（环境工程专业论文）咪唑类离子液体对生物大分子的作用及其植物毒性研究.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 离子液体是一类绿色的、新型的溶剂和催化剂，具有广泛的应用前景；但部分 研究陆续表明离子液体并非如报道的完全“绿色”。最近几年其潜在的毒性、生物 降解性及绿色离子液体的设计与合成引起了人们的广泛关注。针对离子液体的毒 性研究是离子液体开发与利用研究的一个重要环节，本论文选用目前研究最为深 入的l 一丁基一3 一甲基咪唑类离子液体，探究其对生物大分子的作用及其植物毒性。 1 、以人血清白蛋白为主要对象，用荧光光谱法、紫外吸收光谱法和圆二色光 谱法来详细研究3 种咪唑类离子液体对生物大分子蛋白质的毒性作用。结果表明： ( 1 ) 3 种离子液体能对h s a 的内源性荧光产生明显的猝灭作用，并且荧光强 度随着离子液体浓度的增加而减弱，证明离子液体与h s a 具有很强的结合能力。 ( 2 ) 根据s t e r n v o l m e r 方程求出了i l s 与h s a 的结合常数( 的和结合位点数 ( 刀) 。 ( 3 ) 通过考察i l s 与d n a 相互作用的吸收图谱，得出i l s 对h s a 的猝灭机 制属于形成了复合物的单一静态猝灭过程。 ( 4 ) 圆二色光谱( c d ) 确定了i l s 与h s a 的结合导致了蛋白质二级结构的微弱 变化。 2 、利用琼脂糖凝胶电泳法研究了1 丁基3 甲基咪唑溴盐( 【b m i m b r ) 、和1 丁基3 甲基咪唑三氟乙酸盐( b m i m c f 3 c o o h ) 与d n a 的体外结合作用，初步判 断2 种咪唑类离子液体与d n a 间发生了嵌插作用。这对于揭示离子液体引起d n a 损伤、细胞凋亡等致毒分子机理提供一定的参考价值。 ( 1 ) 进一步以小麦( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) 为试材，采用水培方法研究了常见的 离子液体1 丁基3 一甲基咪唑三氟乙酸盐( b m i m c f 3 c o o h ) 对小麦种子萌发、幼 苗生长、淀粉酶活性和叶片可溶性蛋白质含量的影响。 ( 2 ) 处理组幼苗的根长、株高以及叶片蛋白质的含量也显著下降，与对照组 相比各组差异均达显著水平。 ( 3 ) 这表明在一定的浓度下，l 一丁基3 一甲基咪唑三氟乙酸盐对小麦种子萌发 和幼苗生长均具有一定的毒害作用，4m m 是该类离子液体对小麦毒性的临界浓 度。 咪唑类离子液体对生物大分子的作用及其植物毒性研究 3 、选用青皮蚕豆( v i c i af a b al ) 为试验材料，利用大棚土壤栽培条件，研究 了应用广泛的咪唑类离子液体1 丁基3 甲基咪唑氯盐对蚕豆光合系统的影响。结 果表明： ( 1 ) 【b m i m c l 处理后的蚕豆叶片的相对叶绿素含量，随离子液体 b m i m c l 浓度的升高而降低，说明离子液体浓度越大，对蚕豆的光合系统的影响就越大。 离子液体 b m i m c l 处理蚕豆3d 左右时，蚕豆叶片的s p a d 值达到最小值，随着时 间的增加，由于植株的补偿作用，蚕豆叶片相对叶绿素含量值回升，与对照组差 异逐渐缩小。 ( 2 ) 【b m i m c l 处理后的蚕豆叶片净光合速率( 肌) 、气孔导度( g s ) 、蒸腾速率 ( m 的结果分析可以看出，低浓度的离子液体对蚕豆叶片的蒸腾和光合作用影响 差异性不显著。高浓度的离子液体会降低蚕豆叶片的蒸腾和光合作用。 ( 3 ) 高浓度离子液体能增加蚕豆叶片的活性氧含量，从而加速蚕豆的衰老， 导致蚕豆叶片的光合速率降低。 ( 4 ) 细胞受到低浓度离子液体胁迫而提高氧化压力，同时又升高c a t 酶的活 性来保护自身免受氧化损伤，这个过程需要大量的能量消耗。 离子液体进入生物体内可与生物大分子蛋白质和d n a 直接或间接的反应，影 响蛋白质和d n a 的结构和稳定性，导致d n a 交联、d n a 链断裂、碱基改变等多 种化学损伤，进而引起癌变、突变等遗传毒性。本文的研究结果不仅进一步丰富 离子液体对生物体在分子、基因及种群等不同水平的毒性方面的数据，而且有助 于建立保护环境安全的离子液体排放标准。 关键词：离子液体；生物大分子；植物毒性 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t i o n i cl i q u i d s ( i l s ) i sak i n do fn e wg r e e ns o l v e n ta n dc a t a l y s tw i t haw i d e a p p l i c a t i o n s ，h o w e v e r , w i t ht h ed e v e l o p m e n tt ot h ed e p t h ，s o m es t u d i e sh a v es h o w nt h a t i l si sn o tc o m p l e t e l y “g r e e ns o l v e n t s ”r e c e n t l y , t h ep o t e n t i a lt o x i c i t y , b i o d e g r a d a b i l