶协同作用降解含高浓脯氨酸残基的胶原质，在肉 类加工及牛奶苦味肽脱除中有一定应用【l7 1 。 1 3 2 国内研究现状 国内对氨肽酶的研究较少，从动物组织及微生物中提取出来的多为内肽酶，不能 较为彻底地水解蛋白质，且游离氨基酸数目太少，影响食品风味。脱苦多采用n o v o 公司所产的f l a v o u r z y m e ，这种风味蛋白酶是一种复合型蛋白酶，有外肽酶也含有内 肽酶。2 0 0 4 年，台湾学者龙琉林等重组并纯化鉴定了嗜热芽孢杆菌亮氨酸氨肽酶。于 文华等采用细胞融和的方法使嗜热芽孢杆菌亮氨酸氨肽酶c 末端与枯草芽孢杆菌t s 一 2 3 淀粉酶的粗淀粉结合域相结合，在大肠杆菌中表达蛋白，镍螯和色谱纯化，所得蛋白 保持了l a p 活性及粗淀粉水解能力，l a p 酶活提高了2 倍【l8 1 。另外，我校的谷海先老 师等进行了霉菌产外肽酶，脱除蛋白水解液苦味的研究。 国内研究现状表明，关于氨肽酶的各方面研究都与国外有较大差距，因此开展细 菌氨肽酶各方面的研究具有重要的意义，可为今后实现氨肽酶的产业化创造一定的基 础。本课题属自拟。 1 4 本论文研究内容 ( 1 ) 为了降低放大生产氨肽酶的生产成本，拟用廉价的原料豆渣、玉米淀粉做培养 基的氮碳源，通过优化菌株的发酵条件，提高产酶水平。 ( 2 ) 研究了发酵条件改变后所制备的氨肽酶的p h 、温度、p h 稳定性、温度稳定性 及一些化学物质、抑制剂对酶活的影响等酶学性质，并与原发酵条件下( 可溶性淀粉、 蛋白胨和牛肉膏为碳、氮源) 制备的氨肽酶的酶学性质进行比较。 ( 3 ) 氨肽酶在大豆分离蛋白中的应用研究，采用碱性蛋白酶和氨肽酶双酶法协同水 江南人学硕1 ：学位论文 解大豆分离蛋白，用感观评定考察了其脱苦效果，初步探讨了游离氨基酸、分子量分布 及水解产物表面疏水性与脱苦的关系。 4 第二章氨肽酶发酵条件优化 第二章氨肽酶发酵条件优化 2 1 前言 在实际的发酵生产中，具有性能优良的菌种仅仅是一个基础，还需要对发酵过程进 行优化控制，以最大限度地发挥微生物生产目标产物的潜力。获得较高的产物浓度( 便 于下游处理) 、较高的底物转化率( 降低原料成本) 和较高的生产强度( 缩短发酵周期) ， 同样是实现细菌氨肽酶工业化生产所需要解决的问题，因此对细菌氨肽酶发酵过程进行 优化控制就显得尤为重要，主要包括营养与环境条件优化、发酵过程控制以及营养物质 的添加等内容。 酶的生产成本是工业化应用的关键因素。本实验室己优化了以牛肉膏、蛋白胨及可 溶性淀粉为氮碳源的培养基，但因其生产成本过高，需对其改良。一方面，用较廉价的 玉米淀粉、豆渣粉代替价格较高的蛋白胨、牛肉膏，另一方面，对改良后的发酵培养基 及培养条件进行优化，为最终的工业化生产奠定基础。 另外，发酵培养的条件也是不可忽视的重要因素，影响细胞生长以及合成氨肽酶的 环境因素主要有种龄、温度、p h 、溶氧、接种量和发酵时间等。种子的生长情况直接影 响到微生物细胞的生长情况和代谢产物的形成速率；温度直接影响着代谢中各种酶的活 性和生化反应速率；p h 决定营养物的解离状态，制约着微生物细胞对营养物质的吸收 利用速率；溶氧的大小控制着细胞对氧的需求；接种量的大小则影响迟滞期的长短以及 细胞倍增繁殖的速度。 本章主要研究确定了枯草芽孢杆菌z j 0 1 6 的摇瓶发酵条件，在改进的摇瓶发酵条件 下氨肽酶酶活有了显著提高，并在此基础上，又初步研究了在7 l 发酵罐上氨肽酶的发 酵过程。 2 2 材料 2 2 1 菌种 枯草芽孢杆菌z j 0 1 6 ( 实验室筛选) 2 2 2 主要试剂及仪器 l 一亮氨酸一对硝基苯胺( a r ) ，a c r o s ；余为国产分析纯试剂 7 2 2 分光光度计上海第三分析仪器厂； 酸度计d e l t a 3 2 0梅特勒托力多公司； t g 3 2 8 a 电光分析天平梅特勒公司； 高速冷冻离心机h i m a cc r 2 2 g日本同立( h i t a c h i ) 公司。 电热恒温水浴锅上海医疗器械五厂 2 3 试验方法 2 3 1 种子培养基( g l ) 蛋白胨1 0 ，牛肉膏5 ，n a c l5 ，p h 7 2 。 2 3 2 发酵基础培养基( g l ) 玉米粉4 0 ，豆渣3 0 ，k 2 h p 0 43 2 ，k h 2 p 0 40 0 7 4 ，m g s 0 4 7 h 2 00 3 ，n a c l1 ，c o c l 2 5 江南人学硕j ：学位论文 1 m l ( 0 1 m o l l ) ，p h7 5 。