（生物医学工程专业论文）基于电聚合吡咯的电流式胆固醇生物传感器.pdf

浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t c h o l e s t e r o l ，w h i c he x i s t i n gmo u rb l o o d 锄db e i i l gc a 王l e dt h et o t a lc h o l e s t e m la sa w h o l c ，i st h em o s ti m p o n a n ts t e m i di nh 啪a b o d y - t h et o t a lc h o l e s t e m lc o n s i s t so f c h o l e s t e r o le s t e ra l l dd i s s o c i a t i v ec h o l 皓t e r 0 1 t h ed e s i r e dt o t a ld i 丛m ac h o l c s t e lf o r a i li n d i v i d u a li sl e s st h 肌5 2 m m ( 2 0 0m g d 1 ) ，孤dah i g i ll e v e lb e i n gc o n s i d e r c d 勰 掣e a t c rt l l a n6 2 m m ( 2 4 0m g d 1 ) a l o l c s t e r o l i sr o u 血l c l ym e 舔u r e df o rt h er i s k a s s e s s m e n to fc a r d i o v a s c u l 缸c o n d m o n s ，s u c ha sa t h e r o s d c r o s i sa n dh y p e r t c n s i o n ， w l l i c hc a i ld e v e l o pi i l t oc o r o n a r vh e a nd i s e a s e ，m v o c a r d i a la n dc e r e b r a li n f a r c t i o n ( s 仃o k c ) e 1 e c t m c h e m i c a lc h d c s t e r o lb i o s e n s o ri sm a i n l yb a s e do nc h o l c s t e r o le s t e r c h 0 1 e s t e f o l 删d a s e 壮dh o r s c n d i s hp e r o i d c w bc 姐u s ed i 腑r c n tt e c l l i l i q u c st oi l n m o b i l i z e e n z y m e s0 t oe l e c 缸d d es u r f a c e s 加n p c r o m e t r i ca i l dp o t c n t i o m e 啪cm e t h o d sh a v e b e e ni e s e a r c h e dt od e t e r i b 主n et h cl e v do fc h o k s t c r 0 1 r e c e n t l y t h c r ei sac o n s i d e r a 【b l ea t t e n t i o nt 0a m p e 舳c t r i cb i o s e s o r sb a s e d0 n o r g a n i cc o n d u c t i v ep o l y m e r s t h ea b i l i 啦t os y n t h c s i s ec o n d u c t i v ee l e c t m a c t i v e p o l y m c r su n d e rm i l dc o n d i t i o n se a b l c st op e r f o 皿t h ci l n i i l o b i l i z a t i o no far a n g eo f b i o i o 昏c a lm o i e t j c s ( e n z y m e s ，锄t i b o d i e s ，e v e nw h o l el 王v i i i gc e u s ，c c t ) p o l y p y r r o l e a l l di t sd 谢v a t i v e sp l a yal e a d i i l gr o l ed u et ot h e i rv e r s a t i l ea p p l i c a b n i t y h i g i i c o n d u c t i v i t y 卸d 郾 o ds t a b i l i ty i t 啪b ce a s i l yf 0 恤e d 丘0 ma q u c o u sb u f 托r c d s o l u t i o n su n d e rm i l d