（环境工程专业论文）17β雌二醇与酰胺类除草剂和铜绿微囊藻的相互作用研究.pdf

摘要 环境内分泌干扰物作为一类新型污染物已经日益引起人们的关注。传 统生物废水处理不能彻底降解类固醇雌激素，其出水中1 7 伊雌二醇( e 2 ) 的浓度仍可达到几个n g t 至几个# g l 。而这个浓度足以对人和动物产生 内分泌干扰效应。因此本文以水体中常见的铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i s a e r u g i n o s a ) 为对象，研究了e 2 对铜绿微囊藻生长速率的影响，并且探 讨e 2 在藻悬浮液中的生物降解。结果表明：在o 5 4 0m g l 浓度范围 内，e 2 对铜绿微囊藻的生长有一定的促进作用，且该促进作用随浓度增 加而增强；另一方面，铜绿微囊藻对e 2 具有较好的去除效果，并且其降 解过程遵循一级动力学。在有铜绿微囊藻存在时，e 2 的半衰期约为2 o 天，而对照条件下e 2 的半衰期为3 9 6 天。因此，铜绿微囊藻对水体中 e 2 的生物转化起着重要作用，能有效的去除水体中该类污染物。 酰胺类除草剂是目前世界上使用量最多的芽前除草剂。在使用过程 中，大部分除草剂则通过各种形式进入到了空气，水体和土壤中，污染 生态环境。本文铜绿微囊藻为对象，从生物量，光合作用系统及藻细胞 群体现象研究了甲草胺，乙草胺及丁草胺三种除草剂的毒性，结果表明： 从生物量角度看，酰胺类除草剂在前3 天几乎没有对藻产生影响，实验 后几天低浓度的除草剂能刺激藻增长，高浓度的则抑制微囊藻增长。从 叶绿色a 及藻胆蛋白含量来看酰胺类除草剂能抑制叶绿素及藻胆蛋白的 合成，破坏光合作用系统。浓度越大，作用时间越长，破坏程度越严重。 低浓度下的在生物量上表观刺激作用不是正面刺激，生物量的增加可能 是由一些不正常的细胞所引起的。酰胺类除草剂处理下的藻细胞有群体 现象产生，且浓度越大，时间越长，群体现象越明显。藻细胞形成群体 能更有效的抵御外界环境压力，更大可能的增加存活率。比较乙草胺与 甲草胺的实验结果，发现乙草胺的对微囊藻毒性大于甲草胺的毒性。 在氧化损伤实验中，三种酰胺类除草剂都能对铜绿微囊藻产生氧化 压力，细胞体内的脂质过氧化物增多。为了使植物体内氧自由基的产生 和清除保持平衡，体内的抗氧化物酶s o d 及p o d 活性增强。乙草胺对 微囊藻体内m d a 含量及s o d 和p o d 的影响比甲草胺的大，进一步说明 了乙草胺毒性大于甲草胺。 关键词：铜绿微囊藻；1 7 , 8 - 雌二醇；酰胺类除草剂；生物降解；毒理 浙江工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n ed i s r u p t e r s ，a se m e r g i n gp o l l u t a n t s ，h a v eb e e n r e c e i v e di n c r e a s i n ga t t e n t i o n s t e r o i de s t r o g e n sc a n tb ec o m p l e t e l yr e m o v e d b yt r a d i t i o n a lw a t e rt r e a t m e n t ，l e a d i n gt ot h er e s i d u eo f17 & e s t r a d i a lr a n g i n g f r o ms e v e r a ln g lt os e v e r a lp g l ，s u c hc o n c e n t r a t i o n sa r eh i g he n o u g ht o c a u s ee n d o c r i n ed i s r u p t i o ne f f e c tt oh u m a na n dw i l d l i f e t h i sw o r ku s e m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s aa se x p e r i m e n m lo r g a n i s m ，i n v e s t i g a t i n gt h ei m p a c to f e 2t og r o w t hr a t eo fm a e r u g i n o s a ，a n de x p l o r i n gt h eb i o d e g r a d a t i o no f e 2 b ya l g a es u s p e n s i o n t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a ta tt h er a n g eo f0 5 4 0m g l ， e 2s l i 曲t l ys t i m u l a t e st h eg r o w t ho fm a e r u g i n o s a ，a n de x a c e r b a t i n gw i t ht h e i