考察某一成份浓度时，其他条件不改变。 2 3 3 发酵罐培养基( g l ) 玉米粉4 0 ，豆渣3 0 ，k 2 h p 0 43 2 ，k h 2 p 0 40 0 7 4 ，m g s 0 4 7 h 2 00 - 3 ，n a c il ，c o c l 2 l m l ( o 1 m o l l ) ，p h7 5 。 2 3 4 种子一级培养 将保藏好的的菌种取0 2 m l 接入种子培养基中，2 5 0 m l 三角瓶装2 0 m l 培养基，回 转式摇床转速2 0 0 r m i n ，3 7 ，培养7 h 。 2 3 5 种子二级培养 取l m l 一级种子液接入种子培养基，培养条件同一级培养，培养5 h 。 2 3 6 摇瓶培养 种子以8 ( v v ) 的接种量接入发酵培养基中，2 5 0 m l 三角瓶装2 0 m l 培养基，回转 式摇床转速2 0 0 r m i n ，4 0 ，培养2 4 h 。 2 3 77 l 发酵罐培养 全自动发酵罐( b i o e n g i n e e r g ，瑞士) 中装液量3 l ，接种量8 ( v v ) ，搅拌 转速4 0 0 7 0 0 r m i n ，通气量1 ：1 ，温度4 0 。 2 3 8 氨肽酶活，挫测定 l n a 法，测定时，首先加入一定数量的t r i s h c l 缓冲液和底物( l 一亮氨酸对硝 基苯胺l - l e u p n a ) ，然后再加入稀释一定倍数的粗酶液，在5 0 。c 水浴反应1 0 m i n 后， 4 0 5 n m 比色测定酶活。 酶活力定义：5 0 。c ，每分钟分解l 亮氨酸对硝基苯胺产生1 微摩尔的对硝基 苯胺所需酶量即为一个酶活单位。 2 3 9 茵体干重测定 采用细胞干重法。取一定量发酵液于1 0 0 0 0 r m i n ，离心5 m i n ，1 0 5 c 烘至恒重，称 重。 2 3 1 0 还原糖测定 采用d n s 法。取稀释后的粗酶液2 m l ，向其中加入d n s 试剂1 5 m l ，立即在沸水 浴中加热反应5 m i n ，然后立即用流动冷水冷却至室温，再向其中加入蒸馏水2 1 5 m l ， 混合后在分光光度计5 2 0 n m 处测定其吸光值。 2 4 结果与讨论 2 4 1 碳源种类对菌株z j 0 1 6 产酶的影响 碳源是菌体合成自身骨架的主要物质来源，是影响菌体生长和代谢产物合成的关键 因素。而且某些微生物需在一定的限碳条件下才能高产特定的酶【5 】，本文在以2 豆饼 粉为氮源，一定的磷源、硫酸镁的添加量及发酵条件相同的情况下，考察了以添加量均 为3 的玉米淀粉、葡萄糖、麸皮、蔗糖、可溶性淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糖、甘露醇 等几种不同的碳源对菌株产酶的影响，在4 0 0 c ，2 0 0 r m i n 条件下摇瓶培养1 5 h ，接种量 均为5 ，结果见表2 1 。 6 第二章氨肽酶发酵条件优化 表2 1 不同碳源对菌株z j 0 1 6 产酶能力的影响 t a b l e 2 - 1e f f e c to fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e so na pa c t i v i t yb ys t r a i nz j 0 16 由表2 1 知，菌株z j 0 1 6 在不同碳源的培养基中培养，其产酶能力不一，以玉米淀 粉为碳源时，产酶能力最高，而在以麸皮为碳源的培养基中，其所产酶活活力低。据报 道，初始培养基中单糖浓度过低时不利于菌体的生长，而过高则会对菌体产酶产生反馈 抑制作用，玉米淀粉在水解过程中形成了单糖和糊精的混合体系，既满足了菌体的需要 生长又不会对产酶产生抑制作用。 2 4 2 氮源种类对菌株z j 0 1 6 产酶的影响 氮源是菌体合成自身蛋白和遗传物质的主要来源，也是代谢产物中氮元素的来源之 一。菌株z j 0 1 6 在玉米淀粉为碳源，一定的磷源、硫酸镁的添加量及发酵条件相同的情 况下，考察了以添加量均为2 的豆饼粉、黄豆粉、豆渣粉、虾皮粉等有机氮和( n h 4 ) 2 s 0 4 及n h 4 n 0 3 等无机氮，结果见表2 2 。 