l vo x i d a t i v ec o n d i t i o n sa n dh a sb e c nw i d e l vu s c df b rb i o s e n s o r s t h i sd i s s e r t a d o d e s c f i b e sac h o l e s t e r o lb i o s e n s o rw h i c hi sb a s c d 锄s c r c c nd m t e d c 酊b o np 嬲t cc l e c 仃0 d e c h o l c s t e m lo 】【i d a s c 柚dh o r s e r a d i s hp c m x i d e 缸ci 咖o b i l i z e d b yc l e c t f o p o l y m c i i z a t i o no fp o l y p y r r o l e f e 丌o c y a n i d ew o r k s 鹋a ne l e 仃o a c t i v e m e d i a t o lc b o k s t c f o l ( c o n c c n t m 虹r 姐g cf r o m0 m g d lt o4 lhi i 玎鲋ni sd e t c c t e db v 觚a m p e r o m c t d cm e t l l o d r e a c t i o np r i n c i p l e s ，m o d i f i c a t i o no fe l c c t r o d es l l r f a c c 姐d e i l z y m ci m m o b j l i z a i i o na r cd i s c l l 骆e d p 删e t c r so fe l e c t r o p o l y m e r i z a t i o na l l do t h e r f a c t o 娼w h i c hm a yi n n i 地n c et h er c s p o n s eo ft l l eb i o s e n s o ra r ea n “v z c d e x p e r i m e n t a lf e s u l t si n d i c a t et h a te l e 咖p o l y m e r i z a t i o no fp 0 1 y p y r m l ec 孤e f i c c t i v e l y i m m o b i l 主z ec h o l e s t e m lo x i d 鹤e 锄dh o r s e 阳d j s hp e m x i d co nc a r b o np 勰t ee l e c t r o d e s t h e r ei sap o t e n t i c a lt of c a l i z em i n i a t l l r ec h o l e s t e r o lb i o s e n s o r sf b rm a s s i v ei n d u s t r i a l p m d u c t i o na t1 0 wc o s t k 留w o r d s ：c h o l e s t e r o l ，b i o s e n s o r ，e 1 e c t m p o l y l e r i z a t i o n ，c a r b o np a s t e ，p o l ”y 玎o l e i i 浙江大学硕士学位论文 第一章背景介绍 1 1 生物传感器的基本概念 现代生物传感器的概念产生于1 9 6 2 年，当时c l a r k 等人提出酶可以固定在 电化学探测器上形成酶电极。生物传感器是以生物活性单元( 如酶、抗体、生物 膜或活细胞) 作为敏感元件，通过各种物理、化学换能器捕捉目标物与敏感元件 之间的反应，然后将其转换成连续或离散的电信号或光信号，再经电子仪器对这 些信号进行处理，从而成为人们可以掌握的信息【1 】。 生物传感器的核心主要由分子识别和信息转换两部分组成，如图卜1 所示。 分子识别部分是指被固定化的酶、微生物、抗体、细胞等；信号转换部分一般有 电化学测量装置、热敏电阻、场效应管、光敏二极管、光纤、压电元件等【2 】。 与传统的分析方法相比，生物传感器具有如下特点： ( 1 ) 生物传感器是由选择性较好的主体材料构成的分子识别组件，因此一般 无需进行样品的预处理，凭借其良好的选择性可以把样品中被测组分的 分离和检测合为一体，且测定时一般不需添加其它试剂。 ( 2 ) 它的体积可以很小，便于实现连续监测。 ( 3 ) 响应快速、样品消耗量少。敏感材料是被固定化的，可以反复使用。 ( 4 ) 传感器连同测定仪的成本之和仍远低于大型的分析仪器，因而便于推广 普及。 生物传感器可以广泛地应用于微量蛋白( 如肿瘤标志物、特异性抗体、神经 递质) 、小分子有机物( 如葡萄糖、乳酸、胆固醇及各种药物的体内浓度) 、核酸 ( 如病原微生物、异常基因) 等多种物质的检测。在现代医学检验中，这些项目 都是临床诊断和病情分析的重要依据。 