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四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 摘要 现代社会中手性农药的使用越来越普遍。本文考察了4 种典型手 性农药( d ，p d d t 、三氯杀虫酯、氯菊酯和对溴磷) 外消旋及其对映 体对内分泌相关基因的干扰情况。探讨了以人类绒毛膜癌j e g 3 细胞 为模型，研究了这些手性农药外消旋及其对映体暴露对产妇胎儿健康 的潜在风险。研究通过采用实时定量p c r 的方法，发现这些典型手性 农药的外消旋及其对映体对促性腺释放激素( g 出h i ，g 出m i ) 及其 受体( g i l r 职) ，胆固醇来源的雌激素合成以及胎儿在怀孕期间母体免 疫的相关基因( h l a g ) 表达都有不同程度的影响。实验结果显示4 种手性农药的对映体对这些内分泌干扰相关基因的干扰影响的大小分 别为：尺一0 一o , p - d d t s - ( + ) - o , pr - d d t ；孓( + ) 一a f r 一( - ) - a f ；1 r c s p m 和1s - t r a n s p m 处理组大于1s - c i s p m 和1r t r a n s p m ；( 一) - l e p t o p h o s ( + ) l e p t o p h o s ( 存在统计学意义上的显著性差异，p ( + ) 一o ，p - d d t , s - ( + ) 一a f r - o - a e t h e g r o u p s o f1 r c s - p ma n d 1s - t r a n s p m 1s - c i s p m a n d 1 r t r a n s - p m ，- - ) - l e p t o p h o s ( + ) 一l e p t o p h o sp 1 0g k g ，急性经皮l d 5 0 3 6g k g 【7 6 1 。a f 在中性 或者弱酸性时比较稳定，碱性时会有分解。与d 炉，- d d t 一样，三氯杀虫酯也具有 一个不对称的手性中心。 氯菊酯( p c r m e t h r i n ，p m ) 是典型的拟除虫菊酯s p s ，是现在用的比较多的 人工合成的一类重要的杀虫剂。氯菊酯在阳光照射下容易分解，可以用于防治棉 花、蔬菜、茶叶、果树上多种害虫。其分子量为3 9 1 2 8 ，分子式为c 2 1 h 2 0 c 1 2 0 3 ， 熔点约3 5o c ，水中溶解度为0 0 3 m g l 易溶于甲醇、乙醚、丙酮、二甲苯等有机 溶剂。其属低毒杀虫剂，原药大鼠急性经i ：1 l d 5 0 2 0 0 0 m g k g 。氯菊酯具有两个 手性中心，故拥有4 个对映异构体。 浙江工业大学硕士论文 1 2 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 有机磷o p s 杀虫剂占据了我国杀虫剂的主导地位，对溴磷( 1 e p t o p h o s ，l p ) 是 其中之一。其被发现能够使哺乳动物和鸟类的中枢和周围神经的恶化而引起迟发 性的神经病( o p i d n ) 【7 7 】。其分子为c 1 3 h 1 0 b r c l 2 0 2 p s ，分子量为4 1 2 0 7 ，熔点 为7 0 2 7 0 6 c 。到目前为止，市场上是无法购得这些农药的纯对映体，所以在研 究它们的对映体之前，必须要先通过一定的方法获得相应的纯的对映体样品。本 文采用高效液相色谱法对这4 种典型的手性农药进行对映体的拆分，并用气相或 者液相色谱法对所得对映体进行定量分析。 3 2 实验部分 3 2 1 仪器、试剂与样品 对映体拆分在日本分光公司( j a s c o ，t o k y o ，j a p a n ) 的j a s c ol c - 2 0 0 0 系列高效 液相色谱系统上进行拆分。此系统配备p u 2 0 8 9 智能四元梯度泵、流动相真空 脱气装置、a s 1 5 5 9 自动进样器、c o 2 0 6 0 柱温控制系统、u v - 2 0 7 5 紫外一可见光 检测器、c d 2 0 9 5 圆二色检测器、o r - 2 0 9 0 旋光检测器、l c n e ti i a d c 数据采 集器和c h r o m p a s s 色谱工作站( v e r s i o n1 7 4 0 3 1 ) ；6 8 9 0 n 气相色谱仪( g c ， a g i l e n t ，美国) ，配备电子捕获检测器( e c d ) ；旋转蒸发器( r - 2 1 0b u c h i ，瑞 士) 。 所用流动相正己烷、乙醇和异丙醇等为色谱纯级，均购自美国t e d i a 公司。外 消旋的d 护- d d t 分析标准品( 纯度为9 8 ) 购自s u p e l c o 公司( b e l l e f o n t e ，p a , u s a ) ， 结构式见图3 1 ；外消旋三氯杀虫酯分析标准品( 纯度为9 7 ) 购于星火技术研 究所( 河北，保定) ，结构式见图3 2 ；外消旋体氯菊酯分析标准品( 纯度为9 9 5 ) 购自s i g m a 公司，结构式见图3 3 ；外消旋对溴磷( 纯度为9 7 ) 购于保定星火 科技研究所结构式见图3 4 。