（农产品加工及贮藏工程专业论文）益生菌Lcasei+Zhang高密度培养工艺的研究.pdf

摘要 高密度培养研究是发酵剂制备过程中重要的环，对益生菌发酵乳制品的开 发与应用具有重要的理论和实际意义。本文以一株具有良好益生特性的益生菌三 c a s e iz h a n g 为研究对象，从培养基及培养条件的优化、底物抑制、营养物质的补 充等方面进行研究，完成了益生菌l c a s e iz h a n g 的高菌体密度培养及益生菌发酵 剂的制各。主要试验结果如下： 1 培养基的优化：通过单因素试验、正交试验和响应面设计得到l c a s e i z h a n g 菌体干重( y ) 对碳源( x 1 ) 、氦源( x 2 ) 、缓冲盐( x 3 ) 的多项回归方程为： y = 2 3 0 + 0 4 7 x l + 0 5 9 x 2 + 0 ，2 2 x 3 + 0 1 8 x l x 2 + 0 1 6 x l x 3 0 0 4 7 x 2 x 3 - - 0 2 5 x t 一o 2 7 x 2 z o 0 8 4 x 3 + 0 1 0 0 x l x 2 x 3 0 4 1 x l x 2 0 0 3 9 x 1 2 x 3 一o 2 0 x l x 2 二。 并根据此方程得到了优化培养基：葡萄糖2 0 9 9 l 、大豆蛋白胨1 0 ，4 5 9 l 、酵母 粉1 0 4 5 9 l 、磷酸氢二钾3 5 9 l 、乙酸钠1 4 6 9 l 、柠檬酸钠2 3 9 l 、m g s 0 4 7 h 2 0 l l 、m n s 0 4 5 h 2 05 4 m g l 、吐温一8 0l g l 。三c a s e iz h a n g 在此增殖培养基中经 3 7 1 8 h 培养活菌数可达到4 7 8 x 1 0 9 c f u m l 。 2 培养条件的优化：通过单因素试验，得到较适培养条件为：温度3 7 、摇 床转速0 r p m 、起始p h 6 5 、接种量为1 1 0 6c f u m l 。 3 生长动力学模型的推导：在优化培养基及培养条件确定的条件下选用 l o g i s t i ce q u a t i o n 作为l c a s e iz h a n g 细胞生长动力学模型，研究得出其方程为： ，、0 0 0 7 9 e o 4 7 1 6 t 姒u2f 丽0 面0 0 7 9 万忑5 5 丽) f 两 l 一( ，2 ，( 1 一eu 引埔) 4 发酵罐发酵条件的探索：在发酵罐( 3 l ) 中研究了不同培养条件和培养方式 对l c a s e iz h a n g 生长的影响，结果为： 培养温度：3 7 接种方式：种子液预培养1 0 h 后按7 接种( 1 5 ，( 1 0 8c f u m l ) 搅拌速度：3 0 0 r p m 中和剂g1 7 5 氨水 p h 值：5 9 ( 起始p h 6 5 ) 通气条件：间歇通氮气2 0 0 m l 2 h 培养方式：一次性加入补料所需营养物质 培养基成份：葡萄糖8 0 8 l 、酵母粉8 0 2 l 、大豆蛋白胨1 2 8 9 l 、磷酸氢 二钾3 1 8 l 、乙酸钠1 3 2 7 9 l 、柠檬酸钠2 2 9 l 、m g s 0 4 7 h 2 0o 8 8 9 l 、 m n s 0 4 5 h 2 04 7 7 7 m g l 、吐温一8 00 8 8 9 l 。 在此培养基及培养条件下发酵1 2 小时，c a s e iz h a n g 活菌数可达到 3 ，o x 】0 1 0 c f u m 1 5 l c a s e iz h a n g 中试放大试验与菌粉的制备：在发酵罐较适培养基及培养条 件的基础上，在发酵罐( 3 0 l ) 中得到活菌数为2 8 9 x 1 0 1 0 c f u m l ，将该发酵液制得 发酵剂菌粉，活菌数可达4 0 x 1 0 1 1 c f u g ，活力为5 1 6 u 。 关键词：益生菌l a c t o b a c i l l u sc a s e iz h a n g ；培养基优化；高密度培养；发酵剂 s t u d i e so nh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r et e c h n o l o g yo f p r o b i o t i cl c a s e iz h a n g a b s t r a c t h i 曲c e l ld e n s i t yc u l t u r ei sa i li m p o r t a n tl i n ko fp r o b i o t i cs t a r t e rp r e p a r e s ，a n dp l a y s i m p o r t a n tr o l ei nd e v e l o p i n gp r o b i o t i cy o g h u r t o rf e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t s i nt h i sp a p e r , 厶c a