（环境工程专业论文）地下水硝基甲苯降解菌的筛选及降解特性.pdf

m a s t e rd e g r e ed i s s e r t a t i o n s c r e e n i n ga n dd e g r a d a t i o n c h a r a c t e r i s t i c so f m t r o t o l u e n e - d e g r a d i n gb a c t e r i au nlld e r 一 一一 _ l g r o u n d w a t e r c o n d i t i o n s a - p h x u e s u p e r v i s e db ya s s p r o j h u a n gz h o n g h u a n a r oi n gu n i v e r s i t yo fs c i e n c e & t e c h n o l o g y m a r c h ，2 0 1 3 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均己在论文中作了明 确的说明。 研究生虢埠卫 邴年堋阴 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： ! = 审孟加l ；年多月f 珀 硕士论文 地下水硝基甲苯降解菌的筛选及降解特性 摘要 本文采用富集培养法，在低温条件下从受2 , 4 d n t 污染的底泥中驯化选育出一株 2 , 4 d n t 高效降解菌，经革兰氏染色和1 6 sr d n a 序列比对分析，鉴定该菌株为荧光假 单胞菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s s p ) ，探讨了2 , 4 d n t 降解菌在不同初始浓度、温度、 p h 值以及不同碳源作为共代谢基质条件下的降解特性，通过液相色谱、总有机碳测定、 离子色谱、液质联用等技术对中间代谢产物和降解机理进行了初步分析，并建立2 , 4 - d n t 反应动力学模型和微生物降解动力学模型。结果表明：2 , 4 d n t 降解菌在初始浓度为 4 0 m g l 、温度为1 4 士2 、p h 值为7 5 的降解条件下，经过1 9 2 h ，2 ，4 - d n t 降解效率可 达7 3 ，加入淀粉为共代谢基质时d n t 降解效率提高到8 1 ；在不同2 ，4 d n t 浓度、 温度下，2 ，4 d n t 反应动力学均符合一级反应动力学方程，在不同p h 条件下的酶降解 反应动力学方程符合米氏方程模型；在不同共代谢基质条件下，微生物降解动力学符合 单一底物抑制型a n d r e w s 模型。研究结果为2 ，4 二硝基甲苯地下水污染的实际处理提供 一定的理论依据和实验基础。 关键词：地下水污染，2 , 4 二硝基甲苯，生物降解，荧光假单胞菌，动力学模型 a b s t r a c t u s i n gt h ee n r i c h m e n tc u l t u r em e t h o d ，a ne f f i c i e n t2 , 4 - d n td e g r a d i n gb a c t e r i aw a s i s o l a t e df r o mt h es e d i m e n tw h i c hw a sc o n t a m i n a t e db y2 , 4 d n ta ti o wt e m p e r a t u r e t h e s t r a i nw a s 、d e n t i f i e da san u m b e ro fp s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ，s pb a s e do nt h eg r a ms t a i na n d 16 sr e i nas e q u e n c ec o m p a r i s o na n a l y s i s ，a n do p t i m i z e dd e g r a d a t i o nc o n d i t i o n si n c l u d et h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，p h ，a n dd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e sa sc o - m e t a b o l i s m s u b s t r a t e s i na d d i t i o nt oa n a