这4 种农药的外消旋体均溶于乙醇中定容配制成浓度 为2 0 0 0m g l 的储备液，用于接下来的液相拆分及气相和液相定量分析。 浙江工业大学硕士论文 c l 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 图3 - io , p - d d t 异构体 f i g 3 - 1e n a n t i o m e r so f p e r m e t h r i n 留心 c c l l i 。 c 1 i h k 一h 矿 o c i h c - h 、r 、o l i | o 图3 2 三氯杀虫酯 f i g 3 2e n a n t i o m e r so fa c e t o f e n a t e = h o 小c 阶 9 0 u p 舔 ac l = ba 7 b ：l 伪纯p 翻酊m e l h r i n 图3 3 氯菊酯 f i g 3 - 3e n a n t i o m e r so fp e r r n e t h r i n 浙江工业大学硕士论文1 4 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 图3 - 4 对溴磷 f i g 3 - 4e n a n t i o m e r so fl e p t o p h o s 3 2 2 色谱条件 液相色谱拆分条件和气相色谱定量分析方法都是是参考本实验室人员前期 实验分析的结果方法，根据拆分及定量结果表明这些拆分方法效果较好。 3 2 2 1 o , p - d d t 的色谱条件 o , p - d d t 的拆分：手性高效液相色谱柱c h i r a l c e lo j h ( 0 4 6c r u x 2 5c m ( i d ) ) ，填料为日本d a i c e l 化学工业公司产品，涂敷有纤维素衍生物的5p m 硅 胶；1 0 0 的乙醇作为液相色谱流动相；液相色谱进样体积为2 0 儿：流速为0 4 m l m i n ：圆二色( c d ) 检测器的波长设为2 4 0n l t l ；柱温为2 5o c ；色谱数据由 j a s c o 公司的c h r o m p a s s 软件收集并处理。 o , p - d d t 的定量： 采用b g b 。1 7 2 手性气相色谱柱( 2 0 t e r t - b u t y l d i m e t h y l s i l y l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i ni no v - 17 0 ) ，柱长3 0l l l 内径0 2 5l l l l t i ( i d ) ，固定相膜厚0 2 5 岬，不分流进样。气相色谱进样量为2 l l ；进样口温 度为2 5 0o c ；氮载气流速为5 0c m s ；升温程序为9 0o c ，持续1m i l l ，然后2 0o c m i n 升至1 6 0o c ，再2o c m i n 升至1 8 0o c ，保持4 1m i n ，再2 5o c m i n 升至2 2 5 。c ， 最后保持2 5r a i n 。 3 2 2 2 三氯杀虫酯的色谱条件 三氯杀虫酯的拆分：液相拆分条件可以参照本课题组已经发表的文献 7 8 1 。 使用正己烷：异丙醇= 9 9 ：1 作为流动相，在c h i r a l c e lo d 正相手性柱上进行拆分； 柱温为2 5 0 c ，流速0 4m l m i n ；圆二色检测器的检测波长为2 3 0n l l l ；进样量2 0 皿。 三氯杀虫酯的定量：g c 条件完全参照文献【7 8 1 进行拆分。 浙江工业大学硕士论文 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 3 2 2 4 氯菊酯的色谱条件 氯菊酯的拆分：使用正相手性色谱柱c h i r a l c e lo j 柱( 2 5c r u x 4 6i n t o ( i d ) 日本d a i e e l 化学工业公司产品，粒径为5 9 m ；流动相流速o 8m l m i n ，流动相比 例为正己烷：乙醇= 9 8 ：2 ；柱温为2 5 。c ；进样量为2 0 0g l ；圆二色检测器的检 测波长为2 3 6r i m 。 氯菊酯的定量：6 8 9 0 n 气相色谱仪采用电子捕获检测器( e c d ) ，色谱柱为 长3 0r t l 、内径0 2 5m i l l 、固定相膜厚0 2 51 t m 的l i p 5 型石英毛细管柱，不分流 进样。恒压，气相色谱进样量为1 止；进样口温度为2 5 0o c ：氮载气流速为1 0 m l m i n ：升温程序：2 0 0 c ，持续2m i l l ，然后1 0 c r a i n 升至2 6 0 ，最后保 持2m i n 。 3 2 2 5 对溴磷的色谱条件 对溴磷的拆分：使用w h e l k 0 1c s p 柱，粒径) b 5 i _ t m ；流动相比例为正己烷： 二氯甲烷= 9 7 ：3 ；流动相流速0 5m l m i m 柱温为2 5 0 c ；进样量为2 0 0 灶；其中 圆二色( c d ) 检测器的波长设为2 4 0n i n ，具体参见文献 8 0 - 8 1 】。 