（环境工程专业论文）固定化藻菌生物修复富营养化水体的模拟研究.pdfVIP

武汉科技大学硕士学位论文第1 页 摘要 本研究用藻菌共固定化系统来修复富营养化水体。采用了p v a 海藻酸钠包埋固定法， 将蛋白核小球藻和栅裂藻与贫营养菌混合包埋构建藻菌共固定化体系。研究了该固定化体 系富营养化水体生物修复过程中对氮、磷和有机物的去除效率。 p v a 海藻酸纳包埋固定法操作步骤简单，操作条件比较温和，对细胞毒害作用小，固 定化小球的透光性和传质性能较好，载体不阻碍藻菌细胞的增殖，而且对细胞有保护作用。 实验中考察了藻菌共生系统在三组条件实验下对富营养水体的生物修复效果，确定了 实验的最佳条件，即藻菌均不稀释并按照1 ：1 共固定，固定化小球投加量为7 8 m u l 。并在 此条件下进行实际富营养化水体的修复实验，总氮从9 7 6 m l 下降到2 6 3 m l ，效率达 6 4 9 ；磷从1 0 5 m l 下降n o 1 3 m l ，去除率达到8 7 6 ；高锰酸钾指数从1 3 6 9 n l l 下降 n 5 0 6 m l ，效率达6 3 o 。可以看出藻菌固定化体系对富营养化水体的修复有很好的效 果，很好的起到了净化水质的作用，并且也比较经济实用。 总的来说，利用菌藻共生系统具有能耗小的优点，藻类光合作用释放出的氧气为微生 物的生长提供了丰富氧气，而微生物代谢所放出的c 0 2 成为藻类的主要碳源，又促进了藻类 的光合作用。菌藻固定化能够大大提高细菌和藻类的浓度，较好地起到净化水质的作用。 关键词：生物修复；固定化藻菌；小球藻；栅裂藻；贫营养菌；富营养化水体 第1 i 页武汉科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ee u t r o p h i c a t i o no fw a t e rb o d y sh a v en e g a t i v ee f f e c to nw a t e re c o l o g i c a le n v i r o n m e n t a n dq u a l i t yo fd r i n k i n gw a t e r c o s q u e n t l y ，t h eb i o r e m e d i a t i o no fe u t r o p h i c a t e dw a t e rb o d y i s ，i m p o r t a n ti s s u et ob es o l v e di m p e r i o u s l yi ne n v i r o n m e n tf i e l d n e o p e r a t i o no fp v a a n ds o d i u ma l g i n a t ee m b e d d e df i x a t i o ni sq u i t es i m p l e a n da c h i e v e d i nr e l a t i v e l ym i l dc o n d i t i o n s ，w h i c hh a sn ot o x i ce f f e c to nc e l l s l i g h tt r a n s m i s s i o na n dm a s s t r a n s f e rp e r f o r m a n c eo ft h es m a l lb a l l sa r eb e t t e r n o to n l yt h ev e c t o rd on o th i n d e rt h ea l g a ec e l l p r o l i f e r a t i o n ，b u ta l s oc a np r o t e c tt h ec e l l s t h ee f f e c t so fb i o r e m e d i a t i o no fe u t r o p h i c a t e dw a t e rb yi m m o b i l i z e da l g a l - b a c t e r i a l s y m b i o s i ss y s t e mw e r ec o n d u c t e du n d e rt h r e ed i f f e r e n tc o n d i t i o n s ，a n dt h eb e s tc o n d i t i o nw a s d e t e r m i n e d ，n a m e l yi m m o b i l i z e da l g a l - b a c t e r i a la c c o r d i n gt or a