（发酵工程专业论文）α乙酰乳酸脱羧酶固定化及其应用的研究.pdf

摘要 摘要 双乙酰是啤酒发酵的副产物，当其含量超过阈值o 1 5m g l 时，会使啤酒产生不愉 快的馊饭味。传统的啤酒酿造，主要是采用低温后贮的方法来降低双乙酰的含量，而这 一过程通常需要3 - - 一6 周时间。0 【乙酰乳酸脱羧酶( 0 【a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e ，e c 4 1 1 5 ， 简称为a l d c ) 可以直接将0 【乙酰乳酸脱羧为乙偶姻而不经过双乙酰这一步骤，因而可 以快速降低双乙酰含量，加速啤酒的成熟。 本文以工业树脂为载体对a l d c 进行固定化研究，通过单因素和正交试验确定了固 定化a l d c 的最优条件，研究了固定化酶和游离酶的基本酶学性质。并将固定化酶应用 于啤酒的连续发酵试验中，探索了固定化酶填充量、发酵温度和保留时间对发酵液中双 乙酰降低率的影响。主要结果如下： ( 1 ) 选用工业上广泛应用的7 种树脂为载体，采用吸附法固定化a l d c ，确定了 d 3 1 4 f d 为最佳固定载体。 ( 2 ) 研究加酶量、吸附时间、吸附温度和吸附p h 等因素对固定化酶活力和效率的 影响，得出固定化最优条件为：加酶量为6 2 5m l 酶液g 载体，吸附时间为1 0h ，吸附 温度为1 5 ，吸附p h 为7 5 。在此条件下，固定化效率可达4 4 。 ( 3 ) 对固定化a l d c 和游离酶a l d c 的酶学性质进行研究，结果为：固定化酶最适 作用温度为4 0 ，游离酶的最适作用温度为3 5 ；固定化酶的最适作用p h 为5 5 ，游 离酶的最适作用p h 为6 0 。与游离酶相比，固定化酶有较高的热稳定性、更宽泛的酸碱 稳定性和更好的重复使用性。 ( 4 ) 固定化a l d c 应用于啤酒连续发酵实验，结果表明：在柱体积为1 2 0m l 的玻 璃反应柱中，固定化酶的填充量为4 5g ，反应温度为1 1 ，保留时间为1 4h ，此条件 下双乙酰的降低率最高，可达4 3 5 ，此时流出反应柱的发酵液中双乙酰的含量为0 0 9 5 m g l 。系统连续运行3 0d 后，双乙酰降低率维持在3 3 ，说明该固定化酶具有较好的 连续操作稳定性。 关键词：0 【乙酰乳酸脱羧酶；双乙酰：固定化；树脂；啤酒 a b s t r a c t a b s t r a c t d i a c e t y li sab y p r o d u c to fb e e rf e r m e n t a t i o n w h e ni l sc o n c e n t r a t i o ni sh i g h e rt h a n0 15 m e a , ，i tw i l lr e s u l ti nav e r yu n p l e a s a n tt a s t e ，l i k es o u l f o i o dt a s t e i nt r a d i t i o n a lb r e w i n g ， g r e e nb e e rn e e d st h r e et os i xw e e k ss t o r a g ea tl o wt e m p e ：r a t u r et or e d u c et h ec o n t e n to f d i a c e t y l a l p h a a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e ( e c 4 1 1 5 ，a l d c ) c o u l dq u i c k l yt r a n s f e rt h e 0 【a c e t o l a c t a t et ot h ea c e t o i n ，a n da c c e l e r a t et h eb e e rt om a t u r e i nt h i sa r t i c l e i m m o b i l i z a t i o no fa l d cb yi n d u s t r i a lr e s i n sw a ss t u d i e d t h eo p t i m a l c o n d i t i o n so fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o nw e r em a i n l yi n v e s t i g a t e db yt h es i n g l ef a c t o ra n dt h e o a h o g o n a le x p e r i m e n t s t h eb a s i ce n z y m a t i