l y s et h ei n t e r m e d i a t em e t a b o l i t e sa n dd e g r a d a t i o nm e c h a n i s m ， l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o m b i n e dw i t ht o t a lo r g a n i cc a r b o n ，i o nc h r o m a t o g r a p h y ，l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r yt e c h n i q u e sw e r eu s e d ，a n de s t a b l i s h e dt h ed e g r a d a t i o n k i n e t i cm o d e lo f2 ，4 - d n ta n dm i c r o b i a lg r o w i n gk i n e t i c sm o d e l t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：i n t h ec o n d i t i o nt h a tt h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f2 ，4 - d n tw a s4 0 m g l ，t e m p e r a t u r ew a s14 士2 。c ， p hw a s7 5 ，2 , 4 一d n td e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yw a su pt o7 3 a f t e r1 9 2 hi n c u b a t i o nt i m e ，s t a r c h a sc o m e t a b o l i s ms u b s t r a t e sc o u l di n c r e a s ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yt o81 ；i nd i f f e r e n t 2 , 4 一d n tc o n c e n t r a t i o n sa n dt e m p e r a t u r e ，2 , 4 一d n tk i n e t i c sw e r ei nl i n ew i t hf i r s t - o r d e r r e a c t i o n t h ee n z y m ed e g r a d a t i o nk i n e t i c se q u a t i o nf i t e dt h em i c h a e l i s - m e n t e ne q u a t i o n m o d e lu n d e rd i f f e r e n tp hc o n d i t i o n s ；m i c r o b i a ld e g r a d a t i o nk i n e t i c su n d e rc o n d i t i o n so f d i f f e r e n tc o - m e t a b o l i s ms u b s t r a t e sw e r ei n l i n ew i t ht h ea n d r e w sm o d e l t h ec o n c l u s i o n p r o v i d e d s o m et h e o r e t i c a la n d e x p e r i m e n t a l b a s i sf o rt h ea c t u a l p r o c e s s i n g o f 2 ，4 - d i n i t r o t o l u e n ep o l l u t e dg r o u n d w a t e r k e yw o r d s ：g r o u n d w a t e rp o l l u t i o n ，2 , 4 - d i n i t r o t o l u e n e ，b i o d e g r a d a t i o n ，p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s s p ，d y n a m i c a lm o d e l 硕士论文 地下水硝基甲苯降解菌的筛选及降解特性 目录 摘要i a b s t r a c t i i 目录i i i 1 绪论1 1 1 硝基苯类化合物的处理现状1 1 1 1 硝基苯类化合物及2 ，4 d n t 简介1 1 1 22 ，4 d n t 对地下水污染简介2 1 1 3 硝基苯类化合物废水的处理技术。