对溴磷的定量：气相定量( g c e c d ) 使用色谱柱h p 1 7 0 1 ，载气为高纯氮， 载气流速为1 0m l m i n ，检测器温度为3 0 0 ，进样口温度为2 5 0 ，不分流模 式进样，进样体积为1 “l 。 3 2 3 实验方法 ( 1 ) 对映体的制备 4 种农药在各自最佳的液相色谱条件下进行对映体的拆分。然后在h p l c 仪 器的流出口，根据u v 检测器的信号对分离后各个农药的各个对映体分别进行手 动的收集。 ( 2 ) 对映体浓缩 将收集后的4 种农药的对映体样品在旋转蒸发器上旋干至少量体积样品，用 氮气吹干后用乙醇定容于1 0m l 容量瓶，封口膜封存，储存于2 0 条件下。 ( 3 ) 对映体的定量 对映体的样品的纯度在h p l c ( 色谱条件和分离条件一样) 上进行测定，经 过检验，这些样品的纯度都 t 9 8 ，样品制备过程中未发现消旋化。 对映体样品浓度的测定在g c 上进行测定，并采用外标法。具体步骤为：分 浙江工k 大学硕士论文 1 6 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 别取4 种农药的2 0 0 0m g l # f 消旋储备液，用正己烷稀释配成一系列不同浓度( 1 m g l ，2 5m g l ，5m g l ，1 0m g l ，2 0m g l ) 的标准溶液，样品的两个对映体 则按照估计浓度将它们稀释至标准溶液的浓度范围内，即l 2 0m g l 之间，随后 在g c 上进样分析。g c 条件见这些农药的定量条件。记录计算机自动计算出的色 谱图中各自峰面积，以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线， 计算出各个农药的各个对映体浓度。 3 3 本章小结 使用手性液相色谱柱，实现了4 种农药的对映异构体的正相高效液相色谱的 分离，并通过气相色谱对这些对映异构体进行了定量分析。经过h p l c 的测定各 个经过拆分的农药的对映体的对映体纯度都在9 8 以上。 通过气相检测，计算得d 妒- d d t 的两个异构体( 孓( + ) 一o d d z r 一( + k o d d t ) 的浓度为：9 6 2 0 3m g l 和8 7 9 1 5m g l 。三氯杀虫酯的两个异 构体( ( + ) a f 尺( + ) 一a f ) 的浓度为8 1 2 3 2m g l 和7 9 2 2 3 m # l 。氯菊酯的四个 异构体( 1 r c 括( + ) p m ，1 s - c 缸一( - ) p m ，1 r w a n s - ( + ) p m 和1 s - w a n s 一一p m ) 的 浓度：为3 2 5 0 3m g l 、3 6 9 8 3m l 、6 5 8 3 0m # l 和6 4 9 6 4m g l 。对溴磷的两 个异构体( ( - ) - l p 和( + ) - l p ) 的浓度为4 2 3 3 6m # l 和4 9 7 3 2 m g l 浙江工业大学硕士论文 1 7 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 第四章4 种典型环境内分泌干扰物及其对映体对j e g 3 细胞内分泌干扰相关基因的检测 4 1 引言 近些年，随着农药的广泛使用，人类与之接触的机会越来越多，并且在自然 环境下能够在人和动物体内蓄积储存，从而对人和动物机体造成危害。众所周知， 目前市场上广泛使用的农药多数是含有一个或数个手性中心，含有一对或几对对 映异构体。当一个手性化合物进入生物机体时，由于它们的立体选择性性，使得 蛋白质和药物、酶和底物、抗体和抗原等的相互作用具有高度的一致性，致使对 映体之间的生物转化、生物转运以及生态和毒理学效应表现出相应的同步性，从 而使得手性化合物的对映体在环境化学行为和生态毒理方面表现出特殊的对映 体差异性，甚至有时会呈现出完全相反的效应 7 4 , 7 5 1 。大量研究表明这些对映体之 间存在着急性毒性【8 2 】、慢性毒性 8 3 1 、免疫毒性【8 4 1 、发育毒性【8 5 】以及内分泌干扰 性【8 6 】等对映体的选择性。但其对母胎发育的安全性评价目前还未见报道。 生物机体内分泌系统非常的复杂，可由多种因素控制。下丘脑垂体性腺轴 ( h p g ) 是哺乳动物内分泌系统中最重要的部分之一，包括一个完整的神经内分 泌系统的控制和各种激素的分泌。任一激素或h p g 及其受体受到环境的干扰， 都将引起内分泌失调：更甚者，将引起学习，记忆活动和运动能力的不可逆破坏 【8 7 8 9 1 。胎盘是胎生动物和人类的临时场所，具有营养、物质运输和内分泌的功 能，特别在维持正常妊娠方面有着举足轻重的作用。滋养层细胞能在怀孕期间产 生一系列激素以维持正常的胎儿发育。人类绒毛膜癌1 e g 3 细胞株，通常被用来 作为研究外界对人类滋养层影响的一种细胞模型。有越来越多的证据表明，手性 农药对滋养细胞活性和内分泌干扰作用关系到母婴健康的潜在风险 9 0 - - 9 1 1 。