s e iz h a n g ，ap o t e n t i a lp r o b i o t i cl a c t i cb a c t e r i a ，w a sc h o o s e na so r i g i n a lc u l t u r et o p r e p a r e s t a r t e rc u l t u r e o p t i m i z a t i o no fm e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n ，s u b s t r a t e i n h i b i t i o n ，n u t r i e n ts u p p l y , e ta 1 w e r es t u d i e dt oc o m p l e t et h eh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r e a n dp r o b i o t i cs t a r t e rp r e p a r e s i n g l ef a c t o rt e s t ，o r t h o g o n a l i t yt e s t ，r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sw e r eu s e dt od e s i g n t h em u l t i - r e g r e s s i o ne q u a t i o nw i t hc e l ld r yw e i g h to f 三c a s e iz h a n g ( y ) ，c a r b o n s o u r c e ( x 0 ，n i t r o g e ns o u r c e ( x z ) a n db u f f e rs a l t ( x 3 ) ： y 三2 3 0 + 0 4 7 x l + o 5 9 x 2 + o 2 2 x 3 + o 1 8 x l x 2 + o 1 6 x l x 3 0 0 4 7 x 2 x 3 0 2 5 x i 。一0 2 7 x 2 一 0 0 8 4 x 3 2 + 0 1 0 0 x l x z x 3 - - 0 4 1 x 1 2 x 2 - - o 0 3 9 x 1 2 x 3 - - 0 2 0 x l x 2 o p t i m a lm e d i u mw a sd e t e r m i n e db yt h em u l t i r e g r e s s i o ne q u a t i o n ： g l u c o s e 2 0 9g l ，s o yp e p t o n e10 4 5 9 l ，y e a s te x t r a c t10 4 5 9 l ，k 2 h p 0 43 s g l ，s o d i u m a c e t a t e1 4 6 9 l ，c i t r a t es o d i u m2 3 5 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 01 o g l ，m n s 0 4 。5 h 2 05 4 m g l ， t w e e n8 01 0g l c u l t i v a t e di nt h eo p t i m a lm e d i u mf o r18 ha t3 7 ( 2 ，t h el i v i n gc e l l so f l c a s e iz h a n gw e r ei n c r e a s e dt o4 7 8 x1 0 9 c f u m l 。 o p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o nw a so b t a i n e db ys i n g l ef a c t o rt e s t ：t e m p e r a t u r e3 7 c ， r e v o l u t i o ns p e e d0 r p m ，i n i t i a lp h 6 5 ，i n o c u l a t i o na m o u n t1xl0 0c f u m l o nt h eb a s i so fo p t i m a lm e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n ，t h eg r o w t hk i n e t i c sm o d e l w a so b t a i n e d ： ，、0 0 0 7 9 e o 椰2 x(t)=1-(00079255)(1-eo m r ) s t u d i e do nt h eg r o w t ho f 三e a s e lz h a n gi na3lf e r m e n t o r , r e s u l ts h o w e dt h e o p t i m u mf e r m e n t e dc o n d i t i o nw a s ：c u l t u r et e m p e r a t u r e3 7 。