根据所选择的换能器的不同，生物传感器可以分为光学、热学、压电、电化 学等生物传感器。光学生物传感器是建立在对生化反应所吸收或释放光的测定的 基础之上。热学式生物传感器对生化反应所产生的热进行测定。但是，反应产生 大部分热都散失在环境溶液中，并没有被探测器检测到，这就降低了生物传感器 的灵敏度。压电式生物传感器是基于压电效应电偶极子的产生。以上的这些传感 浙江大学硕士学位论文 器都有其缺点，如光学式生物传感器虽然灵敏度很高，却不能在混浊环境中使用， 热学式生物传感器不能在热变化非常小的条件下应用，而且它们都不易控制。电 化学式生物传感器是最常用的一种。它能克服其他种类的传感器存在的大部分问 题。这种传感器响应迅速、容易控制、价格低廉【1 】a ，塞；器 磊冀黜 心黟叫嚣溜 。】| 勰懋 c o f ? o o 呻 篡慧固篡轰时f 、i h # _ i c 州s 科 妇t 帆时l 、 w c 叭四黧怒掣l p l i 帅m u i d p i ；c r je c 姐r i o 划 州。二冷p l t m 瞒0 7s i i s = 4 三= = ” l k m 目舢蕊*i ， 慧出勘l s w i - k 一一”。 r 图l - l 生物传感器的结构f 2 1 电化学式生物传感器的原理是，在生物反应过程中，消耗或生成的电化学物 质如电子能产生可被电化学探测器检测到的电化学信号。它具有较高的灵敏度， 能在污浊的环境中使用，并适于小型化发展。电化学式生物传感器常常是基于电 压法和电流法测定。电流式生物传感器可靠、便宜且具有高度灵敏性，在临床、 环境和工业上应用广泛。 1 2 胆固醇生物传感器的意义和发展 胆固醇的测定通常可以用作对心血管情况的评估，比如动脉硬化、高血压， 它们可以导致冠心病、心机梗塞和脑梗塞。在甲状腺机能减退、肾病、糖尿病、 黏液腺瘤、阻塞性黄疸的情况下，病人的胆固醇水平会增高，胆固醇脂会高于正 常生理标准。如果病人的胆固醇水平降低了，则可能是甲状腺机能亢进、贫血、 吸收不良或萎缩综合症。 人体所需的血清总胆固醇含量小于5 2 m m ( 2 0 0 m g d 1 ) ，当胆固醇含量高于 6 2 m m ( 2 4 0 m g d 1 ) 时需要引起重视。血清中胆固醇的水平随着年龄的增大而增 2 浙江大学硕士学位论文 长。一般来说，女性的胆固醇水平要低于男性，但是到了更年期以后，女性的胆 固醇水平会高于男性。胆固醇在血清中由一系列含蛋白质的微团的脂蛋白携带 的。脂蛋自根据其密度可以分为不同的类型密度非常低的脂蛋白( d l ) ， 低密度脂蛋白( u 儿) ，中等密度的脂蛋白( i d l ) ，和高密度脂蛋白( h d l ) 。 全血中大约7 0 的包含在脂蛋白中总胆固醇被脂肪酸脂化。因此，在脂蛋白中 游离胆固醇的浓度大概只有1 o 2 2 m m ( 4 0 8 5 m g 枷) 【1 】。 传统的胆固醇测定方法都是以分光光度计为基础，包含一些复杂和细致的实 验程序，测定时间都相当长，而且费用相当高( 因为每次测定中必须使用昂贵的 酶) 【3 】。 胆固醇生物传感器在发展经济、简单、快速、准确的测定胆固醇含量的大趋 势下应运而生。 在过去的三十年中，胆固醇生物传感器快速发展。用酶来测定胆固醇的光学 生物传感器已经被开发，这些方法中的一部分受到血清中的其他干扰物质的影 响。用电流和电压的方法来测定胆固醇已经展开了研究。这种传感器的主要缺点 在于在测量前后都需要对其进行校准，它们的生命周期很短，在测试样本中其他 电化学活性物质的氧化会导致假信号。 对胆固醇生物传感器而言，主要干扰物质是抗坏血酸和尿酸，这个问题可以 通过聚合物膜来克服，它对于我们感兴趣的分析物具有更强的选择性，能去除或 减少干扰。但是这需要更多的准备时间，并且增加了生物传感器的复杂性。如果 干扰没有减小，会导致对分析物浓度的过高估计f 1 】。 1 3 各种类型的胆固醇生物传感器 根据所使用的换能器，胆固醇生物传感器大致可以分为热学式、电化学式、 光学式三大类。 1 3 1 热学式胆固醇生物传感器 热学式主要是以热敏电阻式胆固醇生物传感器为主，在结构上把胆固醇氧化 酶和热敏电阻结合在一起，通过测量反应中热量的变化来决定被测样品中胆固醇 的含量【3 】。与其他的热学式生物传感器一样，反应产生大部分热都散失在环境 浙江大学硕士学位论文 溶液中，并没有被探测器检测到，这类胆固醇生物传感器的灵敏度不高，不能在 热变化非常小的条件下应用，而且难以被控制。目前，此类传感器已经很少有人 从事研究【4 】。 1 3 2 光学式胆固醇生物传感器 许多有机物质都具有生物发光现象，某些化学试剂遇到0 2 或h 2 0 2 会产生发 光现象，某些荧光物质遇到0 2 会发生猝灭现象。e r o m e m 等于1 9 8 6 年首先建 议使用包括基于分光光度法或荧光分光光度法的停流法的几种光学方法来测定 胆固醇的含量。随后，光学式胆固酵生物传感器得到了较大的发展。这类生物传 感器的灵敏度较高，但其性能会受到周围环境因素的制约【3 】。 1 3 1 2 - 1 非光纤式胆固醇生物传感器 在发光类型上，该类传感器主要以化学发光为主。基本反应原理如下： h 2 0 2 + 化学发光物( 如鲁米诺) 氨基酞酸根+ 光子 日本的a 1 i y o s h i i g i l c h i 等在实验室用鲁米诺作为化学发光剂研制了测定 总胆固醇的生物传感器。