（环境工程专业论文）发光细菌法和硝化速率法测定污水毒性的可行性研究.pdf

摘要 摘要 随着人们对环境问题的重视及认识水平的提高，传统的水质指标已经不能 满足人们的需要，生物毒性试验在环境领域的作用将会变得越来越重要。目前， 应用于环境领域的毒性测试方法很多，由于微生物具有生长迅速、周期短、测 试费用低、同高等动物有着类似的理化特性和酶作用过程，能在短时间内得到 可靠的毒性资料的优点，因此被较多地用于毒性检测。生物发光法和硝化速率 法是常用的微生物毒性测试方法。虽然这些方法已广泛应用于环境领域，但是 这些方法也存在着一些缺陷，所以本论文对这些方法进行了研究，希望能够更 好地了解这些方法的特点，并对硝化速率法进行了改进，使其能够更好地用于 毒性测试。 在使用发光菌法进行毒性测试时，污水中的某些营养物质会对测试结果产 生影响，使得相对发光度大于1 0 0 。通过实验发现，c h 3 c o o n a ，c 6 h 1 2 0 6 和 n h 。c i 等物质能够增强发光菌的发光强度，从而使得水样毒性的测试值偏低： 不同营养物质对不同毒性物质的影响程度不同；同一种营养物质在不同浓度下 对同一毒性物质的影响程度也不同；毒性物质测试结果所受影响还与混合营养 物质的组分有关。此外，测试过程中使用的n a c l 在一般情况下不会对水样的毒 性产生影响。 使用城市污水厂未驯化硝化污泥进行毒性测试时，由于污泥中存在着两类 硝化细菌( n i t r o s o m o n a s 和n i t r o b a c t e r ) ，这两类细菌相互干扰会影响测试结果 的准确性。实验证实，使用氨氧化细菌培养基( n h 4 c 11 1 5 叽，n a h c 0 3o 5 0 9 l ， k 2 h p 0 4 3 h 2 00 2 1 l ，m g s 0 4 。7 h 2 00 1 2 5g i 一，n a c l0 1 2 5 l ，f e s 0 4 7 h 2 02 5 m 玑) 对硝化污泥进行驯化，培养温度：2 5 。cj - 3 c ，p h7 5 士0 5 ，d o 约2m g l ， 驯化一周后可以富集其中的氨氧化细菌，并淘汰其中的亚硝酸盐氧化细菌，将 其用于单一毒性物质的测试可以得到准确的数据，但用于实际污水测试时，也 存在水中营养物质影响测试结果的问题。 通过对发光菌法和硝化速率法比较后发现，发光菌法灵敏度 硝化速率法。 但是微生物对毒性物质越灵敏，也越容易受到水中营养物质的影响。 关键词：生物毒性发光菌法硝化速率法营养物质方法比较 a b s t r a c t w i t hm o r ea n e n t i o np a i dt ot h ee n v i r o n m e n t a lp r o b l e m sa n dm o r ek n o w l e d g e a b o u tn a t u r ea n dm a n k i n do b t a i n e db ym a n k i n d ，u s u a lw a t e r - q u a l i t yi n d e x e sc a nn o t m e e tt h e r e q u e s to fe n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na n y m o r e i n s t e a d ，b i o a s s a y sa r e p l a y i n gam o r ea n dm o r ei m p o r t a n tr o l e i nt h ef i e l do fe n v i r o n m e n tr e s e a r c h a l t h o u g hm a n yk i n d so fb i o a s s a y sh a v eb e e nu s e di ne n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n ，t e s t s u s i n gm i c r o o r g a n i s m sw e r ec h o s e nm o r eo f t e nt h a no t h e rk i n d so ft e s t sb e c a u s eo f i t sa d v a n t a g e ss u c ha sr a p i dg r o w i n gs p e e d ，s h o r tg e n e r a t i o nt i m e ，l o w e rt e s tc o s t ， s i m i l a rp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t ya n de n z y m es y s t e ma sa d v a n c e da n i m a l s ，a n d r e l i a b l ed a t ao b t a i n e di nas h o r tt i m e b i o l u m i