2 1 1 4d n t 生物降解机制探索6 1 1 5 共代谢降解研究1 0 1 1 6 细胞生长动力学模型1 1 1 1 7 化学反应动力学方程1 4 1 1 8 分子生物学菌种鉴定1 5 1 2 课题研究意义和研究内容1 6 2 实验材料与方法。1 7 2 1 实验材料1 7 2 1 1 菌种来源。1 7 2 1 2 实验所用主要试剂1 7 2 1 3 实验仪器1 8 2 1 4 实验用培养基的配制1 8 2 2 分析测定方法1 9 2 2 1 菌体生长曲线的绘制1 9 2 2 22 ，4 一d n t 浓度的测定及标准曲线绘制1 9 2 2 3 离子浓度的测定2 0 2 2 4t o c 浓度的测定2 0 2 2 51 6 sr d n ap c r 扩增和序列测定2 0 2 2 6 扫描电镜样品制备2 0 2 2 7l c m s 检测中间产物2 l 2 3 实验方法2 1 2 3 1 菌株的筛选分离2 1 2 3 2 降解菌的富集培养和菌悬液的制备2 1 i i i 目录 硕士论文 2 3 3 高效降解菌的筛选2 2 2 3 4 高效降解菌的染色及菌种鉴定2 2 2 3 5 高效降解菌降解条件优化2 2 2 4 动力学模型的建立2 3 2 4 1 微生物细胞生长动力学模型的建立2 3 2 4 2 反应动力学模型的建立2 4 2 4 3 不同共代谢基质条件下动力学模型的建立步骤2 4 3 实验结果与分析2 5 3 1 高效降解菌的筛选2 5 3 1 1 革兰氏染色结果2 6 3 1 2 菌株形态表征及菌种鉴定2 6 3 2 优化高效降解菌的降解条件2 8 3 2 1 不同初始浓度对降解的影响2 8 3 2 2 优化温度条件2 9 3 2 3 优化p h 值3 1 3 2 4 共基质作用的影响3 3 3 2 5 总结3 4 3 3 反应动力学模型建立3 4 3 3 1 低温条件下不同2 ，4 一d n t 浓度的反应动力学模型3 4 3 3 2 不同p h 条件下酶降解动力学方程3 6 3 3 3 不同碳源共代谢的微生物细胞生长动力学模型的建立3 8 3 3 4 不同基质共代谢的反应动力学模型3 9 3 3 5 总结4 0 3 4 中间产物鉴定及降解机理初探4 1 3 4 1 高效液相色谱图4 1 3 4 2t o c 图结果分析4 3 3 4 3 离子色谱图4 3 3 4 4l c m s 图谱分析4 4 3 4 5 总结_ 4 7 4 结论与建议4 8 4 1 结 仑4 8 4 2 建议4 8 致谢。5 0 参考文献5 1 硕士论文地下水硝基甲苯降解菌的筛选及降解特性 1 绪论 1 1 硝基苯类化合物的处理现状 1 1 1 硝基苯类化合物及2 , 4 d n t 简介 硝基苯类化合物( n b s ) 作为化工生产中重要的有机原料，被广泛用于聚氨酯、农 药、橡胶、染料等生产过程中的中间体，包括硝基苯【1 1 、硝基甲苯【2 】、二硝基甲苯【3 1 等， 其生产和使用过程、废水废物的排放等都会对环境造成严重污染。大多数n b s 具有急性 毒性和致癌致畸性，部分已被列入世界环境优先监测污染物名单中，对地下水造成的污 染更不容忽视。2 ，4 d n t ( 2 ，4 d i n i t r o t o l u e n e ) 是多种化工过程的中间体，尤其是火炸药 的主要组成物质。高熔点的d n t 与低熔点的d n t 作用不同，前者用作火药的增塑剂； 而后者用于制作胶质和粉状工业炸药，同时也作为工业炸药的碳载体。 2 ，4 一d n t ( 2 ，4 d i n i t r o t o l u e n e ) 常温下是一种黄色片状或粒状固体，遇碱会变红，在 阳光下颜色则会变深。2 ，4 d n t 易燃，有毒，微溶于水，易溶于有机溶剂，如乙醚，丙 酮和苯等。表i 1 所示为其理化常数： 表1 12 ，4 二硝基甲苯的理化常数 中文名称 英文名称 结构式 分子式 c a s 编号 外观与性状 分子量 蒸汽压 熔点 沸点 密度 稳定性 危险标记 制造方法 2 ，4 二硝基甲苯 2 ，4 - d i n i t r o t o l u e n e 吣v v 。 s , n 从c ：c h 3 c 7 h 6 n 7 , 0 4 ；c h s c 6 h 3 ( n 0 2 ) 2 1 2 1 1 4 2 浅黄色针状结晶，有苦杏仁昧 1 8 2 1 4 1 3 3 3 k p a 1 5 7 7 6 9 5 3 0 0 相对密度( 水= 1 ) 1 5 2 ；相对密度( 空气= 1 ) 6 2 7 稳定 1 4 ( 有毒品) 主要由甲苯硝化而成 1 绪论硕士论文 2 0 世纪9 0 年代以来，国内外研究陆续报道了2 ，4 d n t 对鱼类、高等植物、藻类等 具有急性毒性效应【4 5 1 。