cp r o p e r t i e s o fi m m o b i l i z e da l d ca n df r e e e n z y m ew e r er e s e a r c h e d i m m o b i l i z e da l d c w a su s e di nc o n t i n u o u sb e e rf e r m e n t a t i o n t h e e f f e c t so ff i l l i n ga m o u n to fi m m o b i l i z e de n z y m e ，f e r m e n m t i o nt e m p e r a t u r ea n dr e t e n t i o nt i m e o nt h er e d u c i n gr a t eo fd i a c e t y lw e r es t u d i e d m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ( 1 ) t h r o u g hp r i m a r i l yr e s e a r c h e so ns e v e nk i n d so fr e s i n s ，t h ei m m o b i l i z e de n z y m ew a s p r e p a r e db ya b s o r p t i o nw i t hac a r r i e ro fd 3 14 f d ( 2 ) t h ee f f e c t so ft h ea m o u n to fa l d c ，a d s o r p t i o nt i m e ，a d s o r p t i o nt e m p e r a t u r ea n dp h o nt h ea c t i v i t ya n de f f i c i e n c yo fi m m o b i l i z e de n z y m ew e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a l c o n d i t i o n sf o rt h ei m m o b i l i z a t i o nw e r ea sf o l l o w s ，6 2 5m ll i q u i da l d cw a sa d d e di n t oo n e g r a mo fp r e t r e a t e dr e s i n ，s t i r r e df o r1 0h o u r sa t1 5 i nb u f f e ro fp h7 5 u n d e rt h eo p t i m a l c o n d i t i o n s t h ei m m o b i l i z a t i o ne f f i c i e n c yc o u l dr e a c ht o4 4 ( 3 ) c o m p a r e dw i t hf r e ea l d c ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so fi m m o b i l i z e de n z y m ew e r ea s f o l l o w s t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s4 0 w h e r e a st h ef r e ee n z y m ew a s3 5 t l l e o p t i m u mp hw a s5 5w h e r e a st h ef l e ee n z y m ew a s6 0 c o m p a r e dw i t ht h ef r e ee n z y m e ， i m m o b i l i z e da l d ch a sh i g h e rt h e r m a l s t a b i l i t y , b r o a d e rp hs t a b i l i t ya n db e t t e rr e u s a b i l i t y ( 4 ) i m m o b i l i z e da l d cw a su s e di nc o n t i n u o u sb e e rf e r m e n t a t i o n t l l er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ef i l l i n ga m o u n to fi m m o b i l i z e de n z y m ew