n e s c e n ta n dn h r i f i c a t i o ni n h i b i t i o nt e s t h a v eb e e nu s e dw i d e l y , b u tt h e ys t i l lh a v es o m ed i s a d v a n t a g e s t h i sp a p e ri sa i m e d a tt h e s et w oc o m m o n l yu s e da s s a y sf o rb e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h e ma n dm o d i 聊n g t h en i t r i f i c a t i o ni n h i b i t i o na s s a yf o rm o r ec o n v e n i e n tp r o c e d u r ea n dc o r r e c tr e s u l t s w h e nu s i n gt h eb i o l u m i n e s c e n tt e s t ( p h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u m ) ，s o m e n u t r i e n t si nt h ew a s t e w a t e rc a ni n f l u e n c et h er e s u l t s ，a n dm a k et h er e l a t i v e l u m i n e s c e n c em o r et h a n1 0 0 t h er e s u l t so fe x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a ts u c h n u t r i e n t sa sc h 3 c o o n a ，c 6 h 1 2 0 6a n dn h 4 c ic o u l de n h a n c et h el i g h t i n go ft h e b a c t e r i aa n dm a k et h er e s u l t sl o w e rt h a nt h er e a lt o x i c i t y ；t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n t n u t r i e n t so nt h ed i f f e r e n tt o x i c a n t sw a sd i f f e r e n t ；a n dt h es a m en u t r i e n tw i md i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o na l s oh a dd i f f e r e n te f f e c t s ；t h er e s u l t sa l s oc o u l db ei n f l u e n c e db yt h e d i f f e r e n tc o m p o n e n t so fn u t r i e n tm i x t u r e b e s i d e s ，n a c iu s e di nt h et e s tw o u l dn o t i n f l u e n c et l l er e s u l t so f t h et e s t w h e nd o i n gn i t r i f i c m i o ni n h i b i t i o nt e s tw i mt h en i t r i f y i n gs l u d g e r e s u l t so ft h e t e s tc o u l db ed i s t o r t e db e c a u s eo f m u t u a li n f l u e n c eo f t h et w os t r a i n so f n i t r o b a c t e r i a 斛i t r o s o m o n a sa n dn i t r o b a c t e r ) i tw a sp r o v e dw i me x p e r i m e n t a ld a t at h a tt h e n i t r o s o m a n a sc o u l db ee n r i c h e df r o mn i t r i f i c a t i o ns l u d g ea sf o l l o w s ：t h en i t r i f i c a t i o n s l u d g ef r o mm t m i c i p a lw a s t e w a t e rt r e a t m e n tp l a n tc o u l db eu s e df o rt h