i t y a n dt h ed e s i g na n ds y n t h e s i so fg r e e ni o n i cl i q u i d sh a v ea r o u s e dw i d e s p r e a dc o n c e m d e v e l o p m e n ta n de x p l o i t a t i o no fi o n i cl i q u i d sh a db e c o m eas i g n i f i c a n tr e s e a r c hr e a l m o fg r e e nc h e m i s t r ya n dt h e i rt o x i cr e s e a r c hw a sa ni m p o r t a n tp a r ti nt h e i rd e v e l o p m e n t a n de x p l o i t a t i o n t h i sr e s e a r c hi n v e s t i g a t e dt h ei n f l u e n c eo f1 一b u t y l - 3 一m e t h y l i m i d a z o l i u mi o n i cl i q u i dw i t hb i o m a c r o m o l e c u l e sa n dt h e i rp h y t o t o x i c i t y i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，o nt h eb a s i so ft h ep r e v i o u sr e s e a r c h ，t h et o x i c i t ye f f e c to f i m i d a z o l i u mi o n i cl i q u i d ( i l ) ，1 - b u t y l 一3 - m e t h y li m i d a z o l i u mb r o m i n e ( c 8 h 1 5 n 2 b r , 【b m i m b r ) ，1 - b u t y l 一3 - m e t h y l i m i d a z o l i u mt e t r a f l u o r o b o r a t e ( c 8 h l5 n 2 b f 4 ， + 【b m i m b f 4 ) ，1 - b u t y l 一3 一m e t h y li m i d a z o l i u mt r i f l u o r o a c e t a t e ( c 8 h 1 5 n 2 c f 3 c o o h ， 【b m i m c f 3 c o o h ) a n d h u m a ns e r u m a l b u m i n ( h s a ) w e r ei n v e s t i g a t e db y s p e c t r o s c o p yi n c l u d i n gu va b s o r p t i o ns p e c t r a ，f l u o r e s c e n c ee m i s s i o na n dc i r c u l a r d i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r a t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w ： ( i ) i ti so b v i o u s l yt h a tt h et h ef u o r e s c e n c eo fh s a c o u l db eq u e n c h e db yi l s ，a n d t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fh s aw a sd e c r e a s e dw i t ha d d i t i o no fi l s ，s oi ti s c l e a r l y t h a tt h e r ei ss t r o n gb i n d i n gb e t w e e ni l sa n dh s a ( 2 ) t h eb i n d i n gc o n s t a n t ( 妁a n dt h en u m b e ro fb i n d i n gs i t e s ( 力) w a sm e a s u r e db y s t e m v o l m e rf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gm e t h o d ( 3 ) i td e m o n s t r a t e dt h a tt h eb i n d i n gm e c h a n i s mw a st h es i n g l es t a t i cq u e n c h i n g p r o c e s sa c c o r d i n gt ot h eu v - v i s i b l es p e c t r ao fi l sa n dh