（环境工程专业论文）产高效微生物絮凝剂固氮菌的筛选及特性研究.pdf

摘要 本实验对4 8 株固氮菌的絮凝能力进行了筛选，并对高效絮凝剂产生菌的生长条件、 特性和实际应用情况等进行了研究，结果如下： 从4 8 株固氮菌中，通过初筛获得了1 4 株具有明显絮凝效果的菌株，进一步复筛， 得到两株高效絮凝剂产生菌h y l1 4 1 和h y 2 4 1 。 在确定供试菌株最佳碳、氮源的基础上，通过正交实验筛选出了最佳培养基和最佳 培养条件。结果表明，h y l1 4 1 的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为n 2 ；最佳培养基为蔗糖 5 9 u ，磷酸二氢钾1 5 9 l ，硫酸镁0 6 9 l ；最佳培养条件为转速1 5 0r m i n ，培养温度3 5 c ， 培养基初始p i q7 0 、培养时间3 6h ；在此条件下，该菌产生的絮凝剂对高岭土悬液的絮 凝率达9 6 4 。 h y 2 4 1 的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为硫酸铵；最佳培养基为蔗糖5 9 m ，硫酸铵 1g l ，磷酸二氢钾1 5g l ，硫酸镁0 5 9 i n , 最佳培养条件为转速1 8 0r m i n ，培养温度3 0 。c ， 培养基初始p h 7 0 、培养时间4 8h ；在此条件下，该菌产生的絮凝剂对高岭土悬液的絮凝 率达9 6 6 。 絮凝性能的研究结果表明：两株菌的絮凝活性均来源于细胞分泌的胞外代谢产物， 该生物絮凝剂具有较好的酸碱稳定性和热稳定性。h y l1 4 1 对酸性水质处理效果较好， h y 2 4 1 对中性偏酸性的水质处理效果较好；两株菌所产絮凝剂的最佳投加量均为4 m l l ； h y l1 4 1 和h y 2 4 1 所需c a c l 2 最佳浓度分别为0 5 和1 0 ；最佳絮凝时间分别为5m i n 和 1 0 m i n 。 对微生物絮凝剂的化学组成进行了分析，结果表明：絮凝剂的主要成分为多糖类物 质。 在实际应用中，两株菌所产絮凝剂对水原水的处理效果较好，其中h y 2 4 1 的处理效 果最好，絮凝率达到9 2 8 ，c o d 的去除率达n 8 5 0 ；此外，两株菌所产絮凝剂对洪水 和选矿废水都有一定的处理效果，且h y l l 4 1 处理洪水效果较好，混合絮凝剂处理选矿 废水效果较好。 通过对菌株进行鉴定，得出h y l l 4 1 属于固氮菌属，h y 2 4 1 属于肠杆菌属。 关键词：微生物絮凝剂；固氮菌；筛选；培养基；絮凝性能 a b s t r a c t i nt h i se x p e r i m e n t ，t h ef l o c c u l a n ta b i l i t yo f 4 8d i z o t r o p h i cb a c t e r i a ls t r a i n sw a ss c r e e n e d ，a n d t h e g r o w t hc o n d i t i o n ，c h a r a c t e r i s t i c s a n d p r a c t i c a la p p l i c a t i o no ft h eh i 曲e f f i c i e n t b i o f l o c c u l a n t p r o d u c i n gs t r a i n sw a sp e r f o r m e d ，t h er e s u l t sw a s a st h ef o l l o w s ： o fa l lt h e4 8d i z o t r o p h i cb a c t e r i a ls t r a i n s ，14s t r a i n sh a do b v i o u sf l o c c u l a t i o ne f f e c ti nt h e p r i m a r ys c r e e n i n ge x p e r i m e n t s f r o mt h o s e a z o t e r b a c t e rs t r a i n s ，t o w h i 曲e f f i c i e n t b i o f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gs t r a i n ，i e h y11 4 1a n dh y 2 4 1 ，w e r eo b t a i n e d a f t e rd e t e r m i n a t i o no ft h eo p t i m a lc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e ，t h eo p t i m a lm e d i u ma n d c u l t u r ec o n d i t i o no ft h et e s t e ds t r a i n sw e r es c r e e n e db ya l lo r t h o g o n a lt e