2 ，4 d n t 有很强的毒性，能破坏免疫系统和神经系统，诱发高 铁血红蛋白白血症，人类长期暴露在充满硝基苯的环境中会产生呼吸急促、头晕目眩、 恶心呕吐及皮肤变蓝等中毒症状。溶解态的硝基苯通过食物链进入人体时，轻者引起贫 血和失去感官正常作用，重者会使呼吸功能衰竭并导致死亡。在2 0 0 9 年u se p a 6 j 公布 的最新国家推荐水质基准报告中显示硝基苯人体健康水质基准值为0 0 1 7 m g l ( 考虑消 费水和生物) 和0 6 9 m g l ( 仅考虑消费生物) 。2 , 4 d n t 因其具有急性毒性和致癌致畸性已 先后被列入我国及世界环境“优先控制的持久性有毒污染物”名单中【7 “j 。 1 1 22 , 4 d n t 对地下水污染简介 2 , 4 d n t ( 2 4 d i n i t r o t o l u e n e ) 因其化学性质稳定、生物难降解性，该类污染物极易 在水体沉积物、土壤等环境中累积，进而在食物链中生物蓄积，严重危及公众健康与生 态环境安全。相比于地表水，地下水所处的地质环境、流动特点和地理条件要复杂的多， 发现和确定地下水污染要比较困难，等发现地下水受到污染时，污染状况往往己经比较 严重，尤其是地下水n b s 污染物会随着地下水的流动和地下水位的波动导致污染范围非 常广，通过生物积累、生物浓缩、生物放大等作用会给人类带来巨大潜在危害，要修复 地下水污染就变得更加困难。 h e l e n a 等吲运用特定化合物3 h 3 h e 同位素分析法评估5 0 年前因战争而被爆炸物污 染的地下蓄水层中d n t 和t n t 存含量，结果表明经过5 0 年地下水层迁移，污染物的 浓度几乎没有变化，d n t 和n 盯污染最严重的地方浓度分别达到7 2 5 0 u g l 、3 3 0 0 0 嵋几， 即使含水层继续好氧，d n t 和n 汀的污染经过数百年也会存在。且爆炸物污染的地表 水在生物地球化学的影响下衰减速率为三硝基苯甲硝胺 l ，3 ，5 - t n b t n t 1 ，3 - d n b 2 ，4 d n t ，d n t 自然衰减最缓慢，需要人为强化降解【l 。 近年来，伴随着化工工业的不断发展，各行业对2 ，4 d n t 的需求量呈指数上升趋势， 排入环境的量也不可避免地逐年增多。鉴于其严重的危害性，对2 ，4 d n t 废水的治理己 经刻不容缓。世界各地的科学家和环境领域的专家们都纷纷致力于开发出行之有效的硝 基苯废水的处理方法，使其在达到高效、稳定的同时，降低处理成本，避免二次污染， 符合可持续发展的要求。 1 1 3 硝基苯类化合物废水的处理技术 鉴于硝基苯类化合物2 ，4 d n t 污染的普遍性和危害严重性，各种硝基苯类化合物污 染物处理技术应运而生，主要包括物理方法、化学方法、生物方法及物化一生物集成联 用技术。 1 1 3 1 物理法 对处理含有2 ，4 一d n t 废水的物理方法常用的有吸附法、焚烧法、蒸馏法、萃取法等， 硕士论文 地下水硝基甲苯降解菌的筛选及降解特性 目前应用比较广泛的是吸附法、萃取法。 ( 1 ) 吸附法 吸附法是利用多孔性物质做吸附剂来吸附废水中的d n t ，从而净化废水。应用较 广泛的吸附剂是吸附树脂和活性炭，此外还有硅藻土、焦炭、炉渣、磺化煤等。f e i 等【l l j 比较了高分子基活性碳( p v c 、p e t 、t r ) 、煤基活性炭( f 4 0 0 ) ，纳米管多壁活性炭 ( m 、孙汀) 对疏水性有机物如二硝基苯的吸附效果并研究其作用机理。传统的颗粒状活 性炭吸附剂存在吸附效率低、使用寿命短和再生条件难以及材料的机械强度低等不理想 的缺点，活性炭纤维吸附( a c f ) 作为一种新型的吸附材料具有吸附速度快、吸附过程影 响因素少、操作条件简单、可再生利用和无二次污染等优点。但该法也存在许多不足， 如活性炭吸附是一种非破坏性的技术，只是将污染物从液相转移到固相碳的表面；吸附 饱和的活性炭再生时有疏松、易碎等缺点。而且，活性炭再生通常涉及活性炭曝露在高 温下，在处理废碳吸附爆炸化合物时有可能产生不安全的操作环境，即使深度填埋将来 也会涉及更复杂的消耗。 z h a n g 等【1 2 】研究了活性焦炭对炸药生产废水中的主要成分二硝基甲苯磺酸盐的吸 附，并建立相应的吸附等温动力学模型，证明了吸附是放热的物理过程，且其吸附等温 线与r e d l i c h p e t e r s o n 等温方程模型相吻合。