ei n o c u l a t i o n ； t h es u b s t r a t ec o n t a i n e dn i - h c l1 1 5 9 l ，n a h c 0 3o 5 0 9 l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 0o 2 1 9 l ， m g s 0 4 7 h 2 0o 1 2 5g e l ，n a c l0 1 2 5 ；g l ，f e s 0 4 7 h 2 02 5m g l ；t h ec u l t i v a t i o n 摘要 c o n d i t i o n w a s a s f o l l o w s ：t e m p e r a t u r e ：2 5 。c4 - 3 c ，p h ：7 5 o 5 ，d o ：2 m g l a f t e r aw e e k ，t h es l u d g ec o u l db eu s e df o rt o x i c i t yt e s tw i t h o u tt h ei n f l u e n c eo ft h e n i t r o b a c t e r , a n dg o o dr e s u l t sc o u l db eg a i n e dw h e nd e t e r m i n i n gt h et o x i c i t yo ft h e c h e m i c a l s b u tr e s u l td i s t o r t i o nw i mn u t r i e n t sa l s oa p p e a r e dw h e ne x a m i n i n gt h e w a s t e w a t e ra st h eb i o l u m i n e s c e n tt e s t t h eh i g h e rs e n s i t i v i t yw a sf o u n dw i t ht h eb i o l u m i n e s c e n tt e s tt h a nw i t ht h e n i t r i f i c a t i o ni n h i b i t i o nt e s ta f t e rt h ec o m p a r i s o nr e s e a r c ho ft h e m b u tt h em o r e s e n s i t i v et h em i c r o o r g a n i s mw a s ，t h em o r ee a s i l yt h er e s u l t so ft h et e s tw o u l db e d i s t o r t e d k e y w o r d s ：b i o a s s a y ；b i o l u m i n e s c e n tt e s t ；n i t r i f i c a t i o ni n h i b i t i o nt e s t ；n u t r i e n t ； c o m p a r i s o no f b i o a s s a y s 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：行或9 午 5 年二月- 胃日 、 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名：伤成辟 z 。b 年月三8日 第一章引言 第一章引言 1 1 课题来源、背景及意义 1 1 1 课题来源 本课题来源于国家高科技研究发展计划( 8 6 3 计划) 青年基金项目“城市 污水活性污泥法生态毒性削减的智能模型研究”( 课题编号：2 0 0 2 a a 6 4 9 1 7 0 ) 。 1 1 2 课题背景及意义 生物毒性测试是指系统地利用生物反应测定污染物或环境因素存在时，生 物体受到的影响或危害。在环境领域，可以通过生物毒性测试方法来测定废水 或污染物的生物毒性，评价其对生态环境及人类的危害性1 h 3 】；也可用来评价 自然水体受到有毒物质的污染情况【4 】 5 】；还可以用来评价某个污水处理系统的 生物毒性削减效果【6 1 。此外，生物毒性测试在以下两个方面起着重要的作用。 ( 1 ) 城市污水厂正常运行的保证 随着工业的发展，工业废水量不断增大，工业废水的处理显得越来越重要。 一般地，工业废水的处置方式有三种： 工厂内单独进行无害化处理，达到排放标准后排放； 与生活污水性质相近的工业废水( 如食品工业废水) 直接或适当削减 污染负荷后排入城市污水管道； 经过厂内适当的预处理，达到我国污水排入城市下水道水质标准 ( c j l g - - 9 6 ) 或地方标准规定的水质要求后排入城市污水管道 7 1 。 由于大型污水厂在基建投资，占地面积，运行费用等方面均较中小型污水 厂少：并且大型污水厂在技术力量、管理水平和维修能力方面也较中小型污水 处理厂强，因此与工业废水的单独处理相比，工业废水与生活污水合并处理较 为理想。此外。