（环境工程专业论文）六氯苯厌氧降解菌群的降解机理初探.pdf

摘要 六氯苯厌氧降解菌群的降解机理初探 专业：环境工程 硕士生：曲婷 指导教师：贾晓珊教授 摘要 本论文综述了作为持久性有机污染物( p o p s ) 之一的六氯苯( h c b ) 的性 质、分类、危害和在自然界的分布状况，对六氯苯的各种去除方法进行了总结， 并深入阐述了氯苯类化合物特别是六氯苯微生物降解的机理研究进展。 本论文研究了厌氧培养环境中，六氯苯厌氧降解菌群的降解特性、分析了中 间产物，并在此基础上进行分离纯化，实验结果表明： ( 1 ) 适量的加入还原剂n a 2 s 可以还原环境中的氧气，为厌氧微生物创造更 适宜的条件。低浓度的丙酮对微生物的活性影响并不明显，因此，在氯苯降解特 性实验中可以忽略丙酮溶剂对微生物活性的影响。 ( 2 ) 外加葡萄糖明显提高了混合菌群对h c b 的降解活性，不加入葡萄糖时微 生物对h c b 的降解活性受到严重抑制，h c b 的降解非常缓慢，推测厌氧污泥对 h c b 的降解过程中，有机碳源( 葡萄糖) 的存在也许是一个必要条件。 ( 3 ) 脱氯反应是一个共代谢的过程，葡萄糖起到了初级生长物质的作用，微 生物的生长提供碳源和能源，使具有潜在脱氯活性的生物量增加，从而加快了对 六氯苯的降解。 ( 4 ) 产酸培养反应器中检测到h c b ，p c b 和1 ，2 ，4 t c b 。其由此可以推测， 连续流反应器内有h c b 降解的中间产物p c b 。这表明，本实验室长期h c b 驯化 获得的厌氧污泥降解h c b 的途径至少有h c b 脱氯至p c b ，再脱氯至l ，2 , 4 t c b ； 1 ，2 ，4 t c b 继续被微生物分解而实现h c b 降解这一路径。 摘要 ( 5 ) 以六氯苯驯化的产酸培养菌群对h c b 、1 , 2 ，4 t c b 和1 ，2 ，3 t c b 同样也具 有很好的降解活性。1 , 2 ，4 t c b 的降解活性大于h c b ，这说明在反应器内h c b 的 降解相对缓慢一些，而l ，2 ，4 一t c b 没有明显的积累，这与我们连续流反应器取样 分析的结果也是吻合的。 ( 6 ) 以六氯苯驯化的产甲烷培养菌群无论是单种氯苯存在下还是多种氯苯存 在下对1 ，2 ，4 - t c b 和l ，2 ，4 ，5 - t e c b 和h c b 都有很好的降解活性。无论是单 独培养还是混合培养条件下微生物对l ，2 ，4 ，5 t e c b 和l ，2 ，4 一t c b 的降解活性均 大于h c b 。 ( 7 ) 分离获得3 株菌株，分别命名为h 1 、h 2 和h 3 。三种菌株不能以h c b 为 唯一碳源生长，h 2 、h 3 菌株可以在葡萄糖和h c b 共同存在时分解葡萄糖生长。 【关键词】厌氧微生物六氯苯共代谢 1 1 p r i m a r ys t u d yo fd e g r a d a t i o nm e c h a n i s m f o rh e x a c h l o r o b e n z e n e d e g r a d i n g a n a e r o b i cc o n s o r t i u m m a j o r ： n a m e - e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g q u t i n g s u p e r v i s o r ：p r o f j i ax i a o - s h a n a b s t r a c t a so n eo fp e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ( p o p s ) ，h e x a c h l o r o b e n z e n e ( h c b ) s c h a r a c t e r , c a t e g o r y , h a z a r d ，d i s t r i b u t i o ni nn a t u r ea sw e l l a si t st r e a t m e n tm e t h o d s w e r er e v i e w e di nt h i st h e s i s m o r e o v e r , t h i sp a p e rw e n td e e pi n t ot h ed e v e l o p m e n to f b i o d e g r a d a t i o nm e c h a n i s mo f c h l o r o b e n z e n e s ，e s p e c i a l l yh c b t h i sp a p e rs t u d i e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ea n a e r o b i cd e g r a d a t i o no fh c bo n t h eb a s i so ft h ec u l t u r ea n dd o m e s t i c a