结果表明活性焦炭含量为1 6 0 9 l ，p h 为 6 2 8 ，室温2 0 的条件下经过3 小时搅拌，二硝基甲苯磺酸盐去除率可达到8 0 以上， 同时出水的急性毒性显著下降，是一种低成本有应用前景的处理方法。s h e n 等【l3 j 研究 了硝酸氧化多壁碳纳米管对硝基苯类化合物吸附过程的动力学、热力学方程。吸附过程 为准二级动力学方程，l a n g m u i r 和f r e u n d l i c h 模型，测定了吸附热力学参数如平衡常数， 标准自由能，标准焓值，和标准熵的变化。说明吸附是自发放热过程，硝基苯类化合物 的结构、硝基的数量和位置是影响吸附速率和容量的主要因素，多壁碳纳米管经硝酸氧 化处理极大的增加了比表面积和孔粒径，并引入含氧官能团从而削弱吸附作用。 ( 2 ) 萃取法 萃取法的基本原理是由于不同有机物在溶剂中的溶解度不同从而分层析出，实现污 染物的去除。可分为液液微萃取和固相微萃取，一般作为水溶液中微量污染的检测手段。 于文凤等【1 4 】以生物柴油为萃取剂处理硝基苯废水，萃余相中硝基苯脱除率达到9 9 6 8 。 ( 3 ) 混凝沉淀 由于在不同的p h 条件下，废水中污染物的存在形态和溶解度会不同，因此通过加 入一定量的酸溶液调节废水成酸性，使污染物产生混凝沉淀从而达到去除效果。 由于经济或技术原因及二次污染问题是比较突出且难解决的问题，同时物理法只是 将污染物从一种存在形式转化为另一种形式，并没从根本上使污染物无毒化，因此物理 方法很难在实际中得到推广应用。 1 绪论硕士论文 1 1 3 2 化学法 d n t 废水用化学法处理时，废水中的有机物通常被氧化成c 0 2 、h 2 0 、h n 0 3 等无 毒小分子，在去除有害物质同时，不产生环境二次污染。常用的化学法有零价金属还原 法、f e n t o n 试剂氧化法、超临界水氧化法、电化学法等，这些方法在不断的发展过程中 一取得了良好的处理效果。 ( 1 ) 零价金属还原法 即溶液中的2 , 4 d n t 在给电子体催化下与h + 发生加氢反应被还原，而生成易处理 的胺类物质，再通过后期生物转化作用或絮凝沉淀而将其完全去除。 y i n 等【1 5 】评估地下水中p h 、氧含量及常见离子( c v ，s 0 4 2 ，n 0 3 一，h c 0 3 一，p 0 4 卜) 对零价铁还原n b 污染物的影响，发现酸性环境利于n b 还原，随着铁离子浓度增至 5 0 9 l ，降解过程符合准一级反应动力学方程，c l 一，s 0 4 2 - ，n 0 3 - 的存在促进n b 去除， 而h c 0 3 - 浓度达到5 0 m g l 时则抑制n - b 降解，而p 0 4 3 - 和腐植酸会包裹在铁表明形成复 合物阻碍反应进行。因此，在地下水硝基苯类污染物零价铁修复实践中，应考虑地下水 中离子组分对反应过程的影响。姜永海等【1 6 】采用序批试验利用零价铁还原2 , 4 - d n t 也得 出相同的结论，地下水中常见阴离子c i 一，n 0 3 - 能显著提高2 , 4 - d n t 还原降解率，而 p 0 4 3 - 和重金属c r ( v i ) 则表现为明显的抑制作用，且2 ，4 d n t 还原的最终产物为2 , 4 d a t ，无法进一步降解，需要后续处理。t h o m a s 等【l 刀研究了d n t 废水在再循环批式 反应器中零价金属还原作为前期处理可实现还原和氧化同步进行。表明加入的零价金属 还原d n t 而生成的易于后期氧化的主要中间产物为4 氨基2 硝基甲苯和2 氨基一4 - 硝基 甲苯。其他电子供体如硫化物【1 8 】、氢释放化合物、多糖等【1 9 l 也能还原2 , 4 - d n t 等硝基 苯类化合物。 ( 2 ) 催化氧化法 主要利用高活性自由基( 来自f e n t o n 试剂、h 2 0 2 、0 3 等) 或絮凝体将污染物质氧 化或化学键结合，形成小分子物质或沉淀，方法主要包括光催化氧化、f e n t o n 试剂法、 超临界水氧化以及多种氧化技术相结合的方法。 有机污染物通过光催化氧化能分解转化为c 0 2 、h 2 0 、p 0 4 孓、s 0 4 厶、n 0 3 、x 等 无机小分子，达到完全矿化的目的。非均相光催化反应机理为，当能量大于半导体禁带 宽度的光照射材料时，会激发出分别具有很强还原性和氧化性的光生电子空穴对，光 生电子或空穴遇到吸附在半导体表面溶解氧、水及污染物分子时，立即发生一系列的氧 化还原反应，从而使有毒的污染物降解为毒性较小或无毒的物质。因此具有一定能量的 光照射的水中加入定量的光敏半导体材料，如t i 0 2 、c u 2 0 等从而发生光催化氧化，但 有时降解会不彻底。 