t i oo f1 ：l ，n e i t h e ro ft h e mw e r e d i l u t e d a n dt h eo p t i m u mr a t i oo fi m m o b i l i z e da l g a l b a c t e r i ab a l lt ow a t e ri s7 8 m l l u n d e rt h i s c o n d t i o n ，t o t o a lp h o s p h o r u sr e m o v a lc a p a c i t yf r o m1 0 5 m g lt o0 13 m g lw i t h8 7 6 ，t o t a l n i t r o g e nr e m o v a lc a p a c i t yf r o m9 7 6 m g , lt o2 6 3 m g lw i t h6 4 9 ，a n dt h ep e r m a n g a n a t ei n d e x r e m o v a lc a p a c i t yf r o m13 6 9 m g lt o5 0 6 m g lw i t l l6 3 o t h ee f f e c to fc o - i m m o b i l i z e d a l g a l b a c t e r i a ls y m b i o s i ss y s t e mt ot h eb i o r e m e d i a t i o no fe u t r o p h i c a t e dw a t e rb o d y i sv e r yg o o d ， h a dt h ef u n c t i o no f p u r i f i c a t i o nt oe u t r o p h i c a t e dw a t e rb o d y ，a n dt h i sm e t h o di sv e r yc h e a p g e n e r a l l y , a l g a l - b a c t e r i a ls y m b i o s i sh a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sn oe n e r g yc o n s u m p t i o n o x y g e nr e l e a s e db ya l g a ep r o v i d eo x y g e nf o rt h eg r o w t ho fm i c r o b e s c 0 2e m i t t e db ym i c r o b i a l p r o v i d et h ec a r b o ns o u r c ef o rt h eg r o w t ho fa l g a e t h e r e f o r e ，i m m o b i l i z a t i o no fb a c t e r i a la n d a l g a ec a ni n c r e a s et h eb a c t e r i a - a l g a ec o n c e n t r a t i o nd r a m a t i c a l l y ，w h i c hc a np l a ya ni m p o r t a n t r o l ei np u r i f y i n gw a t e r k e yw o r d s ：b i o r e m e d i a t i o n ；i m m o b i l i z e da l g a e - b a c t e r i a ；c h l o r e l l a ；s c e n e d e s m u s ；p o o r n u t r i e n tb a c t e r i a ；e u t r o p h i c a t e dw a t e rb o d y 武汉科技大学 研究生学位论文创新性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研 究所取得的成果。除了文中已经注明引用的内容或属合作研究共同完成的 工作外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：丝 日期：2 望1 2 ：芏 研究生学位论文版权使用授权书 本论文的研究成果归武汉科技大学所有，其研究内容不得以其它单位 的名义发表。