c ，i n o c u l a t i o n a m o u n t7 a f t e rs e e dl i q u i dw a sc u l t u r e df o r10 h ( 1 5x10 8c f u m l ) ，r e v o l u t i o ns p e e d3 0 0 r p m ， 17 5 a m m o n i aw a t e ra sn e u t r a l i z e r , p h 5 9 ( i n i t i a lp h 6 5 ) ，a d d e dn i t r o g e n2 0 0 m l 2 h ， s u p p l i e da l lt h en u t r i e n ta to n et i m e t h ef i n a lm e d i u mc o m p o n e n t s w e r e ： g l u c o s e8 0 8 9 l ，s o yp e p t o n e1 2 8 l ，y e a s te x t r a c t8 0 2 9 l ，k 2 h p 0 43 1 8 9 l ，s o d i u m a c e t a t e13 2 7 9 l ，c i t r a t es o d i u m 2 1 2 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0 o 8 8 9 l ，m n s 0 4 。5 h 2 0 4 7 7 7 m g l ，t w e e n8 0o 8 8 9 l c u l t i v a t e du n d e rt h eo p t i m u mf e r m e n t e dc o n d i t i o nf o r 1 2 h ，t h el i v i n gc e l l so f l c a s e iz h a n gw e r ei n c r e a s e dt o3 0 x 1 0 1 0 c f u m l a st h eb a s i so f o p t i m u mf e r m e n t e dc o n d i t i o ni n3 lf e r m e n t o r , c u l t i v a t e dt h el c a s e i z h a n gi na3 0 lf e r m e n t o r , t h e l i v i n g c e l l sw e r e2 8 9 x10 1 0 c f u m l ， m a d et h e f e r m e n t a t i o nb r o t ht op o w d e r , t h el i v i n gc e l l sw e r e4 0 10 1 1c f u m l ，a n dt h ec e l lv i t a l i t y w a s5 1 6 u k e yw o r d s ：p 阳b i o t i c h i g hc e l l l a c t o b a c i l l u sc a s e iz h a n g ； d e n s i t yc u 艮u r e ；s t a r t e r o p t i m i z a t i o no fm e d i u m ； d ir e c t e db y ：p r o f z h a n gh ep i n g ( p h d ) a p pl ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：g a op e n gf ei ( a g r i c u l t u r a lp r o d u c t s p r o c e s sa n ds t 。r a g e ) ( f o o ds c i e n c ea n de n g i n e e r i n gc o l l e g e ，i n n e rm o n g o l i aa g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y , h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢时 地方外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：壶丝塾日期：型 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 高鹂盈 内蒙古农业大学硕士学位论文 l 1 引言 1 1 益生菌发酵剂概述 1 1 1 益生菌 益生菌( p r o b i o t i c s ) ，也有译为“益生素、原生菌”等，它是早在1 9 0 7 年m e t c h n i k o f f 提出的发酵乳制品有助于健康长寿的理论中发展而来的。