a s4 5gi nt h ev o l u m eo f12 0m lg l a s s c o l u m n t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s1 l ，t h er e t e n t i o nt i m ew a s14h u n d e rt h i so p t i m a l c o n d i t i o n t h er e d u c i n gr a t eo fd i a c e t y lc o u l dr e a c ht o4 3 5 ，a n dt h ec o n t e n to fd i a c e t y li s 0 0 9 5m g l n ea v e r a g er e d u c i n gr a t eo fd i a c e t y lw a s3 3 a f t e r3 0d a y sc o n t i n u o u s o p e r a t i o n i ti n d i c a t e dt h a tt h ei m m o b i l i z e de n z y m eh a dg o o do p e r a t i o ns t a b i l i t y k e yw o r d s ：0 【a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e ；d i a c e t y l ；i m m o b i l i z a t i o n ；r e s i n ；b e e r h 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章绪论1 1 10 【乙酰乳酸脱羧酶的应用1 1 1 1 双乙酰与啤酒发酵的关系1 1 1 2 双乙酰的形成机制l 1 1 3 降低双乙酰，加快啤酒成熟的主要措施2 1 2c 【乙酰乳酸脱羧酶概述3 1 3 固定化酶技术的研究4 1 3 1 概述4 1 3 2 固定化酶的制备原则5 l - 3 3 固定化载体材料的选择原则5 1 4a l d c 的固定化研究进展6 1 4 1 壳聚糖在a l d c 固定化中的应用6 1 4 2 无机吸附剂类载体在a l d c 固定化中的应用6 1 4 3 复合载体材料在a l d c 固定化中的应用一7 1 4 4a l d c 固定化研究的不足7 1 5 立题背景和意义8 1 6 本课题的研究目的和主要内容8 第二章材料与方法1 1 2 1 材料1 l 2 1 1 主要原料1 1 2 1 2 主要试剂1 l 2 1 3 主要仪器1 1 2 1 4 主要试剂的配制1 2 2 2 实验方法1 2 2 2 1 树脂的预处理1 2 2 2 2 固定化a l d c 的制备l3 2 2 3 固定化载体的选择13 2 2 4 扫描电镜检测。1 3 、2 2 5a l d c 固定化工艺条件的研究：1 3 2 2 6 固定化a l d c 和游离a l d c 酶学性质的研究1 3 2 2 7 麦汁制备和发酵工艺1 4 2 2 8 固定化a l d c 啤酒连续发酵系统1 5 2 3 分析方法l5 目 录 2 3 1 酶活的测定1 5 2 3 2 计算公式1 6 2 3 3 发酵液相关理化指标的测定方法1 6 第三章结果与讨论1 7 3 1a l d c 的固定化1 7 3 1 1 固定化载体的选择1 7 3 1 2 固定化前后树脂超微结构的观测1 7 3 1 3 单因素试验研究反应条件对a l d c 固定化的影响1 8 3 1 4 正交试验确定a l d c 固定化的最佳条件2 1 3 1 5 小结2 2 3 2 固定化a l d c 和游离a l d c 酶学性质的研究2 3 3 2 1 固定化a l d c 和游离a l d c 的最适作用温度2 3 3 2 2 固定化a l d c 和游离a l d c 的最适作用p h 2 4 3 2 3 固定化a l d c 和游离a l d c 的热稳定性2 4 3 2 4 固定化a l d c 和游离a l d c 的p h 稳定性2 6 3 2 5 固定化a l d c 和游离a l d c 米氏常数k m 的测定2 6 3 2 6 固定化a l d c 的分批重复使用稳定性2 7 3 2 7 固定化a l d c 的贮存方式2 8 3 2 8 固定化a l d c 的贮存稳定性2 8 3 2 9 j 、结2 8 3 3 固定化a l d c 酿造啤酒工艺条件的初步研究2 9 3 3 1 后贮时间对固定化a l d c 酿造啤酒的影响2 9 3 3 2 保留时间对固定化a l d c 酿造啤酒的影响3 0 3 3 3 固定化a l d c 酿造啤酒工艺条件的确定3 0 3 3 4 固定化a l d c 的连续操作稳定性3 4 3 3 5 主要理化指标比较3 5 3 3 6 ，j 、结3 5 第四章结论与展望3 7 4 1 主要结论3 7 4 2 展望3 7 致谢3 9 参考文献4 1 作者在攻读硕士学位期间发表的论文4 5 第一章绪论 第一章绪论 双乙酰是啤酒发酵过程中必然产生的不良风味物质，它直接影响了啤酒的风味成 熟，是衡量啤酒成熟与否的决定性指标，它在啤酒中的含量是应该严格控制的。