本人完全了解武汉科技大学有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向有关部门( 按照武汉科技大学关于研究生学位论文收录 工作的规定执行) 送交论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅， 同意学校将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 武汉科技大学硕士学位论文第1 页 第一章文献综述 1 1 淡水资源、水污染和回用 1 1 1 淡水资源及其现状 根据联合国1 9 7 7 年统计，与人类生产生活密切且较易开发利用的湖泊、河流、浅层地 下等淡水储量仅为1 0 4 6 万亿立方米。而且在世界范围内，淡水资源在地区分布上极不平衡。 中国水资源总量约为2 8 1 万亿立方米，居世界第6 位，但人均水资源2 3 0 0 立方米，公顷均水 资源2 8 5 0 0 立方米，仅相当丁世界人均占有量的1 4 ，公顷均占有量的4 5 ，排在世界第1 2 1 位， 是世界1 3 个贫水国家之一。到本世纪中叶，按1 6 亿人口计，我国人均水资源量将比现在降 低1 4 ，约为17 0 0 立方米，淡水资源短缺的形势将更加严峻【1 】【2 】。1 9 9 9 年全国现有的6 0 0 多个 城市中约有4 0 0 个城市缺水，其中缺水严重的城市达1 3 0 多个。在中国，水资源的特点是受 季风影响，在时间和地区上分布很不均衡，洪涝和干早灾害出现频繁，农业生产不稳定， 它与人口、耕地资源和经济的分布不相匹配【3 】。 1 1 2 水污染 目前，全球范围的水体污染已经到了比较严重的程度。据报道，全世界每年约有4 0 0 0 亿立方米的污水排入江河湖泊，污染了全球径流总量的2 1 4 以上。在中国进行监测的7 8 条河流中，有5 4 条受到较严重污染【4 】【5 1 。 水在自然循环中，由非污染环境进入水中的化学物质，称为自然杂质或本底杂质；由污 染环境进人水中的化学物质，称为污染物。进入水体( 地表径流和地下径流) 中的污染物量 超过了水体自净能力或纳污能力而使水体丧失规定的使用价值时，称为水污染 6 1 。水污染 的主要来源由以下几种： ( 1 ) 向自然水体排放的各类废水； ( 2 ) 向自然水体直接倾倒的固体废弃物、垃圾堆放场所的渗出液和淋洗雨水； ( 3 ) 大气污染地区的酸雨及其它淋洗降水； ( 4 ) 大气中有害的沉降物及水溶性气体； ( 5 ) 淋洗植被后溶入了化肥和农药的( 降水) 径流； ( 6 ) 航道中船舶的漏油、废水及固体废弃物。 污水排放引起的水体污染有如下几种基本类型：需氧型污染、毒物型污染、富营养型 污染、感官型污染及酸碱和热水等其它型污染。 1 1 3 水危机与水回用 全球城市化、工业化和农业集约化的进程以及人口的剧增，从根本上导致了水污染的 同益严重，并在一定程度上改变了全球的水循环，从而导致了全球性的水危机，对人类的 发展产生了重大的影响。水危机主要表现在水资源危机、水坏境危机和水生态危机三个方 面【7 1 。 解决水资源问题的途径一般说来有三条：一是水资源开发，即通过开发新的水资源来 满足用水的需求；二是水资源合理调配，即在不增加现有水资源总量的前提下，合理调配 第2 页武汉科技大学硕士学位论文 农业、工业、环境和生活用水的比例，用有限的水资源保证最大限度的经济发展；三是水 资源再生，即在可能的范围内将使用过的水资源直接或间接的进行重复利用，从整体上减 少对水资源总量的需求。 污水可以成为一种稳定的再生水源，回用于许多方面，比较现实易行，具有普遍意义。 “污水资源化”将污水作为第二水源是解决水危机的重要途径。城市污水回用己经成为世 界不少国家解决水资源不足的战略性措施，污水回用满足了工农业和城市发展对水的需 要。城市污水回用的对象主要有以下几方面【8 】： ( 1 ) 污水用于农业灌溉； ( 2 ) 污水再用于工业； ( 3 ) 污水用于城市生活。现今再生污水可再用于城市生活的对象一般限于两方面： 市政用水，即浇洒、绿化、景观、消防、补充河湖等用水；杂用水，即冲洗汽车、建筑 施工以及公共建筑和居民住宅的冲洗厕所用水等： ( 4 ) 污水用于回注地。 污水回用针对不同的回用要求可采用不同的处理技术进行处理，包括一级处理、二级 处理和深度处理。 1 2 水体的富营养化及其危害 “富营养化”是湖泊分类与演化方面的概念。湖泊学家认为天然富营养化是水体衰老 的一种表现。过量的植物性营养元素氮、磷排入水体会加速水体的富营养化过程。在光照 和其他环境条件适宜的情况下，水中所富含的磷酸盐和某些形式的氮素足以使水体中的藻 类过量生长，在随后的藻类死亡和随之而来的异养微生物代谢活动中，水体中的溶解氧很 可能被耗尽，造成水体质量恶化和水生态环境结构破坏，这就是所谓的水体富营养化现象。 藻类所需要的无机营养与植物相同，需求量大的元素包括碳、氮、磷、氢、氧。