英文p r o b i o t i c s 一词源于 希腊语，意思是“为了生命 ( f o rl i v e ) ，与a n t i b i o t i c s 相对立。而它的现代定义则 最早在1 9 6 5 年被l i l l e y 和s f i l l w e l l 阐述为“由一种微生物分泌的刺激其他微生物 生长的物质或组织提取物 。此后随着对益生菌的研究的深入，益生菌定义也屡次被 修订。p a r k e r l 9 7 4 年将其表述为“有助于肠道菌群平衡的微生物及其相关物质”。后 来f u l l e r 将此定义修改为“能通过改善肠道微生物平衡而对宿主产生有益影响的微 生物活体制品川 。1 9 9 2 年，h a v e n a a r 等进一步扩展此定义为“单一或混合发酵的 微生物，能通过改善内源微生物的性质而对人或动物有益 。而最近的g u a m e r 等提 出的更精炼的定义为“当摄入一定量时能对宿主健康有作用的微生物活体 证1 。2 0 0 2 年，欧洲食品与饲料菌种协会( e f f c a ) 给出最新定义：益生菌是活的微生物，通过 摄入充足的数量，对宿主产生一种或多种特殊且经过论证的功能性健康益处。经过 数十年的发展，益生菌的含义日趋完善，益生菌数量及保健功效方面也都得到进一 步丰实，具有益生功效的新菌株不断地被筛选和鉴定一1 。 有关含益生菌的食品例如发酵奶的健康功效其历史纪录可追溯到几个世纪之 前，它们对人体的滋养和治疗作用甚至在圣经中也有提及璐1 。由于近年益生菌的研 究日益深入，益生菌发酵剂也已经开始应用于酸奶的生产。酸乳作为一种细菌发酵 型乳制品，逐渐由高酸性向低酸性发展，人们普遍喜爱低酸、低脂、富含营养素， 具有活性的酸乳。同时，酸乳也改变了使用传统的乳酸菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s a n dl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e k i i s s p b u g l a r i c u s ) 发酵而添加了益生菌，以提高其保健功能 咖。使用这些益生菌生产的酸奶进入消化道后，会抑制一些腐败微生物的生长与定 植，发挥其特殊的生理作用。含有益生菌的酸奶在世界各国较为流行，此类产品的 消费量呈上升趋势。目前法国1 l 的酸乳中添加了益生菌，占整个国家鲜奶销量的 4 7 - 1 列。 1 1 2 发酵剂 发酵剂( s t a r t e r ) 是精心筛选、适合用于发酵食品的微生物人工培养物 ( c u l t u r e s ) 。乳酸菌是最常见、也是最常用的细菌发酵剂，在许多发酵食品，如酸 奶、干酪、酸泡菜、葡萄酒、香肠和火腿的生产中，乳酸菌的作用都是必不可少的。 最早的发酵剂是采用少量已做好的酸奶作为种子，接种到加热处理的奶中以制 作新的酸奶，这种发酵剂牙q 做“天然发酵剂”。随着科学技术的发展，各种有用的微 生物逐渐为人们所发现，为了使这些微生物能更方便地为人类利用，从此开始了对 发酵剂进行一系列的研究和开发。人类使用发酵剂的历史经历了经验性和选择性发 2益生菌厶c a s e iz h a n g 高密度培养工艺的研究 酵剂两个阶段： ( 1 ) 经验性发酵剂是指取少量经自然发酵而成的酸乳或其它发酵物作为发酵 剂，接种在经加热处理过的乳或其它食品原料中，而制成的发酵制品，人们将其称 为“天然发酵剂”。在古代，人类尚未认识微生物之前，一直沿用这种“天然发酵剂” 来生产酸乳制品，今天在一些少数民族地区仍然沿用这种加工方法生产传统酸乳制 品，并且现代人们仍用这种方法来生产泡菜，酱菜等盐渍菜。 ( 2 ) 1 8 7 3 年，l i s t e r 最先从酸乳中分离并研究了乳酸链球菌，将分离制得的 纯乳酸菌作为发酵剂生产酸乳制品，从而引起了人们广泛的兴趣，从此开始了选择 性发酵剂的研究和应用。选择性发酵剂就是指用经分离纯化后的纯乳酸菌种制成发 酵剂，并可根据原料的不同，选择最适宜的产酸、产香菌种。早期的普通液体发酵 剂，也称为传统发酵剂。但这种发酵剂的含菌量低、接种量大、保藏期短、生产工 序多、周期长、质量不易控制、容易污染杂菌和噬菌体。由于这些弊端的存在，迫 使人们研制一种能直接用于生产的浓缩型发酵剂。 十九世纪末二十世纪初，西方一些科学家开始研制浓缩型发酵剂，直到1 9 6 3 年浓缩型发酵剂才进入商品化生产阶段，目前已形成了一定的产业化规模。最初制 成的是冷冻浓缩发酵剂，这种发酵剂即是对传统液体发酵剂进行浓缩以提高其茵含 量，并在冷冻条件下保存。但由于冷冻浓缩发酵剂在贮藏和运输中比较麻烦限制其 推广应用。 二十世纪七十年代至今，随着冷冻干燥技术的发展，可将离心分离后的高浓度 的乳酸菌悬浮液，添加抗冻保护剂，经冻结，再在真空条件下升华干燥制成干燥粉 末状的固体发酵剂一冻干浓缩发酵剂旧1 。 1 1 3 益生菌发酵剂的分类及组成 表1目前用于益生菌制品的菌株 目前用作益生菌的微生物主要是来源于人或动物，人们研究和应用比较多的是 内蒙古农业大学硕士学位论文3 乳杆菌和双歧杆菌这些可以产生乳酸的肠道菌，因此益生菌制品也经常使用这两个 属的菌，其中使用乳杆菌中的肠道菌株生产产品可以追溯到2 0 世纪3 0 年代。