n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n s o nt h eo t h e rh a n d ，肱a e r u g i n o s ad e m o n s t r a t e da n e x c e l l e n te f f i c i e n c yt or e m o v ee 2 ，a n dt h ed e g r a d a t i o nf i tw e l lw i t hf i r s t - o r d e r k i n e t i c s i nt h ep r e s e n c eo fm a e r u g i n o s a ，h a l f - l i f eo fe 2a r ea p p r o x i m a t e l y 2 0 d ，b yc o n t r a s t ，i t i s3 9 6di nt h ec o n t r o lt r e a t m e n t t h e r e f o r e ，m a e r u g i n o s ap l a y sa ni m p o r t a n tr o l eo nb i o d e g r a d a t i o no fe 2 ，a n dp o s s e s s e s e f f e c t i v ec a p a c i t yt or e m o v es u c hc o n t a m i n a n t s a c y l a m i d eh e r b i c i d e sa r en o wt h eh e a v i l yu s e dh e r b i c i d e sw o r l d w i d e m o s to ft h eh e r b i c i d e sr e l e a s ei n t oa t m o s p h e r e ，w a t e ra n ds o i lb yv a r i o u s w a y sd u r i n g t h e u s a g e ，p o l l u t i n g t h ee n v i r o n m e n t t h i sw o r ku s em a e r u g i n o s aa sm o d e lo r g a n i s m ，s t u d i e dt h et o x i c i t yo fa l a c h l o r , a c e t o c h l o ra n d 3 浙江工业大学硕士学位论文 b u t a c h l o rt o m a e r u g i n o s ab yi n v e s t i g a t i n g t h e i m p a c to fb i o m a s s p h o t o s y n t h e s i ss y s t e ma n dc e l lg r o u pp h e n o m e n o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t f o rt h eb i o m a s s a c y l a m i d eh e r b i c i d e sc a u s e dl i t t l ei m p a c tt om a e r u g i n o s a o nt h el a t e rd a y so fe x p e r i m e n t ，l o wc o n c e n t r a t i o n so fh e r b i c i d e ss t i m u l a t e t h eg r o w t ho fa l g a ea n dh i g hc o n c e n t r a t i o n si n h i b i tt h eg r o w t h f r o mt h e c o n t e n to fc h l o r o p h y l laa n dp h y c o b i l i p r o t e i n ，a c y l a m i d eh e r b i c i d e sm a y i n h i b i tt h e i rs y n t h e s i sa n dd a m a g et h ep h o t o s y n t h e s i ss y s t e m t h ed e s t r u c t i o n e x a c e r b a t ew i t ht h e i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o na n dt i m e t h e a p p a r e n t s t i m u l a t i o ne f f e c ti nl o wc o n c e n t r a t i o n si sn o tp o s i t i v e ，a n dt h ei n c r e a s eo f b i o m a s sm a yc a u s e db ys o m ea b n o r m a l c e