c 0 2 是最 主要的碳源，氮源是氨氮和硝酸盐，磷源是溶解性磷酸盐类，氢和氧由水提供。藻类生长 的限制因素是氮和磷。其含量通常决定藻类的收获量，所以水体中氮、磷浓度增高会导致 水体的富营养化。事实上，现在氮磷污染所造成的水体富营养化问题已经越来越严重。新 颁布实施的污水综合排放标准( g b 8 9 7 8 1 9 9 6 ) 中对所有排放污水中的氮磷含量都作出了 明确的规定。尤其是磷酸盐( 以p 计) 的排放严格控制在0 5 m l ( 一级标准) 和1 0 m g l ( 二级标 准) 。进入水体的氮、磷来源主要有以下几个方面：工业和生活污水未经处理直接进入水 体；污水厂出水；面源性的农业污染物( 农药等) ；城市来源( 含磷洗涤剂等) 【9 1 【1 0 】。 氮和磷是造成水体富营养化的主要元素。目前我国的某些湖泊，例如太湖、巢湖、西 湖和滇池等，都出现了富营养化的现象，有些还比较严重。所以从研究废水中去除磷和氮 元素，减少和避免富营养化，具有重要的现实意义。就水体的富营养化而言，当水体中磷 的含量高于0 5 m g l 时，会加速水体的富营养化；当水体中磷的含量低于0 5 m g l 时，则能 控制藻类的生长；当水体中磷的含量低于0 0 5 m g l 时，藻类几乎停止生长。 过量的氮除了会引起水质富营养化以外，还对水环境有其它的危害： 武汉科技大学硕士学位论文第3 页 ( 1 ) 氨氮进入水体后被硝化细菌氧化而消耗水体中的溶解氧； ( 2 ) 游离氨由于会影响鱼腮中氧的传递而成为鱼类的有毒物质( 对大部分鱼类而言，水 体中游离氨对鱼的致死量为( 1 m l ) ； ( 3 ) 氨氮被氧化为硝酸盐后进入人体会形成亚硝酸盐和亚硝胺等，从而导致变性血红 蛋白血症及致变、致畸、致癌。 脱氮和除磷的方法很多，包括物理化学法、生物处理法和生物一化学联合法。物理化 学法有投加混凝剂、吹脱、离子交换等；生物处理法是利用一些微生物( 聚磷菌、硝化菌、 反硝化菌等) 的新陈代谢活动来去除氮和磷；而生物一化学学联合法则是以生物处理为基 础，投加化学药剂，以提高脱氮除磷效梨1 1 】【1 2 】。 因此提高脱氮、除磷效率是解决水体富营养化的一个关键问题。 1 3 生物脱氮除磷技术与研究现状 从世界范围看，进入2 0 世纪7 0 年代和8 0 年代以来，随着水体富营养化问题的日益突出， 水质指标系统不断严格化的趋势使废水脱氮除磷问题成为水污染控制中广泛关注的热点。 随着研究工作的进行，脱氮除磷的生物学原理的认识不断深入，诞生了许多生物脱氮除磷 新工艺，推动了生物脱氮除磷技术的发展，促进了废水生物处理技术的革新与改进。 1 4 发展趋势 在治理技术上，生物处理技术因其净化费用低，环境影响小，污染物降解效果好，在 污水处理中倍受青睐。高效、无二次污染的生物处理技术及产品的开发研究将成为河流湖 泊防治技术的发展趋势。向水体中投加具有特殊分解能力的菌种，将水体中有毒有害的物 质分解为无毒无害的物质，加速毒性物质的分解转化，不仅可提高对河流湖泊的净化效率， 还可实现对河流湖泊的生态修复【1 3 】。目前已有许多科技人员对这一技术及产品进行研究。 系列生物产品的成功研制将成为河道曝气、底泥疏浚等现有防治技术的有益补充引。 另外，随着河流湖泊水体富营养化问题的日趋严重，以脱氮除磷为主要目标的植物修 复技术将成为河流湖泊污染治理的热点，尤其在城市内河污染水体的治理中将发挥重要作 用【l5 1 。在城市内河水体中种植水生植物，一方面可以通过植物发达的根系有效地吸收n 、 p ，达到减轻和遏制水体富营养化的趋势，另一方面，通过水生植物的种植和培养，还可 以起到美化水域环境、改善城市景观的作用。在污染水体得到治理的同时，内河周边的环 境也得到美化，从而打造出一种亲水、美水的空间。 生物修复作为环境生物技术的核心部分，近年来在基础和应用研究上取得了重大进 展，展示了在实际污染控制中应用的可能性。生物修复技术和物理化学方法相比，在处理 成本上占很大优势，比如美国军事环境中心对1 万吨以上的污染土壤修复成本的研究结果 表明，异位生物修复技术成本为2 3 0 3 0 0 u s $ t ，而燃烧法的成本为7 4 0 u s $ t 【l6 。与异位生 物修复相比，原位生物修复技术成本将更低，但影响因素多，工艺条件控制难。因此，研 究开发在复杂的污染体系中快速定量检测污染物的变化和降解微生物及其群落变化的简 便方法，生物修复优化控制方法和理论将是今后环境生物技术的重要研究方向。 第4 页 武汉科技大学硕士学位论文 针对富营养化问题，在本次课题中，用两种不同的藻，即小球藻和栅裂藻，分别与菌 液共固定对受污染的湖泊水体中的氮、磷进行去除，定期监测出水中的氮、磷浓度，观察 藻类生物去除氮、磷的效果及其它的水质指标的变化情况，以确定这种生物修复方法是否 适合富营养化水体的生物修复。 