s t ，r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s tc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c eo fh y1141w a ss u c r o s ea n dn 2 ， r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lm e d i u mc o n s i s t e do fs u c r o s e5 9 l ，k h 2 p 0 41 5 9 la n dm g s 0 4 0 6 9 l t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o ni n c l u d e dr o t a t i o ns p e e d15 0r m i n ，c u l t u r et e m p e r a t u r e 3 5 ，a n do r i g i n a lm e d i u mp h7 0 ，c u l t u r et i m e3 6h u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h eh i 曲e s t f l o c c u l a t i n gr a t eo ff l o c c u l a n t sp r o d u c e db yh y i141t og a o l i n gc l a ys u s p e n s i o ni sa sh i g ha s 9 6 4 t h eb e s tc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c ef o rs t r a i nh y 2 41w a ss u c r o s ea n d ( n h 4 ) 2 s 0 4 ， r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lm e d i u mc o n s i s t so fs u c r o s es g l ，( n h 4 h s 0 41 9 l ，k h 2 p 0 41 s g l a n dm g s 0 4 0 5 9 l t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o ni n c l u d e dr o t a t i o ns p e e d18 0r m i n ，c u l t u r e t e m p e r a t u r e3 0 ，o r i g i n a lm e d i u mp h7 0 ，c u l t u r et i m e4 8h u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h e h i 曲e s tf l o c c u l a t i n gr a t eo ff l o c c u l a n t sp r o d u c e db yh y 2 4 1t og a o l i n gc l a ys u s p e n s i o ni s 雒 h i 曲a s9 6 6 r e s u l t so ff l o c c u l a n t p e r f o r m a n c es h o w e dt h a tf l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo ft w os t r a i n s w e r e e x t r a c e l l u l a rm e t a b o l i t e s ，t h eb i o f l o c c u l a n th a sg o o da c i d i cs t a b i l i t ya n dt h e r m a ls t a b i l i t y b i o f l o c c u l a n tp r o d u c e db ys t r a i nh y1 14 1h a dg o o de f f e c to nd e a l i n gw i t ha c i d i cw a s t e w a t e r ； w h i l e ，b i o f l o c c u l a n tp r o d u c e db ys t r a i nh y 2 4 1h a dg o o de f f e c to nd e a l i n gw i t hb o t ha c i da n d n e u t r a lw a s t e w a t e r w h e nt r e a t i n gt h ew a s t e w a t e r ，t h eo p t i m a lq u a n t i t yo ft h eb i o f l o c c u l a n t p r o d u c e db yh y l1 4 1a n dh y 2 