s a ( 4 ) t h ec i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r ad e t e r m i n e dt h ec o m b i n a t i o no fi l sw i t hh s ah a s l e dt oa s l i g h tc h a n g ei np r o t e i ns e c o n d a r ys t r u c t u r e t h e l b u t y l 3 一m e t h y l i m i d a z o l i u m b r o m i d e ( b m i m b r ) a n d1 - b u t y l 一3 m e t h y l i m i d - a z o l i u mt r i f l u o r o a c e t a t e ( 【b m i m 】c f 3 c o o h ) b i n d i n go fd n ai nv i t r o b ys t u d i e d a p p l y i n ga g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s i ts h o w e dp r e l i m i n a r y t h a tt w ok i n d so f i m i d a z o l i u mi o n i c l i q u i d sw i t hd n ai n t e r c a l a t i o n t h er e v e l a t i o no fm o l e c u l a r m e c h a n i s mo ft o x i e t i t ya b o u tt h a ti l sc a u s e dd n ad a m a g ea n da p o p t o s i sp r o v i d e d s o m er e f e r e n c ev a l u e i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so f1 - b u t y l 3 m e t h y li m i d a z o l i u mt r i f l u o r a c e t a t e ( b m i m c f 3 c o o h ) o nt h es e e d sg e r m i n a t i o nr a t ea n ds e e d l i n gg r o w t ho fw h e a t ( t r i t i c u m a e s t i v u m l ) w e r ee v a l u a t e db yw a t e rc u l t u r et e s t sw i t hd i f f e r e n t tt i 咪唑类离子液体对生物大分子的作用及其植物毒性研究 c o n c e n t r a t i o n s ，w i t ht h e a m y l a s ea c t i v i t ya n ds o lu b l ep r o t e i nc o n t e n t so fs e e d l i n gl e a f t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) t h es e e dg e r m i n a t i o nr a t ea n da m y l a s ea c t i v i t yo fw h e a tw e r ed e c r e a s e d 州t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f 【b m i m c f 3 c o o h ，s h o w i n go b v i o u sd o s e r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s ( 2 ) t h el e n g t ho fr o o ta n ds t e m ，t h ec o n t e n to fp r o t e i nw e r ea l s or e d u c e dw h e n c o m p a i r e dt oc o n t r 0 1 ( 3 ) t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t1 - b u t y l 一3 - m e t h y li m i d a z o l i u mt r i f l u o r o a c e t a t ea t d e f i n i t ec o n c e n t r a t i o n ss h o ws o m et o x i c i t yt ot h es e e d sg e r m i n a t i o na n d s e e d l i n g g r o w t ho fw h e a t ，a n dt h ec r i t i c a lc o n c e n t r a t i o no f 【b m i m c f s c