现行的 啤酒发酵工艺有多种控制双乙酰含量的方法，其中利用a 一乙酰乳酸脱羧酶( 0 【a c e t o l a c t a t e d e c a r b o x y l a s c ，e c 4 1 1 5 ，简称为a l d c ) 可以快速降解双乙酰的前驱物质叫乙酰乳 酸。目前，向发酵液中直接添加a l d c 酶制剂，是较为方便有效的降低双乙酰含量的措 施【1 】o 1 1a 乙酰乳酸脱羧酶的应用 a l d c 主要应用于啤酒酿造工业中。主要是用来防止双乙酰的形成。也可以用于葡 萄汁发酵生产葡萄酒时控制双乙酰的含量。此外还可用于酒精生产行业，双乙酰在工业 酒精生产中也是有害的，特别是在制造无水乙醇时，用苯共沸法使乙醇脱水，双乙酰会 在苯中积累，给苯的回收带来困难，因此也必须设法除去【2 j 。 1 1 1 双乙酰与啤酒发酵的关系 传统的啤酒酿造主要可分为两个阶段：主发酵和后发酵包括贮酒。主发酵阶段，主 要是酵母利用麦芽汁中的糖类生成酒精、二氧化碳以及一些风味物质，这一过程一般需 要8 1 0d 时间。后发酵及贮酒阶段则主要是将嫩啤酒放于低温下贮藏3 6 周，使二氧 化碳达到饱和，冷凝固物及酒花树脂等在低温低p h 值的条件下缓慢沉淀，除去不溶物 质，得到澄清啤酒，并促进啤酒风味的成熟。可见，啤酒的后发酵及贮酒阶段在啤酒的 整个酿造工序中所占的生产周期是最长的，是啤酒酿造过程中的时间限制因子【3 】。随着 科学技术的发展，人们已经认识到，啤酒成熟的关键在于啤酒风味物质的成熟，啤酒的 风味物质主要有醇类、挥发酯类、醛类、酮类、硫化物、双乙酰等，它们的来源主要是 由啤酒的原料大麦麦芽及其它谷物辅料、酒花在酵母的发酵作用下产生的。其中，以 双乙酰对风味成熟的影响最为重要。 双乙酰可赋予啤酒特殊的风味，它的含量直接影响了啤酒的风味成熟，是衡量啤酒 成熟与否的决定性指标 4 1 。在成品啤酒中，若双乙酰含量超过其味阈值( o 1 5m g l ) 时， 会导致啤酒口味不纯、有甜味直至馊饭味，甚至奶油味。因此，将啤酒中双乙酰含量降 至其味阈值以下，被普遍认为是啤酒成熟的主要目标。另外，双乙酰的控制标准随不同 啤酒类型稍有不同。 1 1 2 双乙酰的形成机制 目前，在啤酒发酵过程中，已知的形成双乙酰的途径有以下3 种可能。 ( 1 ) 酵母代谢过程中q 乙酰乳酸非酶氧化脱羧形成双乙酰 江南大学硕士学位论文 图1 1 双乙酰形成机制 f i g 1 - 1t h em e c h a n i s mo f d i a c e t y lf o r m a t i o n 在啤酒发酵过程中，a 乙酰乳酸是酵母缬氨酸代谢途径中的中间产物，在由c 【酮酸 合成缬氨酸的过程中，其中一部分的a 乙酰乳酸会泄漏到酵母细胞外，进行非酶氧化脱 酸反应形成双乙酰，而后双乙酰又被酵母吸收，在细胞内通过双乙酰还原酶和乙醇脱氢 酶还原为乙偶姻，并进一步还原为2 ，3 丁二醇，排出酵母细胞外【5 1 。由于乙偶姻和2 ，3 丁 二醇的味阈值比较高，因而对啤酒风味的影响比双乙酰小的多。在双乙酰还原过程中， 由a 乙酰乳酸经非酶氧化脱羧生成双乙酰的速度比双乙酰的酶促还原速度慢的多，后者 的反应速度约为前者的1 0 倍。这就要求在啤酒酿造中，需要有足够长的后熟期，使缓慢 形成的双乙酰全部还原。若能加快q 乙酰乳酸的非酶氧化分解速度，即可加速发酵液中 双乙酰的成熟，缩短啤酒的酿造周期。 ( 2 ) 由活性乙醛形成双乙酰1 6 j 乙酰辅酶a 与羟乙基硫胺素的焦磷酸盐( 又称为活性乙醛) 直接缩合，进一步放出辅 酶a 而生成双乙酰。 ( 3 ) 污染了可以产双乙酰的杂菌，主要是链球菌。 在以上形成双乙酰的3 种途径中，第1 种途径产生的双乙酰数量是最多的，同时也是 双乙酰形成和降解的最主要途径。 此外，虽然有时啤酒发酵结束时，双乙酰的含量并不高，但其中还是会有大量的a 一 乙酰乳酸存在，如果不能将其尽可能多的转化为双乙酰进而被酵母还原，从而带入至成 品啤酒中，那么在随后的啤酒过滤、灌装、杀菌以及贮存过程中，则可能会有更多的a 一 乙酰乳酸转化为双乙酰，造成双乙酰含量的后期反弹【_ 刀。 1 1 3 降低双乙酰，加快啤酒成熟的主要措施 在啤酒酿造业，控制双乙酰含量的方法有很多，主要是从啤酒的生产工艺、菌种改 造等方面进行研究。 ( 1 ) 优化发酵工艺 主要是从麦汁a 氨基氮水平，酵母接种量和发酵温度这三方面进行控制。 