4 1w a s4 m l l ；t h ec o n c e n t r a t i o no fc a c l 2a d d e dw a s o 5 a n d1 o ，a n dt h ep r o p e rf l o c c u l a t i n gt i m ew a s5m i na n d10m i n ，r e s p e c t i v e l y t h ec h e m i c a lc o m p o n e n to ft h eb i o f l o c c u l a n tw a sa n a l y z e d ；t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em a j o r c o m p o n e n to fb i o f l o c c u l a n tw a sp o l y s a c c h a r i d e s i np r a c t i c a la p p l i c a t i o n ，t h eb i o f l o c c u l a n tp r o d u c e db yt w os t r a i n sh a dg o o de f f e c to nd e a l i n g w i t hs o u r c ew a t e r ，a n dt h a tp r o d u c e db yh y 2 41h a dt h eb e s te f f e c t w h e nt r e a t i n gs o u r c e w a t e r ，i t sf l o c c u l a t i n gr a t er e a c h e dt o9 2 8 ，a n dc o d r e m o v a lr a t er e a c h e dt o8 5 o i n a d d i t i o n ，b o t hb i o f l o c c u l a n th a dg o o de f f e c to nd e a l i n gw i t hf l o o d sa n df l o t a t i o nw a s t e w a t e r ， a n dh y1141s t r a i nh a db e t t e re f f e c to nt r e a t i n gt h ef l o o d st h a nh y 2 41 t h em i x e d b i o f l o c c u l a n th a dg o o de f f e c to nd e a l i n gw i t hf l o t a t i o nw a s t e w a t e r f i n a l l y ，t h et a x o n o m i cp o s i t i o no ft h et w os t r a i n sw e r ed e t e r m i n e d ，t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a t h y1141w a si d e n t i f i e da sa z o t o b a c t e rs p ，a n dh y2 41w a si d e n t i f i e da se n t e r o c o c c is p 。 k e y w o r d s ：m i c r o b i a lf l o c c u l a n t ；a z o t o b a c t e r ；s c r e e n i n g ；c u l t u r ec o n d i t i o n s ，f l o c c u l a n t p e r f o r m a n c e i 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学 位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 藕啼2 口。君年易月2 穹日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，r p 学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名： l 孕争 磁 d 卫o o a 年6 月乒勺日 吖月歹 1 、文献综述 1 1 前言 水是生命的起源，是人类和生物赖以生存不可缺少的物质，是发展工业的重要条 件和农业的命脉。随着经济的快速发展和人口的增加，我国每年的用水量和污水排放 量也在增加，污水处理问题日益严峻。水处理技术开始走向了以资源综合利用为背景 的历程，物理、化学和生物原理的各种污水处理工艺不断出现，如絮凝沉淀法、生化 法、离子交换法、吸附法、化学氧化法、电渗析法和污水生态处理技术等。在众多的 废水处理方法中，絮凝沉降法是目前国内外普遍采用的一种既经济又简便的水处理方 法，现已广泛用于给水、废水处理、污泥脱水等 1 】。而在絮凝沉淀法处理废水中，絮 凝剂的开发选择是其关键技术之一。 