该传感器测试血清样品仅需0 助l ，响应时间为o 5 s ， 但该法和常规测试方法比，准确度不很高，相关系数0 9 3 2 。 m i k e 等用三氯苯酚草酸作为化学发光剂。该传感器的优点是专一性和高灵 敏度，室温2 0 时的检测极限是1 “m o l ，最大的缺点是非离子表面活化剂包括 啊t o nx - 1 0 0 含有不可忽略的过氧化物，它们会与三氯苯酚草酸反应而发光，从 而干扰胆固醇的测定。 m a r i a 等研制了在室温下用磷光传感系统在有机溶剂中检测胆固醇含量的光 学生物传感器，检测范围为( 5 1 0 _ 5 4 1 0 - 3 ) m o l 几。突出优点是胆固醇氧化 酶在所选择的有机溶剂中不溶，且催化能力很活跃，而被测的底物易溶于有机溶 剂，因而很容易恢复酶的初始状态，易于连续检测。但是也存在一些基础问题尚 待解决，如非水介质在控制酶活性的参数、水的作用、有机溶剂在生物催化剂中 所起作用的本质等尚待揭示。 4 浙江大学硕士学位论文 目前，非光纤式光学胆固醇生物传感器还不是很成熟，尚有待进一步研究。 1 。3 2 2 光纤式胆固醇生物传感器 光纤式与非光纤式胆固醇生物传感器的主要区别在于：光纤式胆固醇生物传 感器测试过程中产生的化学发光或荧光是通过光纤来传导的。 在化学反应中，体系要消耗氧气生成h 2 0 2 ，在酶膜和载体之间固定荧光剂 或化学发光剂，固定的荧光剂遇到0 2 分子会发生荧光猝灭，化学发光剂和h 2 0 2 反应能发出可见光，而反应中0 2 的损耗量、h 2 0 2 生成量与胆固醇及胆固醇脂的 量是成比例的，因而只要检测出反应体系中的荧光强度或可见光强度的变化便可 测定样品中胆固醇的含量。决定传感器灵敏度的关键在于胆固醇氧化酶膜的固定 和胆固醇氧化酶膜的活性、荧光剂或化学发光剂的灵敏度。 t r e 蛐a k 等首先研制成了用十环烯作为氧指示剂的测量胆固醇的光纤生物传 感器，检测范围为0 2 m m 0 3 m m ，响应时间为7 1 2 分钟。m a 鲫e l a 等研制 成了r u ( d p p ) 3 c 1 2 为氧指示剂测量用单一优化法处理后的血清中自由胆固醇含量 的光纤生物传感器。检测范围为o 1 5 m m 3 m m 。 k n i g 等对葡萄糖光纤传感器稍加改进，制成了以a b t s 作为h 2 0 2 含量变化 指示剂的胆固醇光纤生物传感器，该传感器的检测范围为0 5 m m 5 m m ，响应 时间为2 分钟，和目前临床常用的检测方法测定值之间的相关系数为o 9 9 8 ，符 合临床检测的要求。缺点是酶膜使用寿命过短，1 0 天之后，酶的活性便低于原 活性的8 0 。 根据国际上光纤传感器发展的趋势来看，测量胆固醇的光纤生物传感器将向 微型化、复合型、多功能化方向发展，即将几种酶同时固定在光纤上。 1 3 3 电化学式胆固醇生物传感器 在生物反应过程中，通过消耗及生成的电化学物质如电子等，借助各种电化 学检测方法能直接或间接地测量胆固醇浓度。这类传感器能克服大部分其他类型 生物传感器所固有的缺陷，且制作简便、价格低廉，近年来应用最为广泛【4 】。 关于此类传感器的详细分析见第二章。 浙江大学硕士学位论文 第二章电化学式胆固醇生物传感器 2 1 基本原理 目前电化学式胆固醇生物传感器大都是基于胆固醇氧化酶的，胆固醇能在胆 固醇氧化酶的作用下生成过氧化氢。 而对于血液中脂化了的胆固醇的测定则需要再添加一种胆固醇腊酶，反应变 为两步：胆固醇脂先被胆固醇脂酶水解为游离胆固醇和脂肪酸，游离胆固醇在胆 周醇氧化酶的作用下又产生过氧化氢。 通过检测0 2 的减少量或h 2 0 2 的生成量可以间接地测定胆固醇含量，其中检 测h 2 0 2 的方法因灵敏度更高而应用最为广泛。僵h 2 0 2 在各种电极上的氧化反应 可逆性差，过电位大，测定时通常须在较高电位下( + o 6 v ) 进行，使得溶液 中共存的大量还原性物质如抗坏血酸、尿酸等产生干扰。在制作酶传感器的过程 中，为了在较低电位下选择性地测定h 2 0 2 ，人们采用了加入氧化还原中介体、 偶联过氧歧化酶和利用酶的直接电化学等方法f 5 ，6 】。 由于h 2 0 2 在碳糊电极上难以直接氧化，所以采用亚铁氰化钾作为电子转移 介质来促进氧化还原反应中的电子传递，以增加传感器的响应电流，同时能使反 应在更低的电位下进行。 利用亚铁氰化钾作为电子转移介质能取得较好的效果，过氧化氢在过氧化物 酶存在的条件下被亚铁氰化钾还原，生成铁氰化钾。而在工作电极上，o 1 v ( v s a g ，a g c l ) 电压条件下，【f c ( c n ) 6 】3 - 能被还原为【f c ( c n ) 6 】4 - 。这一过程中的电 子传递能以电流的形式被检测到。 利用酶电极可以检测胆固醇浓度， 酯化胆固醇+ h 2 0 游离胆固醇+ 0 2 胆固醇酯酶 胆固酵氧化酶 h 2 0 2 + 2 【f e ( c n ) 6 】4 + 2 h + 其反应方程式如下： 游离胆固醇+ 脂肪酸 4 一胆甾烯酮+ h 2 0 2 过氧化物酶 2 【f e ( 口咻】3 。