t i o no fa n a e r o b i cm i c r o o r g a n i s m s a n dt h e n ， a n a l y s et h ee m i f i ni s h e dp r o d u c to fh c bd e g r a d a t i o n ，a tl a s tb a c t e r i aw a sc h o s e ni n a n a e r o b i ci n c u b a t o rw i t hs p r e a d i n gp l a t em e t h o da n d d r a w i n gl i n e s m e t h o d t h e r e s u l t so f t h e s ee x p e r i m e n t sa r ea sf o l l o w s ( 1 ) p r o p e rs u l f e r e t e dn a t r i u mc a nr e d u c eo x y g e n ，c r e a t eb e t t e rs u r r o u n d i n g sf o r a n a e r o b i cs l u d g e ，in f l u e n c eo fl o wa c e t o n et oa n a e r o b i cm i c r o o r g a ni s mi sn o te v i d e n t a n dc a nb ei g n o r e d ( 2 ) g l u c o s ec a ni m p r o v et h ed e g r a d a t i o no fh c bs i g n i f i c a n t l y ，t h ed e g r a d a t i o n c a p a b i l i t y o fm i c r o o r g a n i s m st oh c bh a db e e n s e r i o u s l y r e s t r a i n e dw i t h o u t g l u c o s e ，t h e r e f o r et h ed e g r a d a t i o no fh c bw a sv e r ys l o w i tw a si m p o r t a n tt h a ta d d i n g c a r b o ns o u r c et ot h er e a c t i o ns y s t e m ( 3 ) r e d u c t i v ed e c h l o r i n a t i o nm a i l yb yc o - m e t a b o l i s m h c bw a sd e g r a d e db y i l l a b s t r a c t m i xc u l t u r e dm i c r o o r g a n i s m st h r o u g ht h e i rc o o p e r a t i o na n ds y m b i o s i s b i o m a s st h a t h a dp o t e n t i a la b i l i t yo fd e c h l o r i n a t i o ni n c r e a s e d ，s ot h es p e e do fd e c h l o r i n a t i o nw a s q u i k e n ( 4 ) t h e r ew e r ei n t e r m e d i a t ep r o d u c t so fp c ba n d1 ，2 ，4 一t r i c h l o r o b e n z e n ei n t h er e a t i o no fh c bd e g r a d a t i o n i ts h o w e dt h ed e g r a d a t m no fh c bw a sp e r h a p s t h r o u g ht h ed e c h i o r i d i z i n g i ts u g g e s t e dt h a td e g r a d a t i o no fh c bi na n a e r o b i cm i x c u l t u r er e a c t i o nm a yi n c l u d et h ef o l l o w i n g sr e a c t i o n ：t h eh c bw a sd e c h l o r i d m e dt o p c b ，t h e nt h ep c bw a sr e d e c h l o r i di z e dt o1 ，2 ，4 一t c b ( 5 ) a c i dp r o d u c i n ga n a e r o b i cm i xc u l t u r e dm i c r o o r g a m i s m st h r o u g hl o n gp e r i o d