本实 验采用了0 , 1 3 - d d t 、三氯杀虫酯、氯菊酯和对溴磷4 种典型环境内分泌干扰物为 模型化合物，j e g 3 细胞株为体外模型。研究了这些对环境内分泌干扰物对促性 腺激素释放激素介导的和胆固醇合成途径来源的雌激素代谢相关基因表达的影 响。 浙江工业大学硕士论文 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 4 2 实验材料 4 2 1 细胞系 人类绒毛膜癌j e g 3 细胞株购自中国科学院上海细胞库，其来自于( a t c c ) 美国标准生物品收藏中心。 4 2 2 主要仪器 垂直流净化工作台s w - c j 1 f d 型；3 1 1 1 型的t h e r m oe l e c t r o n 水套式二氧 化碳培养箱( m a r i e t t a ，o h ，u s a ) ；荧光倒置显微镜( l e i c ad f c3 0 0f x ，德国) 所配备的摄影机为l e i c ad f c3 0 0f x ；e s 3 1 5 全自动高压灭菌锅( 日本东京) ； 台式高速离心机( 北京医用离心机厂) ；m h i 型微量振荡器( 海门市其林贝尔仪 器制造有限公司) ；d k s 。1 2 型电热恒温水浴锅( 荡中新电器厂，上海) ；日本日 立公司的h i t a c h ic r2 2 g 型高速冷冻离心机；美国b i o r a d 公司的6 8 0 型酶标 仪；美国a b i 公司7 3 0 0 型的实时荧光定量p c r 仪等。 4 2 3 主要试剂 胎牛血清来i 刍h y c l o n e 公司( b s a ，h y c l o n e ，美国) ；胰蛋白酶0 2 5 来自 h y c l o n e 公司( h y c l o n e ，美国) ；d m e m f 一1 2 培养基来i 刍h y c l o n e 公司( h y c l o n e ， 美国) ；二甲基亚砜来自s i g m a 公司( d i m e t h y ls u l f o x i d e ，d m s o ) ：t k i z o l 试剂 来g r a n di s l a n d 公司( g i b c ob r l ，g r a n di s l a n d ，n y ，u s a ) ；r e v e r t r aa c e 圆q p c r r t 试剂盒( 日本t o y o b o 生化试剂公司) ；s y b rg r e e n 试剂盒( 日本t o y o b o 生化试剂公司) 。 4 2 4 主要实验用液 通过高效液相色谱和气相色谱分析获得4 种农药各个手性对映体的纯度和 浓度，用于接下来的生物实验。所用的各个农药及其对映体浓缩液根据具体实验 加培养液稀释配制所需浓度，并控制乙醇含量o 1 。 磷酸盐缓冲溶液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ) ：每升d d h 2 0 q b 含n a c l8 0 g ，k c l0 2 0g ，n a 2 h p 0 4 h 2 01 5 6g ，k h 2 p 0 40 2 0g ，高压消毒灭菌，4 。c 保存。 细胞消化液：0 2 5g 胰蛋白酶溶于1 0 0m l 磷酸盐缓冲溶液中，过滤除菌后 于4 保存。 普通培养液：含酚红1 0 进1 2 1 胎牛血清h y c l o n e 的必需培养基。 实验培养用液：含5 活性炭和萄聚糖处理过的胎牛血清，不含酚红h y e l o n e 浙江工业大学硕士论文 1 9 网种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 最低限度必需培养基。 r n a 反转录和实时定量p c r 所用试剂，按照试剂盒说明书( 日本t o y o b o 生化试剂公司) 配置的相关试剂。 4 3 实验方法 4 3 1 细胞培养、传代、冻存及复苏 细胞培养：j e g 3 细胞为贴壁细胞，常规培养在含1 0 胎牛血清的d m e m 培养液中，在3 7 ，5 c 0 2 的饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，每隔1 2d 换一次液。j e g 3 细胞培养于2 5c m 2 培养瓶( 美国h y c l o n e 公司) 中，并确保 实验时所用的细胞为处于对数生长期。 细胞传代：当细胞生长至8 0 9 0 左右时，用消毒过的巴式吸管吸去培养 液后，p b s 冲洗两遍，加入1m l 左右的0 2 5 胰蛋白酶消化液，微微晃动以使 胰酶均匀覆盖细胞表面，在倒置显微镜下观察，若发现细胞伪足回缩或细胞变圆 时即吸除胰酶，加入3 - - 5m l 配制的细胞培养液以使消化终止，用巴式吸管轻 轻反复吹打细胞以使之成为单细胞悬液，按1 ：3 比率传代，3 5 天后再次传代。 细胞的冻存：取对数生长期细胞用0 2 5 胰蛋白酶消化液消化离心( 3 0 0 0 r m i n x 3m i n ) ，轻轻吸掉消化液，加入配制好的冻存液( d m s o ：培养液= 1 ：9 ) ，使 细胞密度为l x l 0 7 5 x 1 0 7 个m l ，分装入进口的冻存管中，降阶降温，依次放置 于4 冰箱保存3 0m i n ，_ 2 0 冰箱保存1h ，- 8 0o c 冰箱2h ( 或者过夜) ，最 后转入液氮中长期保存。 