l l s g r o u pp h e n o m e n o nw a s o b s e r v e do na l g a et r e a t e db ya c y l a m i d eh e r b i c i d e s ，a l s oe x a c e r b a t i n gw i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o na n d t i m e a l g a e f o r m s g r o u p t or e s i s t a n t e n v i r o n m e n t a lp r e s s u r ea n do b t a i nh i g h e rs u r v i v a l a c e t o c h l o rd i s p l a y e da h i g h e rt o x i c i t yt om a e r u g i n o s aw h e nc o m p a r e dw i t ht h er e s u l t sf r o m a l a c h l o r i nt h ee x p e r i m e n t so fo x i d a t i v ed a m a g e ，t h r e ea c y l a m i d eh e r b i c i d e sa l l c a u s e do x i d a t i v ep r e s s u r et o 彪a e r u g i n o s a ，a n df a tp e r o x i d ei n c r e a s e d t o k e e pt h e b a l a n c eo ff o r m a t i o na n de l i m i n a t i o no fr a d i c a l si nc e l l s ，t h e r e a c t i v i t yo fa n t i o x i d a n te n z y m ee n h a n c e d a c e c h l o rh a sah i g h e ri m p a c to n t h ec o n t e n to fm d a ，s o da n dp o di nm a e r u g i n o s a ，f u r t h e rd e m o n s t r a t e d t h eh i g h e rt o x i c i t yo fa c e c h l o rt oa l a c h l o r 4 浙江工业犬学硕士学位论文 k e y w o r d s ：m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ； 17 伊e s t r a d i a l ；a m i d e h e r b i c i d e s ； b i o d e g r a d a t i o n ；t o x i c o l o g y 5 浙江工业大学硕士学位论文 第一章绪论弟一旱硒比 随着人类社会的发展，生活、生产和使用过程中进入环境的各种化学物质，都可 能对环境质量和人类健康造成严重的危害。天然雌激素作为一类环境内分泌干扰物主 要来源于人类和动物的粪便，也称天然类固醇雌激素，主要包括雌酮( e 1 ) 、1 7 , 8 - 雌 二醇( e 2 ) 、雌三醇( e 3 ) 和1 7 a 雌二醇( 1 7 a ) ，与外源性内分泌干扰物相比，具有 极高的雌激素效应，即使在n g l 的水平也能干扰包括人类在内的多个物种的内分泌 系统【l 】。比如当它们在水体中浓度为“gl - 1 时，不但能诱导雄性鱼体内的卵黄蛋白原， 甚至还能影响鱼体性器官的正常发育【2 3 1 。而酰胺类除草剂是目前全球应用最广泛的 芽前除草剂，在近代农田化学除草剂中具有重要的地位。由于其除草效果好、杀草谱 广、使用方便，被广泛地用于大豆、谷物及其他几种阔叶草的优先控制。在我国使用 最多的为乙草胺和丁草胺，其中乙草胺对人畜低毒，但对鱼类有较强的毒性，并被美 国环保局定为b 2 类致癌物，丁草胺对水生生物具有较高毒性。在农业应用中，除草 剂只有1 被植物吸收而产生药效，其余则通过喷洒漂移、吸附作用、地表径流、雨 水冲刷等方式进入环境各圈层，尤其是水环境。铜绿微囊藻是天然水体中普遍存在的 一种藻，是淡水藻类的典型代表。因此，研究水体中该类污染物与铜绿微囊藻的相互 作用，对于评价该类有机物的环境风险具有十分重要的意义。 1 1 天然雌激素简介 1 1 1 天然雌激素的性质和结构 天然类固醇激素都具有四环分子结构：一个苯环，两个环己烷和一个环戊烷( 见 表1 1 ) 。天然类固醇激素的区别在于d 环的c 1 6 和c 1 7 上基团构造不同。例如，雌 酮在c 1 7 上有一个羰基，雌二醇在c 1 7 上有一个羟基，雌三醇在c 1 6 和c 1 7 上各有 一个羟基。雌二醇c 1 7 上的羟基可以指向分子平面的下方，形成1 7 。c 雌二醇；指向 上方，形成1 7 伊雌二醇。天然雌激素均具有适度的疏水性，均难溶于水。