工业废水和生活污水合并处理可以均化水质、水量；而且合并 处理时某些工业废水中的有毒物质浓度由于稀释而降低至生物处理允许的浓度 范围内。可以满足污水厂正常运行的要求。另外，生活污水中含有微生物生长 所需的各种营养元素，弥补了某些工业废水中营养元素( 如氮，磷等) 的不足， 以免在单独处理这些工业废水时需要另外投加营养元素。 但是随着工业的发展，工业废水中有毒物质的种类越来越多，排入城市污 第一章引言 水中的工业废水所占的比例也越来越高。虽然工业废水在排入城市污水处理系 统前要满足一定的接管要求；即不影响污水处理厂的正常运行，对某些有毒物 质的排放浓度也有明确的规定，但是通常情况下工业废水的水质及水量变化很 大，在实际管理中很难保证排入城市污水系统的废水满足水质要求。此外某些 突发性环境污染事故中，可能会有毒性物质进入城市污水处理系统。这些进入 城市污水处理系统的有毒物质达到一定浓度之后便会对污水厂的正常运行造成 一定的影响。 目前，国外在这方面的报道较多。k j 0 n s s o n 等人【8 】巾】调查了瑞典1 0 9 个城 市污水厂( 这些污水厂负责处理瑞典9 8 以上的城市污水) 后指出，4 0 , - 6 0 的城市污水厂的进水中含有对微生物有抑制作用的化学物质；有2 0 个污水厂的 硝化过程受到1 0 以上的抑制，而且硝化过程是否受到抑制与污水厂的类型和 规模无关。据eg r a u 等人 t 0 1 报导，由于有毒物质的影响，巴西s a op a u l o b a r u e d 污水处理厂的硝化过程和其他生物反应过程受到抑制，并且还出现了污泥膨胀 的现象，其影响达6 个月之久。 因此，在城市污水进入污水厂之前，有必要对进水水质进行测试，并根据 测试结果采取一定的措施，防止污水厂的正常运行受到影响。传统的水质指标 如c o d ，总氮，总磷等指标所反映的只是水样受有机物污染或是水中营养物质 浓度的情况，并不能反映水样毒性的大小；现代仪器分析技术的发展，如各种 色谱分析技术以及色谱与质谱联用等技术使得水中痕量物质的检测成为了可 能，但是这些方法存在着样品预处理复杂，对测试人员技术要求较高，分析时 间长，测试成本高等缺点，从而使得这些技术难以普及，并且不适合现场快速 测试。生物毒性测试方法能够反映水样的综合毒性，且测试过程相对简单，特 别是急性毒性测试所需时间短，成本低，因此使用生物法测试水样的综合毒性， 评价有毒物质对污水生物处理系统的影响有较大的优势。 ( 2 ) 城市污水回用的安全性评价 2 0 世纪5 0 年代以后，全球入口急剧增长，工业发展迅速，人类对水资源 的需求以惊人的速度增加。我国是一个水资源贫乏的国家，是全球1 3 个人均水 资源最贫乏的国家之一。在水资源短缺问题日益严重的情况下，我国还存在着 水资源使用效率低下，浪费严重的问题。同时，水环境也在不断地恶化，全国 水土流失面积3 6 7 万k m 2 ，占国土面积的3 8 。全国近一半河段和九成的城市 水域受到不同程度的污染。 2 第一章引言 为了缓解目前我国水资源严重缺乏的现状，一方面要加强节约型社会的建 设，另一方面可以从技术层面来解决这个问题。污水回用是个很好的解决途径。 2 0 世纪8 0 年代以来，我国不少城市开展了污水回用的实验研究。针对我国北 方部分城市在经济发展中急需解决的缺水问题，已研究开发出适用于部分缺水 城市的污水回用成套技术、水质指标及回用途径，完成了规划方法及政策法规 等基础性工作。在北京，天津，秦皇岛，大连等十余个城市重点开展污水回用 事业，为我国城市污水回用提供了技术与设计依据，并积累了一定的经验。 但是，随着污水回用的范围和规模的不断扩大，安全供水问题将会受到人 们越来越多的关注。人们对回用水的接受程度，以及作为生活杂用水的心理承 受能力和社会舆论将是制约污水回用的重要因素。通过对回用水的危害评价， 可以为保证供水安全，消除人们的疑虑以及对回用水项目的决策评价提供一定 的依据。其中对水中某些有毒有害物质的危害性评价是相当重要的，可以采用 合适的毒性测试方法来测试回用水的生物毒性，评价回用水的危害性，以此来 保证回用水的安全性。 环境污染已日益受到人们的重视，生物毒性测试的作用也必将会显得越来 越重要，因此就需要对生物毒性测试进行更多的研究以满足人类社会的需求。 1 2 毒性测试概述 目前，国内在这方面的研究较少，尤其是针对毒性测试方法本身的研究很 少。国外在这方面已有了较深入的研究，并制定了各种标准的测试方法。这些 测试方法越来越多地与生物技术相结合，如基因工程菌的培养并将其应用于毒 性测试，还有毒性在线监测的应用等。 毒性测试是确定物质毒性的重要手段，其一般程序是首先确定受试物即化 学物质，然后选择合适的实验系统，再进行具体的实验操作，获得受试生物的 毒性反应，最后进行统计处理获得必要的毒性参数并作出评价【1 1 】。毒性测试包 括： ( 1 ) 急性毒性试验( a c u t et o x i c i t yt e s t ) ；外来化学物质大剂量一次或2 4 小时内多次与生物体接触后，在短时间内测试对生物体所引起的毒性作用的试 验。 ( 2 ) 亚急性毒性试验( s u b a c u t et o x i c i t yt e s t ) ：研究生物体在约1 1 0 生命 第一章引言 周期少量反复接触某种外来物质所引起损害作用的毒性试验。 ( 3 ) 慢性毒性试验( c h r o n i ct o x i c i t yt e s t ) ：研究生物体在长时间内少量反 复持续接触受试物后所产生的毒性效应的试验。 ( 4 ) 蓄积毒性试验( a c c u m u l a t i v et o x i c i t yt e s t ) ：低于一次中毒剂量的外来 化学物质反复与生物体接触一定时间后使其中毒来测试毒性的试验。 根据不同的测试目的，可以选择不同的试验来测试化学物质或水样的毒性 性质。例如，对于城市污水厂迸水毒性测试，由于需要在较短时间内获得迸水 毒性大小以防止污水处理系统受到毒性物质的影响，应当选择急性毒性试验； 对回用水的毒性测试，可以选择急性毒性试验，慢性毒性试验和蓄积毒性试验， 因为回用水中的毒性物质可能会对与其接触的人或动植物产生急性或慢性毒性 作用，也可能会在长期的接触过程中在人或动植物体内积累。 毒性试验可以选择不同的生物进行测试，如使用猴、兔、小鼠、鱼类、水 蚤和藻类等，在研究化学物质对植物的毒性作用时，还可以选择高等植物如蚕 豆，洋葱等物种。在环境领域，可以使用鱼类，水蚤，藻类，无脊椎动物，微 生物等，一般可用来测试化学物质和污水的毒性。由于微生物生长周期短，测 试方法简单，测试成本低，又有着与高等动物类似的理化特性和酶作用过程， 因此以微生物作为受试生物的毒性测试方法在环境领域应用较为广泛。 毒性测试中使用的微生物包括发光细菌，活性污泥，硝化细菌，大肠杆菌， 以及人工诱变鼠伤寒沙门氏菌( 用于a m e s 实验) 等。 ( 1 ) 发光细菌 发光细菌在环境领域毒性测试中使用得最为广泛，它包括天然发光菌和基 因工程发光菌。一般地，在毒性物质存在的情况下，发光菌的发光强度受到毒 性物质的抑制会变弱，并且减弱程度与毒性物质的浓度成一定的数量关系，根 据这个原理可以用来测定污染物或者废水的毒性。1 9 8 1 年，b e c k m a ni n s t n u n e n t s 公司提出了以发光菌作为受试生物的毒性测试方法：m i c r o t o x o 。该方法快速， 简便，且测试成本低，得到了广泛的应用。 ( 2 ) 活性污泥 通过测定活性污泥里微生物的呼吸速率来判断样品毒性大小。活性污泥从 城市污水厂中即可获得，成本低，尤其是当评价城市污水进水对污水厂处理效 果的影响时，呼吸速率法由于使用活性污泥本身进行测试，其测试结果的代表 性是其他方法所不具备的。 4 第一章引言 ( 3 ) 硝化细菌 硝化细菌对氨的氧化过程包括两个步骤：首先，游离的氨或铵根离子被氧 化为亚硝酸盐，然后亚硝酸盐继续被氧化为硝酸盐。有毒物质的存在会对这两 个过程产生抑制，水中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮浓度的变化可以反映硝化 细菌受抑制的情况，因此通过测定水中的氮指标可以了解水样的毒性。 ( 4 ) 大肠杆菌 大肠杆菌( e c o l d 对环境毒物较为敏感，是较好的指示菌 1 2 1 。使用大肠杆 菌进行毒性测试时。可以观察环境毒物对e e o l i 有无抑制以及抑菌圈的大小来 判断毒性的大小【1 2 】 1 3 】；也可以测定毒性物质对c 0 2 产生的抑制程度来判断毒 性的大小【1 4 1 ，因为大肠杆菌的呼吸过程中有c 0 2 产生。 ( 5 ) 人工诱变鼠伤寒沙门氏菌 该菌株用来检测致突变物质。采用人工方法使其操纵子基因点突变，形成 组氨酸营养缺陷型突变菌株。这种菌株不能合成组氨酸，因而在无组氨酸的培 养基上不能生长。当在具有致突变性化学物质的作用下( 有的需要肝微粒体酶 的活化) ，可使突变型沙门氏菌回复为野生型，表现为能在无组氨酸的培养基上 生长。根据受试物使突变型沙门氏菌菌株在无组氨酸的培养基上的生长能力来 衡量该物质的致突变能力【1 5 1 。 上述毒性测试方法中使用的微生物包括纯种细菌如发光菌，硝化细菌 ( n i t r o s o m o n a s 和n i 仃o b a e t e r ) ，大肠杆菌等，也有的直接使用活性污泥( 混合 菌种) 来测试毒性的，如呼吸速率法。当使用毒性测试方法对污水厂进水进行 测试时，采用呼吸速率法和硝化速率法较为合适，因为这两种方法使用的微生 物来自城市污水厂的活性污泥，其测试结果能够较好地反映污水处理系统受到 的影响。虽然发光茵法相对比较灵敏，但是发光菌法中使用的发光菌一般是一 种海洋细菌，其生活环境与城市污水厂污水处理系统中的环境相差较大，其测 试结果不能够准确反映污水厂处理系统受到进水中毒性物质的影响1 1 6 。国外有 研究人员将发光菌( v i b r i of i s c h e f i ) 基因接入活性污泥的一种菌株( p s e u d o m o r m s n u o r e s c e n s ) 中得到s h k l ，由于其母体来自活性污泥，因此可以用来测试城市 污水厂的进水毒性，并能得到较好的测试结剽”】。 