因为作为双乙酰形成的前驱物质刮一乙酰乳酸，是酵母缬氨酸代谢途径中的副产 物，而i f , 乙酰乳酸的形成同时也会受到缬氨酸的反馈抑制作用。当提高麦汁中a 氨基氮 水平时，也就相应地提高了麦汁中缬氨酸的含量，此时缬氨酸通过对乙酰羟基丁酸合成 2 兰= 皇丝笙 酶的抑制反馈作用，可减少q 乙酰乳酸的合成和积累，因而相应地也就降低了a 乙酰乳 酸分解为双乙酰的支路代谢，从而减少双乙酰的生成量。一般情况下，麦汁中a 氨基氮 含量以控制在( 1 8 0 - j ：2 0 ) m g l 为宜，辅料的用量需要根据麦芽的具体情况而定【引。 适当的提高主发酵的酵母接种量和发酵温度，可以有效的降低双乙酰的含量。因为 双乙酰的前驱物质和其他一些酵母代谢副产物( 高级醇、酯类等) 大都是在酵母繁殖过程 中产生，如果降低酵母接种温度( 5 7 ) ，加大酵母接种量 ( 1 5 1 8 ) 1 0 6 细胞l i 叫， 主发酵前期采用低温( 9 1 0 ) 发酵，以降低酵母的增殖率，可以减少n 乙酰乳酸和一 些挥发性风味物质的形成。当主发酵外观发酵度达到6 5 左右时，酵母的一些挥发性风 味物质已基本形成，此时提高主发酵后期双乙酰的还原温度( 1 2 - - 1 3 ) ，并推迟升压时 间( 外观发酵度达7 0 以上) ，避免酵母过早沉降，保持双乙酰还原阶段发酵液中有一定 的酵母密度。之后再逐步降温至0 - - 1 。采用这样的工艺，既有利于缩短主发酵期和后 发酵期，挥发性高级醇和酯类含量也不会增加，又可加速双乙酰的还原，降低酒液中双 乙酰的含量，加速啤酒的成熟。 ( 2 ) 添加a 乙酰乳酸脱羧酶 从上述双乙酰的形成机制可知，若能降低发酵液中0 l 乙酰乳酸的含量，即可有效降 低发酵液中双乙酰的含量。正如前面所介绍的a l d c 就可以起到这样的作用。但可惜的 是，酵母本身并不具有编码0 【乙酰乳酸脱羧酶的基因。而此酶在很多细菌，如芽孢杆菌、 产气肠杆菌中却普遍存在。因此，只能依靠酶工程技术，从含有该酶的菌种中提取此酶； 或者是采取基因重组技术，将a l d c 基因导入酵母中并使其表达，从而达到降低双乙酰 含量的目的。 ( 3 ) 低双乙酰酵母菌株的选育 曾有人试图通过筛选双乙酰抗性菌株来选育不产或少产双乙酰的酵母菌株，但结果 并不理想【9 j 。目前，主要是采用诱变、变异和基因工程的手段，选育形成0 t 乙酰乳酸峰 值低的酵母菌株，也就是说选育a 乙酰羟基丁酸合成酶活力低的菌株，以减少双乙酰前 驱物质的积累。 g o o s s e n s g j e j k 1 0 j 将乙酰羟酸同分异构还原酶基因( i l v 5 ) 整合到啤酒酵母染色体上， 构建成啤酒酵母工程菌。发酵实验结果表明：双乙酰含量降低了5 0 ，啤酒风味没有明 显的变化。但是，在构建此工程菌时，必须注意的是在啤酒酵母染色体上至少必须要保 留一个乙酰羟基合成酶基因，否则容易造成酵母本身异亮氨酸和缬氨酸合成的缺陷，影 响酵母自身的正常生长，对发酵造成不良后果。 1 2 仅乙酰乳酸脱羧酶概述 0 【乙酰乳酸脱羧酶，分子量约为3 3k d a ，它可以直接将双乙酰前驱物质叫乙酰 乳酸脱羧为乙偶姻，而不经形成双乙酰这一步骤，因而可以大大降解酒液中残留的d 乙 酰乳酸，快速降低其中双乙酰的含量，加速啤酒的成熟，有效地缩短啤酒的生产周期， 提高啤酒质量，保持啤酒在贮存过程中的质量稳定，避免发生双乙酰回升现象【1 1 】。同时 因该反应的终产物没有发生改变，因而对啤酒风味没有影响。a l d c 的作用机理如下图 江南大学硕士学位论文 丙酮酸 ； 洳乙酰乳 ： 非酶促氧化脱羧； ( 慢) 双乙酰 ( 3 掘基丁酮) 一- 2 , 3 丁二醇 图1 - 2a - 乙酰乳酸脱羧酶的作用机理 f i g 1 - 2t h e m e c h a n i s mo fa - a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e 1 9 5 2 年，j u n i t b l 首次从产气肠杆菌( a e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) 分离得至0 a l d c 。1 9 7 2 年 由l o k e n 和s t o r m e r 1 4 d 7 】从该产气肠杆菌中分离纯化得至u a l d c ，并对其酶学性质进行了 广泛的研究。之后，不同来源的a l d c 先后被分离、纯化，其物理化学及酶学性质也得 到了比较详细的研究1 引。1 9 8 2 年，g o d t f r e d s e n 等【1 9 ，2 0 】于艮道用a l d c 可加速啤酒的熟化过 程，在新酿制的啤酒中加入该酶制剂，1 0 保温2 4h 后，双乙酰含量达到阈值以下，同 时啤酒的主要理化指标和感官性质与常规熟化三周的啤酒相同，大大缩短了啤酒的发酵 周期，展示了a l d c 在啤酒工业上诱人的应用前景，促进了a l d c 的进一步研究和在生 产中的应用。