表1 1 中列 出了各种天然雌激素的物理化学性质。 浙江工业大学硕十学位论文 1 1 2 天然雌激素的来源和产生 天然类固醇雌激素主要通过人类和家畜的粪便产生。e 2 是初级代谢物，具有最 高活性；而1 7 a 雌二醇和e 1 属于次级代谢物，活性相对较弱。e 3 被认为是终极代谢 产物，活性最低。粪便中天然雌激素含量和类型因物种的不同而不同。例如，奶牛能 够排泄1 7 a 、e 2 、e 1 和e 3 ，而其他动物主要排泄e 2 、e 1 和e 3 4 1 。一个孕妇一天能 排泄5m g 的e 2 【5 l 。l a n g e 等人的评论中报告说，在美国，每年由家畜排泄的雌激素 活性总量为4 8 5 吨1 7 f l - 雌二醇当量( e e q ) 。牛、猪和鸡的粪便每年分别产生4 5 、0 8 和2 7 吨 6 】。由人类和家畜排泄的天然类固醇雌激素中，e 2 和e 1 占总雌激素效力的 9 5 以上。 粪便中的雌激素通过地表径流和地下径流等方式进入地表和地下水。f i n l a y m o o r e 等报告，填埋垃圾的土壤中，雌激素活性高达6 7 5n g k g 干重的e 2 当量，而地 表径流中雌激素活性为5 0 至2 3 0 0n g l 【g 干重的e 2 当量【7 】。此外，与受雌激素影响 的土地邻近的地下水含6 至6 6n ge 2 当量k g 干重。s h o r e 等人指出，施用家禽粪便 的农田的径流对环境产生了重大影响，结果不仅导致邻近溪流中e 2 浓度的提升，同 时施用粪便的土地中的紫花苜蓿分泌的植物雌激素也增加y t 8 1 。 浙江上业大学硕 ：学位论文 1 1 3 环境中天然雌激素的去除 环境中的雌激素包括存在于水体中的雌激素及固体中的雌激素。从水体中去除雌 激素化合物可通过三种主要途径：挥发、生物或非生物降解和固体的吸附作用【9 1 。由 于天然雌激素的蒸气压较低，在常温常压下挥发损失的量很少。研究表明，自由雌激 素主要通过生物途径降解，而在非生物条件下，雌激素基本保持在初始水平【1 0 】。普通 小球藻的存在使得e 2 半衰期从4 8 小时降至3 小时，水生细菌也能促进e 2 转化成e 1 1 l ， 1 2 】。有研究报道在亚尔河、考尔德河和泰晤士河这三条英国河流中，e 2 生物降解成 e l 的一级衰减的半衰期为0 2 9 天，而e 2 在理想条件下光解成e l 的半衰期至少需 要1 0 天【1 3 】。将e 2 转化成e l 来去除雌激素活性是不完全的，因为e 1 仍然具有o 1 。 0 2 倍e 2 当量的雌激素活性 1 4 】。 污水中的细菌能完全将雌激素化合物降解成无害的产物 】5 1 。从东京污水处理厂的 活性污泥样品中分离的革兰氏阴性细菌可根据伪零级反应动力学降解初始浓度为3 0 m g l 的e 2 。这种革兰氏阴性污泥细菌被鉴定为红球菌，它们能在2 4 小时内将初始 浓度为1 0 0m g l 的e 2 降解至1m e d l 【16 】。城市污水处理厂中的微生物群落较工业 污水处理厂具有更高的生物降解能力。城市污水处理厂的污泥在2 4 小时内能将e 2 的矿化8 4 ，而工业污水处理厂污泥的矿化率仅为4 【博】。水体中天然雌激素的另一 种去除方法是通过相关固相的吸附，如污水处理中的污泥或应用土地的土壤等。自由 雌激素具有稳定性、适度疏水性，并且容易大范围地从液相分配到固相中。类固醇雌 激素的吸附行为可以用经验f r e u n d l i c h 等温线模拟【l9 1 。 固体中自由雌激素的去除主要通过土壤细菌的生物降解。与污泥细菌的生物降解 相比，土壤细菌的生物降解速率较慢，且反应不完全。常温下，e 2 在有机质含量为 3 2 的粘土和2 9 的粉砂土壤中的半衰期分别为6 1 和7 2 小时，以二氧化碳释放量 测定的矿化效率在粘土和粉砂土壤中都不超过1 5 2 们。动物粪便中的细菌能够降解 雌激素。由于粪便细菌的存在，施用猪粪的土壤能够促进雌激素的降解。r a m a n 等人 检测了雌激素在牛粪和猪粪中的降解。他们发现，在有氧条件下培养，e 2 的浓度在 开始的2 4 小时里急剧下降，而e 1 在4 8 小时内不断积累并达到最大浓度 2 1 2 2 】。粪便 微生物c o m y b a c t e r i u m 属被认为是降解e 1 和e 2 的主要菌种。 雌激素的完全降解主要取决于对酚醛环的破坏。人们发现，菌类淡紫拟青霉能够 将联苯中的酚醛环裂解成三羟基代谢物，因此被认为也能够降解雌激素化合物【2 3 1 。 浙江工业大学硕t ：学位论文 1 2 酰胺类除草剂简介 1 2 1 酰胺类除草剂的理化性质 酰胺类除草剂根据其化学结构和生理活性的不同可分为两类：芳酰胺类和氯代乙 酰胺类。芳酰胺类主要包括：敌稗、萘丙胺、苯噻草胺等。氯代乙酰胺类包括：甲草 胺、乙草胺、n g - 胺、丁草胺、异丙甲草胺等。 酰胺类除草剂的化学结构通式如图2 1 所示。以不同的取代基来置换内、r 2 、r 3 ， 而形成特性各异的酰胺类除草剂品种。 n p 图2 - 1 酰胺类除草剂的结构通式 f i g 2 - 1g e n e r a l s t r u c t u r eo fa m i d eh e r b i c i d e s 甲草胺( a l a c h l o r ) ，化学名为2 氯n - ( 2 , 6 二乙基苯基) - - ( 甲氧甲基) 乙酰胺， 是一种芽前使用的氯乙酰胺类除草剂，被广泛应用于玉米、大豆及棉花及等作物的一 年生杂草及多种阔叶草的控制。