第一章引言 1 3 毒性测试技术的发展 1 3 1 生物传感器监测器( s e n s o r m o n i t o r ) 的应用 国外学者对于生物毒性传感器已有一些研究，而且由于生物工程技术的发 展，将各种基因工程菌与生物传感器技术相结合，制成了各种生物毒性传感器 并应用于永样毒性的在线监测。虽然这些技术还存在着一些问题，但这些探索 与研究无疑对毒性测试技术的发展有着重要的意义。 生物传感器使用简便，反应迅速，适合现场测试，在城市污水急性毒性测 试方面有很好的应用前景，也能用于突发环境污染事故的实时监测。生物传感 器常使用发光菌及硝化细菌，因为这两类细菌灵敏度较高，且较易培养。 ( 1 ) 发光菌传感器 p h i l p 等人【1 3 1 开发了一种对含酚废水敏感的生物传感器，该传感器使用 “l i g h t o f f ”型+ 基因工程菌作为受试生物。结果表明，在l o m i n 内，该传感器 能够对2 种酚类化合物( 苯酚和3 氯苯酚) 和含酚废水作出响应，但是对于这 两种纯的酚类化合物，它的灵敏度要低于vf i s c h e r i 。w i l c s 等人【1 9 】使用四种基 因工程菌构成的传感器组在实验室内对苯酚进行了测试，然后将其应用于污水 厂( 含酚废水) 的测试，通过测试确定了四种基因工程菌的相对灵敏度。但是 该研究中，测试样品仅限于苯酚和6 个废水水样，需进行更多的测试确定这些 基因工程菌对不同毒性物质的灵敏度。 还有一些发光菌传感器用于特定化学物质的检测。t e s e i o n e 和b e l f o r t 2 0 1 使 用了对汞敏感的生物传感器来检测汞的存在。其检测范围：h g ( i d1 0n m 一4 “m ，其结果受发光菌的培养时间和培养条件的影响较大。 ( 2 ) 硝化菌传感器 a n d r e a sk o n i 9 1 2 1 l 使用硝化细菌制成了硝化菌传感器。该传感器使用溶氧探 头，通过测试水样中d o 的变化来评价水样毒性的大小。在实验室小试和实际 污水厂的在线监测过程中都能够在较短时间内褥到可重现的结果，但是该生物 传感器通常只篦正常工作一周，其长期稳定性较差，原因是异养菌在传感器表 面的生长降低了传感器的灵敏度。 滴定传感器( t i t r a t i o nb i o s e n s o r ) 也是通过硝化细菌的活性来反映毒性的大 小。由于硝化细菌在氧化氨氮的过程中会产生氢离子： n h 4 + 3 2 0 2 - 9n 0 2 - + h 2 0 + 2 h + 一 6 注：发光菌按发光类型的不同可以分为两类：“l i g h t - o f f 型和“l i g h t - o n ”型。“l i g h t - o f f 型发光 菌在正常情况下发光，遇毒性物质发光强度减弱，而“l i g h t e n ”型正常情况下不发光，当遇到某种 特定毒性物质便会发光。 第一章引言 该反应使得水中的p h 值降低，滴定传感器向水中滴定碱来维持恒定的p h 值，因此可以通过测定消耗碱的量来衡量硝化细菌活性。a r o z z i 等人圆分别 使用呼吸速率传感器和滴定传感器对工业废水进行了测试，发现这两种传感器 都能够在较短时间内得到测试结果。同时还通过测试次氯酸钠的毒性对这两种 传感器进行了比较，发现呼吸速率传感器对次氯酸钠的灵敏度较高。另外，污 泥浓度对测试结果的影响很大。 1 3 2 基因工程菌( g e m s ) 的应用 生物技术的发展给生物毒性测试带来了巨大的发展空间。目前将基因技术 与发光菌测试结合的研究比较多。 2 0 0 0 年以来。国外研究人员已培养出多种基因工程菌并将它们应用于各种 废水的测试。这些g e m s 中包括“l i g h t - o n ”型和“l i g h t - o f f 型。某些可以用 于特定种类毒性物质的测试，包括：氧化物、细胞膜破坏物质、d n a 破坏物质、 蛋白质破坏物质。还也有一些适用于不同种类毒性物质的测定。 1 3 3 毒性鉴定 随着毒性测试研究的深入，仅对污水或者其他非纯物质样品毒性的测试已 不能满足科学研究和实际工程的要求，还需要找出测试样品中毒性产生的原因。 美国国家环保局在8 0 年代末9 0 年代初提出了毒性鉴别评价( t o x i c i t y i d e n t i f i c a t i o ne v a l u a t i o n ) ，其目的就是鉴别废水中的毒性物质，鉴别过程可分为 3 个阶段脚卜口4 】： 第一阶段：毒性物质特性实验。确定毒性组分的理、化特征。 第二阶段：毒性物质鉴别分析。分析鉴别有机物，利用化学分级技术将毒 性物质分离出来进行毒性追踪试验。在样品分离过程中，产生的每个子样品中 含一种毒性物质。依据毒性物质的特性来确定需要分为若干组。样品分级后， 用g c m s 分析有毒的子样品，样品中的化学物质可被一一鉴别。通过对照化学 物的浓度和l c 5 0 ，可初步确定可疑的毒性物质。 第三阶段：毒性物质确证过程。进一步证明毒性就是所怀疑毒性物质引起 的。证实第二阶段鉴别出的可疑毒性物质是否为真正的毒性物质。使用方法包 括：相关性比较、种类敏感性比较、症状观察、添加试验、质量平衡、删除技 术。