1 9 8 6 年，丹麦嘉士伯研究中心的p is i g s g a a r d 介绍了一种先进的发酵工艺， 该工艺是以a l d c 作为啤酒后熟助剂，在7d 后熟和发酵时间内，加酶的酒液中双乙酰含 量均明显低于阈值，并且未发现由于添加a l d c 酶制剂对酵母的发酵速率和活力有不良 影响2 1 1 。陈炜等【2 2 】从地衣芽孢杆菌中提取a l d c 用于啤酒主发酵和后发酵试验，实验结 果证明：a l d c 对降低主发酵和后发酵啤酒中的总双乙酰量( 主要为a 乙酰乳酸和双乙酰) 均有一定效果，尤其对后发酵啤酒效果尤为显著。 众多实验结果均证明：a l d c 能降低啤酒发酵过程中双乙酰的含量，缩短发酵周期， 提高设备利用率，有效提高啤酒的生产效率1 2 强引。 1 3 固定化酶技术的研究 1 3 1 概述 固定化酶的应用开始于二十世纪五十年代，最早被称为“水不溶酶 或“固相酶 。 在1 9 7 1 年的第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶 的名称，并将其定义 为：被局限在某一特定区域上的，并且保留了它们的催化活力，可以反复、连续使用的 酶。根据酶的分类，固定化酶和经过化学修饰的酶、用分子生物学方法在分子水平上改 良的酶一起属于修饰酶1 2 6 。 从上世纪六十年代起，固定化酶得到了迅速的发展，有大量关于此项技术的综述和 专著。尽管已经做了大量的研究工作，但在工业化应用的案例尚少。到目前为止，在工 业上实现规模应用的固定化酶，还仅局限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化 酶等为数不多的几个酶种。限制固定化酶产业化应用的主要原因有1 2 7 】： ( 1 ) 酶固定化的成本较高。固定化成本包括酶、载体以及所用化学试剂的费用、制 4 第一章绪论 备工艺费用及固定化效率等。在工业化生产中，酶的固定化效率低、稳定性差、连续操 作需要的设备比较复杂，大大增加酶固定化的成本，从而限制了固定化酶的工业化应用。 ( 2 ) 生物催化剂不同于常规催化剂，最显著的特点之一就是其三维构象对微环境的 敏感性及其柔顺性。一些固定化方法如吸附法，对酶分子的三维构象、柔顺性等无明显 不良影响，因而可获得较高的固定化酶活性。但由于酶三维构象的变换自由度与游离酶 相似，酶的稳定性难尽人意，固定化酶很难具有理想的操作稳定性。其它的一些固定化 方法如共价法，由于酶的三维构象及其柔顺性受到限制，常伴随酶活性的大量丧失。而 且所用的固定化载体有可能会触及到酶的活性敏感区，导致酶活力下降。因此，如何获 得具有理想三维构象柔顺性的固定化酶体系一直是生物催化剂多相反应体系难以解决 的科学问题之一。 ( 3 ) 其它方面的问题，如固定化酶寿命不长以及有些固定化酶难以与高分子底物作 用等等。 尽管如此，随着生物、信息和纳米技术的发展，以及对环境保护意识的增强，人们 还再根据传统酶固定化技术存在的问题，不断探索改进、完善和发展新的酶固定化方法。 1 3 2 固定化酶的制备原则 酶的种类十分繁多，目前可供选择的固定化方法也有很多种。一般要根据不同酶的 性质、不同的应用目的以及不同的应用环境来选择相应的固定化方法。但无论选择哪一 种方法，都要遵循以下几点要求【2 8 】： ( 1 ) 固定化应尽可能地保持自然酶的催化活性。这要求酶的固定化不应破坏酶活性 中心的结构，因此在酶的固定化过程中，要注意酶与载体的结合部位不应当是酶的活性 部位，以防止活性部位的氨基酸残基发生变化。另外，酶蛋白的高级结构是凭借氢键、 疏水键和离子键等弱键来维持的，因此固定化时应采取温和的条件，尽可能避免导致酶 蛋白高级结构的破坏。 ( 2 ) 固定化的载体应该与酶结合较为牢固，使固定化酶可回收及多次反复使用。其 次，载体不能与反应液、产物或废物发生化学反应。另外，载体必须有一定的机械强度， 否则固定化酶在连续的自动化生产中会因机械搅拌而破碎。 ( 3 ) 固定化后产生的空间位阻应该较小，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产 品的质量。 ( 4 ) 酶固定化的成本要尽可能的低，以利于工业化生产使用。 1 3 3 固定化载体材料的选择原则 可用于固定化的材料有很多，常用的载体材料包括有机载体、高分子载体和无机载 体等等。其中常用于固定化酶的高分子载体材料一般可分为两大类：天然高分子材料和 人工合成高分子材料。选择高分子载体时应该认真考虑以下几点因素【2 9 】：载体材料的稳 定性及生物相容性；载体材料可结合酶的最大能力；载体材料与底物的竞争力；在加工 过程中，载体材料必须保持稳定，以防止酶的大量流失和酶活力的下降。 