+ 2 h 2 0 ( 3 ) 【f e ( c n ) 6 】3 。+ e 【f c ( c n ) 矿 ( 4 ) 前三个反应是在酶的作用下发生的生物催化反应，后一个反应是电极反应。 浙江大学硕士学位论文 电流检测法通常在高电位条件下进行( 0 6 o 7 v v s a g a g c l ) ，利用氧化还 原介质亚铁氰化钾( 【f e ( a 叼6 】4 ) 来还原过氧化氢可以降低工作电压，从而减小 干扰物质的影响。另一方面，该反应的产物铁氰化物( 【& ( a 哺p ) 也可以在低 电位下被检测到，这说明应用电流检测法也能较好地排除干扰。 但是，这种反应体系受到空气氧化亚铁氯化钾的影响，实际上这是在酶的氧 化反应过程中发生的竞争反应。 当反应处于最佳p h 条件下，且酶量充足时，电极反应是整个反应的控制步骤， 这时应该充分考虑电子介体的种类、氧化还原状态、用量以及其他影响反应的条 件。 2 2 电化学检测方法 2 2 1 电流检测法 电流检测法是基于工作电极上底物的氧化反应或还原反应，因此这种方法只 对电活性物质有效。另一方面，电流检测法可以达到很低的测量下限【7 】。 通常在电流检测法中，测量的电流( i ) 与电极面积( a ) ，交换的电子数量 ( n ) ，法拉第常数( f ) ，扩散系数( d ) ，扩散层厚度( 6n ) 和底物浓度( c ) 有关。 l ；一a 嚏f d 三 6 如果其他参数恒定，响应电流与底物浓度( c ) 成正比。 前提条件是旌加的电压必须足够正或足够负，分别能引起底物的氧化反应或 还原反应。 加入电子转移介质亚铁氰化钾能有效地降低氧化还原电位，降低干扰。 电流检测法可靠、便宜、并且具有很高的灵敏度，因而应用非常广泛。在后 续的实验中均采用电流检测法。 2 2 2 电压检测法 电压检测法测量的是电极表面积聚的电子。这种方法由于其固有的宽检测范 浙江大学硕士学位论文 围而受到青睐。但是，用电压检测法来检测胆固醇含量却鲜有报道。这可能是胆 固醇酶反应的氧化还原电位难以测定造成的。 如上文所述的反应机理，胆固醇腊被胆固醇脂酶水解为游离胆固醇和脂肪 酸，游离胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下又产生过氧化氢，过氧化氢在过氧化物 酶存在的条件下经亚铁氰化物还原，产生铁氯化物。胆固醇及胆固醇脂反应的产 物定量地转化成铁氰化钾，此过程中的氧化还原电压与 f e ( c n ) 6 】3 【f c ( c n ) 6 】4 的 浓度有关，可以通过能斯脱方程来描述。换句话说，电压检测法基于铁氰化物和 亚铁氰化物的比例，通过能斯脱方程来评价反应的程度范围。 假设胆固醇脂定量地转化为胆固醇，而总胆固醇又转化为过氧化氢，然后过 氧化氢与亚铁氰化钾反应。令胆固醇脂、游离胆固醇和亚铁氰化钾的初始浓度分 别为【c 髓】o ，【c h 】o ，【f e 明o ；【p 】和【f e i 】是反应中生成的过氧化氢和铁氰化钾的 浓度，并且亚铁氰化钾过量： 【f c 】- 2 【p 】= 【c 明。+ c 脏】0 反应后的亚铁氰化钾浓度变为： 【f e 玛= 【f e 】。一征k 】 对氧化还原活性物质应用能斯脱方程： e ：c o n s t + 堕l n ( 堕婴) f 【f e 】 e ：c o n s t + 塑l i l ( ! 望m 里些1 1 f 、f f c 】。( 【c h 】。+ 【c h e 】。) 7 其中，r 、t 、f 分别是通用的气体常数、温度常数和法拉第常数。后一个方 程预测了当【f e 明o 【f c i i i 】时的能斯脱效应。氧化还原电压能被电极检测到。 与电流检测法相比，电压检测法测量小的浓度变化的能力十分有限，得到的 测量信号的稳定性和重复性也存在很大问题【7 1 。 2 3 化学修饰电极 化学修饰电极( c m e s ) 构成了一种近代的电极体系。与电化学中其他电极 的概念相比，c m e s 最突出的特性是，在电极表面接着或涂敷了具有选择性化学 基团的一层薄膜( 从单分子到几个微米) 。它是按人们意图设计的，并赋予了电 浙江大学硕士学位论文 极某种预定的性质，如化学的、电化学的、光学的、电学的和传输性等。化学修 饰电极的表面性质比离子选择电极( i s e s ) 要广得多，它概括了有意图设计的最 高形式，设计相界面，设计在电极表面和电极之间的膜中分配和传输性质。c m e s 和i s e s 的不同之处还在于前者一般用安培法，利用电荷转移反应来进行实验测 定和研究，而后者则是用电位法测定相界电位( 界面电位差) 。酶电极是用来测 定在被固定化的酶层和底物发生反应的产物的。c m e s 在性质上与安培式酶电极 并无太大区别，差别只在于后者采用天然的生物催化剂，而c m e s 则是人为设计 的( 包括生物的) 分子电极【8 】。 在分子水平上人为设计电极功能，把化学修饰电极与酶反应的特异性结合起 来，以“全化学”方法制作酶电极是电化学生物传感器发展的方向之一，可在酶 电极发展的三个阶段发挥作用。在a a r k 型酶电极中，在媒介体型酶电极中，在 酶的直接电化学中都有其应用价值。在组成酶电极中利用化学修饰电极表面的各 种方法可不受电极尺寸和形状的限制，并且膜层厚度可控和修饰剂分布均匀。