对不同氧化剂的探索也取得一定进展，c h e n 等【2 0 】探讨了饮用水中d n t 等苯环物质 被臭氧氧化的机理过程，并通过臭氧和o h 反应速率表明反应效果比单独o ，氧化要高， 4 硕士论文地下水硝基甲苯降解菌的筛选及降解特性 主要由于硝基的亲电子性和被反应物质结构，在高p h 值，0 3 i - - 1 2 0 2a o p 反应由于臭氧 和o h 的存在高效进行。研究还发现，t o c ( 总有机碳) 含量通过常规的直接臭氧氧化 不会明显地降低，而经过臭氧氧化作用将有机碳氧化为生物易降解的水溶性有机碳后， 联合后续生物法处理能有效地通过生物代谢作用降低总有机碳含量。随后，c a r l o s 等【2 l 】 又研究了d n t 在f e n t o n 氧化过程中通常是先羟基化后伴随着苯环开裂，因h 2 0 2 在f e 2 + 催化下生成氧化能力很强的未配对的羟基自由基o h ，其氧化电位高达2 8 0 v ，能直接 氧化有机物甚至矿化为c 0 2 和h 2 0 等无机物。f e n t o n 氧化法具有操作过程简单、运行 费用低，并且在处理难降解、具有生物毒性或常规化学法难以氧化的有机废水等方面都 有很好的处理效果。因此，f e n t o n 氧化法在国内外废水处理研究中得到普遍的研究应用 和发展。 z h a n g 掣2 2 j 以m f e o o h 柱撑人造沸石( z p f ) 为新颖催化剂研究h 2 0 2 氧化去除地下 水中d n t 污染物的效能，对比分析不同p h 条件下f e o 还原、z p f h 2 0 2 催化氧化及 还原- 催化氧化三种修复技术对2 ，4 d n t 的处理效果，得出低p h 利于2 ，4 d n t 还原， 而中性条件即反应体系p h 值接近a - f e o o h 零电点时，2 , 4 d n t 催化氧化降解效果较 好，且其降解数据符合拟一级反应动力学模型，还原z p f 催化氧化的作用机制主要为 非均相芬顿反应。 常双君等【2 3 j 采用超临界水氧化( s c w o ) 法降解二硝基甲苯( d n t ) 炸药生产废水， 得出温度、停留时间的控制对d n t 去除率有显著提高，并用自由基反应机理解释了超 临界水氧化d n t 的降解过程。超临界水氧化技术是近年来迅速发展的深度氧化技术， 原理是在超临界水( t = 3 7 4 。c ，p ：2 2 1 a ) 条件下，水的介电常数减少对有机物和0 2 都是极好的溶剂，有机物的氧化是在均相氧化体系中进行的，因此水作为一种理想的介 质使反应不会因相间转移而受限制，同时，相对高的反应温度会使反应更快，能迅速将 有机污染物的氧化分解成n 2 、h 2 0 、c 0 2 和盐类等无机小分子化合物，没有二次污染， 但此方法对设备的强度要求较高。 1 1 3 3 物化联用 为了同时满足技术上和经济上的要求，克服单独使用一项技术处理d n t 废水的局 限，提出了多种技术联合处理d n t 废水。 超声波的非线性振动产生的辐射力对臭氧氧化具有强化作用，臭氧在超声波场中强 化分解产生更多的氧化性更强的o h 来氧化降解废水中的污染物，臭氧的传质效率在超 重力条件下能够提高，因此超声波一超重力一臭氧氧化耦合工艺可显著提高臭氧的利用 率和氧化能力。 c h e n 等1 2 4 】研究通过超声激活强化过硫酸根阴离子对d n t s 的氧化过程，并通过优 化变量参数如超声波功率密度、过硫酸铵负离子浓度、反应时间和废水酸度等几乎可完 全去除d n t s 。结果表明，增加硫酸根自由基的量可明显增强氧化作用，说明自由基起 l 绪论 硕士论文 主要的氧化作用。反应中，d n t 首先甲基氧化生成二硝基苯甲酸，然后脱羧基形成邻 二硝基苯，最后实现矿化。随后，c h e n 等【2 习又用超声波照射矿化t i 0 2 悬浮多项体系的 d n t 和t n t ，结果表明增强废水的酸度且降低反应温度可提高去除率，吸附在t i 0 2 颗 粒上的d n t s 经历硝基键断裂生成一硝基甲苯或甲基氧化生成二硝基苯甲酸的过程， t i 0 2 的吸附作用大大提高了d n t s 的去除率。接着c h e n 等【2 6 】继续研究了原生废酸溶液 中通过电化学法产生的过氧化氢实现对d n t 的矿化，并考察电势、反应温度、氧含量、 硫酸含量等条件的影响。结果表明，d n t 首先硝基断裂生成对硝基甲苯，然后甲基氧 化生成苯甲酸，再脱羧基实现矿化。t o c 的降低伴随着水的消耗，此电解法可为工业应 用甲苯硝化过程废酸重新利用的新的方向。 w e n 等【2 7 】利用一体化光解光催化和生物降解( i c p b ) 固定化工艺降解2 ，4 d n t ， 一个多孔陶瓷载体用于吸附t i 0 2 及积聚微生物，另一个大孔海绵载体吸附2 ，4 d n t 的 同时保护微生物。