表2 2 不同氮源对菌株z j 0 1 6 产酶能力的影响 t a b l e 2 2e f f e c to fd i f f e r e n tn i t r o g e ns o u r c e so na pa c t i v i t yb ys t r a i nz j 0 1 6 由表2 2 知，菌株z j 0 1 6 在不同氮源的培养基中培养，其产酶能力差异较大。其中 以豆渣粉为氮源时，产酶能力显著，酶活可达11 3 3 1 u m l ，值得关注的是，该菌在有 机氮为氮源的培养基中能产酶，而在无机氮为氮源的培养基中几乎无产酶能力。 2 4 3 碳氮比对菌株z j 0 1 6 产酶的影响 培养基中营养物质的浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满 足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用。因此培养基中各 营养物质之间的浓度比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳 氮比( c n ) 的影响较大。 由以上碳氮源对菌株z j 0 1 6 产酶的影响的考察可知，碳源以玉米淀粉、氮源以豆渣 7 江南人学硕l ：学位论文 粉为最佳。现考察碳氮比对菌株产酶的影响，以玉米淀粉为碳源，豆渣粉为氮源，浓度 分别设为2 、3 、4 ，1 、2 、3 ，在初始p h 7 2 ，4 0 。c ，2 0 0 r m i n 摇床速度下发 酵1 5 h ，结果如表2 3 。 表2 - 3 氮源、碳源浓度对菌株z j 0 1 6 产酶能力的影响( u m l ) t a b l e 2 - 3e f f e c to fc o n c e n t r a t i o n so fca n dno na pa c t i v i t yb ys t r a i nz j 0 16 由表2 3 可知：当豆渣粉为3 ，玉米淀粉为4 时，产酶量最高，并且当氮源浓度 小于碳源浓度时，随着氮碳浓度的增加，产酶量也跟着增加，进一步增加氮碳比或各自 的浓度，结果如表2 4 。 表2 - 4 氮源、碳源之比对菌株z j 0 1 6 产酶能力的影响 t a b l e 2 - 4e f f e c to fc no na pa c t i v i t yb ys t r a i nz j 0 16 由表2 4 可以知道，仍以豆渣粉为3 ，玉米淀粉为4 时，产酶量最高，继续增加 氮碳比，酶活急剧降低，而且在同一比例下，氮、碳源浓度低的酶活高些，这可能因为 氮、碳源浓度过大时，培养基的粘度较大，导致溶氧量不足而影响到了菌体的生长。 2 4 4 磷源对产酶的影响 磷酸盐可以促进菌体的基础代谢及产物的形成，且对p h 值的改变有缓冲作用，细 菌所产生的氨肽酶一般是碱性【1 1 】【1 9 】1 2 0 1 ，为了了解培养基中起始磷酸盐浓度对产酶的影 响，本研究对培养基中起始磷酸盐拟采用k 2 h p 0 4 与k h 2 p 0 4 ，且两者的摩尔浓度比为 3 3 ：1 ，总浓度为o 0 0 8 等质量的磷进行了考察，结果如图2 1 。 由图2 1 可知，磷酸盐对酶活的影响较为显著，产酶量随磷酸盐浓度的增大而增加， 当磷酸盐浓度为0 0 6 等质量磷时菌体产酶达到最高峰，因此在后续的研究中采用 o 0 6 等质量磷的磷酸盐浓度。 第二章氨肽酶发酵条件优化 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 o 藿1 0 0 0 5 0 0 o 00 0 40 0 6 磷酸盐浓度( ) 6 5 6 3 6 1 5 9 毛 h 5 7 敢 5 5 5 3 5 1 + 氨肽酶酶活+ 终了p h 图2 - 1 磷源浓度对菌株z j 0 1 6 产酶能力的影响 f i g 2 - 1e f f e c to f p h o s p h a t ec o n c e n t r a t i o no na pa c t i v i t yb ys t r a i nz j 0 1 6 2 4 5 硫酸镁浓度对产酶的影响 镁离子是许多重要酶( 如己糖激酶) 的激活剂，并且它在控制核蛋白体的聚合中起 着重要的作用，因而为微生物生长所必须，考查了不同浓度的硫酸镁对产酶的影响。如 图2 2 。 ： 一厂 ； 一； 0o 10 20 30 40 5 硫酸镁浓度( g l ) 6 5 6 3 6 1 5 9 亳 h 5 7 躲 5 5 5 3 5 1 + 氨肽酶酶活- 1 1 - - - - 终了p h 图2 2 硫酸镁浓度对菌株z j 0 1 6 产酶能力的影响 f i g 2 - 2e f f e c to fm a g n e s i u ms u l f a t ec o n c e n t r a t i o no na pa c t i v i t yb ys t r a i nz j 0 16 由图2 2 知，在0 o 4 9 l 的范围内，添加硫酸镁对产酶的影响不大，酶活基本维持 2 3 0 0 2 5 0 0 u m l ，但在硫酸镁浓度达到o 3 l 时产酶量达到最高，因此在后续研究中采 用o 3 l 为最佳浓度。 2 4 6 培养条件对菌株产酶的影响 2 4 6 1 起始p l l 及温度对产酶的影响 不同的起始p h 值将直接影响菌体的生长及氨肽酶的产量。考察了发酵液起始p h 从 6 o 变化到8 0 对发酵的影响。结果见图2 3 。由图2 3 可知，起始p h 的适宜范围为7 2 7 7 ， 9 卯 如 卯 拍 巧 筋 斟 勰 筋 筋 一1mn一蛭溢 江南人学硕：l 学位论文 最适的起始p h 为7 5 。 3 吕 e 烘 避 6 5 6 3 6 1 5 9 毛 k 5 7 瓣 5 5 5 3 5 1 起始p h + 氨肽酶酶活- m - - 终了p h 图2 - 3 起始p h 对菌株z j 0 1 6 产酶能力的影响 f i g 2 3e f f e c to fi n i t i a lp ho na pa c t i v i t yb ys t r a i nz j 0 1 6 温度是影响微生物代谢和生长的重要因素。对同一微生物来说，其不同的生理生化 过程有着不同的最适温度。因此，需要考察本菌株达到最佳的生产能力时的培养温度。 选择3 0 、3 3 、3 5 、3 7 、4 0 。c 、4 3 考察温度对发酵的影响。结果见图2 4 。 3 吕 已 蜒 避 6 5 6 3 6 1 5 9 毛 h 5 7 积 5 5 5 3 5 1 3 03 33 63 94 24 5 温度( ) + 氨肽酶酶活+ 终- j p h 图2 4 温度对菌株z j 0 1 6 产酶能力的影响 f i g 2 _ 4e f f e c to ft e m p e r a t u r eo na pa c t i v i t yb ys t r a i nz j 0 16 由图2 4 知，温度对产酶影响较大，菌株最适产酶温度为4 0 ，故4 0 为最佳培 养温度。当温度达到4 3 时，酶活急剧下降，分析菌株产酶水平下降情况，初步可 认为一方面随着温度的升高，菌株代谢途径发生改变导致酶合成量的减少，另一方 面由于随着温度的升高，酶的热失活速率加快。 2 4 6 2 装液量、接种量对产酶的影响 溶氧是影响微生物发酵的重要因素之一。在摇瓶培养过程中，可以通过转速和装液 量来考察溶氧对发酵的影响。枯草芽孢杆菌是好氧的微生物，可调节摇瓶装液量来研究 l o 第二章氨肽酶发酵条件优化 溶氧量对其发酵的影响，结果见图2 5 。 2 5 0 0 2 0 0 0 】 1 5 0 0 3 鎏1 0 0 0 5 0 0 o ol o 2 03 04 05 06 0 装液量( m l 2 5 0 m l ) 6 3 6 2 6 1 6 暑 h 5 9 敢 5 8 5 7 5 6 + 氨肷酶酶活 - - i - - - 终了p h 图2 5 装液量对菌株z j 0 1 6 产酶能力的影响 f i g 2 - 5e f f e c to fo p e r a t i o n a lv o l u m eo na pa c t i v i t yb ys t r a i nz j 0 16 当2 5 0 m l 三角瓶装液量超过2 5 m l 时，氨肽酶产量随着装液量的增加呈线性下降， 说明菌体对溶氧要求较高，溶氧水平可能是菌体产酶的一个限制性因素，故装液量以 2 0 m l 2 5 0 m l 为宜。 随着接种量的增加，生物量及产酶也随之上升，在6 1 0 范围( v ) 内基本稳 定，当接种量高于1 0 时，菌株的产酶水平开始下降，从整体看来接种量的大小对于菌 体生长影响不显著，确定最佳接种量为8 。 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 鲁 e1 5 0 0 衄 罐1 0 0 0 5 0 0 o 024681 01 21 4 接种量( ) + 氨肽酶酶活+ 终了p h 6 5 6 4 6 3 z 已 6 2 卜_ 敢