根 据修饰剂的功能可带来灵敏度提高、检测限拓宽、稳定性增强以及防止毒化和避 免干扰等优点，特别有利于酶电极向微型化、集成化方向发展【8 】。 2 3 1 化学吸附法 当电极浸入溶液中时就发生吸附，这是固体，溶液界面的一种自然现象。以 往总把吸附当作干扰看待，但化学修饰电极的出现改变了这种认识，并对此加以 利用作为制造电极表面微结构的一种方法。化学吸附( 或称不可逆吸附) 是制备 单分子层修饰电极的一种很简便的古老方法。一般而言，只要碳电极表面用氧等 离子体处理过，再把它浸入伯胺或仲胺的溶液中，就能在短时间内得到具有强吸 附能力的化学修饰电极。例如许多二茂铁乙二胺类均能牢固地吸附在石墨电极表 面【8 】。 2 3 2 聚合物薄膜法 多分子层修饰电极中以聚合物薄膜的研究最为广泛。与单分子层修饰电极相 比，多分子层具有三维空间结构，可以提供许多势场，且其活性基浓度高、响应 信号大，具有较好的化学、机械和电化学的稳定性。 浙江大学硕士学位论文 聚合物薄膜电极的制备根据所用初始试剂不同而分为从聚合物出发制备和 从单体出发制备两大类。 2 3 2 。1 从聚合物出发制备 蘸涂法是将基底电极浸入到聚合物的稀溶液中，足够时间后靠吸附作用自然 地形成薄膜。用此法形成的膜量当电极从溶液中移出时会增加，通常要甩掉其表 面上多余的溶液，并使之干燥。 滴涂法是取数微升的聚合物稀溶液，滴加到电极表面，使其挥发后成膜。此 法的主要优点是能通过原始聚合物的浓度和滴加体积得到聚合物薄膜在电极上 的覆盖量。用此法得到的聚合物膜表面较为粗糙，若在含有该溶剂的饱和蒸气中 慢慢干燥，会有显著改善。 旋涂法是用微量注射器取少量聚合物稀溶液，滴加到正在旋转的圆盘电极的 中心处。过多的溶液被抛出电极表面，剩下的溶液在电极表面干燥成膜，这样得 到的膜较均匀。 控制实验条件可以得到很好的重复性。这些方法在氧化还原型和离子交换型 聚合物薄膜电极的制备方面广为应用。 氧化、还原电化学沉积法是基于聚合物的溶解度随氧化( 或离子化) 状态而 变化，当聚合物膜被氧化或还原到其难溶状态时，则在电极表面形成聚合物薄膜。 此过程往往是不可逆的【8 】。 2 3 - 2 _ 2 从单体出发制备 1 电化学聚合 有机物的电极反应中常伴随着活泼的自由基离子( 阳离子和阴离子) 中间体 产生，后者可以作为聚合反应的引发荆。含胺基和羟基的芳环单体经电氧化反应 后可生成非导电聚合物膜。当单体中含有氧化还原对时，经电聚合在电极表面生 成的膜具有电化学活性。如二茂铁衍生物在玻碳电极上进行电氧化，该过程中产 生自由基，自由基头尾结合形成聚合物。 1 0 浙江大学硕士学位论文 2 导电聚合物薄膜的制备 导电聚合物的电化学制各方法一般是将聚合物单体和支持电解质溶液加入 到电解池中，用恒电流、恒电位或循环伏安法控制反应，使之生成导电性聚合物。 在聚合过程中伴随着阴离子的掺杂效应，其中恒电流法应用很广，易于控制聚合 物膜的厚度，重复性较好，且不一定需用参比电极；而恒电位法则不能控制电聚 合速度，重复性不易控制，并且反应需要在三电极系统中进行；用循环电位扫描 法也能获得好的效果。所用电极材料很广，其中以铂和玻碳最好，前者易加工和 进行前处理，后者的电位窗较宽，容易形成与电极基底接着好的聚合物薄膜【8 】。 2 3 3 化学修饰碳糊电极 各种各样的碳糊电极被用来制造生物传感器，碳糊电极的优点在于具有低背 景电流，可一次性使用，制造成本低廉等。碳糊是由石墨粉和不溶于水的有机粘 合剂组成。化学修饰碳糊电极是在碳糊电极的基础上发展起来的，是由碳糊电极 表面固定了化学修饰剂而组成。 直接混合法将化学物质、碳粉和粘液三者适量混合。此法的关键在于如 何得到均匀的碳糊，使修饰于碳粉表面的活性组分得以均匀分布。制备过程常用 超声振荡分散碳粉和修饰剂。 溶解法将化学修饰成分直接溶解在粘液中，再加入碳粉混合制各。这种 方法只限于亲脂性很强的修饰剂，必要时可以加热促溶。 2 4 电子转移介质 一般的酶都是生物大分子，其氧化还原活性中心被包埋在酶蛋白质分子里 面，它与电极表面间的直接电子传递难以进行，即使直接电子传递能够进行，电 子传递速率液很慢，这是因为分子( 氧化还原中心) 与电极表面间的电子传递速 率随两者间距离的增加呈指数衰减。对蛋白质分子而言，当电子给予体与电子接 受体之间的距离从8 a 增加到1 0 a 时，电子传递速率衰减到原值的1 1 0 0 | 0 0 。如 果引入电子转移介质就能克服这一缺点。 电子转移介质能有效地增强电极响应，应用很广。虽然直接电子转移可能是 增强酶传感器响应的最好手段，但迄今为止远未达到其潜在在能力4 1 。 1 l 浙江大学硕士学位论文 ：疋疋a 执。钟 a n 口l v p o d 能l。讶 r 7 一i c # 口：= 图2 - l 含电子转移介质和无电子转移介质的传感器【4 】 以葡萄糖为例，第一代生物传感器是依赖于溶解在溶液中的氧浓度的。 溶液：g o d “+ g l u c o s e - g l u n o l a c t o m + g o d 删 g o d 柏d + 0 2 _ g o d 0 x + h 2 0 2 电极：h ，o ，一o ，+ 2 h + + 2 e 为了解决第一代生物传感器对氧浓度的依赖问题，出现了应用人工电子受体 ( 具有低氧化电位) 的第二代生物传感器。