s o fh c bd o m e s t i c a t i o na d g o o dd e g r a d a t i o na b i l i t yf o rh c b ，1 , 2 ，4 - t c ba n d 1 , 2 ，3 - t c b ；i ts h o w e dt h a tt h ed e g r a d a t i o no fh c bi nt h er e a c t o ri ss l o w e r ，t h e r ei sn o a c c u m u l a t i o no f1 , 2 ，4 - t c ba n d1 , 2 ，4 ，5 - t e c b ，t h i si ss a m ew i t ht h er e s u l to fr e a c t o r a n a l y s i s ( 6 ) m e t h a n ep r o d u c i n ga n a e r o b i cm i xc u l t u r e dm i c r o o r g a n i s m st h r o u g hl o n g p e r i o d so fh c bd o m e s t i c a t i o ni nt h i sr e a c t o rh a db e t t e rd e g r a d a t i o na b i l i t yf o r c h l o r o b e n z e n eh o m o l o g1 ，2 ，4 ，5 - t e t r a c h l o r o b e n z e n ea n d1 ，2 ，4 一t r i c h l o r o b e n z e n e t h a nh c b ( 7 ) t h r e es t r a i nc e l l sw e r eo b t a i n e db ys e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，c a l l e dh 1 、 h 2 、h 3 ，o w e v e r ，t h e s et h r e es t r a i n sc a nn o tg r o w t hw i t hh c ba so n l yc a r b o n s o u r c e ，h 2 、h 3c a ng r o w t hw i t hg l u c o s ea n dh c b k e y w o r d s ：a n a e r o b i c m i c r o o r g a n i s mh e x a c h l o r o b e n z e n e ( h c b ) c o m e t a b ol i s m i v 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容 外，本论文不包含任何他人或集体已经发表或撰写过的作品或成 果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：f 曲亏 e l 期：刎年月j | ) - - e l 学位论文使用授权声明 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论 文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复 制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位 论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：曲娉 日期：硼3 年6 月j2 ，日 导师签名： 日期：年月日 前言 上i - - 刖吾 工业革命极大地改变了人类社会文明发展的进程，使人们在享受工业文明创 造的丰硕果实的同时，也遭受了随之而来的环境污染和生态破坏的危害。 2 0 世纪5 0 年代至今，全世界大规模生产化学品，全球人工合成有机化合物 的数量和种类不断增加，给我们的生活带来了很大影响。一方面，人t 合成有机 化合物的使用，使我们的生活变得非常便利，许多生活用品、生产资料的生产过 程中，都用到了人工合成有机化合物。另一方面，这些有机物在生产和使用过程 中，通过各种途径流失到环境中，丽且往往难分解，有剧毒，长期残留在环境中， 对人类健康及生态安全构成严重的威胁。因此人工合成有毒有机污染物的污染和 危害已经成为当前世界上重大的环境问题之一。 2 0 0 1 年5 月2 3 日，包括中国在内的9 0 个国家的环境部长或高级官员在瑞 典斯德哥尔摩代表各自政府签署了“关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约”， 从而正式启动了人类向有机污染物宣战的进程。根据该公约，行缔约国将通过法 律，禁止或限制使用12 种对人体健康和自然环境特别有害的持久性有机污染物 ( p o p s ) 【l 】。这些污染物能够沿食物链传播，在动物体内的脂肪上聚集。它们还 会引起过敏、先天缺陷、癌症、免疫系统和生殖系统受损。