甲草胺的溶解度2 4 2m g l ，可以到达地表水和地下 水，水中的残留量经常达到u g l 级的水平【2 4 】。甲草胺可以诱发哺乳动物癌症、干扰 内分泌及降低男性精子浓度与活性，被美国环保局定为b 2 致癌物质 2 5 2 6 】。 乙草胺( a c e t o c h l o r ) ，化学名为2 乙基6 甲基肚乙氧基甲基0 【氯代乙酰替苯胺， 是一种具有选择性的内吸性酰胺类除草剂。乙草胺可被植物幼芽吸收，单子叶植物通 过芽鞘吸收，双子叶植物下胚轴吸收传导，有效成分在植物体内干扰核酸代谢及蛋白 质合成，使幼芽、幼根停止生长。乙草胺对人畜低毒，但对鱼类有较强的毒性，并被 美国环保局定为b 2 类致癌物f 2 7 】。 丁草胺( b u t a c h l o r ) ，化学名称为2 氯- ( 2 , 6 二乙基苯基) - - ( 丁氧甲基) 乙酰胺， 是一种内吸传导型苯乙酰胺类除草剂，已成为我国用量最大的三种除草剂之一【2 8 1 。丁 草胺难溶于水，溶解度仅为2 0m g l ，易溶于多种有机溶剂。在常温及中性、弱碱性 条件下化学性质稳定。对人畜低毒，对皮肤、眼睛有刺激作用，对鱼类高毒。丁草胺 主要通过杂草的幼芽吸收，传导全株后，在体内抑制和破坏蛋白酶，影响蛋白质的形 成，抑制杂草幼芽和幼根正常生长发育，从而使杂草死亡。 4 浙汀工业人学硕士学位论文 1 2 2 酰胺类除草剂的作用机理 除草剂主要通过破坏光合作用路径从而使植物死亡。广泛使用的氯代苯氧型除草 剂的作用机理就是模仿植物生长素的作用。当除草剂以低浓度出现在细胞的作用点 时，通常能够刺激细胞的分裂和延长，而当浓度增加时，2 4h 的诱导就能发现生长畸 形【2 9 】，包括影响茎叶的弯曲，抑制芽和根的生长，对叶子色素沉着的强化。这些植物 的变态也包括了生化反应，如乙烯基的生产过剩会导致气孔关闭和碳同化作用受抑 制，最后导致植株干燥坏死。 酰胺类除草剂在植物体内几乎不输导，只能在药剂接触部位起作用，不仅破坏植 物的光合作用，而且还抑制呼吸作用，干扰核酸与蛋白质合成等。酰胺类除草剂的作 用机理是抑制脂类合成或抑制细胞分裂与生长，通过抑制呼吸作用中硫基酶的活性从 而抑制植物的呼吸作用。有些酰胺类除草剂可作为电子传递抑制剂、解偶联剂对植物 的光合作用产生抑制，如异丙甲草胺可显著地抑n d 球藻在叶绿体形成之前的光合作 用，甲草胺、毒草胺等氯代乙酰胺类除草剂还可抑制蛋白质的合成，特别是抑制赤霉 酸诱导蛋白酶和口淀粉酶的形成。氯代乙酰胺类除草剂的另一主要作用机制是对植物 膜的影响，例如异丙甲草胺可伤害形成的细胞器膜，破坏膜结构和生物化学状况，从 而抑制组织内养分的传导【3 0 ，3 。 1 2 3 环境中酰胺类除草剂的降解 农药在环境中迁移转化的主要途径有水解和光降解两种。 农药进入环境后的水解反应主要分为三种： ( 1 ) 化学水解，即农药分子r x 与水分子发生化学反应，基团r 与x 间的键断 裂，形成新的共价基团o h 3 2 1 。酰胺类除草剂水解反应一般脱去分子中的氯原子。郑 和辉等研究了乙草胺、丁草胺在2 5 0 c 下，p h4 、5 、1 0 的蒸馏水和河水中的水解动 力学。结果表明其水解反应遵循一级动力学规律 3 3 】。 ( 2 ) 生物水解，是指农药在生物体内通过酶的生物化学作用进行的水解代谢。水 解代谢部位通常在在酯键，卤素，醚键和酰胺键，代谢产物一般都己失去毒性。几乎 所有的有机磷酸酯类农药，氨基甲酸酯类农药，菊酯类杀虫剂都能进行生物水解。 ( 3 ) 光水解，在光照条件下进行水解，通常为亲核取代反应。多数含有醚键和酯 类的农药在有水或湿气存在时，紫外光照射就能发生水解。丁草胺在氙灯光照下，光 浙江工业大学硕上学位论文 解速率为纯水 河水 塘水 稻田水；丁草胺的光解率与单位丁草胺分子接受的 光能呈正相关，即当光能一定时，丁草胺分子数越多，单位丁草胺分子接受的光能就 越少，分子裂解也就越少，其光解率就越小，符合农药降解的一般规律【3 4 1 。 农药的水解活性与农药结构，亲核试剂的类型和碱性，离去基团的性质，溶剂的 类型和溶剂化因子等因素有关。而且p h 值，温度等环境因素也会影响农药的水解。 z h e n g 等 3 5 】等研究了乙草胺和丁草胺的水解动力学及水解产物，发现酰胺类除草 剂是不易水解的化合物，而酸性条件有利于水解，乙草胺和丁草胺在p h4 时的水解 速率是p h7 时的1 倍。王敏欣等【3 6 】研究了温度在不同缓冲体系中对异丙甲草胺水解 的影响。当体系温度升高时，异丙甲草胺的水解速率显著加快。强酸条件下，异丙甲 草胺的水解活化大于强碱条件，异丙甲草胺在碱性体系中的水解反应更容易进行。 农药及其降解产物在环境中的另一种重要的降解途径是光降解。光降解可分为直 接光解和间接光解。直接光解是指农药分子直接吸收太阳光能而发生的分解反应。间 接光解包括光敏化光解和光诱导降解，环境中存在的某些物质吸收光能后呈激发状 态，引发一系列农药参与反应，最终完成农药的光化学转化。