o o hs o l u t i o na f f e c t i n g t h ew h e a tw a s4m m t os t u d yt h ew i d e l yu s e di m i d a z o l ei o n i cl i q u i d ，1 一b u t y l - 3 一m e t h y l i m i d a z o l i u m c h l o r i d es a l to nt h ep h o t o s y n t h e t i cs y s t e mo fb r o a db e a n s ，u s i n gt h eg r e e n h o u s es o i l c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) t h es p a dv a l u eo f 【b m i m c lt r e a t e dp i s u ms a t i v u ml e a v e sw a si n c r e a s e dw i t h t h ei o n i cl i q u i d b m i m c 1c o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e d ，i n d i c a t i n gt h a tt h e g r e a t e rt h e c o n c e n t r a t i o no fi o n i cl i q u i d 【b m i m c l ，t h eg r e a t e rt h ei m p a c to nt h ep h o t o s y n t h e t i c s y s t e mo ft h eb r o a db e a nw a s ( 2 ) i tc a nb ec o n c l u d e df r o mt h er e s u l to fp n ，g sa n dt ro ff b m i m c 1t r e a t e dp i s u m s a t i v u mt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f 【b m i m c 1s h o w e dai n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ei n t r a n s p i r a t i o na n dp h o t o s y n t h e s i si n f l u e n c eo fl o wc o n c e n t r a t i o n so fi o n i cl i q u i d so nt h ei p i s u ms a t i v u ml e a v e s ( 3 ) h i 曲c o n c e n t r a t i o n so fi o n i cl i q u i dc a ni n c r e a s et h ea c t i v eo x y g e nc o n t e n to f p i s u ms a t i v u ml e a v e s ，t h u s s p e e d i n gu pt h es e n i l i t yo fi t ，a n dr e s u l t i n gi nl o w e r p h o t o s y n t h e t i cr a t e t h ei o n i cl i q u i dc a nb ed i r e c to ri n d i r e c tr e s p o n s eo fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e so f p r o t e i n sa n dd n a i nv i v oa n dc a ne f f e c tp r o t e i n sa n dd n as t r u c t u r ea n ds t a b i l i t y , l e a d i n gt od n ac r o s s l i n k s ，d n as t r a n db r e a k sa n db a s ec h a n g e si nav a r i e t yo f c h e m i c a ld a m a g e ，a n dt h u sc a u s ec a n c e r , m u t a t i o na n dg e n e t i ct o x i c i t y t h i sr e s e a r c h r e s u l t sc a nn o to n l yf u r t h e ri o n - r i c hl i q u i do nt h e o r g a n i s mi nm o l e c u l a r , g e n ea n d p o p u l a t i o nl e v e l so ft o x i c i t yd a t a ，b u ta l s oh e l p sp r o t e c tt h ee n v i r o n m e n ts a f eo ni o n i c l i q u i de m i s s i o ns t a n d a r d s k e yw o r d s ：i o n i cl i q u i d ；b i o m a c r o m o l e c u l e ；p h y t o t o x i c i t y i v 江苏大学硕士学位论文 1 1 研究背景 第一章绪论 在化学工业发展之初，当遇到需要溶剂时，人们就会用常规的液体溶剂如苯、 甲苯、二氯甲烷、乙腈、甲醇、乙醇和水等，它们为人类生活得改善起到了无法 比拟的作用。