目前 常用于益生菌产品的菌株列于表l 中阻1 钉。 1 1 4 益生菌发酵剂的功能与应用 1 1 4 1 益生菌发酵剂的功能 益生菌发挥益生功能有两个前提条件：耐酸耐胆盐和吸附定值。益生菌被食入 人体后，菌体必须通过环境恶劣的胃液，同时要抵抗来自胰腺的胆汁盐，胃酸和胆 汁盐具有抗菌性。益生菌能否抵抗较强的酸性环境是在肠道中存活和发挥作用的先 决条件，而且其在人体肠道内存活能力高低直接关系到该菌体能否发挥健康促进作 用。据报道，为了防止有关疾病的发生，只有摄入含有1 0 6 c f u m l 以上的益生菌才 能充分发挥其健康促进的特性。应此，益生菌耐酸耐胆汁特性是益生菌能否作为功 能性食补因子的一项重要指标。吸附是细菌定植细胞的前提。益生菌一般不能在宿 主体内永久性的定植( 寄生宿主除外) 。大多数情况下，宿主在停止摄入益生菌的几 天至几周内，可以在粪便中检测到益生菌的存在，而后则逐渐消失。k os h i i n o 是这 样解释益生菌为什么不能永久定植的：每个个体都有自生独特的微生物菌群，任何 外源细菌都很难在其中定植下来。摄入的益生菌毕竟不同于肠道中天然菌群中的细 菌，因此大多数情况下都不能永久性定植。但是益生菌可以在肠道中生存一段时间， 为有益菌的生长创造良好的环境。因此，我们有必要持续摄入一定数量的益生菌聃3 。 益生菌的保健功能主要体现在以下方面： 抑制肠道致病菌、调节肠道免疫功能、防治多种类型腹泻； 刺激畅道蠕动、防止便秘和胃肠胀气； 促进生长、控制感染与增加营养素的消化利用率； 促进钙、镁、铁、锌和维生素d 的吸收； 减轻乳糖不耐受症状； 降低高血压、减低血中低密度脂蛋白胆固醇； 抗肿瘤作用； 提高对放射线的耐受性。 益生菌的代谢产物从简单的短链脂肪酸到一些人体必需，结构较复杂的有机酸如 叶酸、乳清酸等，这些化合物能使消化道的p h 降低，形成种酸性环境，并且对 宿主一系列的生理过程进行调节。乳酸菌在肠腔内释放的各种酶可以对消化过程起 协同作用，并减缓部分肠道吸收不良的症状，如在亚洲人群中最为常见的乳糖不耐 症等。细菌素等抗菌物质的产生能提高益生菌在体内的抗菌作用，增加了其作为生 物治疗方法的应用潜力一1 。此外，益生菌降低血清胆固醇水平和血脂浓度以及抗 高血压、抗肿瘤的作用成为近年来研究热点哺1 ，有大量的动物实验和临床试验对多 !堇竺堕墨：堡兰垒圣皇竺g 壹宣堕堡菱王茎笪塑窒 种益生乳酸菌的功能进行验证，同时进行的还有其对免疫功能的调节作用研究。一 般认为益生菌的这些功能与在发酵食品中产生的生物活性物质如生物活性肽和胞外 多糖等密切相关m 1 。 1 ，1 4 。2 益生菌发酵剂的应用 表2 市场上主要使用的典型益生菌 典型菌株生产公司 a c i d o p h i l u sn c f m l a c i d o p h i l u sd d s - 1 工a c i d o p h i l u ss b t - 2 0 6 2 l a c i d o p h i l u sl a - i & l a 5 l ，a c i d o p f i i l u sl 10 l c a s e is h i r o t a ，c a s e ii m m u n i t a s c a s e il 2 6 h e l v e t i c u sl 9 2 l f e r m e n t u mr c 1 4 l j o h n s o n i il a i & l j l l p a r a c a s e ic a l 4 3 l l p l a n t a r u m2 9 9 v z h r e u t e r is d 2 1 1 2 m m 2 三r h a r a b o $ 1 l $ g g r h a m n o s u sg r 1 l ，r h a m n o s u s2 7 1 厶r h a m n o s u sl b 2i s a l i v a r i t 4 5u c c l1 8 肠c f 括l l a l ，l d c t i sb b l 2 b 1 0 n g u ms b t 2 9 2 8 b 1 0 n g u mb b 5 3 6 口，b r e v ey a k u l t 法国罗地亚公司 美国纳贝斯克菌种公司 日本雪印乳品有限公司 丹麦汉森公司 荷兰d s m 公司 日本y a k u l t 公司 法国达能公司 荷兰d s m 公司 日本c a l p i s 公司 加拿大u r e x 生物技术公司 瑞士雀巢公司 丹麦汉森公司 瑞典p r o b i a b 公司 德国b i o g a i a 公司 芬兰v a l i o 乳品公司 加拿大u r e x 生物技术公司 瑞典p r o b i a b 公司 瑞典e s s u m 公司 爱尔兰大学 瑞典e s s u m 公司 丹麦汉森公司 日本雪印乳品有限公司 日本m o r i n n a g a 乳品有限公司 日本y a k u l t 公司 目前，益生菌在食品中的开发形式主要是与传统发酵剂配伍，制成酸乳、酸乳 酪、酸乳饮品等有利于人类健康的功能性乳制品。