它需要两步反应，酶参与了与底物的 第一个氧化还原反应，然后被电子转移介质重新氧化，最后，电子转移介质被电 极氧化 4 。 溶液：g o d 仳+ g l u c 0 呻g l u c o n o l a c t 0 c + g o d 瑚 g o d 捌+ m 。；g o d 靠+ m 同 电极：m 一m 。，+ n c 运用电子转移介质的优点： 1 ) 对氧浓度的依赖性减少 2 ) 酶电极的工作电位由电子转移介质的氧化电位决定 3 ) 运用电子转移介质，在低氧化电压条件下，可以排除一些干扰物质 4 ) 如果被还原的电子转移介质的氧化不包含质子，酶电极对p h 相对不敏 感 优良的电子转移介质应具备如下性质【8 】： 1 ) 可与酶的氧化还原辅基快速反应 2 ) 能吸附或滞留在电极表面 3 ) 呈现可逆的电极反应动力学 浙江大学硕士学位论文 4 1 具有较低的氧化还原电位，并与p h 无关 5 1 氧化和还原形式能稳定存在 对氧惰性或非反应活性 7 、应是无毒性的 可采用的电子转移介质有很多种，最早使用的电子转移介质是铁氰化物和 醌，后来二茂铁及其衍生物的应用也很普遍。由于二茂铁是疏水性的，应用于含 水体系时可以避免从电极表面脱落，而且二茂铁具有良好的化学可逆性，可以通 过改变其结构来调节其氧化还原电位。 有机染料如亚甲基蓝，甲基紫罗兰，茜素黄，普鲁士蓝，劳式紫，天青a 和 c ，甲苯胺蓝：无机氧化还原离子如铁氰化物都被应用于大量的生物传感器。 这种依靠电子转移介质实现电子传递的酶电极的寿命除了与酶本身的寿命 有关外，还在很大程度上取决于电子转移介质在电极表面的稳定性。电子转移介 质可以通过多种方式滞留于电极表面，迄今为止，最普遍采用的技术仍然是溶剂 挥发，由于很多电转移介质是疏永性的，常需要采用有机溶剂。 2 5 丝网印刷碳糊电极 2 5 1 丝网刷技术 现代丝网印刷的发展起源于美国。从丝网印刷的先驱哈瑞莱瑞海特( h a r r v k m yh i e t t ) 和爱德华欧文斯d w a r d a o w c n s ) 算起，丝网印刷早在2 0 世纪初期 ( 1 9 0 1 1 9 0 6 ) 就已经开始了【9 】。 近年来，化学传感器迅速发展，电化学传感器尤其受到关注，其在生物医学、 环境领域中的应用拓展需要一种更为简单的电极制作技术，能实现批量生产、化 学性能优异、重复性好、灵敏度优，廉价可次性使用，以便于解决连续监测中 难以维持的响应稳定性和长期重现性及在线、在体分析中不可避免的污染和腐蚀 等问题。 丝网印刷技术常用来制作电化学传感器的换能元件，是目前制备一次性使用 电化学传感器电极的主要方法【1 0 】。丝网印刷以丝网印版作模具，所制作传感器 电极的大小和形状可以改变，易于实现微型化和集成化。 浙江大学硕士学位论文 丝网印刷是把带有图像或图案的模版附着在丝网上进行印刷的。它的基本原 理是，丝网印版图像部分的网孔能够透过油墨漏印至承印物上；印版上其余部分 网孔堵死不能透过油墨，在承印物上形成空白。通常丝网由尼龙、聚酯、丝绸或 金属网制作而成。当承印物直接放在带有模版的丝网下面时，丝网印刷油墨或涂 料在刮墨刀的挤压下穿过丝网中间的网孔，印剥到承印物上( 刹墨刀有手动和自 动两种) 。丝网上的模版把一部分丝网小孔封住使得颜料不能穿过丝网，而只有 图像部分能穿过，因此在承印物上只有图像部位有印迹。丝网印刷技术实际上是 利用油墨渗透过印版而实现印刷的。 丝网印刷工艺中最关键的环节就是印版的制各。传统的制版方法多为手工镂 空制版，现代较普遍使用的是光化学制版法( 感光制版法) 。这种制版方法以丝 网为支撑体，将丝网绷紧在网框上，然后在丝网上涂布感光胶，形成感光膜，再 将底版密合在感光膜上，经曝光，显影，印版上需要通过油墨的图像部分的网孔 设定不封闭，印刷时能透过油墨在承印物上形成图案。丝网印刷的工艺大致如图 2 2 所示； 图2 _ 2 丝网印刷工艺流程【9 】 图中，原稿是要制作的传感器试条的图形，底版是丝网印刷的阳图案，一般 将原稿刻绘在胶片上得到晒版用的底版。 丝网是制作网版的骨架，是支撑感光胶或感光膜的基体。要得到好的丝网印 刷质量，丝网的选取非常重要。这与印刷的要求、印刷质量、模版或中间媒介的 类型、印刷的细节多少和承印物表面情况都有关系。但不管是哪种丝网材料，都 必须具有一定的弹性及强度，能经得住来回拉扯而不致于被撕破，还须具有清晰 可见的网纹，其中网目和开孔必须大小一致，丝网线不能有跑线的情况，油墨通 过性要好，丝网必须抗颜料、油墨、溶剂的腐蚀，耐清洗、耐拉扯、抗橡胶、适 应印刷中所需的其他条件。总之，丝网的条件要求是非常苛刻的。在国外，丝网 用的材料主要有丝绸 净 、“ p o l ，j l 【n 0 k 辩 p a 睁 p p 明y k n t 一d ，1 k n p h 竹 图3 - i 各种导电聚合物【1 6 】 近年来采用有机导电聚合物制作电流式生物传感器得到了广泛关注。在工作 电极上直接制作导电聚合物能包埋各种生化反应所需要的生物组分( 如酶、抗体) 于电极表面的聚合物结构中，直接一步制备生物传感器【1 7 】。它们的电特性能保 证生物组分和电极之间的电子传递，从而产生一系列的信号用于分析。