不过，好处总是伴随着损失。常规溶剂都有相当大的挥发性，每年 向大气中排放的挥发性有机化合物( v o c s ) 估计达2 0 0 0 万吨之多，这些排放造成的 负面影响包括全球气候变化、城市空气质量的变坏、人类的疾病等等。针对有机 溶剂产生的污染，目前普遍采用绿色替代溶剂技术【l 】。 近年来，一种新型绿色溶剂离子液体引起了人们的高度重视。离子液体 蒸气压低，不挥发，所以不会逃逸损失，不会造成污染，因而被誉为“绿色”溶剂。 离子液体是指在室温或接近室温下呈液态的全部由离子构成的物质，由于离子液 体不挥发、不易燃、导电性强、性质稳定、对许多无机盐和有机物有良好的溶解 性，因此在分离过程和化学反应等领域显示出良好的应用前景1 2 ，3 1 2 0 0 3 年b a s f 公司首先实现了离子液体的规模化应用【4 】，预示了离子液体作为新型的绿色工业溶 剂的大规模工业应用已经启动。 目前，已有2 0 0 多种i l s 被合成和使用，其他新型的i l s 如手性离子液体、金 属离子液体、载有催化剂的离子液体等也正在不断涌现出来。离子液体代替传统 的有机溶剂，在改善环境方面具有诱人前景，近年来，新型绿色环保的离子液体 研究越来越受到关注1 5 1 。但是，从离子液体的制备、再生和处置过程看：目前用于 制备离子液体的主要原料( 烷基取代咪唑、烷基取代吡啶、烷基取代季盐和烷基取 代铵盐等) 大多是挥发性有机物；而离子液体的再生过程主要是采用具有挥发性的 传统有机溶剂进行萃取的过程；某些离子液体本身是有毒且难以生物降解的【”】。 随着离子液体研究的深入，人们逐渐认识到离子液体作为新型绿色溶剂其自身的 绿色性问题【6 1 ，比如：离子液体作为溶剂或催化剂最终可能有一部分要流失到环 境中，对环境造成的污染会有多大，离子液体在自然界的降解性如何，以及离子 液体在生物体内的累积程度和对生物体的毒性等一系列问题已经引起广大科研工 作者的广泛关注。b e m o tr j 等1 7 人研究了几种离子溶液对淡水蜗牛生存和行为( 活 1 咪唑类离子液体对生物大分子的作用及其植物毒性研究 动和进食率) 的影响，这些结果为离子溶液进入淡水生态系统前的潜在危险评估 提供了初始信息。s y l w i as t u d z i f l s k a 等1 8 1 人用咪唑离子溶液对土壤进行人工污染， 研究毒性与疏水性的关系，这是在研究离子溶液的毒性方面，首次对土壤中有机 碳含量对水芹的影响的实验。s a n g m o kl e e 等1 9 1 人测量室温离子溶液对埃希氏菌 属大肠杆菌的相对毒性，研究指出埃希氏菌属大肠杆菌的生存能力受离子溶液的 离子种类与极性的影响，微生物对由阳离子和阴离子组成的离子溶液的抵抗力是 不同的。与阳离子溶液的特定的影响不同，溶液中阴离子化合物的影响是不定的。 季铵和吡啶类化合物对于一些细菌和真菌有显著的毒性作用，因此咪唑、嘧啶和 季铵类离子液体的潜在抗菌性越来越受到重视【9 】。离子液体的毒性在其对生态环境 的影响与应用风险评价方面起着极其重要的作用。因此，在离子液体大规模应用 前很有必要对其应用风险进行评价。 1 2 离子液体及其分类 1 2 1 离子液体的定义 离子液体( i o n i cl i q u i d ) 又称室温熔盐( r o o mt e m p e r a t u r em o l t e ns a l t ) 、有 机离子液体( o r g a n i ci o n i cl i q u i d ) 。室温熔盐的名称是从熔盐的定义派生出来的， 因为盐都是离子化合物，在熔融状态下盐由自由移动的正、负离子组成，离子液 体是室温条件下由正、负离子组成的液体，所以称为室温熔盐。有机离子液体的 名称是根据阳离子是有机离子而得来的。离子液体的定义有狭义和广义之分，狭 义定义即只针对有机离子液体而下的定义，即：离子液体是由有机阳离子和无机 或有机阴离子构成的、在1 0 0 以下呈液体状态的盐类；离子液体的广义定义，即： 在1 0 0 以下呈液体状态，含有裸离子、配位离子和超分子离子，不含挥发性液体 溶剂的体系1 1 0 】。 1 2 2 离子液体的分类 要对离子液体进行分类，首先要按照液体中移动的粒子对液体进行分类。按 此类方法可以把液体分为两大类：分子液体( m o l e c u l a rl i q u d i ，m l ) 和离子液体 ( i o n i cl i q u i d ，i l s ) ，分子液体的移动粒子是分子，离子液体的移动粒子是离子。 江苏大学硕士学位论文 目前所研究的离子液体均是由有机阳离子和无机或有机阴离子共同组合而成的液 态介质，其具体分类也可以按照阴阳离子的不同进行划分。常见的阳离子有季铵 盐离子、季鳞盐离子、咪唑盐离子等，阴离子有卤素离子、四氟硼酸根离子、六 氟磷酸根离子等。