细胞的复苏：冻存在液氮中的细胞取出后，立即放入3 7 水浴锅中，不断 轻轻摇动冷冻管使其在lm i n 中内融化。在已用紫外和酒精消毒的超净台内将解 冻后的细胞加入新鲜培养液稀释5 倍左右，并转移到离心管中，3 0 0 0r m i n x 3r a i n ， 离心后小心弃上清液，加入配制的培养液轻轻吹打细胞使之成为悬液，接种到培 养瓶中，在2 4h 内更换新鲜培养液。 4 3 2 细胞处理 选取对数生长期的细胞进行实验，在药物处理前，将细胞置于无酚红的实验 用液( 含5 活性炭一萄聚糖处理过的胎牛血清，不含酚红的最低限度必需培养 基) 培养1d ，以提高细胞对雌激素的敏感性，然后按细胞密度lx 1 0 6 个m l 接 种于3 5m m 的细胞培养皿中( 美国的c o m i n g 公司) 。细胞培养的各个药物处理 浙江工业大学硕士论文 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 浓度为：d ，p ，d d tl x l 0 m o l l 、三氯杀虫酯1 x l o 击m o f l 、氯菊酯l 1 0 击m o y l 和对溴磷l x l 0 。6m o l l ( 实验所用浓度是根据本实验室之前的数据和前期预实验 确定的) ，处理2 4h 后进行r n a 提取。 4 3 3 总r n a 的提取 用t r i z o l 试剂按照常规方法进行总r n a 的提取。基本实验步骤为：将培养液 吸去，用p b s d x 心地洗两次，加入lm l t r i z o l 试剂于3 5m l t l 的细胞培养皿中，室 温放置5m i n 后，转入e p 管并加入0 2m l 氯仿，剧烈振荡1 5 - 2 0s 后室温放置3r n i n ， 1 20 0 0r p m 4o c 离心1 5m i n ；小心取出上清转至洁净的e p 管( 约4 5 0 u 1 ) ，加入0 5 m l 异丙醇，混合均匀后室温静置1 0m i n ，1 2 0 0 0r p m 4o c 再次离心1 5m i l l ；弃去 上清，加入7 5 d e p c 水配制的乙醇1m l ，7 5 0 0r p m 4o c 离心5m i n 后弃去上清， 室温干燥m r n a 至半透明状；2 0 3 0 “l 无r n a 酶的d e p c 水使r n a 全部溶解； 2 6 0 和2 8 0n l l l 的分光光度测得提取的r n a 纯度和浓度。提取的r n a 质量通过2 的琼脂糖胶验证。 4 3 4 反转录 采用了r e v e r t r aa c e q p c rr t 试剂盒( 日本t o y o b o 生化试剂公司) 进行 反转录r n a 为c d n a ，反转录体系为2 0 此，加入1 昭提取的l 悄a 。反转录的 产物稀释到1 0 0 血直接用于随后的r e a l t i m ep c r 。反转录过程为：1 ) r n a 的 变性，把r n a 在6 5o c 条件下温浴5r a i n 后，立即放于冰上冷却。2 ) 反应液的 配制，5 x r tb u f f e r4u i ；r te n z y m em i x l u l ；p r i m e rm i x l u l ；r n a2 烬； n u c l e a s e f r e ew a t e r 加至2 0u l 。3 ) 逆转录反应，在3 7o c 条件下，进行1 5m i n 的逆转录反应；在9 8 0 c 条件下，进行5r a i n 的酶失活反应；反映结束后，保存 于2 0o c 冰箱中。 4 3 5 实时定量聚合链式反应 4 3 5 1 引物设计 使用a b i 公司的7 3 0 0 型实时荧光定量p c r 仪( a p p l i e db i o s y s t e m s ，f o s t e rc i t y , c a u s a ) 进行模板d n a 的扩增和检测。选择了八个类固醇基因，一个人类白 细胞抗原g 基因，三个促性腺激素释放激素及其受体基因和一个管家基因作为 检测的对象。( c y p l l a ，c y p l l b ，c y p l 7 ，c y p l 9 ，c y p 2 1 8 2 ，3 p - h s d 2 ， 1 7 3 h s d l ，1 7 1 3 h s d 4 ；h l a - g ；g n r h r ， g n r hi ，g n r hi i ： 3 - a c t i n ；表 浙江工业大学硕士论文 2 l 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 1 ) 。相关基因的特异性引物经过设计与相对应的d n a 序列吻合，由上海生工合 成。 