1 5 藻菌共固定化体系 活性污泥法是目前广泛采用的污水处理方法，它能利用细菌对多种营养物质的吸收和 降解能力有效去除水体中的污染物。和传统的悬浮生物处理法相比，固定化微生物处理工 艺具有处理效率高，稳定性强，能纯化和保持高效菌株，生物浓度高，污泥产量少，固液 分离效果好等优点，因此受到了广泛关注。通过试验可以证明固定化硝化与反硝化混合污 泥可以实现单级生物脱氮，效果好于未固定污泥。 近年来，藻菌共固定化技术开始得到人们的重视因为实际废水是一个十分复杂的混合 体系，将藻细胞和单一菌株或混合菌群共同包埋固定在载体内，其稳定性和抗冲击能力应 当比用单一藻种处理更高【1 7 】。研究表明，两种紧密包埋在一起的微生物间进行气体分子的 交换是可能的。在藻菌共生体系中，藻类光合作用产生的氧比曝气充氧更能为细菌有效利 用，不仅可以提高细菌吸收污染物的能力，而且可以节能降耗：同时，细菌可以利用藻类 的代谢产物，并分解废水中的有机大分子，使之有利于藻类的吸收利用。因此，在共固定 化体系中，藻菌二者的共生关系应有助于提高体系对废水的抗冲击能力及去污效果【1 8 】。 藻菌共生体系 图1 1 漂菌共生体系中微生物间关系示意图 通过研究表明，将小球藻和细菌共固定于海藻酸钠与聚乙烯醇的混合液，藻细胞光合 作用产生的氧气可以被细菌有效利用，其利用效率要高于单独固定藻细胞或是细菌【1 9 】。在 这一体系中，细菌产生的c 0 2 和一些代谢产物对藻的生长有好处；载体可以吸收富集周围 环境中的营养物，同时一些代谢副产品会释放于水中，不会影响固定化细胞的生长。同时 与细菌共固定可以提高藻细胞的合成代谢活性，生产更多的氧气和硝酸还原酶，从而提高 了脱色率。另外将细菌与普通小球藻共固定于海藻酸钙载体中，会大大促进小球藻的生长： 武汉科技大学 硕士学位论文第5 页 在此体系中，小球藻的生物量大大提高了，但除氮能力却有所下降。藻类在无菌条件下 生长会明显依赖于有机氮的种类，而细菌的存在有利于转移有机氮i 。 相对于固定化藻，目前关于藻菌共固定化体系用于废水处理的报道还比少，有关其作 用机理、藻菌细胞生理特征的变化以及环境因子对体系的影响等内容尚需进一步研究。 1 6 固定化藻菌类在环境领域中的应用 1 6 1 对氮、磷等营养物的吸收去除 在废水处理领域中，传统的一级、二级污水处理技术可以有效去除污水中的b o d 、 c o d 、s s 等物质，但出水仍然含有相当多的营养物质、难降解有机物和重金属，易引起 受纳水体的二次污染。而用物理、化学方法对出水作深度处理费用太高，经济上难以接受。 o s w a l d 曾指出进一步去除氮、磷营养物的深度处理所需的费用是一级处理的4 倍，而更高 级的去除无机盐和重金属的处理所需的费用则是一级处理的8 1 0 倍【2 1 1 。而传统的生物脱氮 除磷工艺存在一定的缺陷：生物脱氮技术对污水中碳源的要求比较高，一般的城市污水碳 氮比及碳磷比较低，氮磷相对过剩，致使常规工艺对氮磷的去除效果比较低；另外一般的除 磷工艺使大量的磷从污水中转移到剩余污泥中，从根本上看仍然不能消除磷对生态环境的 影响【2 2 1 。利用菌藻共生系统如氧化塘去除水中的氮和磷具有能耗小的优点，藻类能够富集 大量氮、磷营养物，尤其对磷存在“过度吸收”现象，而且不会产生额外的污染，因此对污 水中高浓度的氮、磷有很好的去除效果对比研究表明，不同的藻类对氮、磷的净化效率是 不同的，以小球藻和栅裂藻的去除率最高【2 3 1 。这两种藻都可以耐受生活污水并利用其中的 营养物质生长，同时去除污水中大部分的c o d 、t n 、t p 。藻类光合作用释放出的氧气为 微生物的生长提供了丰富的氧源，而微生物代谢所放出的c 0 2 成为藻类的主要碳源，又促进 了藻类的光合作用。但通过国内外研究发现，一般菌藻共生系统存在着一系列问题，如生物 量少，藻类难以收获、水力停留时间长、占地面积大。菌藻固定化能够大大提高细菌和藻 类的浓度有效地利用菌藻的共生关系解决以上问题，较好的去除水中的n 、p 等营养物质【2 引。 1 6 2 去除污水中难降解有机物 有研究表明，多数藻类既可以单靠光照和二氧化碳进行正常的自养生长，也可以利用 有机碳源进行异养条件下的繁殖，其生长速率在这两种情况下都能达到最大。a b e l r o v i c h 曾指出藻类所需碳源大约有2 5 5 0 来自于对有机碳的异养代谢【2 5 1 。污水中的有机化合物 可作为藻类生长所需的重要碳源，因此藻类可以富集和降解农药、烷烃、偶氮染料、淀粉、 酚类、邻苯二甲酸醋及金属有机污染物等多种有机化合物。较之悬浮态藻，固定化藻具有 去除率高，可耐受毒物浓度高等特点【2 6 1 。刘厚f f l 等对藻类降解偶氮染料的机理进行了初步 探讨，认为藻类不但能够通过光合作用为好氧细菌的降解作用提供氧气，而且能够单独降 解偶氮染料，其降解机理与细菌一样。