通过电化 学聚合反应也能形成多层聚合物结构，包埋多种生物分子。另外，由于导电聚合 物对一定大小的分子具有抑制作用，可以排除一些干扰物质。 导电聚合物作为分子导线，其三维立体导电结构可使电子在生物分子的活性 中心与电极表面之间实现直接传递，显著提高生物传感器的响应特性。通过控制 聚合膜的厚度、生物分子在膜中的空间分布、聚合膜的空隙度等指标可以调整生 物传感器的响应特性和选择性。 导电聚合物生物传感器一般由三部分组成：支持电极( 提供机械结构及传导电 信号) ，导电聚合膜( 作为固定化载体及分子导电器件) ，以及生物活性物质( 与待 2 0 丝 浙江大学硕士学位论文 测物发生特异性反应或专一识别) 。组成和工作原理如图3 2 所示【1 8 】。 待溷i 物 f f 敏感物 导电聚台物膜7 惰性电投 图3 2 导电聚合物生物传感器工作原理示意图 构建的关键是如何将生物活性物质有效地固定在导电聚合膜上，且最大限度 地保持其生物活性，形成可长期反复作用的生物识别固态元件。 3 3 2 电聚合固定化酶原理 虽然可通过许多方法合成导电聚合物，但因电聚合方法操作简单，过程易于 控制，因而被普遍采用。在聚合过程中，生物活性物质可与聚合单体同时聚合到 电极表面，形成生物识别固态元件。通过有效地控制电聚合过程，生物活性物质 可固定到各种类型的电极或者电极的特定部位。也可将两种或多种酶等生物活性 物质同时固定于同一层聚合膜或分别固定于多层聚合膜上。 引 呤 冈h 畛 引 妣玲 学 1化二 =理l |娄 浙江大学硕士学位论文 图3 3 电聚合固定化酶( a ) 为电聚合之前( b ) 为电聚合过程【1 9 】 电聚合固定化酶可以通过不同的途径来实现【2 0 】： 1 静电吸附作用 当聚合液的p h 值高于酶的等电点时，酶分子带负电荷，能与氧化态导电聚 合物的聚阳离子基团之间产生静电吸附作用，从而被固定。该过程中被固定化的 酶量较少，因为静电吸附作用仅仅局限于单层聚合物表面，而被固定化的酶量的 多少会极大地影响传感器的响应，因而仅用这种机制实现酶的固定化所得到的传 感器响应并不大。 2 电化学掺杂 这种机制的实现同样必须基于酶分子带负电荷这一前提条件。电化学掺杂是 依赖于导电聚合物氧化态和还原态之间的转换过程，伴随着离子运动和聚合物离 子交换特性实现的。在电聚合过程中，聚毗咯被氧化，氧化态聚吡咯膜的正电荷 通常呈分散分布，而酶分子在一定酸碱度的缓冲液中带负电( 缓冲溶液的p h 值 大于酶的等电点时) ，这就使得酶分子能以离子键与聚毗咯结合，以保持聚合物 链的电中性。因此，在聚合液中加入酶等生物活性分子，随着聚吡咯膜的形成， 生物活性分子能以离子键与聚吡咯结合，同时也可被周围的聚合物链缠结包埋， 从而被固定。聚吡咯固定生物活性分子的聚厶固定过程可用下列方程描述【2 0 】： 其中a 一为带负电荷的生物活性掺杂物质。 电聚合方法固定化酶的优点如下【1 6 ，2 0 ，2 1 】： ( 1 ) 制备方法简单 ( 2 ) 聚合物膜的厚度可控 r e d t = 主 ( ) i l d 北 r+ x 、 a 广，f，l 浙江大学硕士学位论文 ( 3 ) 被固定化的酶量可控 ( 4 ) 在中性溶液中聚合可以防止蛋白质的变性 ( 5 ) 可以通过聚合物膜的孔径大小手中制干扰物质 ( 6 ) 有利于生物传感器的微型化，工艺上与新型电极材料结合也利于实现 大批量生产。 缺点如下： ( 1 ) 在电聚合过程中需要高浓度的酶和聚合物单体【1 6 】。 ( 2 ) 酶分子的尺寸大小和表面电荷强弱会影响固定化结果。 ( 3 ) 导电聚毗咯的过氧化会导致聚吡咯导电性的退化。 3 3 3 电聚合固定化酶方法 通过导电聚合物固定活性物质主要有两大类方法：直接聚合一沉积法f 一步 法) ，另一是聚合一再沉积法( 二步法) 。聚合所使用的电解池通常为三电极体系： 工作电极，辅助电极，参比电极。聚合装置如图3 4 。 毫似学分析使 图3 4 电聚合装置【2 2 】 3 3 3 1 直接聚合一沉积法 直接聚合一沉积法是在聚合前，将活性物质与单体，支持电解质混合，在电 聚合反应生成导电聚合物的同时，活性物质被包埋到聚合物膜中。f 0 u j d s 和 a i z a w a 等分别采用这种法制得了聚毗咯和聚苯胺葡萄糖传感器。这种聚合方法 通常有三种控制模式：恒电位聚合法，恒电流聚合法，扫描电位聚合法【2 2 】。 新江大学硕士学位论文 1 恒电位聚合法 恒电位聚合法在电化学生物传感器的制作中使用非常广泛。它是指在电聚合 过程中维持工作电极的电位始终保持一恒定值。一般制备聚苯胺生物传感器的电 位控制在0 6 5 v ( v ss c e 饱和甘汞电极) ，制备聚毗咯生物传感器的电位控制在 o 9 0 v ( v ss c 目。由于聚合过程中保持电位不变，所以聚合物的导电状态不会发生 改变，从而使得带负电荷的酶的掺杂和吸附作用一直进行。 在电聚合过程中，可以用库仑计控制通过的电量。从而控制膜的厚度。这样 制得的生物传感器的重复性将大大改善。 在这种方法中，影响膜质量的主要因素有聚合电位和单体浓度。 2 恒电流聚合法 恒电流聚合法是指在电聚合过程中维持聚合电流恒定。只要聚合电流保持恒 定，聚合物的生成的速率就是恒定的。膜的厚度可方