这些污染物已经在土 壤和水里残存了儿十年，它们不仅难于进行生物降解，而且流动性很强，能够通 过自然循环散布到世界各地。 六氯苯( h e x a c h l o r o b e n z e n e ，简称h c b ) 是一种典型的p o p s ，它在水体、土 壤、大气以及哺乳类动物、龟类和植物等生物体中广泛存在 7 - 1 1 ，而国内对于氯 苯类化合物的基础研究和应用研究还比较薄弱，所以它敦促科研人员应就其种 类、来源、迁移转化规律、降解机理、去除方法等方面展开系统深入的研究。 本研究即是基丁上述情况，研究了经过六氯苯驯化的厌氧微生物菌群对六氯 苯的降解特性及产生的中间产物，纯种菌株的分离、纯化，以期为六氯苯及p o p s 的监测、管理做出贡献。 第一章绪论 第1 章绪论 1 1 持久性有机污染物概述 1 1 1 持久性有机污染物的定义及其来源 持久性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，以下简称p o p s ) 是指具有长 期残留性、生物蓄积性、半挥发性帮高毒性，并通过各种环境介震( 大气、水、 土壤等) 能够长距离迁移并对人类健康和环境造成严重危害的天然或人工合成有 机纯合物 2 1 。 世界上p o p s 种类繁多，达数千种，可以分为氯代芳香族化含物、多环芳烃、 杂琢化合物、有枫氰化合物以及合成高分子有机物等几类，其中许多是含蠢特殊 化学结构的同系物和异构体。目前受到各国关注的主要有3 类1 6 种，分别是： ( 1 ) 杀虫剂：滴滴涕、氯丹、灭蚁灵、艾氏裁、狄氏裁、异狱氏裁、七氯、毒 杀酚、林丹和六氯苯；( 2 ) t 业化学品：多氯联苯、多环芳烃、多氯酚和六溴 联苯；( 3 ) 故意生产豹工业副产物：二嚼荚和多氯代二苯并呋嚷强4 1 。这1 6 种p o p s 当中，绝大多数属下有机氯化合物。这也说明了有机氯化合物是世界各 圉政府、环境专家以及学者芙注的焦点和研究的重点。 p o p s 既有天然的，也有人工合成的，以人工合成的居多，因其性能优良， 翔途多丽被广泛地生产、使用和排敖【期。农药是p o p s 的一个非常曩要来源，我国 使用农药始于上个世纪的5 0 年代，作为一个农业大国生产和使用的农药主要是有 机氯农药，其中滴滴涕、氯丹在7 0 年代使用较多，占农药使用量的8 0 以上，现 在许多国家已经停止使用这些农药，但这些污染物质在环境中可以存留几十年甚 至儿百年，至今在水果、蔬菜、农作物及土壤中检出率仍相当离，其对环境的影 响仍没有消失。p o p s 还来源于工业生产过程中，有些p o p s 是作为工业产鼎在使 用过程中释放到环境中，有些则是由于不恰当的处置、事故或老化的设备泄露等 非故意释放的。多氯联苯( p c b s ) 主要用丁制造电力行业使用的电容器的浸渍剂和 油漆添加剂，我国政府曾组织过针对全国的p c b s 污染物状况调蠢，根据调查结 果分析，我国p c b s 污染物的存有量在2 万吨左右。p o p s 还来源予燃料燃烧等过 第一章绪论 程中产生的副产品，如二嗯英p c d d s 和呋喃p c d f s 等。在1 2 种p o p s 类物质中， 以二嗯英( p c d d s ) 和呋喃( p c d f s ) 的环境特性和生物毒性相对较复杂，对生物体的 危害损伤较严重【2 ，6 1 。 1 1 2 我国持久性有机污染物的污染现状 我国环境污染尤其是有机物污染日趋严重，p o p s 在水体、底泥、土壤等环 境介质以及农作物、家畜家禽、野生动物，甚至人体组织、乳汁和血液中均有被 检出的报道。近年来我国进行了一些水体的环境污染调查，在长江黄石段检出 有机物1 0 0 多种，松花江哈尔滨段检出有机物2 6 4 种，第二松花江吉林段检出有 机物4 1 7 种，珠江检出有机物2 4 1 种，上海市黄浦江水源中检出有机物4 0 0 多种， 太湖检出有机物7 4 种。这些数据表明，有机物污染隋况不容乐观【2 】o 调查发现在天津市郊污灌地区的3 块代表性农田的土壤、北京近郊土壤等一 些地区都有不同程度的d d t 残留。由于有机氯农药具有很强的生物富集性，因 此生物体内有机氯农药的含量比较高。杨燕红等采用g c e c d 对珠江三角洲几个 城市的污水及深圳河、大沙河中的有机氯农药进行了初步探查，结果表明，几种 有机氯农药尽管已经停止生产多年，但在污水及河水中仍有残留，其中d d t 及其 衍生物d d e 含量达0 0 2 0 5 0m g l t l2 1 。 储少岗等对我国浙江东南沿海受p c b s 污染地区村落附近的农田样品进行分 析，发现土壤污染较为严重。水生生物体内p c b s 的调查结果表明，我国长江口 以北从鸭绿江口至长江口的符种经济贝类均受到了p c b s 的污染，p c b s 含量最高 的是山东蓬莱贻贝。由于p c b s 具有很高的生物富集性，因此，水生生物体内较 低浓度的p c b s 含量就有可能对人类的健康构成严重的威胁，必须引起人们足够 的重视。 