g e n e 3 - 端5 端 表4 1 实时定量p c r 的引物序列 t a b l e4 - 1p r i m e rs e q u e n c e su s e df o rr t - p c r 4 3 5 2 实验方法 扩增实验采用s y b rg r e e n 试剂盒( 日本t o y o b o 生化试剂公司) ，每个样品 为4 个孔重复，反应体系为2 0 此( 包括d n t p s ，m g c l 2 ，t a qd n a 酶，s y b r g r e e n ， a n t i - t a q 单克隆抗体) 、上游引物0 8p l ( 1 0l x m ) ，下游引物0 8 皿( 1 0 州) ，e d n a 模板4 “l 和去核糖核酸酶1 4 4 刖管。p c r 的程序为：第一阶段为9 5 时间6 0s ； 第二阶段为9 5 时间1 5s ；6 0 时间1 5s ；7 2 时间4 5s 并设为4 0 个循环。循环 结束后进行溶解曲线的分析以确保扩增的特异性。 4 3 5 3 统计分析 根据每个d n a 样品浓度的对数值与循环数的焦点决定起始循环数( c t ) 值。 相对m r n a 水平通过公式2 。q 分析 9 2 - 9 3 】。实验进行至少4 次重复，单独的对 映体及外消旋处理的实验组m r n a 表达通过实验结果用o r i g i n7 0 软件 ( o r i g i n l a b ，n o r t h a m p t o n ，m a , u s a ) 进行单因素( o n e w a y ) 方差分析( a n a l y s i s o f v a r i a n c e ，a n o v a ) 。当p 0 0 5 时，视为有显著性差异。数值是相对于1 3 - a c t i n ， 标准化后的得到的，代表m r n a 相对表达量。不同的字母代表显著性差异，相 同字母表示无显著性差异( p 0 0 5 ，t l = 5 ) 。星号代表空白组和处理组之间存在 浙湖： ：q k 大学硕论文2 2 显著性差异。 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 4 4 结果分析 4 4 1d ，p - d d t 及其对应体对内分泌相关基因的p c r 结果 4 4 1 1 基因g n r h i ，g n r h i i 和g n r h rq r t p c r 的结果 g n r h i 和g 舢n 也称做促黄体激素释放激素( l h r i - i ) ，是前导肽类激素 负责f s h 和l h 从垂体前叶的释放。促性腺激素释放激素受体( g n r h r ) 编码 g n r h i 的受体，与g 蛋白偶联后激活磷脂钙第二信使系统能够与促性腺激素释 放激素结创9 4 1 。g n r i - i i 、g n r h i i 和g n r h r 除了与促性腺激素释放激素l h 和 f s h 的释放有关，另有文献证实与调节胎盘、女性子宫和卵巢中一些复杂过程， 如卵泡生长，排卵，黄体素水平的维持有关【9 5 】。如图4 1 所示，当实验组j e g 3 细胞暴露于o , p - d d t 浓度为1 0 彳m o l l2 4h 后，g n r h i ，g n r h i i 和g n r h r m r n a 的表达水平都有不同程度的升高。同时在j e g 3 细胞中，暴露于外消旋 0 , 1 3 - d d t 处理组的g n r h i ，c _ m r h i i 和g n r h r 的水平与对照组相比分别为1 5 8 、 2 9 、7 3 9 倍。在所选的暴露浓度下，0 , 1 3 r - d d t 对映体处理组中g n r h i 和它的受 体g n r h r 的m r n a 水平呈现相同的上升趋势。值得注意的是，对于g n r h i 和 它的受体g n r i - i r 的m r n a 变化参数，o , p - d d t 外消旋处理组明显比它的2 个 对映体处理组影响剧烈。例如，o , p = d d t 外消旋、s ( + ) 一o , p r - d d t 和处理后，基 因g n r h r 的m r n a 的水平为7 3 9 、2 5 0 5 8 9 、o 8 9 6 7 6 。对于基因g n r h i i ， 只( - ) o ，pr - d d t 处理组与孓( + ) 一o , p - d d t 之间存在显著性差异。并且， r ( _ ) d 炉 - d d t 对该基因的影响较孓( + ) - d 护 - d d t 强，其中r 一( - ) 一。护 - d d t 处理组 的该基因r n r n a 的相对表达水平为2 5 ，而孓( + ) o , p r - d d t 处理组为1 6 。 浙江工业大学硕士论文 2 o 1 6 1 2 0 8 0 4 4 0 3 2 2 4 1 6 0 8 o 0 7 5 6 0 4 5 3 0 1 5 o 0 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 c o n t r o lr a c e m a t e r - ( 一) 一0 ，p - d d t s - ( + ) 0 ，p 一d d t 图4 - 1g n r h i ( a ) ，g n r h i i ( b ) 和g n r h r ( c ) 在j e g 一3 细胞中暴露于o , p - d d t 及其两个对映体浓度1 x l o 7 m o ll 1 2 4 h 后基因的表达情况。