一些天然的高分子材料有着良好的机械性能并且毒性小，它们常被用于酶和微生物 江南大学硕士学位论文 的固定。这类材料有：矿物质和其它无机载体，如高岭土、皂土、多孔玻璃、氧化铝、 纤维素粉等；离子交换剂，如羧甲基纤维素、d e a e 葡萄糖等；蛋白质载体，如胶原蛋 白，其它还有海藻酸盐、k 角叉菜、琼脂等。合成高分子树脂材料可以经受住微生物、 酸碱环境中化学物质的作用，有着出色的机械性能，因而倍受研究人员的青睐【3 0 j 。 1 4a l i ) c 的固定化研究进展 近些年来，国内外许多学者在a l d c 固定化方面做了大量的研究工作，探索了新的 固定化载体和固定化方法，以追求更好的固定化效果。随着固定化技术的迅速发展，越 来越多的载体被应用于a l d c 的固定化。研究较多的载体材料有壳聚糖、聚乙烯醇聚合 物、无机吸附剂等。固定化方法主要是采用物理吸附法、交联法和共价结合法三种。下 面从固定化载体材料的角度概要地介绍a l d c 固定化技术的最新研究进展。 1 4 1 壳聚糖在a l d c 固定化中的应用 壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，是地球上存在极其丰富的天然高分子材料，其来 源广泛，是世界上产量最丰富的、可再生的有机资源之一，因此壳聚糖材料是令人感兴 趣的一类适合工业需要的固定化酶载体材料。壳聚糖作为酶固定载体有独特的生化性 质：无毒性、良好的凝胶特性、独特的生物兼容性、降解产物的无毒性、生理惰性、显 著的蛋白质亲和性、金属离子螯合性等1 3 。 王建华【3 2 】等采用壳聚糖作为固定化载体，戊二醛为交联剂制备固定化a l d c 。通过 单因素实验，对固定化条件进行了优化。最优制备条件为：戊二醛质量浓度为3g l ，p h 6 5 ，温度2 5 。在该条件下酶活力可达1 3 8 0u g ，蛋白载量9 8 3 0m g g ，比活力1 4 0 4 u m g ，活力回收率可达3 7 1 。固定化a l d c 的最适作用温度为3 0 ，最适p h5 5 。啤 酒发酵试验显示出了该固定化a l d c 具有明显降低双乙酰的效果。 f r a n kn i t z s c h e l 3 3 】等利用壳聚糖也研究开发了一种新的载体材料m l c ，并用该 载体对a l d c 进行了固定化。啤酒试验后，发现在后熟过程中双乙酰含量从0 1 4m g l 降 至0 0 7m g l ，有效地达到了降低双乙酰的目的。 1 4 2 无机吸附剂类载体在a l d c 固定化中的应用 采用无机吸附剂进行固定化时，酶与载体之间是通过氢键、范德华力以及离子间的 静电引力结合，载体吸附酶量、载体与酶结合的牢固程度以及固定化后的酶活力取决于 载体的性质。 经表面处理过得硅载体常作为固定化酶的无机载体。有许多报道证实采用吸附法 载体易再生，而且固定化酶在使用数周后仍可保持7 5 以上的酶活。在2 0 0 4 年世界酿造 大会的年度报告中指出，利用i m m o p o r e ( - - 种多孔玻璃) 载体固定a l d c ，可实现啤酒 的连续化成熟。该操作工艺为：主发酵后的发酵液一离心分离除去酵母一生啤酒巴 氏杀菌3 0s i m m o p o r e 载体固定化a l d c 反应器一储酒罐后熟。 在该工艺中巴氏杀菌的时间非常短，几乎不改变啤酒的1 2 1 感，而长时间热处理会使 啤酒的口感发生显著的变化。i m m o p o r e 载体固定化a l d c 处理1 0m i n 后，生啤酒送到 6 第一章绪论 固定酵母的储酒罐中进行后熟，该过程一般需要2 3h 。经过中试得到的啤酒质量非常 好。采用此固定化方法可以实现啤酒的低温快速发酵 3 4 】。 1 4 3 复合载体材料在a l d c 固定化中的应用 将有机载体材料和无机载体材料复合组成新的载体材料，可以改进材料的性能。磁 性高分子微球就是其中一种新型载体材料，它是指内部含有磁性金属或金属氧化物的超 细粉末而具有磁响应性的一类材料。磁性高分子微球作为固定化载体具有以下优点 3 5 - 3 7 】： ( 1 ) 有利于从反应体系中分离和回收，操作简便； ( 2 ) 磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流化床反应器中，可以减少持续反应体系中 的操作，适合于大规模连续化操作； ( 3 ) 利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械 搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。 邱广亮【3 8 】等采用复合技术制备出粒径为1 0 0 , - 一3 0 0n n l 的磁性淀粉复合微球，以此为 载体，采用溴化氰共价结合法、戊二醛交联法和物理吸附法对a l d c 进行了固定化。