絮凝剂是一类能使悬浮液中的微细颗粒凝聚、沉降的物质。广泛应用于酿造、食 品加工、化工冶金的固液分离以及废水处理等领域【2 4 1 。目前，絮凝剂主要有三大类： 无机絮凝剂、有机絮凝剂和微生物絮凝剂。 无机絮凝剂也称凝聚剂，应用历史悠久，广泛用于饮用水、工业水的净化处理以 及地下水、废水淤泥的脱水处理等。无机絮凝剂大体上可以分为铝系和铁系，铝系包 括硫酸铝、明矾、聚合硫酸铝( p a s ) 、聚合氯化铝( p a c ) 、铁系包括三氯化铁、 硫酸亚铁、聚合氯化铁( p f c ) 、聚合硫酸铁( p f s ) ，其它的还有石灰，氯化钙， 酸、碱等，目前使用较多的有聚合硫酸铝、聚合氯化铝等几种。 无机高分子絮凝剂对各种复杂成分的水处理适用性强，可有效地去除细微悬浮颗 粒，但生成的絮体不及有机高分子生成的絮体大。单独使用无机絮凝剂，投药量大， 目前已较少采用。有关研究还表明，铝盐具有毒性，常饮用以铝盐为絮凝剂的水，能 引起老年性痴呆症。铁盐会造成处理水中带颜色，高浓度的铁也会对人类健康和生态 环境产生不利影响。 近2 0 年来有机絮凝剂的使用发展迅速，大体上可分为天然有机絮凝剂和人工合成 有机絮凝剂。天然有机絮凝剂包括淀粉、单宁、甲壳素、腐植酸等；人工合成有机絮 凝剂包括聚丙稀酰胺，聚丙烯酸钠、聚乙烯醇等，目前使用较多的是聚丙烯酰胺。 一般有机絮凝剂的色度去除较无机絮凝剂高2 0 左右。但合成高分子絮凝剂其单 体或水解、降解产物常常有毒，如聚丙烯酰胺的单体具有强烈的神经毒性，还是强的 致癌剂【5 1 。所以各国对其使用作了规定，如美国批准使用聚丙烯酰胺的最大允许浓度 为lm g l ，英国规定聚丙烯酰胺的投加量平均不得超过0 5 m 班，最大投加量不得超过 l m g l ，从而大大限制了此类絮凝剂的应用【6 7 】。天然有机絮凝剂，由于取自动植物， 因而毒性较低，但有的絮凝效果不理想，有的成本过高，所以应用也很有限。 无机和有机高分子絮凝剂存在的问题，使研究开发具有高絮凝活性、安全、无毒 和不造成二次污染的絮凝剂成为迫切而有意义的课题。而微生物絮凝剂作为一种天然 高分子絮凝剂，是一类较新的水处理剂，其克服了无机和有机絮凝剂在使用安全和环 境污染方面的问题，对人体无害，可被生物降解，对生态环境无不良影响。并且能产 生絮凝剂的微生物种类多，生长快，易于采取生物工程的手段实现产业化，因而微生 物絮凝剂具有广阔的应用前景，越来越受到各国水处理工作者的重视。 1 2 微生物絮凝剂的研究与应用现状 1 2 1 微生物絮凝剂的概念及特点 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t 简称m b f ) ，是利用生物技术，从微生物体或 其分泌物中提取、纯化而获得的一种新型水处理剂，具有良好的絮凝沉淀性能，其特 点如下： ( 1 ) 高效性 与现在常用的各类絮凝剂，如铁盐，铝盐和聚丙烯酰胺等相比，同等用量下，它 的处理效率明显高于传统絮凝剂i s 。 ( 2 ) 安全无毒性 微生物絮凝剂的安全性也可得到保证，经小白鼠安全试验证明0 1 ，m b f 完全能 用于食品、医药等行业。 ( 3 ) 不污染环境 到目前为止，已报道的微生物产生的絮凝物质为糖蛋白、粘多糖等高分子物质， 其分子量多在1 0 5 以上，具有可生化性，即能够自行降解，因而不会带来二次污染 1 。 ( 4 ) 絮凝范围广、脱色效果独特 如已研制成功i 拘n o c i t l 2 ，13 1 ，是以红平红球菌为主体的絮凝剂，在c a 2 + 存在下， 对大肠杆菌、泥浆水、畜产废水、染料废水等有极好的絮凝和脱色效果。 ( 5 ) 投放量相对少 使用少量的m b f ，就能实现大面积污水的净化作用。等同用量下，与先用各类絮 凝剂相比，a s p e r g i l l u ss o j a ea j 7 0 0 2 1 1 4 】产生的絮凝剂对活性污泥的絮凝速度最大，而 2 且沉淀较容易用滤布过滤。 ( 6 ) 价格相对较低 一方面微生物絮凝剂为生物菌体或有机高分子，较化学絮凝剂便宜：另一方面， 微生物絮凝剂是靠生物发酵产生的，化学絮凝剂是人工合成的，从原材料、生产工艺 和能源消耗等方面考虑，微生物絮凝剂也是经济的，这一点已为国内外普遍认同。 1 2 2 微生物絮凝剂产生菌的种类 具有分泌絮凝剂能力的微生物称为絮凝剂产生菌。能产生絮凝剂的微生物有很多 种类，细菌、放线菌、真菌以及藻类等都可以产生絮凝剂15 1 。迄今为止，已发现的产 絮凝剂的微生物数量众多，分布极为广泛，常见的产絮凝剂的微生物见表1 【1 “1 1 。 1 2 3 微生物絮凝剂的种类 微生物絮凝剂的来源可以包括以下四类： ( 1 ) 微生物细胞 如某些细菌、霉菌、放线茵和酵母菌，它们大量存在于土壤，活性污泥和沉积物 中。不同种微生物间各自细胞表面正负电荷之比不同，即其电负性大小不同，因此利 用不同种微生物表面间的细微成分及结构差别可能导致絮凝，这就是微生物细胞间絮 凝的重要机理之一。 ( 2 ) 微生物细胞壁提取物 如酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和n 乙酰葡萄糖胺等成分均可作为絮 凝剂。