光化学反应主要有4 种类型： ( i ) 光氧化反应，许多含有苯环的大分子农药在氧气充足的环境下经光照苯环上 的烷基在水溶液中羟基自由基的作用下被氧化为羰基或进一步氧化成羧基【3 7 1 。而某些 农药氧化后的产物的毒性却要大于原药【3 s 】。 ( 2 ) 光水解反应，指大多数醚或酯类农药化合物在湿气环境中紫外线照射就能发 生水解反应。近年来随着农药光水解研究的深入，人们开始研究催化剂，氧化剂和光 敏剂对水解作用的研究。如在模拟太阳光的紫外光照射下，水体中的丙酮能促进丁草 胺的水解。水体中的腐植酸也能促进丁草胺的水解【3 9 1 。 ( 3 ) 光还原反应，大多数有机氯农药在光照条件下都可以进行还原脱氯光化学分 解。现除了三氮杂苯类化合物光催化分解相对比较难外，几乎所有的农药都能够被 t i 0 2 分解；( 4 ) 光敏化作用，自然界中的天然光敏化剂和光促灭剂如丙酮，色氨酸， 腐植酸等，都影响着农药在环境中的光化学反应过程。郑和辉等m 】研究了表面活性剂 对丁草胺在土壤中的紫外光降解的影响，发现低浓度的阴离子表面活性剂十二烷基苯 磺酸钠( d d b s ) 促进丁草胺在土壤中的光解，而高浓度的d d b s 则会阻碍丁草胺在 土壤中的光解。阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵( h d t m a ) 也会阻碍丁草 胺在土壤的光解。 6 浙江工业大学硕七学位论文 1 3 农药与藻类的毒理学研究 藻类是淡水水体中常见的类群。作为水生生态系统的初级生产者，藻类通过自身 的光合作用，为其他水生生物提供氧气和食物，其种类多样性和初级生产量直接影响 水生态系统的结构和功能。水体中藻的种类及藻细胞数量也成为监测评价水环境质量 的重要指标之一【4 。 藻类是一种很好的测试生物，对毒物敏感、易获得、个体小、繁殖快，在较短时 间内就能得出化学物质对藻类许多世代及种群水平的影响评价【4 2 。许多国家在化学品 风险测试中选用藻类进行生物测试，并建立了多个藻类生物测试标准方法 4 3 , 4 4 】。研究 农药对藻类生态毒理学，能有效的了解农药对藻类和藻类群落的毒性效应，评价农药 的生态风险，而且有助于认识农药对生态系统结构和功能的整体效应，揭示农药在生 态系统中的迁移和转化规律，维护整个生态系统的健康【4 5 1 。 近年来，随着对藻类在生态毒理学方面应用的日益重视，对藻类致毒机理的研究 也逐步深入，藻类毒理实验逐渐由简单的以获取生物量半抑制浓度等指标转向从分子 水角度研究有毒物质对藻类的毒性作用。目前热门的机理性研究包括毒物对藻类生物 膜、光合作用、呼吸作用、固氮作用以及生化组分的影响等几方面。 1 3 1 农药对藻类的毒性效应 农药的化学结构和理化性质决定了农药对藻类的毒性。汝少国等【4 6 】研究了有机磷 农药对扁藻的毒性，认为有机磷农药的毒性与磷上连结的原子紧密相关：有机磷农药 以p 为中心，与中心的共价结合的o 比s 毒性明显增大；与磷酸基上o 结合的r l 和r 2 烷基结构越复杂毒性越大；r 3 烷基为亚烷基时农药浸透性强易于作用于生物 体，产生毒性。 农药对藻类的影响与其浓度有密切关系。许多实验表明，农药在低浓度时能刺激 藻类的生长，如p a t o r a n 在浓度低于1 0m g l 能刺激栅藻的生长【4 7 】；磷胺在低浓度 可作为颤藻的氮、磷源，刺激其生长。大多数农药的毒性会随着时间的延长而有所降 低。d o g g e t t 4 8 j 研究发现长期在二嗪磷处理下的聚球藻会出现停滞期延长，而后促进 生长。高玉荣等发现单甲脒对栅藻的毒性随时间延长而降低，细胞结构恢复正常，甚 至还促进生长。产生这些现象可能的原因有：1 ) 农药的生物分解；2 ) 农药的自动降 解；3 ) 生物适应环境；4 ) 后期进入细胞的农药量减少。但也存在随时间的延长，农 浙江工业大学硕上学位论文 药毒性增大的情况，如杀草快对普通小球藻、铜绿微囊藻、四尾栅藻的毒性，7 天的 e c 5 0 值比3 天的e c 5 0 值小，毒性增大【4 9 】。 农药对藻类的毒性大小还与藻的种类有关，不同的藻类对农药的敏感性不同。 m e g h a r a j t 5 0 1 研究了久效磷和喹硫磷对聚球藻，双对栅藻，小席藻及灰色念珠藻的毒性 作用，发现久效磷能刺激聚球藻的生长，对其他三类藻产生不同的毒性：喹硫磷能刺 激小席藻的生长，而抑制其它三种藻类的生长。农药的使用导致敏感种逐渐消失，抗 性种逐渐占优势，最终改变藻类种群的组成。k a s s a i 5 1 1 在研究西草净对藻类研究中发 现随时间延长，优势种发生变化，从中心硅藻到绿球藻目，再到蓝藻纲，最后为绿球 藻目。 农药对藻类的影响还与环境因子，如p h 值、光照强度、佐剂、营养物和温度等 有关系。丁草胺和杀草丹在p h 值较低的环境下毒性增强，而在p h 值较高的环境中 毒性减低。由于很多农药都难溶于水，在毒性实验中常会使用到助溶剂，这些助溶剂 和农药的同时存在可能会对藻类毒性有加和作用、协同作用及拮抗作用。适宜的温度 能刺激藻的生长，减少农药对藻类的毒性，但有些农药的毒性也会随着温度的变化而 改变。 1 3 2 农药对藻类的毒性机理 农药对藻类的毒性机理主要包括对生物膜的作用，对光合作用的影响，对藻类呼 吸作用的影响及对藻类固氮作用的影响等。 