生产用菌株为单菌株或多菌株联 用，例如与某些酵母菌、醋酸菌等能够强花产品风味或物理性能、生产性能的菌株 内蒙吉农业大学硕士学位论文 5 混合使用。益生菌可参与发酵或不参与发酵直接添加，应用范围除了以食品方式经 口摄达肠道之外，还可以制成雾状以应用到上呼吸道，或以膏药方式涂到泌尿道进 行局部治疗。益生菌7 0 应用于乳制品中，其它含益生菌的膳食补充剂产品较多， 剂型的有胶囊、粉剂、口服液、片剂、并添加了其它成分，如：非乳载体、酸果提 取物、低聚果糖、免疫球蛋白、发酵副产物及其它生物活性物质。有些菌株有临床 实效，而以药品的形式作为整肠剂、止泻剂及医疗辅助用品。市场上主要使用的典 型益生菌列于表2 中哼1 。 1 2 发酵剂高密度培养的概述 高密度培养技术( h i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r e ) ，也就是高密度发酵技术。由于各 个菌种所能达到的最高菌体浓度相差较大，目前的文献中并没有对高密度培养有确 切的定义。一般来说，高密度培养是指应用一定的培养技术或装置提高菌体的发酵 密度，使菌体密度较传统培养方式有显著的提高，从而减少培养体积，还可以缩短 生产周期，最终提高特定产物的比生产速率，减少设备投资从而降低生产成本，提 高在市场上的竞争力n 训。 随着发酵剂的商业化生产和应用的迅速增加，工业发酵的基本目标自然转向了 以最小的代价获得最大的产值和利润，而实现这一目标的工程手段是针对每个特定 过程建立相应的高效发酵模式。因此，进行工业化生产，培养天然菌和工程菌的技 术和工艺就显得日趋重要。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、 高密度的培养h “矧。 1 3 发酵剂高密度培养的研究方法 1 3 1 物理条件的研究 对物理条件的研究主要是培养温度、初始p h 和对氧气的需求值三方面。对温 度的研究很多，由于来源不同、菌株不同和培养基等不同，所以最合适的培养温度 方面有一定的差异。吕加平等( 1 9 9 9 ) 研究了来源于酸奶的乳酸菌的最适合培养温度 为3 7 口引：黄良昌等、c h i a r as 等( 2 0 0 2 ) 研究的培养温度为4 0 m 一们；吕兵等( 2 0 0 2 ) 研究的乳酸菌最适合的培养温度为4 2 。c 阳】；熊晓辉等( 2 0 0 4 ) 研究了来源于泡菜发酵 的乳酸菌最适合的培养温度为3 7 t 2 “：孙翠焕等( 2 0 0 6 ) 研究的德氏乳杆菌保加利亚 亚种最佳培养温度为4 2 1 。在初始p h 值方面的研究，存在一定的差异。可能是 由于菌株来源不同、培养温度不同、培养基不同和种子活性不同等引起的。吕兵等 ( 2 0 0 1 ) 研究的最适初始p h 值为6 3 t 删；黄良昌等( 2 0 0 2 ) 研究的最适初始p h 值为 5 8 d 引；张兰威( 2 0 0 2 ) 研究的最适初始p h 值6 2 璐引：c h i a r as 等( 2 0 0 2 ) 研究的最适 初始p h 值为6 5 d 司；熊晓辉等( 2 0 0 4 ) 研究的最适初始p h 值为6 5 n ；高鹏飞等 ( 2 0 0 8 ) 对于酪乳杆菌进行研究，发现最适初始p h 为6 5 m 1 。在对氧气的需求方面 曼堇竺堕墨：竺兰型垫塑曼童宣壁堕菱三茎塑塑窒 一般认为绝大部分乳酸菌都是兼性厌氧的，国内外专门针对氧气影响菌体干重的研 究报道主要是通过摇瓶来做的，几乎没有测定具体的氧气含量，而摇瓶所使用的不 同摇床及瓶塞对氧气含量的影响较大，没有发现关于氧气含量是如何影响菌体干重 的相关报道。 1 3 2 培养基的研究 培养基是提供超浓缩培养过程中的营养物质，所以它对超浓缩培养的影响也是 很大的。由于超浓缩培养基的研究较多，也有很大差异，史媛英等( 1 9 9 9 ) 以脱脂奶 粉为基础培养基培养的保加利亚乳杆菌最高菌数达到2 5 8 1 0 1 0 c f u m l ，是由于在培 养过程中采用了补料( 培养4 h 后添加2 乳糖) 培养的方法m 1 。国外对培养基的研究 很少，基本上都是在m r s 培养基础上进行的改良，研究其中的一种或者几种特定的 成分对菌体生长的影响，如c a t e r i n et w ( 1 9 8 3 ) 研究了c a z + 和m 9 2 + 对保加利亚乳杆 菌生长的促进作用h 引；j u i l l a r dv d ( 1 9 9 5 ) 研究了在乳酸菌培养过程中寡肽是其主要 利用的氮源哪! ；g a u d r e a u h ( 1 9 9 9 ) 研究了酵母浸出物对乳酸菌生长促进作用的本质 研；l a h a p 等( 2 0 0 1 ) 研究了脂肪和脂肪酸作为生长因子促进乳酸茵生长b 。 1 3 3 培养方法的研究 大多数乳酸菌是产物抑制型发酵，发酵产生的乳酸严重影响乳酸菌的进一步增 殖，要想实现乳酸菌的超浓缩培养，必须除去发酵液中的乳酸，国内外关于乳酸菌 的超浓缩培养的方法，都是围绕着除去发酵液中的乳酸来进行的，一般采用如下几 种方法。 1 3 3 1 化学中和法 乳酸菌在生长繁殖过程中，代谢葡萄糖产生乳酸。