h u a n g 等用海藻酸盐固定化小球藻降解偶氮染料， 并研究了固定化藻细胞的生理学特型2 7 j 。 l i 等研究了固定化小球藻对氯化丁基锡的生物吸收和降解能力，认为固定化藻体系可 用来去除水体中的t b t 、d b t 和m b t 等有机物。h u a n g 等用海藻酸盐包埋固定盐泽螺旋藻 第6 页武汉科技大学硕士学位论文 去除水体中的三苯基锡，发现去除效率可达6 8 ，而且与悬浮态藻相比，固定化藻细胞的 生长速率、叶绿素、硝酸还原酶和藻蓝蛋白含量都有所提高【2 8 1 。 1 6 3 对重金属的富集和去除 藻类能够大量吸收和富集污水中的锡、汞、铜、锡、锰、锌、钻等多种重金属，富集 倍数可达几千倍，其富集重金属容量可达藻千重的1 0 。关于藻类富集金属元素的机理， 李志勇等认为主要包括生物吸附和主动运输，而物理吸附、被动扩散和表面沉积也有- d , 部分贡献【2 9 1 。g e o f r e y 等研究了固定化海生小球藻对放射性同位素6 0 c 0 2 + 、5 4 m n 2 + 和6 5 z n 2 + 的去除动力学，认为重金属首先在藻细胞表面被动吸附，随后通过主动转运进入藻细胞内 部。与悬浮态藻相比，固定化藻细胞的代谢加强，代谢产品量提高。促进了细胞对金属的 需求，因而能够积累更多的金属并增加藻细胞对重金属毒性的抗性，从而更有效地去除污 水中的金属。w i l k i n s o n 等用海藻酸盐固定化小球藻去除水中的h g ，1 2 天后去除率有9 9 p 。 c o s t a 等用海藻酸钠固定化小球藻吸收z n ，c d 和a u ，发现在6 0m i n 之内即能完全吸附。 h a s h i m 等用p v a 固定化马尾藻来进行c u 吸附与解吸的多次循环证明了固定化生物吸附c u 离子的能力，说明固定化藻类用于富集金属实际上是起着生物离子交换树脂的作用p 。 1 7 本论文所研究的内容与意义 武汉市区内部分湖泊自身污染严重，己给社会经济和生态环境带来很大影响。本课题 即针对这一问题，结合武汉市的实际情况，在全面查阅国内外相关资料的基础上，选择以 生物修复治理湖泊污染作为研究课题，旨在利用固定化藻菌对污染湖泊水体生物修复的应 用基础研究上取得新突破，并在生产实践中推广应用。本选题为固定化藻菌生物修复富 营养化水体的模拟研究。着眼于湖泊水体富营养化污染问题，将固定化技术应用于藻菌 共生系统，试图提供一种简单、高效、节能的生物法脱氮除磷新工艺。实验总体分为两部 分进行，在第一部分中对固定化体系本身的耐受能力和对水体处理的最佳条件进行了探 索，并确定最佳处理的综合条件，在第二部分中结合第一部分的最佳处理条件对富营养化 湖水进行了模拟处理和理论分析。其中在第一部分中，对于固定化体系的耐受性探索选用 了实际的生活污水，细菌液为城市污水处理的活性污泥液，其主要原因在于生活污水的氮、 磷含量高有利于考察固定化体系的耐受能力，而选用活性污泥主要是便于生活污水的处理 效果研究；在第二部分中，固定化体系最佳处理条件的探索所用为实际的富营养化湖泊水 体，细菌液为富营养化湖水人工暴起而得的贫营养菌液，其主要原因是便于实际研究和应 用。 经固定化后的藻菌共生系统作为一种优化后的生物修复技术拥有着广阔的应用前景 在治理技术上，其因其净化费用低，环境影响小，污染物降解效果好，在污水处理中倍受 青睐【3 2 】【3 3 】。高效、无二次污染的生物处理技术及产品的开发研究将成为河流湖泊防治技术 的发展趋势。 武汉科技大学硕士学位论文第7 页 第二章材料与方法 2 1 藻菌固定实验的材料与方法 2 1 1 材料 1 ) 小球藻和栅裂藻：来自本试验室自主培养；2 ) 活性污泥：取自周家大湾污水处理厂二沉 池回流污泥；3 ) 菌：取自武汉某湖湖水经曝气两周得到的贫营养菌液；4 ) 聚乙烯醇( p v a ) ： 天津市天大化工实验厂；5 ) 海藻酸钠：浙江永嘉精细化工二厂，化学纯；6 ) 脱水c a c l 2 颗粒。 2 1 2 藻种培养 小球藻属于绿球藻目，小球藻科，小球藻属，为单细胞、球形。栅裂藻属于绿藻目， 栅藻科，栅藻属。本次试验的藻种经过无菌操作接种于s e 培养基锥形瓶中3 7 】【3 8 】。调节培养 箱温度到2 4 0 c 士2 0 c ，光强为4 0 0 0 叫x ，光暗比为1 2 ：1 2 。培养后用于固定化实验。