目前所研究的离子液体中，阳离子主要以咪唑阳离子为主，阴 离子主要以卤素离子和其它无机酸离子为主。根据离子液体中有机阳离子母体的 不同，可以将离子液体分为咪唑盐类、吡啶盐类、季铵盐类和季膦盐类等。根据 离子液体在水中溶解性的不同，也可以将离子液体分为亲水性离子液体和疏水性 离子液体。 与传统的有机溶剂相比，离子液体具有许多独特的性质1 1 1 1 ，如：液态温度 范围宽，从低于或接近室温到3 0 0 以上，且具有良好的物理和化学稳定性：蒸 汽压低，不易挥发，通常无色无嗅；对很多无机或有机物质都表现出很好的溶 解能力，且有些具有介质和催化双重功能；具有较大的极性可调性，可以形成 两相或多相体系，适合作分离溶剂或构成反应一分离耦合体系；电化学稳定性高， 具有较高的电导率和较宽的电化学窗口，可以用作电化学反应介质或电池溶液。 1 3 离子液体对蛋白质的作用 1 3 1 蛋白质的结构 作为一类重要的生物大分子，蛋白质主要由碳、氢、氧、硫等化学元素组成。 蛋白质是由许多氨基酸通过肽链相连形成的高分子含氮化合物，由2 0 多种氨基酸 按不同比例组合而成的，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合成具 有完整生物活性的分子。随着多肽链的氨基酸组成、数目以及排列顺序的不同， 就有其特定的空间构象，也就形成了不同的蛋白质。蛋白质结构可分为一级结构、 二级结构、三级结构及四级结构，二、三、四级结构统称为蛋白质的空间结构。 1 3 1 1 蛋白质的一级结构 蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序就是蛋白质的一级结构，也是蛋白质 最基本的结构。蛋白质的一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础， 它是由基因上遗传密码的排列顺序所决定的。但蛋白质分子并不是这样简单的一 3 咪唑类离子液体对生物大分子的作用及其植物毒性研究 条肽链，有的成环状，有的是由一条以上肽链组成。构成一级结构的主要化学键 除了肽键还有二硫键，它是由肽链中相应部位上两个半胱氨酸残基脱氢连接而成 的，是连接肽链内或肽链间的主要桥键。二硫键可以稳定蛋白分子，在蛋白质分 子中起着稳定肽链空间结构的作用，往往与生物活性有关。当二硫键破坏后，蛋 白质或多肽的生物活性就消失。一般二硫键数目越多，蛋白质结构的稳定性就越 强f 1 2 1 。 蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构，由于组成蛋白质 的2 0 种氨基酸各具特殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，当它 们按照不同的序列关系组合的时候，就可形成多种多样的空间结构和不同生物学 活性的蛋白质分子。蛋白质的生物学活性决定了每一种蛋白质的生物学活性的结 构特点。 1 3 1 2 蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧 链部分的构象。二级结构主要有a 螺旋、p 折叠、p 转角，常见的二级结构有a 螺旋和b 折叠。二级结构式通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的， 氢键是稳定二级结构的主要作用力。 仅螺旋是蛋白质中常见的一种二级结构，a 螺旋模型是1 9 5 1 年由p a u l i n g 和 c o r e y 等在研究马鬃、猪毛、羊毛等q 角蛋白时被提出来的【1 3 1 。旺螺旋肽链主链绕 假想的中心轴盘绕成螺旋状，一般情况下都是右手螺旋结构，螺旋式靠链内氢键 维持的。a 螺旋上升一圈含有3 6 个氨基酸残基。螺旋沿螺旋体的中心轴每上升一 圈相当于向上平移o 5 4n n l ，即螺距为o 5 4a n l ，每个残基沿着螺旋的长轴上升o 1 5 n l l l ，螺旋的半径为o 2 3a m 。当螺旋上升时，每个氨基酸残基沿螺旋的长轴旋转 1 0 0 0 。a 一螺旋体中氨基酸残基的侧链伸向外侧，在相邻的螺圈之间会形成内氢键， 并且氢键的取向与中心轴几乎平行。侧链的基团会影响螺旋的形成和稳定。第一 个氨基酸残基的酰胺基团c = o 基与第四个氨基酸残基酰胺基团的n h 基形成氢 键。0 【螺旋的构象非常稳定是因为a 螺旋的结构允许所有的肽键都可以参与内氢 键的形成。 d 折叠是蛋白质中常见的二级结构，是由两条或者多条几乎完全伸展的肽链平 4 江苏大学硕士学位论文 行排列，通过链间的氢键交联而形成的，也是p a u l i n g 等人提出的。b 一折叠结构的 氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之问形成。所 有的肽链几乎都参与链内氢键的交联，氢键几乎都垂直侧链的长轴。肽链的主链 呈锯齿桩折叠构象。在b 折叠体中，a 碳原子一直处于折叠的角上，氨基酸的r 基团处于折叠的棱角上同时与棱角垂直，并且两个氨基酸之间的轴心距为0 3 5n m 。 b 折叠体有两种类型，一种为平行排列，即所有肽链的n 一端都在同一边上；另一 种为反平行排列，即相邻的两条肽链方向相反。 d 转角是多肽链中常见的二级结构，广泛存在于球状蛋白质中，连接蛋白质分 子中的二级结构( 0 【螺旋和p 折叠) ，改变肽链走向的一种非重复多肽区，一般含 有2 1 6 个氨基酸残基。