随着酸度的升高，p h 值的降 低，菌体生长受到抑制。为了解除乳酸对乳酸菌的生长抑制作用，通常采用中和剂 来中和培养液中的乳酸。常用的中和剂有n a o h 、n i - - 1 3 h 2 0 、c a ( o h h 、n a 2 c 0 3 等。 l o u b i e r ep 等( 1 9 9 7 ) 认为n h 3 - h 2 0 的效果最好。在中和培养过程中，由于乳酸盐浓 度的不断增加，当它达到一定水平时，仍会抑制菌体的生长繁殖啼幻。孙翠焕等( 2 0 0 6 ) 研究的德氏乳杆菌保加利亚亚种最佳培养条件为氨水控制恒p h 为6 o 。浓缩培养 液中菌数可达9 1 5 1 0 9c f u m l h 羽。靳志强等( 2 0 0 7 ) 自动流加2 0 碳酸钠溶液保持p h 值6 2 恒定培养德氏乳杆菌保加利亚亚种s 1 ，菌体干重可达3 8 8 9 9 l t 3 1 。 1 3 3 2 缓冲盐法 向培养基中添加缓冲盐，调节培养液中的酸碱在一定范围内变动，不致酸度过 高，可促进菌体生长及繁殖。缓冲剂有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐和c a c 0 3 等，国 内蒙吉农业大学硕士学位论文 7 际上也有人利用乳中本身蛋白质和磷酸盐。在缓冲盐法浓缩培养的研究中，美国和 意大利处于领先地位，但其缓冲盐配方属于专利保密。山丽杰等( 2 0 0 2 ) 曾用质量分 数为2 0 2 9 的超滤浓缩奶和脱脂乳作为培养液，利用高浓度的蛋白和磷酸盐达 到缓冲效果嘲1 ：高松柏等( 1 9 9 1 ) 曾在质量分数为5 的脱脂乳水解液培养基中和质 量分数为1 2 脱脂乳培养基中分别加入缓冲盐a 和缓冲盐b ，4 0 培养8 h 和6 h ，乳 酸菌活菌数分别达到2 2 1 0 9 c f u m l 和6 5 1 0 9c f u m l ，是不加缓冲盐培养基的3 倍和6 倍叫；吕兵等( 1 9 9 6 ) 在含有质量分数为0 3 的酵母膏、质量分数为0 1 的 吐温8 0 的1 2 ( 质量分数) 脱脂乳培养基中，加入质量分数为o 5 的k 2 h p 0 4 作为 缓冲盐，4 2 c 培养4 h ，乳酸菌活菌数达到2 9 x 1 0 9e f u m l ，是起始培养基的2 倍以 上，在此基础上，添加质量分数为3 0 的n a 2 c 0 3 作为中和剂，控制培养基p h 值为 6 3 ，4 2 培养6 h ，乳酸菌活茵数达到5 8 9x 1 0 9 c f u r n l ，较起始培养基的活菌数 提高4 5 倍；冯友军等( 2 0 0 3 ) 应用1 0 柠檬酸( 钠) ，5 乙酸( 钠) 和2 丙酮酸钠 按一定比例复合而成的缓冲体系使乳酸菌菌体培养的发酵终浓度从2 2 2 x 1 0 8 c f u m l 提高到1 3 2 x1 0 9 c f u m l 晦引。由此看出，利用缓冲盐和化学中和法进行乳酸菌的浓缩 培养，菌体的增殖效果显而易见，但是要想达到很高的浓度也很困难，因为缓冲盐 的缓冲的作用是有一定范围的，况且高浓度的盐也会抑制菌体的生长。 1 3 3 3 吸附法 用合适的吸附剂通过吸附除去培养液中的乳酸等小分子有机酸来维持p h 值的稳 定。a r a d h a n as 等( 1 9 9 2 ) 用离子交换树脂来除去培养液中的乳酸，但是它也除去了 培养基中重要的阴离子，对茵体生长不利喳町。c h e r tc 。c ，等( 2 0 0 2 ) 利用聚乙烯吡啶 ( p o l y v i n y l p y r i d i n e ，p v p ) 和活性碳来除去培养基中的乳酸，但是p v p 很昂贵，回收 一次活性就丧失1 4 。活性碳不但吸附乳酸，而且也吸附少量菌体细胞。采用活性 碳柱固定化，可以避免对菌体细胞的吸附。张兰威( 2 0 0 2 ) 则试验了用d 3 0 1 叔胺 型树脂来吸附培养液中的乳酸盐曙射。m a l l i k ab o o n m e e 等( 2 0 0 7 ) 采用电渗析法取出发 酵液中乳酸盐，以1 2 4 9 l 的速率去除含有1 2 0 9 l 孚l 酸盐的培养基来培养乳酸乳杆 菌，最终可使菌体菌体干重干重达到0 0 5 9 g h 刀。 1 3 3 4 渗析法 渗析法，也称过滤培养法，是利用膜技术，选择合适的膜孔径来浓缩菌体。原 理是向培养液中添加新的营养液，乳酸菌代谢产物则通过膜除去，促使乳酸菌繁殖。 r i e s e n b e r g d 等( 1 9 9 9 ) 采用此法培养的乳酸菌浓度可达到l 1 0 1 1 c f u m l 喳们。这种方法 尽管达到了较高的菌体浓度，但设备投资大，对滤膜材料的要求比较严格，同时在 培养过程中易感染噬菌体，工业上应用并不广泛。 8益生菌c a s e iz h a n g 高密度培养工艺的研究 1 3 3 5 连续培养 连续培养，又称连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同 时以相同的速度流出培养基，从而使发酵液总量维持恒定，使培养物在近似恒定状 态下生长的微生物培养方式旧1 。