藻类的生物膜主要包括细胞质膜、类囊体膜和线粒体膜。农药破坏藻细胞的生物 膜，使环境中的有毒物质顺利地进入细胞，从而加大了这些化合物对藻的毒害。农药 损害类囊体膜影响藻类光合作用。破坏线粒体膜会引起藻类的呼吸、生长等一系列的 生理学改变。 有机磷杀虫剂乐果，通过影响膜的流动性，使植物体内的p b s ( 藻胆蛋白) 从 p s i i ( 光系统i i ) 反应中心漏出，抑制类囊体膜上的a t p a s e 活性，导致光合作用电 子传递受阻，p s i i 荧光增强而光合作用放氧减少【5 2 1 。敌百虫影响质膜的通透性，减 少依赖于质膜运输的营养物质进入细胞的量，而2 ，4 d 则通过改变质膜的通透性增加 了营养物的供给，促进藻的生长【5 3 】。 很多除草剂能影响藻的光合作用，但不同的除草剂作用于光合作用的不同部分， 因此作用机理也有所不同。三嗪类除草剂被认为作用于光合作用p s i i ，杀草快，敌草 浙江上业| 大学硕士学位论文 隆等能阻碍光合作用电子的传递【5 4 1 。有些农药通过改变藻类的叶绿素含量来影响藻类 的光合作用，如杀草丹能减少灰色念珠藻的叶绿素a 的含量【5 5 。 。 农药还能影响藻类的呼吸和固氮作用。许多农药作用于真核生物的线粒体能量产 生过程而影响呼吸作用。蓝藻的固氮作用与异形胞出现的数量和固氮酶活性直接相 关，许多农药可通过抑制藻的固氮酶活性或异形细胞出现频率来影响藻的固氮作用。 1 3 3 藻类对农药的富集及降解 藻巨大的总表面积和藻细胞的特殊胞外组分及细胞形态决定了藻对农药有很大 的富集能力。藻富集农药的最大富集量一般出现在农药低浓度而藻最高生长率时，这 可能是由于藻量的增加了细胞总表面积和吸收率，从而增强了富集。藻类对农药的富 集主要以被动作用为主，但有时主动作用也起较大的作用。 藻类不仅能富集农药，还能将农药降解为无害的化合物或转化为自身所需的氮 源、磷源进行生长。早先就有实验证明了d d t 能被藻降解为d d d 和d d e 。近年来 关于有机磷农药降解报道也很多，如z a b i o t o w i c s t 5 6 j 发现有多种藻株能以n 去甲基化 方式降解伏草隆。m e 曲删等【5 7 】发现多种蓝藻能降解久效磷，且不同藻类降解农药 的能力不同。 农药对藻类的毒害和藻类降解农药两个过程同时存在。各种农药只有在非毒性浓 度时才能被降解，降解过程占主导地位，主体上表现为降解；反之农药对藻的毒害作 用将起主要作用，表现为毒害作用。加强藻类降解农药及其机理的研究，可以利用藻 类降解有机污染物，这无疑为去除有机污染物，改善生态环境提供了一条经济有效的 途径。 1 4 课题的提出和研究内容 1 4 1 课题的提出 环境内分泌干扰物( e e d c s ) 可通过影响内源性激素的产生、结合、活性和代谢 等干扰人类和动物内分泌系统的正常生理功能，因此在世界范围内引起越来越多的关 注 5 8 】。而这些效应通常能引起发育异常，生殖紊乱，精子数量减少以及睾丸、前列腺 和乳腺等器官的癌症发病率上升【5 9 鲫。1 7 伊雌二醇( e 2 ) 作为一种内源性类固醇雌激 9 浙江工业大学硕士学位论文 素，其内分泌干扰效应比外源性内分泌干扰物高1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 倍，即使在n g l 的水 平也能对人类和动物产生内分泌干扰效应【6 h 3 1 。e 2 主要通过人类和牲畜的粪便进入 到环境中。传统生物废水处理不能彻底降解类固醇雌激素，出水中e 2 的浓度仍可达 到几个n g l 至几个比g l 。而这个浓度足以对人和动物产生内分泌干扰效应。 酰胺类除草剂是目前世界上应用最广泛的芽前除草剂，在近代农田化学除草剂中 占居重要的地位。由于其除草效果好、杀草谱广、使用方便，被广泛地用于大豆，谷 物及其他几种阔叶草的优先控制【州。在我国现使用最多的乙草胺和丁草胺，它们同为 酰胺类除草剂。其中乙草胺对人畜低毒，但对鱼类有较强的毒性，并被美国环保局定 为b 2 类致癌物，丁草胺对水生生物具有较高的毒性。在农业生产使用中，除草剂只 有1 被植物吸收而产生药效，更多的则通过喷洒漂移、吸附作用、地表径流、雨水 冲刷等方式进入大气、土壤和水环境中。酰胺类除草剂的大量使用过程中，更多的量 则进入到了生态环境中【6 5 1 。我国和美国水体中均已检出酰胺类除草剂的残留物 6 6 , 6 7 。 近年来关于酰胺类除草剂对水生动物斑马鱼，水生植物的毒理研究较1 6 8 , 6 9 ，但对于 水体中另一大类生物，淡水蓝藻的毒性研究却较少。 在水生生态毒理研究中，藻类由于是单细胞生物，生长周期短，对毒物敏感、易 获得、个体小、繁殖快，能在较短时间内可得到化学物质对藻类许多世代及种群水平 的影响评价，是一个很好的测试生物 7 0 】。许多国家在化学品风险测试中选用藻类进行 生物测试，并建立了多个藻类生物测试标准方法【7 1 1 。铜绿微囊藻属蓝藻系，是一种原 核单细胞生物，普遍存在于天然水体中。由于其生命周期短，易于培养等优点，是生 物实验中一种普遍使用的模型生物。 通过酰胺类除草剂对铜绿微囊藻的水生毒理研究，评价其农药的生态风险，为环 境保护以及这类农药的合理使用提供一定的科学依据。