数值是相对于争a c t i n ，标准化后的得到的，代表m r n a 相对表达量。不同 的字母代表显著性差异，相同字母表示无显著性差异0 0 0 5 ，n = 5 ) 。箭头代表空白组和处理组之问存在显 著性差异。 f i g 4 1r e l a t i v ee x p r e s s i o no fc _ m r h i ( a ) ，g n r h i i ( b ) a n dc a l r h r ( c ) i nj e g - 3c e l l si n c u b a t e dw i t hr a c e r n i c o , p - d d ta n di t st w oe n a n t i o m e r sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f10 7m o ll - lf o r2 4 h v a l u e sw e r en o r m a l i z e da g a i n s t p a c t i na n df o l di n d u c t i o nr e p r e s e n t sr e l a t i v em e a nm r n ae x p r e s s i o nt on e g a t i v ec o n t r 0 1 d i f f e r e n tl e t t e r so nt h e t o po f b a r sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gr a c e m i co j p - d d ta n di t st w oe n a n t i o m e r s ，a n dy e tt h es a m el e t t e r p r e s e n t sn os i g n i t i c a md i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ，n = 5 ) t h ea s t e r i s kp r e s e n t sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gn e g a t i v e c o n t r o la n dt h eg r o u p st r e a t e dw i t ho , p - d d t ( p 0 0 5 ，n = 5 ) 4 4 1 2j e g 3 细胞中类固醇合成相关基因的表达结果 本实验中，因为j e g 3 细胞系有能力产生类固醇激素，我们检测了8 个类固 醇合成途径中的关键基因。这些基因是c y p l l a ( 胆固醇侧链裂解酶) 9 9 】， c y p l1 8 2 ( 醛固酮合成酶) 9 7 - 9 8 1 ，c y p l 7 ( 类固醇1 7 a 羟基化酶或者1 7 ，2 0 裂解 酶) ，c y p l 9 ( 芳香酶) 【1 0 0 邶，c y p 2 1 8 2 ( 类固醇2 1 羟基化酶) 【1 0 加3 1 ，3 p h s d 2 ( 3 p 羟基类固醇脱氢酶) ，1 7 1 1 - h s d l 和1 7 1 1 一h s d 4 ( 1 7 一p 1 型和4 型1 7 p 羟基脱氢 酶) t 9 9 , 1 0 3 。 浙江工业大学硕士论文 2 4 zq：，t)皇oisk盘硭o2_量。臣 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 根据d ，p ，d d t 外消旋和两个对映体处理组浓度1 0 7m o l l 暴露2 4h 后这些 基因的表现，将它们分为两组。如图4 2 中，o , p - d d t 外消旋及其对映体处理组 的这些个基因m r n a 表达水平显现出一致性，都是上升或者下降。而图4 3 中 的暴露于d ，p - d d t 的外消旋和各个对映体的处理组，上调或者下调的步调不一 致。不难看出，图4 2 中对于基因c y p l l a 、c y p l l b 2 、c y p l 7 、c y p l 9 的m r n a 表达水平，d 刀 - d d t 外消旋及其对映体处理组相比于对照组都为统计学意义上的 显著上升。而对于基因c y p 2 1 8 2 和3 p h s d 2 的m r n a 表达水平，o , p7 一d d t 外 消旋及其对映体处理后，其为显著性的下调了。显而易见的，这8 个类固醇合成 途径中的关键基因中有4 个基因的对映体处理组之间具有显著性差异，分别为 c y p l1 8 2 、c y p l 7 、1 7 1 1 h s d l 和3 p h s d 2 。其中，对于基因c y p l l b 2 、c y p l 7 和1 7 1 1 h s d l m r n a 表达，r - d 护 - d d t 处理组相比较于孓( + ) 一o , p - d d t 具有更 强的促进翻译表达的作用。