其中s e 培养 基的配置见表2 1 表2 1s e 培养基的配置 名称含量 n a n 0 3 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 m g s 0 4 7 h 2 0 c a c l 2 2 h 2 0 k h 2 p 0 4 n a c l s o i le x t r a c t f e c l 3 6 h 2 0 f 争一e d t a a 5 s o l u t i o n 木 d i s t i l l e dw a t e r 0 2 5 9 o 0 7 5 9 0 0 7 5 9 0 0 2 5 9 0 1 7 5 9 0 0 2 5 9 4 0 m 1 0 0 0 5 l m l 1 9 5 8 土壤提取液的配置方法：取花园土未施过肥0 5 k g 置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水 1 0 0 0 毫升，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热2 小时，冷却数小时在无菌条件下过滤， 取上清液，将灭菌蒸馏水加入上清液至总体积1 0 0 0 毫升【3 9 】【4 0 1 。土壤提取液保存在4 。c 备 用。a 5 溶液的成分见表2 2 ( 添加1 0 0 m l 的蒸馏水) 。 表2 2a 。溶液的成分 h 3 8 0 3 2 8 6m g m n c l 2 4 h 2 0 z n s 0 4 7 h 2 0 c u s 0 4 5h 2 0 ( n h 4 ) 6 m 0 7 0 2 4 4 h 2 0 18 1m g 2 2m g 7 9m g 3 9m g 第8 页武汉科技大学硕士学位论文 将e d t a 和f e c l 3 6 h 2 0 分别溶于水和h c l ( 0 1 r q ) ，混匀即可， e d t a f e 的配置方法见2 3 。 表2 3e d t a f e 的配置方法 n a e e d t a l g d i s t i l l e dw a t e r f e c l 3 6 h 2 0 h c l ( o 1 n ) 5 0 m l 8 1m g 5 0 m l 2 1 3 藻类计数 仪器与材料：显微镜、血球计数板、菌液。 2 1 3 1 血球技术板的结构与计算方法 血球技数板是一块比普通载玻片厚的特制片制成。玻片中央刻有四条槽，中央两条槽 之间的平面比其他平面略低，中央一小槽，槽的两边的平面上各刻有9 个大方格。中间的 一个大方格为技数室，它的长河宽各为l m m ，深度为o 1 m m ，其体积为o 1 m m 3 。计数室 规格：把一大方格分成2 5 中格，每一中格分成1 6 小格，总共4 0 0 小格。 计算方法： 细胞数m l = ( 8 0 小格内的细胞数8 0 ) x 4 0 0 1 0 0 0 稀释倍数 2 1 4 细菌菌落总数( c f t j ) 的测定 仪器和材料：无菌培养皿l o 套、无菌移液管l m l 2 支、1 0m l1 支、营养琼脂培养基 1 瓶、活性污泥或土壤或湖水1 瓶、无菌稀释水9 0 m l l 瓶、9 m l 的5 管、接种灯、酒精灯、 恒温箱。 2 1 4 1 操作方法 ( 1 ) 稀释水样；( 2 ) 接种；( 3 ) 计菌落数，将培养2 4 h 的平板取出计菌落数。 2 1 4 2 菌落计数及报告方法 用肉眼观察，计平板上的细菌菌落数，也可用放大镜和菌落计数器计数。记下同一浓 度的三个平板的菌落总数，计算平均值，再乘以稀释倍数即l m l 水样中的细菌菌落总数。 2 1 5 包埋剂的选择与配制 2 1 5 1 包埋剂的选择 微生物的固定化方法有载体结合法、交联法和包埋法。载体结合法是通过物理吸附、 化学或离子结合的方法将细胞固定在载体上，操作简单，对细胞活性影响小，但能固定的 细胞量有限【4 1 1 。交联法是利用两个功能团以上的试剂与细胞表面的反应基团形成共价键固 定细胞，此法反应激烈，对细胞活性影响大，而且交联剂大多价格昂贵【4 2 】【4 3 1 。包埋法是使 细胞扩散进入多孔性载体内部，或利用高聚物在形成凝胶时将细胞包埋在其内部，该法操 作简单，对细胞活性影响小，固定化小球机械强度较高，因此是目前使用最广泛的固定化 方法【4 4 1 。理想的固定化载体应满足以下要求：1 、固定化过程简单，易于制成各种形状， 操作条件温和，能在常温常压下进行；2 、固定化过程中及固定化后对微生物低毒或无毒； 3 、性质稳定，机械强度高，抗微生物分解，生物保留量高，细胞漏出少；4 、不溶于溶液， 武汉科技大学硕士学位论文第9 页 对其他生物的附着性低；透光性和透气性良好，传质性能好，最好价格低廉。目前采用的 固定化载体材料可分为天然高分子多糖类和合成高分子化合物【4 5 1 。天然高分子多糖类材料 主要包括海藻酸钠和卡拉胶，用其进行固定化具有操作简便、对微生物毒性小、生物密度 高等优点，在以往研究中被广泛采用，但其凝胶机械强度低，易磨损，可被微生物降解， 当污水中某些特定物质浓度提高时容易发生破损。