而藻类作为一种普遍存在于水 体中的自养型生物，能够富集并降解水体中的有机污染物，将其转化为碳源、氮源作 为营养元素进行生长。国内外许多研究结果表明，藻类能够降解水体中多种有机污染 物【7 2 ，7 3 1 。通过藻类对雌二醇的降解研究，可以寻找出一种新手段应用于低浓度有机废 水的处理，不仅操作简便，同时也因其在环境中广泛存在，可大幅度减少废水处理的 成本。 1 4 2 研究内容 l 邛雌二醇作为一种天然的环境内分泌干扰物，与合成化合物比较，具有强烈的 浙江上q k 大学硕一 ：学位论文 雌激素效应：甲草胺、乙草胺和丁草胺是现代农业使用量最多的酰胺类除草剂。本文 以这两种具有代表性的污染物为模型化合物，以水生生态系统中常见的铜绿微囊藻为 受试生物，分别研究铜绿微囊藻降解1 7 f l - 雌二醇和酰胺类除草剂对铜绿微囊藻的毒 性。具体研究内容如下： 1 以铜绿微囊藻为模式藻类，研究了不同质量浓度的1 7 , 8 - 雌二醇对铜绿微囊藻 生长速率的影响：同时，研究了铜绿微囊藻对不同质量浓度e 2 的生物降解作用，探 讨了其降解动力学。 2 以铜绿微囊藻为模式藻类，研究了三种酰胺类除草剂即甲草胺，乙草胺和丁 草胺对铜绿微囊藻生长速率的影响；对铜绿微囊藻的叶绿素a 的合成及藻胆蛋白合成 的影响；观察在除草剂处理下藻液的群体现象。 3 以铜绿微囊藻为模式藻类，通过研究三种酰胺类除草剂处理下藻细胞体内的 丙二醛( m d a ) ，超氧化物歧化酶( s o d ) ，植物过氧化物酶( p o d ) 的变化，进一 步探讨了酰胺类除草剂对微囊藻的作用及是否产生了氧化损伤。 浙江工业大学硕士学位论文 第二章铜绿微囊藻去除1 7 f l - 雌二醇的研究 由于内分泌干扰物能干扰人体和生物体内激素的产生、结合以及代谢，导致发育 异常、生殖系统紊乱、雄性精子数目减少，以及诸如睾丸癌、卵巢癌和乳腺癌等等病 变，它们在全世界正不断引起人们的重视，研究内分泌干扰物的环境过程以及他们的 毒理学效应，已经成为当前研究的热点。目前已经确定的或者被认为是潜在的内分泌 干扰物不但包括大量的人类合成的化合物，比如多氯联苯、d d t 、多溴联苯醚、表面 活性剂等，同时也包括雌酮( e 1 ) 、1 7 f l - 雌二醇( e 2 ) 和雌三醇( e 3 ) 等天然类固醇 激素。 作为一种内源性类固醇雌激素，e 2 的内分泌干扰效应比外源性内分泌干扰物高 得多，即使在n g l 的水平也能对人类和动物产生内分泌干扰效应。而传统的生物废 水处理不能彻底降解类固醇雌激素，当这些处理完的含有e 2 的水进入水环境时，会 对水生动物如鱼类，贝壳类生物造成性别抑制或逆转，并通过食物链对人体的健康造 成危害。大量的证据表明，由于洛杉矶大量废水的排放，造成了太平洋沿岸鱼类的雌 性化。 藻类，作为一种普遍存在于水体中的自养型生物，能够富集并降解水体中的有机 污染物，将其转化为碳源、氮源作为营养元素进行生长。国内外许多研究结果表明， 藻类能够降解水体中多种有机污染物，但有关藻类对水体中的农药的降解作用研究却 相对较少。t i a n t 7 4 3 报道了低剂量的有机磷杀虫剂乐果增加普通小球藻体内的碱性磷酸 酶，使乐果水解转化成无机磷酸盐，从而作为一种磷源刺激普通小球藻的生长。蔡喜 运等【7 5 3 研究了蛋白核小球藻、普通小球藻和斜生栅藻对手性农药禾草灵及水解产物禾 草灵酸具有不同的降解效果且发现低剂量的化合物在不同的剂量范围内刺激了三种 水藻的生长，呈现出了“毒物的兴奋效应”。铜绿微囊藻，是一种原核生物在我国的 富营养化湖泊、池塘水体中分布很广，是我国太湖、巢湖、滇池等大型湖泊的水华优 势种【7 6 1 。目前有关藻类对水体中的内分泌干扰物的降解作用研究却相对较少。 鉴于铜绿微囊藻的广泛存在和内分泌干扰物所引起的环境问题日益加剧，以铜绿 微囊藻为模式藻类，研究了不同浓度的e 2 对铜绿微囊藻生长速率的影响；同时，研 究了铜绿微囊藻对不同浓度e 2 的生物降解过程，并且探讨了其降解动力学。 1 2 浙江工业大学硕+ | ：学位论文 2 1 实验材料 2 1 1 实验仪器 实验所用仪器主要包括：高效液相色谱仪( j a s c o ，日本) ，配备f p 2 0 2 0 荧光检 测器、p u 2 0 9 8 四元梯度洗脱泵、a s 2 0 5 5 自动进样器、c o 2 0 6 0 柱温箱以及c h r o m p a s s 色谱工作站( j a s c o ，日本) ：v - 5 5 0 紫j , b 可见分光光度计( j a s c o ，日本) ；p q x 智能 人工气候箱( 宁波莱福科技有限公司) 和m u l t i f u g ei s r 低温高速离心机( t h e r m o ， 美国) 。 2 1 2 实验试剂 实验所用的试剂主要包括：1 7 伊雌二醇标准药品( 9 9 ，s i g m a - a l d r i c h ) ，溶解 度为5 4 1 3 3m 班；丙酮、甲醇( 色谱纯，t e d i a ，美国) 。其他试剂均为分析纯( 含 量 9 9 ) 。 2 1 3 藻种培养 实验所用的铜绿微囊藻( m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ) f a c h b9 0 5 购于中