因微生物细胞壁的提取物主要是含羧基、氨基或烃基的长碳链，当存在于水中 时，因发生水解作用，而使其成为极性的羧基、氨基或烃基，这样它们就能够在引力 的作用下与污水中的异号电荷相吸引，当达到一定的质量时，就会因重力的作用而沉 降下来。 ( 3 ) 微生物细胞代谢产物 微生物细胞的代谢产物成分复杂，如细菌的荚膜和粘液质，其有效成分主要有蛋 白质，多糖，脂类及其复合物，易与污水中的污染物质发生吸附沉降作用，从而起到 去除污水中污染物质的作用，可作为絮凝剂 4 2 1 。 ( 4 ) 基因工程菌株细胞代谢产物 利用基因工程技术和现代分子生物学，把高效絮凝基因转移到便于发酵的菌中， 构建高效遗传菌株，克隆絮凝基因能在降解多种底物的同时产生絮凝剂4 3 1 。 表l 具有絮凝性能的微生物种类 拉丁名称中文餐称拉工垒鳌 生塞垒签 4 1 2 4 微生物絮凝剂的絮凝机理 目前，普遍认为絮凝机理主要有三种，即吸附架桥、电性中和、网捕或卷扫作用 【4 4 4 6 】。这三种机理究竟以何为主，取决于絮凝剂的种类、投加量、水中胶体粒子的性 质、含量以及水的p h 值等。 微生物絮凝剂的作用机理则更为复杂，目前还不十分清楚。其主要原因是微生物 絮凝剂是由微生物产生的，不同的微生物产生的絮凝剂性质不同，而且微生物絮凝剂 的成分复杂，提纯分析较困难。普遍认为生物絮凝剂是带有电荷的生物大分子，这三 种机理都可能存在，但主要是前两种。 ( 1 ) 吸附架桥机理。 絮凝剂借助离子键、氢键，同时结合了多个颗粒分子，因而在颗粒问起了“中间 桥梁”的作用，从而使之形成网状结构沉淀下来。 ( 2 ) 电性中和机理 胶体粒子的表面一般带有负电荷，当带有一定正电荷的链状生物大分子絮凝剂或 其水解产物靠近这种胶粒时，将会中和胶体表面上的部分电荷，减少静电斥力，从而 使胶粒间发生磁力碰撞而凝聚。加入金属离子或调节p h 值可影响其絮凝效果，就是 通过影响其带电性而起作用的。 ( 3 ) 网捕或卷扫作用。 当絮凝剂的投量一定且形成小粒絮体时，可以在重力作用下迅速网捕，卷扫水中 的胶粒，从而产生沉淀分离，称为卷扫或网捕作用。这种作用可以看成是一种机械作 用，所需絮凝剂量与原水杂质含量成反比。 此外，人们还进行了大量的研究工作，提出了许多能解释特定条件下絮凝过程的 理论，主要有荚膜学说，菌体外纤维素纤丝学说，电性中和学说，疏水学说和胞外聚 合物架桥学说等4 7 , 4 8 。荚膜学说认为细胞在生长的过程中形成了粘性荚膜，粘连颗粒 使之形成絮体；纤维素纤丝学说认为菌体外的纤丝直接参与了絮凝，纤丝把颗粒联结 到一起，形成絮团：电性中和学说认为细菌在溶液中可以看成带电胶体，在絮凝时和 相反电性的颗粒发生电性中和，压缩双电层，颗粒相互靠近，发生絮凝；疏水学说认 为细菌表面的疏水性与絮凝过程有关，颗粒与细胞表面的疏水作用对细菌的粘附至关 重要；胞外聚合物架桥学说认为细菌体外的聚合物是絮凝产生的物质基础，这些物质 与颗粒表面相互作用，从而导致絮凝的发生。从微生物絮凝剂的多样性以及表现出的 絮凝范围、广谱性来看，絮凝机理不是单一的，而是多样的。 1 ：2 5 影响微生物絮凝剂产生及絮凝能力的因素 1 2 5 1 培养基成分 培养基成分包括碳源、氮源、生命所需的各种无机盐及其它物质等。不同的微生 物需要不同的营养基质。 ( 1 ) 碳源 碳源对微生物絮凝剂合成条件的研究结果表明，絮凝剂的合成与碳源有较大关系 【4 9 1 。如以果糖为碳源培养彳，c 口，f j 弘门绀l a t u s 3 6 】时，絮凝剂产量超过其他所有受试碳源。 有的絮凝剂产生菌在改变培养基中的碳源后，其絮凝活性将发生变化，甚至消失【5 0 1 。 还有人发现，对生长最合适的碳源并不一定就是对絮凝剂分泌最有利的碳源。 ( 2 ) 氮源 不同的微生物絮凝剂对氮源的要求不同。k u r a n e 5 1 1 研究发现无机氮和有机氮对 n o c 1 的产生菌均可用，只是所需要的无机氮源以尿素，硫酸氨最好；有机氮以酵母 汁、酪蛋白为最佳。对于m b f a 9 ，无机氮则不利于a 9 茵生长，而有机氮中的蛋白胨， 酵母汁，牛肉膏等有利于a 9 菌产生絮凝剂。 ( 3 ) 其它物质 培养基中的无机盐对絮凝剂的产生也有影响5 2 - s 5 1 。无机盐以k 2 唧0 4 、k h 2 p 0 4 、 m g s 0 4 、n a c i 等为主，但无机盐对有些絮凝剂产生的影响并不显著。也有报道添加其 它生长因子【5 6 , 5 7 ，如氨基酸等。 1 2 5 2 培养条件 培养温度、初始p h 值、通气情况及其他培养条件对絮凝剂的合成也有一定的影 响。 ( 1 ) 培养温度 一般认为，产微生物絮凝剂的最适宜温度在2 5 3 5 c 之间，温度太低，菌体生长 速度变慢，温度太高，会使菌体产生的絮凝剂活性降低。对r e r y t h r o p o l i s 5 8 1 的研究表 明，在3 0 c 时絮凝剂的产量要高于2 5 c 和3 7 。c 时的产量。 ( 2 ) 初始p h 值 培养基初始p h 值过高或过低均不利于絮凝剂的产生。一般来说，细菌和放线菌 的最适p h 为中性或弱碱性，而霉菌为酸性。对于不同的微生物，其最适p h 值不同。 6 如彳s o j a e 5 纠在p h 值为6 时菌丝生长旺盛，但根本不表现出絮凝活性；c x e r o s i s 删只有 在酸性条件下才能产生絮凝剂。 ( 3 ) 通气情况 通气情况直接影响絮凝剂产生菌的生长及絮凝剂的分泌。王镇等 1 叼对四株絮凝剂 产生菌进行通气量影响试验，发现培养后期减少通气量有益于多糖类絮凝剂的产生， 而不利于部分核酸类絮凝剂的产生。但也有些微生物产絮凝剂的能力不受通气量的影 响 6 1 1 。 ( 4 ) 培养时间 不同种类的微生物有不同的生长周期，产生絮凝剂的周期也不一样。 1 。2 。5 3 絮凝条件 除此之外，影响微生物絮凝剂絮凝能力的因素还包括絮凝剂的分子结构、分子量， 水质的p h 值，投加剂量，无机金属离子，温度等，即有其特定的应用条件【6 2 ，6 3 1 。 ( 1 ) 絮凝剂的分子结构、分子量 一般来说，线性结构的大分子絮凝剂的絮凝效果较分子结构是交联或支链的要 好。此外，微生物絮凝剂的分子量越大，吸附位点越多，携带的电荷也越多，中和能 力也越强，桥联和卷扫作用越明显。 ( 2 ) 溶液p h 值 p h 值影响微生物和悬浮颗粒的结构和表面电荷的性质和数量，因而影响絮凝剂 和被絮凝物的相互作用，不同的絮凝剂对p h 的变化敏感程度不同，同一种絮凝剂对 不同的被絮凝物具有不同的最适p h 值。如真菌p 口c 玎d 掣c 甜s p 产生的絮凝剂聚半乳 糖胺，在p h i 4 7 5 时，絮凝能力最强，当p h 为3 或8 时，絮凝能力急剧下降。 ( 3 ) 絮凝剂投加量 絮凝剂一般都有一个最佳的投加剂量，过多或过少均会使絮凝效果下降。据分析 【6 4 1 ，最佳值约为固体颗粒表面吸附大分子化合物达到饱和时的吸附量，因为此时大分 子在固体颗粒上架桥几率最大。 ( 4 ) 助凝剂的影响 某些絮凝剂表现絮凝活性需要添加二价或三价金属离子，这样能降低悬浮物的运 动电势，减少微生物絮凝剂和悬浮物间的排斥力，降低反应的自由能，同时通过化学 作用介导生物絮凝剂分子的各官能团与悬浮物的吸附结合，促进絮凝作用的发生。如 c a 2 + ，m 孑+ ，f e 2 + 等，c a 2 + 可以显著提高微生物絮凝剂的活性，对于一些微生物来说， 7 形成絮凝体必须有c a 2 + 的参与，但对于另一些微生物却不是这样。黝n m 9 2 + 也能提高 微生物絮凝剂的活性，但关于m 孑+ 的作用，一些研究者根据各自的研究结果得出的结 论并不一样6 5 , 6 6 】。 ( 5 ) 温度的影响 有些微生物絮凝剂的絮凝能力会随着温度的变化而发生变化，这类絮凝剂中往往 含有蛋白质或多肽等对温度敏感的物质，在高温下易变性，空间结构发生改变，造成 活性位点结构变化，使某些活性基团不再与悬浮颗粒结合，从而使絮凝活性降低 6 7 】。 而由多聚糖构成的絮凝剂就不受温度的影响。 1 2 6 微生物絮凝剂的提取及成份 i 2 6 1 微生物絮凝剂的提取 由于m b f 的化学成分主要是多聚糖和蛋白质，因而提取方法与一般的多聚糖和蛋 白质的提取方法无多大区别。首先用过滤或离心的方法去除菌体，离心条件一般为中 高速( 5 0 0 0 1 0 0 0 0 r m i n ) 。视发酵液的组分及絮凝物质的种类和性质不同而采用乙醇、 硫酸铵、丙酮、盐酸胍等沉淀，对于一些结构、成分复杂的絮凝剂，则需要用酸碱或 有机溶剂反复溶解、沉淀，得到粗品，将粗品溶于水或缓冲溶液，再通过凝胶电泳、 离子交换、减压浓缩等方法得到精制絮凝剂。较常用的有下面三种【6 8 1 。 ( 1 ) 凝胶电泳 将细菌培养物过滤，取滤液，用6 m o l l 的盐酸将p h 值调到7 o ，离心分离，取沉 淀物，用1 ：1 的氯仿和甲醇混合液提取，之后离心，用0 1 m o l l 的盐酸将沉淀溶解，再 加入6 m o 儿的n a 0 h 溶液调p h 值到7 0 ，离心后，用乙酸盐缓冲液( o 0 1m o l l ，p h 值为 4 ) 溶解沉淀物。最后用e d t a 琼脂糖凝胶柱( a 5 0 ) 色谱和琼脂糖凝胶( g 2 0 0 ) 色谱分离 提纯。然后可以用获得的纯品进行化学分析。 ( 2 ) 溶剂提取 用丙酮提取可以获得微生物絮凝剂的粗制剂。将细菌培养物过滤，取滤液，用丙 酮以1 ：1 的比例提取，然后离心，取沉淀物，用5 0 的丙酮洗，之后冷冻干燥，就可得 到絮凝剂的粗制剂。粗制剂可以用于实验室的絮凝能力研究。 ( 3 ) 碱提取法 用n a o h 溶液从活性污泥中提取微生物絮凝剂的方法如下：将经驯化的活性污泥 静置，用水洗污泥3 次。加入n a o h 溶液，慢搅拌2 小时。离心后取上清液，加乙醇至 8 其浓度为6 0 ，4 c 冰箱中放置过夜。离心后去上清液，力1 ：1 6 0 的乙醇，再离心去清 液，加9 0 的丙酮，离心后去上清液，然后加乙醚，再次离心去上清液，将沉积物溶 于少量蒸馏水中，在2 3 天内透析数次。在5 0 c 下减压浓缩，并冷冻干燥成粉状，得 到精制絮凝剂。 1 2 6 2 微生物絮凝剂的成分 微生物絮凝剂是由微生物产生的具有一定絮凝能力的有机高分子化合物，它具有 复杂的化学组成，其分子量多在1 1 0 5 以上，主要成分是粘多糖、蛋白质、糖蛋白、 纤维素、d n a 、脂肪等【6 9 , 7 0 。不同种类的微生物产生的絮凝剂的主要成分不相同， 很多研究者在这方面进行了研究【7 1 7 ”。