结果发现，光催化使硝基还原为铵基后水解释放n h 4 + ，生物降解氧 化释放n 0 3 一，i c p b 更能完全释放无机氮，几乎等于氧化为硝酸盐和铵根的量。 1 1 3 4 生物法降解2 ，4 - d n t 地下水污染 地下水的原位生物修复技术是从2 0 世纪8 0 年代发展起来的一项低投资、高效益、 便于实施且极具发展潜力的清洁技术【2 引。近年来，众多研究者对硝基苯类化合物降解菌 的分离纯化、鉴定、基因工程菌构建等方面做了大量研究，均表明利用该技术修复d n t 污染地下水是切实可行的。地下水生态系统是具有特定环境的循环系统，生物法是在特 定条件下，对生产上较容易采集菌种进行驯化，使之适应培养环境，从而通过微生物的 新陈代谢降解有机物。d n t 是一种人工合成化合物，这些异物质在天然产物中很少出 现，因此较难生物降解。但是微生物在长期选择性压力下，可通过产生诱导酶来利用硝 基苯作为碳源、氮源或能源。d n t 降解菌既可在低于管理机构规定的最低检测出d n t 浓度为o 0 5 7 1 a m 的情况下维持稳定生长【2 们，也可几乎完全降解硝基苯浓度高达 1 0 0 0 m g l 的工业废水【3 0 1 ，具有很好适应性，因此在地下水贫营养的环境下投菌法进行 d n t 的降解是可行的，且在存在某些共底物和氧获得受限制的条件下有利于工程菌对 2 ，4 d n t 降解【3 l 】。生物法处理废水范围广、量大、运行费用低，人力、物力的投入要比 其他方法少的多，且不易造成二次污染，因此人i - 到l l 化筛选出硝基苯类化合物地下水污 染的高效降解菌是生物法处理的重要研究方向。l i 等【3 2 】从受污染的松花江底泥里面筛选 出来的p s e u d o m o n a s p u t i d a ，能在5 。c 的低温下将1 2 0 m g l 的硝基苯1 7 5 h 内完全降解。 1 1 4d n t 生物降解机制探索 众所周知，d n t 属于难降解化合物，其生产和使用过程、废水废物的排放及意外 泄露等已导致对地下水的严重污染【3 3 】。微生物作为地球物质循环中最重要的分解者，其 对环境中污染物的代谢消解作用是微生物修复地下水污染的的技术基础。目前对微生物 硕士论文 地下水硝基甲苯降解菌的筛选及降解特性 降解d n t 的好氧厌氧机理已有了一定程度的发展，人们普遍认为，生物降解硝基苯类 化合物主要有三种代谢方式：加氧酶激发代谢 3 4 】、硝基还原酶激发代谢【3 5 】和通过形成迈 森海默络合物中间体的芳环还原酶激发代谢【3 6 i 。 硝基苯类化合物难于被好氧生物降解，主要是因为苯环上的电子云密度由于n 0 2 的吸电子性下降，不利于氧化酶的亲电子攻击【3 刀，从而限制了硝基苯类化合物的好氧降 解速率，难于被好氧微生物降解。s p a i n 3 8 】总结出好氧生物降解硝基苯类化合物的4 种 不同的途径：单加氧酶催化消去硝基使其脱离苯环生成亚硝酸根【3 9 】；芳环上被双加氧酶 催化先插入2 个羟基，然后硝基以亚硝酸盐形式去除，最后裂解开环【3 5 j ；硝基苯类化合 物被还原为羟胺类，胺基经过重排或水解消去【4 0 】；芳环被还原进一步形成迈森海默络合 物，接着硝基被转化为亚硝酸根去耐”】。 在一定的环境条件下，微生物可利用d n t 做为唯一的碳源、氮源及能源。美国庭 德尔空军基地的j i m 等【4 l 】从二十世纪九十年代便开始研究d n t 的微生物降解，在d n t 污染环境的生物修复方面做出了卓越的贡献，其实验室分离的p s e u d o m o n a ss p d n t 及 b u r k h o l d e r i as p d n t 是最早被分离出来的2 , 4 d n t 降解菌。在好氧条件下2 , 4 d n t 可 被其完全矿化，同时矿化产物c 0 2 、h 2 0 和n 0 2 - 符合化学计量比。并在随后的研究中分 析了其降解途径：在双加氧酶的作用下2 ，4 d n t 芳香环首先羟化生成4 甲基5 硝基儿 茶酚( 4 m 5 n c ) ，同时释放出n 0 2 ，接着单加氧酶使其去除硝基而氧化生成2 羟基5 甲基苯醌( 2 h 5 m q ) ，伴随n 0 2 的释放，接着被还原为2 ，4 ，5 三羟基甲苯，然后依靠甲 基丙二酸半醛脱氢酶开环矿化，最终生成丙酮酸和丙酰，好氧矿化降解途径如下图l 所 示： u p p e rp a t h w a y 2 ，4 - d n t 2 h 5 m q l 绪论 硕士论文 l o w e r p m h w a y a 图1 1b u r k h o l d e r i as p s t r a i nd n t 对2 ，4 一d n t 的好氧矿化过程 从分子水平上对微生物进行基因组研究，可为探索微生物个体以及群体间作用、重 要代谢及调控机制的奥秘提供新的线索和思路。