例如，r ( - ) 一o ： - d d t 与( + ) 一o , pr - d d t 相比于对照 组，基因c y p l l b 2 m r n a 相对表达值为2 1 2 和1 7 6 倍，基因c y p l 7 m r n a 相 对表达值为2 8 5 和1 6 9 倍。而对于基因3 p h s d 2 ，o , p f - d d t 的外消旋和两个对 映体对其m r n a 表达的作用则比较特殊( 图3 ) 。o , p r - d d t 外消旋、r 一( - ) - o , p - d d t 和孓( + ) d ，p - d d t 处理组作用后，测得的基因c y p l1 8 2 m r n a 的相对表达量为 2 8 4 、1 3 9 和0 5 7 。换言之，o 汐 - d d t 外消旋和尺( - ) o , p - d d t 对基因c y p l l b 2 的作用是上调的，而娶( + ) o , p - d d t 对基因c y p l l b 2 的作用是下调的。同时， 尺( _ ) d 护 - d d t 处理组引起的c y p l l b 2 m r n a 相对表达量是岛( + ) 一。炉 - d d t 处理 组的2 4 倍左右，即对于j e g 3 细胞系中基因c y p i i b 2 ，r 卜) o , p r - d d t 对其的 影响作用远大于娶( + ) d 护 - d d t 。总的来说，d 护 - d d t 的两个对映体对这8 个类 固醇关键基因存在显著的手性选择性。 浙江工业大学硕士论文 2 5 四种手性农药对甾体类激素代谢影响的对映体选择性 ， c y p l i a 凰勰 痢感黼豳 c 躺两离随 d 勰凰图豳 r a c e m a t e r 4 一 - o ，p d d ts - ( + i 一0 f - d d t c o n t r o lr a c c m a t e r - ( - ) - o p d d ts - ( + 0 p - d d t 图4 - 2c y p l1 a ( a ) ，c y p l 7 ( b ) ，c y p 2 1 8 2 ( c ) ，1 7 p - h s d 4 ( d ) ，c y p l1 8 2 ( e ) ，c y p l 9 ( f ) 和3 p h s d 2 ( g ) 在 j e g - 3 细胞中暴露于d 护- d d t 及其两个对映体浓度i x l 0 - 7 m o ll j2 4 h 后基因的表达情况的。数值是相对于 p a c t i n ，标准化后的得到的，代表m r n a 相对表达量。不同的字母代表显著性差异，相同字母表示无显著 性差异q 0 0 5 ，n = 5 ) 。箭头代表空白组和处理组之间存在显著性差异。 f i g 4 - 2 r e l a t i v ee x p r e s s i o n o f c y p l i a ( a ) ，c y p l 7 ( b ) ，c y p 2 1 8 2 ( c ) ，1 7 争h s i m ( d ) ，c y p l l b 2 ( e ) ，c y p l 9 ( 1 9 a n d3 肛h s d 2 ( g ) i nj e g 一3c e l l si n c u b a t e dw i t hr a c e m i co , p - d d ta n di t st w oe n a n t i o m e r sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f 1 0 7m o ll - 1f o r2 4 h v a l u e sw e r en o r m a l i z e da g a i n s ti - a e t i na n df o l di n d u c t i o nr e p r e s e n t sr e l a t i v em e 锄m r n a e x p r e s s i o nt on e g a t i v ec o n t r 0 1 d i f f e r e n tl e t t e r so nt h et o po f b a r sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gr a c e m i cd 炉7 - d d t a n di t st w oe n a m i o m e r s ，a n dy e tt h es a m el e t t e rp r e s e n t sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ，n = 5 ) t h ea s t e r i s k p r e s e n t sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gn e g a t i v ec o n t r o la n dt h eg r o u p st r e a t e dw i t ho t p - d d tq 0 0 5 ，n = 5 ) 浙江工业大学硕士论文 、，z盆o-，