就已发现的生物絮凝剂产生菌来看，大多为 机能性蛋白质类物质和机能性多糖类物质，脂类、d n a ：等其他类型的生物絮凝剂较 为少见。 ( 1 ) 蛋白质类微生物絮凝剂 据k u r a n e 报道 7 4 】，n o c 1 的主要成分是蛋白质，而且分子中含有较多的疏水氨基 酸，包括丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸等；a s p s o j a ea j 7 0 0 2 7 ：】合成的絮凝剂 的主要活性成分是蛋白质和己糖胺；另外，细菌兄叫励印d 份，f l a v o b a c t e r i u ns p 7 6 1 ， 放线菌n a m a r a e 以及真菌h a n s e n u l aa n o m a l a 分泌的微生物絮凝剂的主要成分也都是 蛋白质。 ( 2 ) 多糖类微生物絮凝剂 多糖类微生物絮凝剂有很多种，有些是由一种糖单体组成，有些是由多种糖单体 构成的多聚糖7 7 1 。a l c a l i g e n e sc u p i d u s 和a n a b a e n o p s i sc i r c u l a r i s 7 8 1 分泌的絮凝剂的主 要成分都是酸性聚多糖；z o o g o l e as p 【7 9 】分泌产物含氨基多糖；p s e u d o m o n a ss p 【8 0 】， p h o r m i d i u ms p s t l l ，a s p e r g i l l u sj 影口p 产生菌分泌的絮凝剂主要成分分别为粘多糖、磺 酸异多糖和多聚糖胺。s a l e h i z a d e h 等 8 2 】发现胞外聚多糖积累和细菌絮凝存在一定的关 系，进而从活性污泥中分离出不含细胞的絮凝剂，其化学本质是碳水化合物。 ( 3 ) 脂类微生物絮凝剂 目前发现的唯一脂类絮凝剂是1 9 9 4 年k u r a n e 从r e r y t h r o p o l i ss 1 的培养液中分离 出来的生物絮凝剂。其中含有葡萄糖单霉菌酸脂( g m ) ，海藻糖单霉菌酸脂( t m ) ，海 藻糖二霉菌酸脂( t d m ) 三种组分，霉菌脂碳链长度从c 3 2 到c 4 0 不等，其中以c 3 i ，c 3 6 和c 3 8 居多。 ( 4 ) d n a 类微生物絮凝剂 9 p s e u d o m o n a ss t r a i nc 1 2 0 菌体细胞凝集的直接原因来自高分子量的天然双链 d n a ：w a t a n a b e 分离的光合细菌r h o d o v u l u ms p p s 8 8 ，其絮凝活性与该菌分泌到胞外 的d n a 有直接关系。 1 2 7 微生物絮凝剂的应用 ( 1 ) 废水悬浮颗粒的去除 微生物絮凝剂可用于高岭土、粉煤灰、泥水浆等水样的处理。在含有大量极细微 悬浮固体颗粒( s s 浓度为3 7 0 m g l ) 的焦化废水悬浮液中， j n 入2 f l o a l c a l i g e l l e sc u p i d u s 【8 3 1 培养物，并加入钙离子，废水中即形成肉眼可见的絮凝体。这些絮凝体可以得到有 效的去除，沉降后上清液的s s 为8 0 m g l ，去除率为7 8 。而原来用聚铁絮凝剂处理同 样的悬浮液，效果并不好，s s 的去除率仅为4 7 。 ( 2 ) 有色废水脱色 目前，对有色废水脱色还没有有效的处理方法。我国采用物理化学方法、无机或 合成高分子絮凝剂处理、生化处理，效果均不显著，尤其是对那些可溶性色素很难处 理。而采用微生物絮凝剂n o c 1 对含有可溶性着色物质的黑墨水，面包酵母生产过程 中排出的糖蜜废水，酒精生产过程中精馏后的酒精发酵母液，造纸废水和染料废水等 有色废水进行实验，发现废液经处理后变为无色透明，可见微生物絮凝剂具有很好的 脱色性能。 ( 3 ) 畜产、屠宰废水的处理 畜产废水是b o d 较高，难处理的有机废水，含有较高的t o c 和t n 。有研究表明 【8 4 1 ，猪粪尿废水采用微生物絮凝剂n o c 1 处1 0 m i n 后，废水的上清液变成几乎透明 的液体。废水的t o c 由处理前的1 4 2 0 m g l 降至4 2 5 m g l ，t n 由4 2 5 m g l 降至2 l s m g l ， 去除率分别达7 0 矛1 1 4 0 。o d 6 6 0 值由处理前的1 5 7 变成0 8 6 ，浊度去除率达到9 4 5 ( 4 ) 污泥沉降性能的改善 活性污泥处理系统的效率常因污泥的沉降性能而降低，从微生物中分离出的絮凝 剂能有效地改善污泥的沉降性能，防止污泥解絮，提高整个处理系统的效率。将从 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 【8 5 1 中分离的絮凝剂加入已发生膨胀的活性污泥中，可以使污 泥的s v i 从2 9 0 下降n s o 。在活性污泥中添加絮凝微生物可以促进污泥的沉降，且不会 降低有机物的去处率。 ( 5 ) 用于重金属离子脱除 l o 在工业废水中，含重金属离子的废水占有相当大的比重，这些废水中的重金属离 子如c r 3 + ，c u 2 + ，h 9 2 + ，c d 2 + ，n i 2 + 等是对生态环境危害极大的一类污染物。