( 相关性比较：将浓缩的可疑毒性物质的毒性与废水毒性作相关性比较；敏 7 第一章引言 感性比较：观察不同实验物种在可疑毒性物质和废水样品中的敏感性是否一致； 症状观察：观察实验动物在可疑毒性物质和废水样品中引起的中毒症状是否一 样：当有多种毒性物质存在时，由于毒性物质间的联合毒性作用，需引入添加 试验和质量平衡、删除技术等技术。) 近年来，国外还有些学者发展了以毒性测试为指导的污水成分分析技术， 这种技术主要是将毒性测试与仪器分析结合起来，使用现代仪器分析污水中毒 性物质种类与含量。与t i e 相比，其过程相对简单，但其对仪器的依赖程度高， 追求快速检测和测试过程的自动化。它包括萃取、分离、毒性检测、鉴定和确 认。目前在该领域的技术进步主要体现在连续固相萃取的使用，薄层色谱分离， 平板毒性测试( o n - p l a t e ) ，l c - m s 的应用。这些技术的应用使得废水中极性物 质的检测成为可能，并加快了样品处理的速度。然而，该测试过程仍然比较复 杂而且费时，所以不适宜推广应用。该测试过程在自动萃取、分离技术以及毒 性检测系统的小型化方面仍需进一步研究，分子水平或亚微生物水平 ( s u b o r g a n i s m a ll e v e l ) 的亚致死效应的生物检测系统的应用在这方面也具有很 好的发展前景】。 1 4 本课题前期的部分研究成果 黄满红 2 6 1 通过比较大型蚤2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 急性毒性试验，2 1 d 大型蚤慢性 毒性试验和发光细菌法后发现，这几种方法可靠性较好，发光细菌法相对较为 灵敏。邢海甬【2 7 】通过实验发现，虽然发光细菌法用于城市污水毒性测试灵敏度 较高，但是测试结果重现性较差；而用丙酮改进的发光细菌法虽然重现性较好， 但是测试时间长，数据处理过程较为复杂，不适合作为常规的毒性测试方法推 广使用。此外，邢海甬通过比较呼吸速率法和硝化速率法后发现，硝化速率法 的灵敏度高于呼吸速率法。 1 。5 研究内容 虽然有关毒性测试方法的研究已有很多，但是即使是标准方法，也存在着 不足。需进一步研究使其更完善由于发光细菌法在毒性测试方面应用相当广 泛，硝化速率法由于使用活性污泥能够较好地反映城市污水处理系统受进水中 毒性物质影响的程度，此外这两种方法的灵敏度较高，因此在本课题前期研究 8 第一章引言 的基础上，本论文将对发光细菌法和硝化速率法作进一步研究，希望能够更深 入地了解这些方法的特点，以便于方法的改进。 研究内容主要包括： ( 1 ) 城市污水中营养物质对发光菌法测试的影响研究确定城市污水中 营养物质对毒性测试结果影响的方式及程度； ( 2 ) 硝化速率法的改迸研究对常规的硝化速率法进行优化，使其能够 在较短的时间能得到准确的测试结果； ( 3 ) 通过实际水样的测试数据对改进的硝化速率法和邢海甬使用的硝化速 率法及发光菌法进行比较，确定这些方法运用于污水毒性测试的特点。 9 第二章营养物质对发光菌测试法的影响研究 第二章营养物质对发光菌测试法的影响研究 发光菌是一些自身能发光的细菌，自然界中存在的发光菌有多种，见表2 1 。 它们是兼性厌氧的革兰氏阴性细菌，大小约为0 4 。1 0 x1 0 彩l lm ，无孢子、荚 膜，有端生鞭毛一根或数根；最适温度为2 0 3 0 ，最适p h 为6 9 。发光细菌 广泛分布于海洋或者非海洋环境中，以游离或是与鱼类、浮游生物共生、共栖 方式的存在。发光菌发出的光与自然光的性质不同，光的颜色呈现蓝绿色，波 长为4 6 0 - 4 9 5n m ，其分离培养比较容易。 表2 1 天然发光菌种类渊 属栖息地名称 哈维氏弧菌v h a r v e y i 海洋 美丽弧菌i 型v s p l e n d i d u s i 费氏弧菌v f i s c h e f i 弧菌属v i b r i o 火神弧菌v l o g e i 霍氏弧菌易北变种 非海洋 v c h o l e r a ev a ra l b v n i s 明亮发光杆菌 ep h o s p h o r e u m 发光杆菌属p h o t o b a c t e r i u m海洋 毒西鱼发光杆菌e l e i g n o t h i 曼达帕姆发光杆菌 p m a n d a p a m e n s i s 异短杆菌属x e n o r h a b d u s非海洋发光异短杆菌x 1 u m i n e s c e n s 发光茵法在环境领域应用相当广泛，主要包括以下几个方面； ( 1 ) 特定化学物质的检测和定量分析 一些基因工程发光菌可以用于特定化学物质的检测和定量分析，这些发光 菌属于l i g h t - o n 型，即当该类发光菌遇到环境中某种特定毒性物质时，这类发 光菌便会受到该物质的刺激而发光，以此可以判断环境中是否存在该毒性物质。 其具体方法是将具备能够诱导产生降解目标污染物的酶的调节基因或操纵子与 发光酶系统的操纵子融合，再使用质粒将融合的基因插入某种细菌，比如大肠 杆菌( e c o l i ) ，通过该方法得到的基因工程菌便可以用来检测特定的污染物。 ( 2 ) 毒性测试 这一方面的应用在国内外最为广泛，使用最多的是m i c r o t o x o 法，该方法使 第二章营养物质对发光菌测试法的影响研究 用费氏弧菌v f i s c h c r i 。在毒性物质存在时，发光菌发光强度会变弱，根据发光 强度受抑制程度的大小来确定样品毒性的大小。 ( 3 ) 微生物量的测定 在进行生态修复时，可以通过环境中的微生物量来评价生态修复的效果。 由于微生物在生理活动过程中会有a t p 产生，且a t p 的产生量与微生物量相关， 通过测量a t p 的量便可对环境中的徽生物量进行估计。由于a t p 作为能量物质 可供生物发光使用，因此从微生物中提取出a t p ，将其用于发光菌的发光，通 过发光强度的大小来对环境中的微生物量进行估计，从而可以对生态修复的效 果作出评价。 在国内，使用发光菌法进行毒性测定的研究较多，大多使用南京土壤研究 所生产的发光菌冻干粉。该发光菌是明亮发光杆菌p p h o s p h o r e u m 。国内也有 研究人员使用的青海弧菌【2 9 】，它是一种淡水发光菌。水和废水监测分析方法( 第 四版) 1 3 0 推荐使用的生物急性毒性试验就有明亮发光杆菌t 3 法和青海弧菌 q 6 7 法。目前国内大多数的研究停留在使用发光菌测试某些化学物质或者废水 的毒性，真正涉及发光菌方法本身的研究较少。林志芬等人【3 l 】对发光菌法进行 了改进，在使用发光菌法进行毒性测试时，引入了一个校正因子p 丙酮，通过实 验发现，引入校正因子后发光菌法测试结果的重现性较好，但该方法耗时较长， 数据处理较麻烦。 l ， 2 1 实验目的 马梅等人 3 2 1 在其研究过程中认为，使用发光菌法直接对城市污水进行毒性 测试时，所得到数据为毒性物质和水样中营养物质共同作用的结果。本人在实 验测试过程中也发现某些水样的相对发光度 1 0 0 的现象。初步认为：当水 样的毒性较小或者水样中没有毒性物质时，水样中存在的某些营养物质会使发 光菌的活性增强，从而使得相对发光度 1 0 0 ；同时也有文献指出，在使用发 光菌法进行测试时，加入水样的n a c l 可增强水样中金属离子( 如c a 2 + ) 的毒 性【3 3 i 。因此，发光菌法还存在着一些不足，需要进一步研究。 本实验将考察城市污水中几种常见营养物质对发光菌法测试结果影响的方 式及程度。 第二章营养物质对发光菌测试法的影响研究 2 2 实验材料及方法 2 2 1 实验材料 ( 1 ) 标准毒性物质：c u s 0 4 5 h 2 0 ( a r ) ，3 ，5 一二氯苯酚( 3 ，5 一d c p ，9 8 ) 。 ( 2 ) 营养物质，见表2 2 。 表2 2 实验中所用营养物质及其浓度 营养c h j c o o n ac 6 h n 0 6 n h c i n a n 0 3n a n 0 2n a h 2 p 0 4 物质 ( c o d )( c o d ) ( 氨氮) ( 硝酸盐氮)( 距硝酸盐氮)( 正磷酸盐) 浓度 0 - - 5 0 00 一巧0 00 , - 5 0o l oo 一lm v 2 0 m g ，l 表2 2 中所选的营养物质分别对应城市污水中常用的水质指标：c o d 、氨 氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和正磷酸盐，这些物质对于微生物来说都是易降解 或是易被利用的营养物质，其浓度是根据实际城市污水厂污水处理单元中常见 的浓度范围选取的。另外，表中的浓度为各物质所对应的水质指标的浓度，如 无特殊说明，下文中所提到的营养物质的浓度均为其对应水质指标的浓度，而 非物质的实际浓度。 2 2 2 实验方法 采用对比实验的形式进行，即对加入营养物质前后测试结果进行对比来确 定营养物质对测试结果的影响程度。 实验分为两组：第一组，单一营养物质影响实验；第二组，混合营养物质 影响实验。每组实验重复3 次。详见表2 3 、2 4 。 测试使用的生物毒性测试仪( d x y - 2 ) 和发光菌冻干粉均为南京土壤研究 所生产。测试方法详见水和废水监测分析方法( 第四版) 明亮发光杆菌t 3 法。 乏2 。3 数据分析方法 几个定义：影响因子、正影响和负影响 加入营养物质后相对发光度 ( 1 ) 影响因子仁 ( 2 ) 影响因子 1 ， 加入营养物质前相对发光度 为正影响；影响因子 6m g l 时，i 值明显下降，说明过高的k n 0 3 浓度可能会对 发光菌产生抑制作用。但在整个实验浓度范围内，i 值均大于1 0 ，k n 0 3 对c u s 0 4 的影响属于正影响。 ( 6 ) n a n 0 2 对c u s 0 4 测试结果的影响 m 圜 罂 舔 1 4 1 2 0 00 20 40 60 81 01 2 亚硝氮m g l ( n a n 0 z ) 图2 6 n a n 0 2 对c u s 0 4 的影响曲线 图2 6 中，随着n a n 0 2 浓度的升高，可以看到曲线逐渐上升，影响因子大 于1 0 ，n a n 0 2 对c u s 0 4 的影响属于正影响。 1 6 第二章营养物质对发光菌测试法的影响研究 ( 7 ) n a h 2 p 0 4 对c u s 0 4 测试结果的影响 1