1 2 氯苯类化合物的性质、污染及其去除方法的研究 1 2 1 氯苯类化合物的性质及环境行为 3 第一肇绪论 氯苯类有机化合物( c h l o r o b e n z e n e s ，c b s ) 是苯环上的氢被1 个或多个氯取代 的芳香族氯化物，在环境中普遍存在，是一类物理化学性质极为稳定，不易溶解 或难溶于水的人工合成有机化合物。c b s 被广泛用作合成染料、芳香剂和农药等 的中间体，溶剂，印染载体的添加剂，绝缘液体，居室防蛀剂和卫生间除臭剂等， 中国1 9 9 1 年c bs 生产能力约l 。4 x 1 0 5t a ，居世界第2 位，1 9 9 4 年，生产能力已达1 7 5 x 1 0 5t a 跃居世界第一位，2 0 0 1 年c b s 实际产量已达到2 2 1 0 5t a 。c bs 具 有较强的毒性，一氯苯( m c b ) 、对二氯苯( p - 2 d c b ) 、闻二氯苯枷一2 d c b ) 、邻二 氯苯( d 一2 d c b ) 、1 ，2 ，4 三氯苯( 1 ，2 ，4 - t c b ) 、六氯苯( h c b ) 已被美国国家环保局 ( e p a ) 列为优先控制污染物阐。一氯苯( m c b ) 、邻二氯苯( 1 ，2 - d c b ) 、对二 氯苯( 1 ，4 - d c b ) 以及六氯苯( h c b ) 被列入我国水中优先监测污染物的黑名单 【湖。迄今为止，c bs 在大气、承、蔬菜、底泥、污泥中均己检盘 4 1 ，对人体健康 可造成严重的影响和对生态系统构成严重的威胁。 1 2 1 1 氯苯类化合物的性质 氯苯类化合物( c b s ) 包括一氯苯( m c b ) 、二氯苯( d c b s ) 、三氯苯( t c b s ) 、四 氯苯( t e c b s ) 、五氯苯( p c b ) 、六氯苯( h c b ) 。氯苯类化合物的基本理化性矮见表 1 【1 5 ，1 6 】。由袭可看到，1 , 2 ，4 。三氯苯的空气水分配常数是三种三氯苯中最低的， 也就是说它是三氯苯中最难挥发的，丽l ，3 ，5 一三氯苯的空气水分配常数是三种三 氯苯中最高的，也就足说它是三氯苯中最容易挥发的。在所有氯苯化合物中六氯 苯的熔点、沸点和辛醇一水分配系数最高，溶解度最低，空气一水分配常数仪小于 五氯苯，即其性质最稳定，最难溶于水，极难挥发。 4 第一章绪论 氯苯c 6 h 5 c l 1 1 2 61 1 1- 4 5 21 3 2 03 2 02 3 9 1 , 2 - 二氯苯c 6 h 4 c 1 2 1 4 7 0 1 3 0- 17 0 1 8 0 02 3 03 0 5 1 , 3 - 二氯苯c d j l 4 c 1 2 1 4 7 01 2 9- 2 4 71 7 3 02 4 53 0 8 1 , 4 一二氯苯c d - 1 4 c 1 2 1 4 7 01 2 55 3 11 7 4 02 0 53 3 0 l ，2 ，3 一三氯苯 c d - 1 3 c 1 3 1 8 1 5 l ，2 ，4 三氯苯 c 6 h 3 c i ， 1 8 1 5 l ，3 ，5 三氯苯c 6 h 3 c 1 3 1 8 1 5 1 ，2 ，3 ，4 - 四氯苯c 6 h 2 c 1 4 2 1 5 9 l ，2 ，3 ，5 - 四氯苯c 6 h 2 c 1 4 2 1 5 9 l 245 四氯苯c 6 h 2 c 1 4 2 1 5 9 五氯苯c 6 h c l 5 2 5 0 3 六氯苯c 6 c 1 6 2 8 4 8 2 02 1 8 51 4 5 1 7 o2 1 3 51 5 8 6 3 52 0 8 01 5 0 4 7 52 5 4 00 7 5 5 4 52 4 6 0 1 0 0 1 4 0 02 4 3 0 - 0 1 4 8 6 02 7 7 0 - 0 6 6 2 3 0 03 2 2 0 2 6 0 o 8 02 7 8 ( 0 8 2 e x p ) 1 0 4 3 4 0 ( 1 0 0 e x p ) o 8 63 4 7 ( o 8 2 e x p ) 1 0 43 4 5 ( o 8 2 e x p ) 1 o l4 1 4 1 0 34 0 6 0 3 64 1 9 0 9 5 4 6 4 o 6 04 6 6 1 3 04 7 2 1 4 75 1 8 1 4 45 8 0 ( 1 5 4 e x p ) 注：m 一摩尔浓度；p 一比重；t m 一熔点；n 一沸点；矿一蒸汽压；c i w s a t 一溶解度；k i 。一空 气水分配常数；k i 。一辛醇一水分配系数；k i 。一酸度常数 氯苯类化合物的毒性表现在以下几个方面： ( 1 ) 对动物的毒性。 许多氯烃有机污染物对鱼类可产生急性毒性。周宇等【2 4 1 初步研究了氯代苯 类化合物对斑马鱼胚胎的单一和联合毒性效应，实验选用一氯苯、对二氯苯、三 氯苯、四氯苯等4 种氯苯类化合物进行斑马鱼胚胎毒性试验，对暴露于不同组分 和不同浓度化合物中的鱼卵，通过观察其不同发育阶段的形态变化，结果发现， 3 种氯代苯对斑马鱼胚胎发育过程具有毒性效应，并且随着苯环上氯原子数的增 加而增强，即一氯苯 香港大埔 无锡 香港元朗 广州 佛i l l 香港沙田 西安 珠海 深 圳。各城市污泥的c b s 都是以个别或少数化合物为主，显示出不同的分布特征， 主要是l ，2 ，4 三氯苯和六氯苯。