a i t o r 等【4 2 】发现b u r k h o l d e r i as p d n t 降 解菌的d n a 已具有完整或能够扩展酶类处理异形生物质及其中间产物的能力，通过调 节基因编码转录调控因子( d n t r ) 代替相异的首要基因型，此种转录调控因子与基质无 关从而具有新型催化功能。分子生物学显示2 ，4 d n t 降解酶是一个三组分酶，包含黄素 蛋白n a d ( p ) h 还原酶、r i e s k e 铁氧化还原蛋白酶和由两个不同亚基组成的终端加氧酶， 且其行为相似于萘双加氧酶【4 3 】。透明颤菌血红蛋白( v g b ) 基因片段可显著提高细胞的 氧供应，特别在细胞呼吸中作为一种终端氧化酶而起作用，使细菌在低氧条件及其他极 端下能够很好的生存。各国科学家利用v g b 基因移植从而提高多种污染物降解菌效率提 高已有很大进展。n a s r 掣2 9 】通过基因工程将透明颤菌血红蛋白( v 曲) 片段复制到d n t 降解菌b u r k h o l d e r i as p ( 来源于p s e u d o m o n a ss p ) 中，以氧合态的形式介入细胞与氧的 代谢途径，明显促进了微氧条件下细胞的生长状况和蛋白质合成的能力，新的菌株( y v l ) 低氧下对2 , 4 d n t 降解率是原来3 5 倍，多次代培养菌降解能力更高。新菌株( y - v 1 ) 在 含氧量低的、添加油醇为共底物的两相生物反应器中1 2 0 h 可降解o 8 醴，4 - d n t ，因此人 工设计合成密码子优化的v h b 基因及其天然的低氧启动子序列，构建高产d n t 抗贫氧 高密度基因工程菌适应外界恶劣环境是一项很有发展前景的技术m 】。m a i a t 4 5 】发现在硝基 芳烃类化合物释放到环境中的几十年，水平基因转移( h g t ) 促进了代谢途径的快速进 化，目前被筛选出来的降解菌处于进化的不同阶段。如d n t 降解菌a c i d o v o r a xs p s t r a i n j s 4 2 和b u r k h o l d e r i as p s t r a i n 的调控基因和双加氧酶就来源于萘降解菌的进化。具体演 变过程如下图： 硕士论文 地下水硝基甲苯降解菌的筛选及降解特性 图1 2 合成硝基芳烃化合物的降解代谢途径及其调控系统的演变 硝基苯类污染物的好氧处理虽能实现完全矿化，但一般硝基苯进水浓度要低，且降 解速率很慢，工业废水高浓度、快速的处理要求难以满足；另外，在某些情况下，硝基 苯在好氧降解时还可能生成毒性更大、或几乎不能降解的中间代谢产物。厌氧法相对于 好氧法来讲，不需要反应器的曝气，节省了运行费用，剩余污泥量少，但反应速率较慢， 反应时间长，处理构筑物容积大，厌氧法处理有机废水已有近百年的历史。 - n 0 2 为硝基苯类化合物中的强拉电子基团，使本有共扼效应的硝基苯环同时具有强 的吸电子诱导效应，更加稳定了苯环，因此废水中硝基苯的厌氧微生物降解较好氧降解 更易发生。经厌氧加氢处理后的- n 0 2 转化为- n h 2 ，而- n h 2 为推电子基团，具有推电子 效应，苯环电子云密度由于可逆的诱导效应和超共扼效应而增加，降低了其稳定性，产 生的还原产物对微生物毒害作用低而易于生化处理，从而大大提高了废水的可生化性。 废水中的硝基苯经厌氧茵还原成苯胺类物质，然后苯胺可氧化成邻苯二酚后再进一 步开环降解【4 6 】。s p a i n ”】认为厌氧生物降解硝基苯类化合物也有4 种不同的途径：硝基 苯酚经单加氧酶加入氧原子，而脱去硝基；一些硝基苯类化合物的芳环易被双加氧酶插 入2 个羟基，从而芳环上的硝基被脱去；一些好氧微生物同样可通过向二硝基苯类化合 物加氢还原形成h 迈森海默络合物的中间产物，然后亚硝酸盐经重新芳香化去除；硝 基苯、4 硝基苯甲酸上的硝基首先加氢还原成相应的羟胺，然后羟胺在酶的催化重组作 9 1 绪论 硕士论文 用下形成相应的羟基芳香化合物，最后裂解开环矿化羟基芳香化合物。 存在的2 , 4 d n t 的厌氧生物降解途径如下图2 所剥4 7 】： n 0 2 2 ，4 - d n t n 0 2 卫 n o 4 - h i l t o n - 2 拜 n h o h 土 n 0 2 2 h a - 4 n t n h o h 4 h a - 2 l t n 0 2 2 a 斗 r r o h 3 n h 2 4 - a 2 - n t n h 2 2 4 n a t n h 2 图1 32 ，4 - d n t 厌氧降解途径 由于2 ，4 d n t 及其代谢中间产物易矿化的条件不同，单独采用还原