p 转角主要是因为蛋白质分子中，肽链经常会出现1 8 0 0 的 回折，这种回折角就是p 转角结构。它的转角部分，由四个氨基酸残基组成，弯 曲处的第一个氨基酸残基的c = o 基和第四个残基的- n h 基之间形成氢键，形成一 个不很稳定的环状结构。 1 3 1 3 蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上，整条肽链中所有原子或基团的三 维空间的排布，即多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。多肽链首先在不同 区段相邻氨基酸残基形成有规则的二级结构：a 螺旋，b 折叠，b 转角，无规则卷曲 等构象单元，然后各侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成结构域，由 两个或者两个以上的结构域形成三级结构。维系这种特定结构的作用力主要有氨 基酸残基侧链一r 上基团之间的作用力一氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫 键等。疏水键在蛋白质的三级结构中起着重要的作用。三级结构的特征主要有( 1 ) 含有多种二级结构单元；( 2 ) 具有明显的折叠层次；( 3 ) 大都是紧密的球状或椭球状 实体；( 4 ) 分子表面有一空穴( 活性部位) ；( 5 ) 疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链 暴露在分子表面。三级结构形成后，蛋白质分子才形成固有的分子形状，才具有 亲水胶体的特性。功能蛋白质的活性部位得以形成并表现出相应的生物学活性。 1 3 1 4 蛋白质的四级结构 蛋白质分子中每个具有独立三级结构的多肽链称为亚基，蛋白质分子中各个 5 咪唑类离子液体对生物大分子的作用及其植物毒性研究 亚基的立体排列及亚基接触部位的相互作用和布局，称为蛋白质的四级结构。因 亚基之间不含有共价键，亚基间次级键的结合比二、三级结构疏松，所以在一定 的条件下，四级结构的蛋白质可分离为其组成的亚基，而亚基本身构象仍可不变。 当亚基单独存在的时生物活性很小或无生物活性，只有通过聚合成四级结构时， 蛋白质才具有完整的生物活性【1 4 】。 1 3 2 蛋白质分子中的作用力 蛋白质分子的一级结构的作用力主要是共价键，肽键和二硫键都属于共价键。 而次级键是维持蛋白质的空间构象稳定的主要作用力，次级键属于非共价键。氢 键、疏水键、盐键以及范德华力都属于次级键。氢键存在于多肽链的链内和氨基 酸侧链极性基团之间，是维持蛋白质分子的二级结构如c t 螺旋、p 折叠等构象的 作用力。疏水键又称疏水作用力，不是真正的化学键。疏水键是两个不溶于水的 分子间的相互作用，指多肽链上疏水性较强的氨基酸，如苯丙氨酸、亮氨酸等。 蛋白质分子中许多的氨基酸的疏水侧链可形成疏水键，并且由于疏水效应，这些 疏水的残基常常被水带入蛋白质分子内聚集成簇，从而带动肽链的盘曲折叠，对 蛋白质三、四级结构的形成和稳定性起重要作用。 1 3 3 人血清白蛋i 刍( h s a ) 的结构特点 人血清蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，简称h s a ) 是人血浆中含量最丰富的蛋 白质之一。许多外源性及内源性药物都需要与血清蛋白进行可逆的非共价键结合 之后可以被转运至体内的各受体部位，进而发生药理作用【1 每18 1 。因此，血清蛋白 是被研究最多的蛋白质。 h s a 是5 8 5 个氨基酸残基组成的单链蛋白质，呈心形，分子量约为6 6 k d ， 约6 7 的h s a 是0 l 螺旋结构。h s a 的肽链有3 5 个半胱氨酸残基，仅仅3 4 位上 有一个巯基，其余都是二硫键。二硫键中有8 对组成交叉二硫键，只有接近n 端 的是一个单个二硫键，二硫键对维系蛋白质空间结构的稳定性起着重要的作用。 h s a 含有1 8 个酪氨酸残基( t y r ) ，在2 1 4 位上含有一个色氨酸残基( t r p ) ，n 端 位天门冬氨基酸残基( a s p ) ，c 端位亮氨酸残基( l e u ) 【1 7 ，18 1 。人血清白蛋白的晶 体结构研究表明h s a 由三个相似的结构域组成( i 、i i 、i i i ) ：i ( 残基1 1 9 5 ) ， 6 江苏大学硕士学位论文 i i ( 残基i i 一1 9 5 ) ，i i i ( 残基3 8 4 5 8 5 ) ，每一个结构域由两个亚结构域( a 与b ) 组成( 图1 1 ) ，形成圆桶状结构，几乎所有疏水性氨基酸都包埋在圆桶内部，构 成疏水腔1 1 5 l 。2 1 4 位上的色氨酸残基( t y r ) ，荧光强度易受小分子配体的影响， 从而可利用色氨酸荧光强度的变化来监测化合物在该位点的结合情况。 图1 1 人血清白蛋白的x - 射线晶体结构 f i g 1 1t h ex c r y s t a l l o g r a p h i cs t r u c t u r eo f h u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) 1 3 4 离子液体与蛋白质相互作用的研究内容 1 3 4 1 猝灭类型 荧光猝灭的类型有两种，分别为动态猝灭和静态猝灭。