土壤和沉积物中的高浓度正是冈为氯苯类化合物 的低水溶性特性所致。而土壤和沉积物的高残留将是导致植物组织中高残留的最 直接的因素。 7 第一章绪论 1 2 2 氯苯类化合物的去除方法 目前，国内外对氯苯类化合物去除方法的研究主要涉及物理法、化学法和微 生物法三个方向。物理法的原理是根据氯苯类化合物的物理特性，剩用吸附、吹 脱、气提、萃取等方法将其从气、液、同相中分离出来。化学法处理氯苯类化合 物可以分为化学氧化法和化学还原法。化学氧化法包括焚烧、浸式氧化、臭氧氧 化、过氧化氢氧化、f e n t e n 试剂法和光催化氧化法等。化学还原法比较常用的有 零价金属还原法和双金属催化还原法。 由于物理法处理氯苯类化合物只是将其从一个相转移到另外一个相，不是彻 底的降解，两化学法则面临着能源消耗大的闻题，因此，许多学者都将目光投向 了氯苯类化合物的微生物降解。 氯苯类生物降解机制可分为三类：氧化脱氯、还原脱氯和共代谢。氯苯类化 含物通常被认为是环境外来化合物，由于自然界中的微生物缺乏相应的降解酶， 所以难以被微生物利用。但是经过长期的接触驯化，有些微生物通过自然变种， 或通过形成诱导酶，丽逐步改变自身以适应环境，能够将氯苯类化合物降解或部 分化。迄今为止，许多学者已从土壤或水体中分离出这些微生物。以下分别介绍 这三种脱氯机制。 1 2 2 1 氯苯类化合物的氧化脱氯机制 在好氧条件下，氯苯类化合物的降解反应基本上遵循种相似的先开环再脱 氯的机制【2 6 】。首先在双加氧酶作用下，在芳环中插入氧原子，形成相应的环状 氯代二醇，再在去氢酶作用下，脱除两个氢原予转化为相应的氯代邻二酚。研究 表明，好氧生物体中不仅含有双加氧酶，而且还禽有可使苯环发生邻位裂解的酶。 该酶可健化氯代邻二酚邻位开环，生成相应的氯代粘康酸，此产物在内酯化过程 中脱除氯原子并被氧化成氯代马来酰基乙酸，最终进入兰羧酸循环。氯苯类化合 物的氧化脱氯还存在一种较少觅的先脱氯后开环再脱氯的催纯反应体系，即在单 加氧酶作用下，由羟基取代氯原子，臀经过单加氧酶的进一步作用，形成丌环裂 解的中间体氯代邻二酚，才能进一步降解。 3 第一章绪论 1 9 8 4 年，德国的r e i n e k e 及k n a c k m u s s 从污泥中分离富集出能够利用一氯苯为 唯一碳源的微生物【2 刀。1 9 8 8 年，美国的h a i g l e r 等从活性污泥中分离出假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s ) j s l 0 0 ，它能以邻二氯苯和一氯苯为唯一碳源和能源【2 引。1 9 9 1 年， 德国的p e t e rs a n d e r 等从工业废物处理场的土壤中驯化分离出p s u d o m o n a sp s l 2 和 p s l 4 ，能够降解一氯苯、三种二氯苯、1 ，2 ，4 一三氯苯和l ，2 ，4 ，5 一四氯苯2 9 1 。1 9 9 8 年，德国学者p o t r a w f k e 和他的伙伴经过3 年驯化，分离出能够以1 , 2 ，3 ，4 一四氯苯 为唯一碳源和能源的好氧微生物p s e u d o m o n a sc h l o r o r a p h i s 3 0 1 。 随着氯取代数的增加，氯苯类氧化脱氯的难度会逐渐加大，达到五氯苯和六氯 苯时，好氧生物降解就出现了困难。因此研究人员将目光投向了还原脱氯的厌氧 微生物菌群。 1 2 2 2 氯苯类化合物的还原脱氯机制 还原脱氯是指氯苯类化合物在得到电子的同时去掉一个氯取代基，并释放出 一个氯阴离子的过程【3 1 1 。由_ 丁氯原子强烈吸引电子云，使苯环上电子云密度降 低，在好氧条件下，氧化酶很难从苯环上获取电子而发生亲电反应；氯原子数越 多，苯环上电子云密度越低，亲电反应越困难，因而迄今为止没有五氯苯和六氯 苯好氧脱氯的报道。而在厌氧条件下，环境的氧化还原电位较低，微生物可以较 容易的对氯苯类化合物发生亲核反应，氯苯类化合物显示出较好的厌氧生物降解 性。许多在好氧条件下难于降解的有机物在厌氧下变得能够甚至容易降解。还原 脱氯使氯原子数减少，降低这些难降解有机物毒性，易于被别的微生物同化【2 6 。 像大多数厌氧反应一样，还原脱氯需要多种微生物的参与。这是因为多种微 生物共存易于创造厌氧环境，而且一种微生物要靠其他微生物作为电子受体和供 体，另外一种微生物可以借助其他微生物消除抑制性的中间代谢产物，从而使降 解进一步完成。但也有例外，目前己发现一种微生物d t i e d j e 能够独立进行还 原脱氯过程【3 引，不需要其他微生物的参与。研究表明，自然环境中存在可以降 解氯苯类化合物的厌氧细菌，在含有氯苯类化合物的河流、土壤等深层缺氧层中 及鼠类肠容物中都发现了能降解氯苯的厌氰细菌 3 3 - 3 7 】。 2 0 0 4 年，本实验室在厌氧微生物菌群对氯苯类化合物的耐毒特性等方面进 9 第一章绪论 行了研究，确定了氯苯类化合物对厌氧产甲烷微生物菌群的确存在毒性作用，不 过同时也再次验证了该微生物菌群对于六氯苯的确具有一定的降解能力，可以对 其进行驯化培养，找出高效菌种。 