通 过试验得出：以戊二醛交联法制备的磁性酶活为最佳，活力为1 1 3 8 8u g 微球，蛋白载 量为8 9 7m g g 微球，比活力为1 2 6u m g 蛋白，活性回收率为5 9 6 。固定化酶最适温 度3 0 ，最适p h 为5 0 ，热稳定性及酸碱稳定性均有所提高，磁性酶重复使用1 0 次， 仍保持7 7 2 的相对活力。啤酒发酵试验证实：固定化酶具有明显降低双乙酰的效果， 而且由于其具有磁性，可通过施加外部磁场，方便简单地将其与酒液分离，对啤酒风味 无影响。 钱斯古日树3 9 】等用磁性淀粉微球作为载体，同样是采用溴化氰活化法、戊二醛交联 法及物理吸附法固定化a l d c ，并对它们的理化性质进行了比较。得到的结果也是戊二 醛交联法固定化a l d c 的各种理化性质最为理想，总活力为1 6 6 0u g ，蛋白载量为1 2 3 1 7 m g g ，比活力为1 6 4 8u m g 蛋白，活性回收率为1 4 9 2 。固定化酶最适作用温度为3 0 ，最适作用p h 为5 0 ，半衰期为2 1 6d 。固定后a l d c 的热稳定性、储存稳定性均 比游离酶好。 臧姝【4 0 j 等采用分散聚合法，制备得到磁性聚乙烯醇( p v a ) 微球。以磁性p v a 微球为 载体，采用戊二醛交联法制备固定化a l d c ，对固定化条件进行了初步研究。得到最佳 固定化条件为：游离酶的添加量为2 0m l g 微球，戊二醛的添加量为0 9 8 。在该条件 下，制备的固定化a l d c 的活力为6 5 1 8 0u g ，而且其比活力和活性回收率分别为8 7 2 3 2 u m g 和4 2 3 3 。 1 4 4a l d c 固定化研究的不足 总体来说，国内对a l d c 固定化的研究起步较晚，研究内容也主要是使用常见的固 定化材料，对固定化条件进行简单的优化。对固定化酶在啤酒发酵应用方面的研究鲜有 涉及。而国外所使用的固定化载体材料大都为专利产品，不易获得。因此，在这方面的 研究，还需要进一步筛选出在工业上有应用前景的载体，并着重研究固定化a l d c 在啤 7 江南大学硕士学位论文 酒酿造行业中的实际应用性。 1 5 立题背景和意义 由于近年来大麦、酒花等啤酒主要生产原料的价格涨幅很大，导致啤酒的生产成本 猛增，加之工人成本增加，运输成本居高不下等原因，使得国内啤酒企业面临着前所未 有的压力和挑战，啤酒行业的竞争也变得愈来愈激烈。在这种形势下，如何降低生产成 本、缩短生产周期、提高啤酒质量，取得更好的经济效益，是众多啤酒企业特别关注的 问题。特别是在啤酒生产旺季，啤酒的酿造周期较长，严重制约了中小型啤酒厂的设备 利用率和生产能力。另外，由于生产中存在的一些偶然因素，或一些技术问题，如：辅 料添加比例太高、大麦麦芽质量差、酵母异常、或卫生状况差等原因，常常导致在发酵 过程中双乙酰峰值较高、难以还原以及成品酒中出现双乙酰含量反弹超标等异常情况的 发生。 如上文中所述的那样，人们已经采取多种方法来降低啤酒酿造过程中的双乙酰含 量，但在这些方法中，存在着工艺条件复杂、影响酵母自身生长、生产成本高、以及利 用基因工程技术将编码a l d c 酶的基因导入酵母细胞中，构建带有a l d c 基因的工程菌， 但导入基因在酵母中表达的遗传稳定性欠佳，而且人们对该技术所酿制啤酒的安全性持 不同意见，存在安全方面的隐忧等缺点。而最直接有效的方法则是向发酵液中添加 a l d c ，这样既可以缩短啤酒的发酵周期，提高设备的利用率，且对啤酒的质量和风味 也无不良的影响。在啤酒生产旺季时，可以解决企业生产能力不足的问题，避免错失商 机；以及解决发酵出现异常情况时，双乙酰还原困难的问题。 但目前国内使用a l d c 酶制剂的啤酒厂家还不是很多，主要原因是：相比较啤酒厂 使用的其他酶制剂类，a l d c 的使用成本较高，加之游离酶不能够反复使用，造成了一 定的浪费，增加了企业的生产成本；若将a l d c 进行固定化，采用固定化酶有望弥补游 离酶的这一缺点。与游离酶相比，a l d c 经固定化后其优势表现在以下几个方面： ( 1 ) 可以在较长时间内进行反复多次使用，提高了酶的使用率； ( 2 ) 酶的稳定性得到提高； ( 3 ) 易于装成酶反应柱，可以进行装柱连续反应，便于工艺操作的连续化和自动化， 便于工业化应用。该系统不仅可以与传统的发酵相匹配，亦可与连续主发酵相结合完成 啤酒的发酵【4 1 。 1 6 本课题的研究目的和主要内容 在前人对固定化a l d c 研究工作的成果和不足之上，综合考虑到本研究是要连续处 理啤酒发酵液中的双乙酰，因而对固定化材料机械强度要求更高一些，所以尝试选用了 在a l d c 固定化研究中从未使用过的一种载体材料一工业树脂。树脂是工业上使用最 广泛的材料之一，它价