a r a d h a n as 等( 1 9 9 2 ) 对乳脂链球菌( s t r e p t o c o c c u s c r e m o r i s ) 进行了连续培养，指出菌的生长情况受乳酸的抑制作用及营养物提取的影 响，菌体浓度达不到很高曙们。h a y a k a w a 等( 1 9 9 0 ) 年报道了乳酪乳杆菌的浓缩培养基 和抗热的有机膜交叉流过滤和发酵，连续补料率为0 3l h ，3 4 h ，需要2 1 4 l 新鲜 的培养基，细胞干重达到4 0 9 l 。刘振民( 2 0 0 2 ) 首次采用了微滤膜浓缩与反应器 相偶联培养德氏乳杆菌，对数期末进行全营养物质的流加，菌体密度可达到 1 1 x 1 0 1 1 c f u m l m l 。陆爱华( 2 0 0 6 ) 对中空膜纤维组件在高密度培养保加利亚乳杆菌和 嗜热链球菌的应用中进行了初步探讨，结果显示中空膜纤维组件在乳酸菌的高密度 培养的应用方面还存在一定问题，有待于进一步研究h 卯。 1 3 3 6 膜生物反应器 膜生物反应器( m e m b r a n eb i o r e a c t o r ) 是高效膜分离技术，是由膜组件和生物反 应器构成。用于乳酸菌超浓缩培养的膜生物反应器实质上就是一个发酵罐，偶联膜 过滤系统、在线的葡萄糖检测、乳酸检测、蛋白质检测、p h 值检测和氧通量等检测 装置，通过计算机来整体控制。这些反应器允许培养基交换，并在阻止乳酸积累引 起的生长抑制方面起到了很好的作用。用搅拌陶瓷膜生物反应器可以使乳酸乳杆菌 的产率达到1 4 0 9 l ( 每g 干细胞重相当于o d 6 0 0 1 9 ，4 0g l 干细胞重相当于 1 0 1 1 e f u m l ) 泓。c h i a r as 等( 2 0 0 3 ) 应用偶联了葡萄糖、氧通量、p h 值、蛋白质检测 器的生物反应器，在3 7 ， p h 值6 5 、初始搅拌速率为1 0 0 一 - 2 0 0 r m i n ，氧通量为 0 2 - 0 5 l m i n ，使氧的分压保持在4 的条件下对保加利亚乳杆菌进行了培养，使 细胞干重高达2 8 0 9 l o 钉。膜生物反应器是目前效果最理想的超浓缩培养方法，但是 由于设备昂贵技术复杂，一般的中小企业是承担不起的。国内还没有发现这方面的 研究报道哺幻。 1 4 国内外发酵剂高密度培养的研究概况、研究水平及发展趋势 1 4 1 国外研究水平和发展趋势 早在19 世纪末2 0 世纪初，西方乳业科学家就开始研制浓缩发酵剂强 。到现在 各种高效发酵剂已经实现商业化，各发达国家对发酵剂的研究和生产非常重视，很 少由发酵制品厂自己从试管菌种开始制备发酵剂，而是由发酵剂制备中心来提供。 最著名的发酵剂生产公司有丹麦的c h r h a n s e n 、d a n i s c o 、荷兰的d s m 公司等。 世界二分之一的乳品发酵剂由丹麦的c h r h a n s e n 来提供。h a n s e n 公司的冻干发酵 剂的活菌数达5 x l o c f u m l 。美国专利u s 0 0 5 0 9 8 7 2 1 报导应用超滤浓缩乳作为发 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 酵剂培养基，其较高的缓冲能力使菌数高达2 5 1 0 9 c f u m l 。除此之外，还有一批 知名发酵剂制造商，例如：美国的m a r s h a l l 公司、法国的e u r o z y m 公司、英国的 m a u r if o o d s 公司等，也有一些国家是由政府管辖的乳品研究所为乳品厂提供发酵 剂。如澳大利亚的c s i r o 研究所、荷兰的n i z o 研究所、瑞士的l i e b e f e l d 研究所 等，他们生产的发酵剂性能优良、形态各异，遍布世界各地的乳品企业。随着生物 工程在各领域中的发展应用，许多研究人员都在计划采用遗传工程的方法来提高发 酵剂的生产效率，使其能具有现有发酵剂所不具备的优良特性。主要利用基因分析 和d n a 杂交方法来分析遗传基因的位置和排列顺序，探索抗噬菌体的机能，生产 出具有强抗噬菌体能力的新型高效发酵剂汹1 。 在国外，益生菌发酵乳制品的生产都采用直投式发酵剂。直投式发酵剂是相对 传统发酵剂直接应用于生产的发酵剂，直投式发酵剂克服了传统发酵剂的不足，具 有以下优点：( 1 ) 活力高，活菌数高达1 0 1 1 - 1 0 1 2 c f u g ( 或c f u m l ) ；( 2 ) 不必反复传 代扩培，节省空间，减少投资，微生物污染几率低，并简化了生产工艺过程；( 3 ) 避免了由于发酵剂传代的原因造成的产品质量不稳定，有利于产品质量标准化。 从世界发达国家对发酵剂研究现状来看，具有以下特点和发展趋势： ( 1 ) 建立专业化菌种资源库：如丹麦汉森( c h r h a n s e n ) 公司就有近上万株乳酸 菌菌株资源库，用于菌种筛选和改良的遗传种质资源十分丰富，并具有自主知识产 权。法国达能( d a n o n e ) 在过去的9 0 年，建立了一个乳酸菌保藏中心，称为b a c t e