猝灭剂分子与荧光分 子受到激发光的激发后，跃迁至激发态时相互产生激烈的碰撞，使得荧光发生动 态猝灭的过程，随着体系温度升高而增强【14 1 。静态猝灭是猝灭剂与荧光分子发生 了基态的相互结合，产生了不发荧光或发弱荧光的复合物，能量在复合物的内部 发生了转移，荧光分子发出的荧光会被猝灭剂分子吸收，在体系温度的升高的同 时，形成的复合物会被逐渐分解掉，导致静态猝灭效应逐渐降低f 1 6 ，1 7 1 。李志勇等 【1 8 1 ：研究了在不同温度下离子液体与蛋白质相互作用的荧光光谱，结果表明离子液 体与蛋白质的相互作用是一个动态过程，蛋白质荧光的猝灭是由于离子液体和蛋 白质发生碰撞而引起的，它们之间没有形成复合物，而且猝灭常数较小，说明离 7 咪唑类离子液体对生物大分子的作用及其植物毒性研究 子液体和蛋白质之间相互作用较弱。 1 3 4 2 结合模式 ( 1 ) 位点结合模式 s c a t c h a r d 模型称为位点结合模型。若生物大分子能提供，个结合位点与小分 子结合，并且这些结合位点相互之间是独立的，不受其他结合位点是否结合小分 子的影响，也不存在相互作用、相互干扰，并且每个结合位点与小分子结合的强 度不存在什么差异，符合这些假设条件的生物大分子结合部位可以认为是等同的， 小分子与这些结合部位的结合的模式就被称为位点结合模型1 9 , 2 0 。方程式( 1 1 ) 为： 羔：k n k l ，( 1 - 1 ) 【d 】 式中，2 表示生物大分子所能提供的最大结合位点数，1 ，表示每摩尔生物大分子 平均结合小分子的摩尔数，k 为生物大分子与所研究小分子的固有结合常数，【d 】 为小分子的游离浓度。如果生物大分子与小分子只存在这种结合模式，那么根据 v d 对 ，作图，将得到一条直线。如果生物大分子与小分子存在两种结合强度不 同的位点但又相互独立时，v d 对v 作图将得到向下弯曲的曲线。一般来说，生 物大分子与小分子存在两类结合位点时比较常见。 ( 2 ) 相分配模型 p l s a v e n t o 2 1 】最早提出相分配模型，他认为牛血清白蛋白对阴离子染料的吸收 光谱和质子化常数的影响类似于表面活性剂胶束的作用，没有特定的专一性结合 位点，并且认为蛋白质是一个不同于水的微相，微相在水相中分散，小分在在微 相与水相中分配，最后达到平衡。 ( 3 ) 转移性和非专一性模型 t a i r a 2 2 1 最早提出专一性和非专一性模型，认为蛋白质能够提供专一性结合位 点和非专一性结合位点与小分子结合。专一性结合位点类似于s c a t c h a r d 模型，即 高亲合性及较小的结合位点数；非专一性结合类似于小分子在水相和有机相中的 分配，特点是亲和性小，具有无限的结合位点数。 江苏大学硕士学位论文 1 3 4 3 相关参数的计算 研究血清白蛋白与小分子相互作用，涉及到的参数有猝灭常数、结合常数、 结合位点数、能量转移效率、结合距离等，除了上面所提到的由s c a t c h a r d 方程来 计算血清白蛋白与小分子相互作用的结合常数以及结合位点数，一般还可从由以 下几个方程来加以计算。 当猝灭剂分子与血清白蛋白结合时，血清白蛋白的内源性荧光会因猝灭剂分 子浓度的增加发生有规律的猝灭，对于动态促灭，可根据一来加以计算出猝灭常 数： i f o = l + 【q 】- l + 蜒v 【q 】( 1 - 2 )f q vl 、j o l o 式中凡是不加猝灭剂时血清白蛋白的荧光强度，为加入的猝灭剂浓度为【q 】 时血清白蛋白的荧光强度，硒为双分子猝灭过程速率常数，t o 为猝灭剂不存在时荧 光分子的平均寿命，【q 】为猝灭剂浓度，b 为猝灭常数。对于静态猝灭，当血清白 蛋白与小分子发生1 ：l 的结合时，可以推导出公式： 凡伊= 1 + q q 】( 1 3 ) 式中k 为复合物的结合常数， q 】为小分子猝灭剂的游离浓度。对于一个反应 体系，难以得到小分子的确切游离浓度，计算中基本都以药物的总浓度代替，因 此使得所计算出的结果存在一定的误差。 多结合位点的情况，张勇等【2 3 】提出了一个求取结合常数及结合位点的线性回 归方程。假设血清白蛋白能提供刀个相互独立的结合位点与小分子结合，并且复 合体系中荧光强度与血清白蛋白的游离浓度成正比，则有： l o g ( f _ o - f ) ：l o g k + 脚o g q 0 - 4 ) r 式中凡和f 分别为猝灭剂不存在与存在时血清白蛋白的荧光强度，k 为蛋白 质与小分子的结合常数，【q 】为小分子的游离浓度。由于此处仍涉及到体系中小分 子的游离浓度，计算所得的结果同样存在误差。 1 3 4 4 蛋白质构象的变化 当血清白蛋白与小分子作用后，其空间构象尤其是蛋白质的二级结构很可能 9 咪唑类离子液体对生物大分子的作用及其植物毒性研究 会发生改变，从而改变蛋白质的某些特定活性功能2 4 1 。定性定量地测定蛋白质空 间构象的变化示研究小分子与蛋白质相互作用的重要内容。研究血清白蛋白结构 的变化，一般可用同步荧光法、圆二色谱法、红外光谱法或三维荧光光谱法来加 以考察1 2 8 一o l 。 圆二色谱对蛋白质立体结构变化高度灵敏，能定量的检测出蛋白质q 一螺旋与 b 一折叠的含量，从而直接反映蛋白质二级的变化情况。 红外光谱法是一种对氢键非常敏感的测定手段，而蛋白质二级结构的形成主 要依靠肤链