1 2 2 3 共代谢降解机制 “共代谢”的概念来源于p e t e r 和f o s t e r 提出的“共氧化” 3 7 1 ，其定义为在生 长基质存在时对不可利用基质的氧化。j e n s o n 将此概念一般化，提出“共代谢”， 现在一般定义为只有在初级能源物质存在时才能进行的化合物的生物降解过程。 不仅包括细胞在对生长基质代谢过程中对非生长基质的共同氧化，也包括休眠细 胞( r e s t i n gc e l l s ) 对非生长基质的代谢，此时共代谢的能量来自细胞的内源呼吸。 共代谢被认为是由于初级基质诱导产生的酶和辅助因子缺乏专一性所致。由 于代谢所需的酶来源于初级基质的代谢，因此对次级基质的共代谢活性取决于对 初级基质的利用。如德国的p r b r u n s b a c h 等在研究一氯苯、l ，4 二氯苯的生物 降解时，发现该微生物能共代谢l ，2 二氯苯和l ，2 ，4 三氯苯。但当生长基质消 耗殆尽时，l ，2 二氯苯和l ，2 ，4 三氯苯不再降解。由于共代谢体系中的酶缺乏 专一性，在一个同时存在2 种基质的体系内，必然存在着对所需酶的竞争作用， 两种基质的代谢速率之间存在着相互作用。在上述研究中，l ，2 二氯苯和l ，2 ，4 三氯苯的引入，降低了一氯苯的代谢速率，是细胞对生长基质的利用产生明显滞 后。 1 3 六氯苯生物降解的研究进展 六氯苯通常被认为是环境外来化合物，自然界中的微生物缺乏相应的降解 酶，难以被微生物利用，在自然界中降解很慢。此前，国内外对六氯苯的生物降 解研究不多，六氯苯降解菌的分离筛选工作也做的不多，但目前大量的符国研究 人员正对微生物的富集、分离及菌种鉴定、降解脱氯机理、第二基质存在时的诱 导、对同类有机物的共代谢等生物降解性能和机理进行着大量的研究。 1 0 第章绪论 影响有机物生物降解的因素主要有环境条件、微生物状况和待降解有机物的 结构特性三个方耐3 8 1 。 环境条件包括温度、p h 值、营养元素和有毒物质的浓度等，环境条件改变， 微生物降解有机物的效率将会改变。 微生物状况包括微生物的种类、数量，一般微生物未必具备降解氯苯类化合 物的酶系统，但是可以通过对其进行驯化使它产生此种酶系统。 待降解有机物的结构特性是决定微生物能否将其降解的内在冈索。与生命物 质的分子结构越是类似的有机物，越容易被微生物降解。非生命有机物分子中常 含有生理学中少见或完全不存在的某些特殊的基团，这些特殊基团的性质、数量、 位置都会影响有机物的生物降解性能。卤素、氮基、氰基等特殊的基团，都会使 有机物的生物降解性能大大降低。 1 3 1 六氯苯的好氧生物降解 从h c b 的结构可以看出，六个氯取代基的引入降低了苯环上电子云密度， 在好氧条件下，氧化酶很难从苯环上获取电子而发生亲电反应。 赵建夫【3 9 1 采用连续、完全混合活性污泥法进行了对包括h c b 在内的六种氯 代苯类化合物的生物降解性能研究。结果表明，在2 8 d 的连续试验中，h c b 基 本上不能被微生物降解。 刘婷等【4 0 1 从某化工厂排水沟底泥中取样，经2 个月的富集驯化得到h c b 好 氧降解菌群。微生物的累积好氧量曲线和生长曲线表明，该菌群能够以h c b 为 唯一碳源和能源生长。当培养温度为3 0 c ，p h 为7 0 时，该菌群能在1 8 d 内将 无机盐培养基中浓度为4 5 m g l 的六氯苯降解5 5 以上，降解速率达到 1 3 7 5 1 * g ( l d ) 。 闫达中等【4 1 ，4 2 1 进行了五氯酚降解菌s p h i n g o b i u mc h l o r o p h e n d 肠堋a t c c 3 9 7 2 3 对h c b 氧化脱氯的研究，利用同源重组方法将表达单元c c l ma 冶+ c 定点重组在 五氯酚降解菌a t c c 3 9 7 2 3 非必需基因p c p m 上，把五氯酚降解菌改造成六氯苯 降解菌z w y 0 0 5 。结果表明，反应温度3 0 。c 条件下，6 小时后0 4 3 1 x mh c b 大部 分完全降解为五氯酚，降解速率为o 6 7 n m o l ( m g j 干重h 。) ；并且中间产物五 第一章绪论 氯酚也会很快降解。 1 3 2 六氯苯的厌氧生物降解 贾青竹等【4 3 1 以采自某一堆粪池的污泥为种泥研究了h c b 在辽河沉积物中的 缺氧降解动力学。结果显示：在缺氧条件下h c b 可以被微生物缓慢降解，当外 加有机碳源葡萄糖和乙酸钠后h c b 的生物降解速率有显著提高，h c b 的缺氧生 物降解符合准一级动力学方程，动力学常数分别为l 【( 不外加有棚炭源) _ o 0 0 1 4 d ，k ( 葡 萄糖) = 0 0 0 3 3 d 一，k ( 乙酸钠) = 0 0 0 5 2 d 。 陈朱蕾等从武汉某化工厂排水沟底泥中分离出4 株能以六氯苯为唯一碳源 和能源生长的厌氧降解菌，并对单菌株和混合菌株降解六氯苯的能力进行了比 较，发现混合菌株比单菌株对六氯苯有更好的降解能力，混合菌株的种类越多， 降解效果越好。同时对混合菌群降解六氯苯的最适条件进行了研究，确定了混合 菌群降解六氯苯的最适条件为p h 值7 0 、温度3 0 c 、六氯苯浓度为3 m g l ，在 最适实验条件下混合培养物对h c b 的降解率达到了8 0 4 4 1 。 