研究表明【8 6 1 ， 有的微生物如啤酒酵母以及真菌、细菌等，对重金属有一定的耐受性，而且能去除水 中的重金属离子。 ( 6 ) 乳化液的油水分离 目前未见到无机或有机合成絮凝剂用于处理油脂乳浊液的报道。而r k u r a n e 的研 究表明，向棕搁油乳浊液中加，m 1 a t u s 的絮凝剂粗制品后，可见油滴上浮到乳浊液的 表面，形成油层，下层清液的c o d 值明显下降。 ( 7 ) 物质的分离纯化 利用生物絮凝剂的高选择性，可进行物质的分离纯化。如s t e p a n e n k ov g 将 b a c i l l u sc e r e u s 成功地用于黄金、白钨矿等贵重稀有金属类化合物的富集提取。 1 2 8 微生物絮凝剂的研究成果及发展方向 1 2 8 1 微生物絮凝剂的研究成果 自从b u t t e r f i e l d 于1 9 3 5 年从活性污泥中筛选出絮凝剂产生菌以来，人们对微生物 絮凝剂进行了大量的研究。1 9 7 1 年，z a j i c 和k n e t t i n g 从煤油中分离出了一株棒状杆菌， 该菌可以分泌对污水具有絮凝作用的多聚物。1 9 7 6 年，j n a k a m u r a 等人8 7 1 首先从霉菌、 细菌、放线菌、酵母菌中筛选出1 9 种具有絮凝能力的微生物，其中以酱油曲酶a j 7 0 0 2 产生的絮凝剂效果最好。1 9 8 5 年，h t a k a g i 等a t 8 8 】研究了拟青霉素属微生物产生的絮 凝剂，采用乙醇沉淀和凝胶色谱法精制得到了称为p f l 0 1 的絮凝剂，分子量约3 0 万， 主要成分为半乳糖胺，对红血细胞、活性污泥等均有良好的絮凝效果。1 9 8 6 年，k u r a n e 等人【8 5 】利用红平红球菌俾乃d 如c c 淞叼砌，印d ，西) 成功研制出微生物絮凝剂n o c 1 ， 是目前发现的最好的微生物絮凝剂。1 9 9 1 年k t o e d a 等又从土壤中分离了一株产碱 杆菌，它在含有蔗糖的培养基中分泌絮凝剂a l 2 0 1 。1 9 9 9 年，m w a t a n a b e 和y s u z u k i 等发现海洋光合细菌r h o d o v u l u ms p p s 8 8 的胞外聚合物具有絮凝性能。2 0 0 3 年，s d e n t 等从土壤中分离出一株粘质杆状细菌，研究了该菌产生的絮凝剂的组成特性，并用于 处理淀粉废水。 美国、日本、英国、法国、德国、前苏联、葡萄牙、以色列、韩国等国家对微生 物絮凝剂都进行了大量的研究，取得了一些初步的研究成果。目前，国外市场上已有 几种牌号的微生物絮凝剂粉末和活液制品销售。 我国对m b f 的研究起步较晚，但近年来发展很快，取得了很大的进步。台湾邓德 丰【则从废水中分离n c 6 2 细菌菌株，产生的微生物絮凝剂可用于处理猪粪尿废水和红 豆加工厂废水。王镇等人【9 1 】从污泥中分离出四株高絮凝性菌株，并对其进行了详细研 究。宫小燕等人【9 2 1 从活性污泥中筛选培养了假单胞菌p s e u d o m o n a ss p g x 4 1 ，对高岭 土悬浊液絮凝效果好。柴晓利等人【9 3 】研制的氮单孢菌生产的絮凝剂处理生活污水时效 果较好，且对造纸、染料、皮革废水的脱色效果非常明显。胡筱敏等人【9 4 1 从土壤中分 离了一株产生絮凝剂的芽孢杆菌a 9 ，絮凝黄浆废水效果好，药剂用量少且不需助凝 剂。湛雪辉等人嗍从污水中筛选出菌株1 1 ，所产絮凝剂絮凝率近8 6 。时红【9 研利用 筛选株t j 3 产生的微生物絮凝剂处理高岭土悬浊液，絮凝率达到9 2 4 。 目前，从事这方面研究的科研单位主要有：中科院成都生物研究所，南开大学， 东北大学，上海大学，大连理工大学，中科院微生物研究所，华南理工大学，黑龙江 科学院应用微生物研究所等。 1 2 8 2 微生物絮凝剂的发展方向 尽管目前已发现多种微生物絮凝剂，但对实际处理对象絮凝效果好，具有开发应 用价值的却不多。所以，今后微生物絮凝剂的研究将主要集中于以下几个方面： ( 1 ) 继续筛选微生物絮凝剂产生菌，希望获得高效、安全、稳定的菌株。选育高 效微生物絮凝剂产生菌，提高絮凝活性，降低絮凝剂用量，是微生物絮凝剂能否在工 业上推广应用的关键。 ( 2 ) 随着微生物絮凝剂工业化生产和应用的研究和推广，降低微生物絮凝剂生产 成本已显得十分重要。目前开发各种絮凝剂产生菌是在实验室中以葡萄糖、果糖、半 乳糖、甘露醇等作为有机碳源，以酵母浸出汁、牛肉膏、蛋白胨，酪蛋白，氨基酸等 作为有机氮源，存在培养基成本高的缺点，严重的限制了微生物絮凝剂的适用性，因 此寻找开发廉价的代替品，作为絮凝剂产生菌的碳源和氮源以降低微生物絮凝剂的生 产成本，具有重要意义。 ( 3 ) 深入研究微生物絮凝剂的化学组成、理化性质、活性分布、絮凝性能，利用 基因工程的手段和生化工程的技术提高微生物絮凝剂的生产效率，并研究适用于工业 大生产的絮凝剂收获提取方法 ( 4 ) 研究高效微生物絮凝剂针对不同水质的处理情况，即能明显提高絮凝效果， 从而降低处理成本。 1 2 2 、研究目的和内容 2 1 研究目的 微生物絮