其它国家和地区的研究中，分离单株降解菌的研究也不多，他们研究的大多 数为混合菌群的降解特性。目前研究人员已经观察到在土壤和水中h c b 的微生 物降解。 陈意铭等 4 5 1 发现来自沉积物的厌氧混合培养物经过长时间的h c b 驯化以后 对p c b 和h c b 有了降解能力，h c b 的降解产物为l ，3 ，5 t c b 。研究结果表明， h c b 脱氯至1 ，3 ，5 t c b ，不是单一微生物所致，而是不同的几种微生物共同作用 的结果。 d , - i c i o 等【4 6 1 进行了担子菌类对由于- t 业残渣而被h c b 污染土壤的生物降解 能力研究。结果表明，在6 5 d 的反应时间内p s h o c y b ec f c a s t a n e l l ac c b 4 4 4 和 l e n t i n u sc f z e y h e r ic c b 2 7 4 消除h c b 的能力分别为3 1 5 0 和1 4 0 0 m g k g ( 土壤) 。 m a t h e u s 等从受到污染的土壤中筛选到1 9 株担子菌( b a s i d i o m y c e t e s ) ，它们 对h c b 的耐受力可达5 , 0 0 0 - - - - - 5 0 ，0 0 0 m gh c b k g 土壤，并伴有低速率的c 0 2 产生 【4 7 】 o 王炯强4 8 1 测试了河川底泥原生菌种的脱氯能力，结果表明：某两河流底泥 1 2 第章绪论 原生菌种对h c b 的降解存在较长迟滞期( 1 2 0 天) ，且无法完全脱氯降解；泰 国运河底泥微生物具有对h c b 的脱氯能力，底泥与水比例越高的组别脱氯能力 越强，底泥水不论过滤与否都有h c b 脱氯作用发生，底泥水经厌氧前处理的时 间越长，对h c b 的脱氯能力越佳。 t o m o y a s u 掣4 9 】进行了河流沉积物中h c b 的生物降解研究。结果表明，h c b 在同一个河流、三个不同地段的沉积物中均能够生物降解，并且没有降解滞后期。 另外实验结果还表明，沉积物富含有机质时h c b 的降解速率会有一定的提高。 迄今为止，六氯苯的厌氧生物降解机理尚不十分明朗。 1 9 8 8 年，f a t h e p u r e 3 6 1 在研究的基础上，推测了六氯苯的厌氧脱氯途径如下： l ic i a 图l - i1 9 8 8 年f a t h e p u r e 推测的六氯苯脱氯途径 f i g u r e l - 1p a t h w a yo f d e c h l o r i n a t i o no f h c bp r e s u m e db yf a t h e p u r ei n1 9 8 8 结果表明，在厌氧污泥中h c b 脱氯至t c b 和d c b ：h c b 脱氯速率为 13 6 i _ t m o l l - i d 一。f a t h e p u r e 推测在此研究条件下，六氯苯通过两种途径降解，大 量的六氯苯转化成l ，3 , 5 三氯苯，其余则生成二氯苯，这可能是同时存在两种降 解途径不同的菌种。也说明苯环上三个氯原子的连续排列是不稳定的，中间的氯 原子与碳的结合力最弱，最容易被还原，借以保持更大的稳定度，当居中的氯原 予完全脱除，如形成l ，3 ，5 t c b 时脱氯反应停止，可见c b s 化合物的结构对其的 脱氯也有很大的影响。 19 9 3 年，r a m a n a n d 3 7 1 又提出了另外一个六氯苯脱氯途径： cc 第一章绪论 三率_ 率：砍： 三，文。 1 4 躐 谢淑一誓 占足y ay貘 a电q c 第一章绪论 兰墩一c i 一 图1 - 41 9 9 9 年s y y u a n 推测的六氯苯脱氯途径 f i g u r e1 - 4p a t h w a yo fd e c h l o r i n a t i o no fh c bp r e s u m e db ys y y u a ni n1 9 9 9 2 0 0 3 年，j a y a c h a n d r a n 5 2 1 等进行了纯培养物c b d b1 ( 对t e c b s 和t c b s 有 脱氯能力) 对h c b 和p c b 的厌氧降解能力研究，推测了h c b 和p c b 的厌氧降 解途径，如图1 1 4 所示。实线箭头表示h c b 的主要降解途径，可以看出h c b 降解的主要中间产物为l ，2 ，4 ，5 t e c b ，1 , 2 ，4 ，5 t e c b 继续脱氯至1 ，3 一d c b 和 1 4 d c b 。 兰礅一取乙 j i f c lc i c i ：6 审a c i 图l 一52 0 0 3 年j a y a c h a n d r a n 推测的六氯苯脱氯途径 f i g 1 5p a t h w a yo fd e c h l o r i n a t i o no fh c bp r e s u m e db yj a y a c h a n d r a ni n 2 0 0 3 2 0 0 4 年，f e r d i 5 3 1 研究了在