尤其是海藻酸盐凝胶，易溶于较高浓度 的磷酸盐溶液中，不适于处理城市生活污水【4 6 1 。合成高分子化合物中常用作固定化载体的 有聚丙烯酞胺、光硬化树脂等。它们具有机械强度高、抗微生物分解性能好、化学性质稳 定的突出优点，但聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大，而且成形 的多样性和可控性不好【4 7 】。 2 1 5 2 包埋剂的配制 本次试验的包埋剂所采用的是p v a 与海藻酸钠，具体配置方法如下：( 1 ) 取两个5 0 0 m l 的烧杯( 烧杯1 ，烧杯2 ) 分别向其中加入2 5 0 m l 的蒸馏水。( 2 ) 用电子天平称取2 0 克的海藻 酸纳，按4 的比例将其投入烧杯1 中。( 3 ) 用电子天平称取3 克的p v a ，按0 6 的比例将其 投入烧杯2 中。( 4 ) 将烧杯1 ，2 分别放入沸水浴同时用玻璃棒搅拌进行溶解。两个小时后， 将两个烧杯中的溶液混在一起，再进行溶解1 个小时。( 5 ) 将两者的混合液倒入1 0 0 0 m l 的锥 形瓶中，用棉花塞紧瓶口，再用牛皮纸把瓶口包起来。( 6 ) 将该锥形瓶放入手提式不锈钢蒸 汽消毒器进行消解1 h 。 2 1 6 藻菌固定的方法 ( 1 ) 分别取一定体积的藻类细胞浓缩液，新鲜活性污泥的浓缩液两者的等体积混合液 与预先灭菌的包埋剂均匀混合，形成混合液。 ( 2 ) 将该混合液分批次倒入套上针头的滴定管中，调整流量后，将水凝胶滴入慢速搅 拌下的2 c a c l 2 溶液中。即形成一定直径一定数量的小球藻或栅裂藻与活性污泥混合液的 固定化胶球，胶球直径在3 m m 左右。 ( 3 ) 十五分钟后分离出小球，表面光滑，半透明，有良好的弹性和机械强度。 ( 4 ) 再将小球用蒸馏水清洗2 次。 2 2 测定的方法与步骤 为了更好的观察与检测固定化胶球对水体污染的净化能力，需要通过测量一些水质指 标来分析说明。常用的水质指标有；n h 4 + - n 、n 0 3 - n 、p h 、c o d m n 、t p 、t n 等。 2 2 1n h 4 + - n 的测定 纳氏试剂比色法：l 、水样预处理：无色澄清的水样可直接测定，本实验主要以湖水 为实验对象，其浑浊度较低，故预处理水样般取为5 0 m l ，以便不会使用过多的水样进行 测定；2 、标准曲线的绘制；3 、水样的测定：分取适量的水样( 使氨氮含量不超过o 1 m g ) ， 进行比色测定；4 、空白试验：以无氨水代替水样，作全程序空白测定。标准曲线如下图 2 4 所示： 第1 0 页武汉科技大学硕士学位论文 o0 2 0 40 60 8 吸光值( a ) 图2 4 氨氮的标准曲线 2 。2 2t p 的测定 采用钼酸盐试剂比色发测定水体中t p ，标准曲线如下图2 5 所示： 2 2 3t n 的测定 00 20 40 60 8 嚼光值f a 、 图2 5 总磷的标准曲线 采用碱性过硫酸钾发测定水体中的t n ，其中方法和计算为在波长2 2 0 和2 7 5 n m 处测定吸 光度后，分别按下式求出除零浓度外其他校准系列的校正吸光度a 。和零浓度的校正吸光度 a b 及其差值a ， a s = a 。2 2 0 2 a s 2 7 5 ；a b = a b 2 2 0 - - 2 a b 2 7 5 ；a r = a s a b 式中：a 。2 2 标准溶液在2 2 0 n m 波长的吸光度； a 。2 7 5 标准溶液在2 7 5 n m 波长的吸光度； a b 2 2 旺零浓度( 空白) 溶液在2 2 0 n m 波长的吸光度； a b 2 7 5 零浓度( 空白) 溶液在2 7 5 n m 波长的吸光度。 标准曲线如下图2 6 所示： 武汉科技大学硕士学位论文第1 1 页 oo 20 a0 60 8l1 2 吸光值( a ) 图2 6 总氮的标准曲线 2 2 4 高锰酸盐指数的测定 采用高锰酸钾滴定法测定水体中的c o d m n 具体的计算过程如下： 水样不经稀释： c o d 舻竖! 竺二堡! 茎二! 竺! 兰鱼! ! 塑：竺。竺，：! 兰! 竺竺 1 0 0 如果水样用蒸馏水稀释，可用下式计算： ( 0 2 ，m g 甩) c o d 蛐= 【( m t 堕兰一l _ w 竺! 茎二! q p ! 垒坚塑箜! 坐：! 墅竺( o ：，m g l ) 式中v l 为高锰酸钾液滴定用量：k 为高锰酸钾液的校正系数；v s 为水样体积( m l ) ；f 为稀释水样时蒸馏水和溶液总体积的比值。 注意事项： 高锰酸钾法是条件实验，测定应严格按规定条件进行操作，否则实验结果不能进 行比较。 所取水样，要求在测定中回滴过量的n a 2 c 2 0 4 标准溶液时所消耗k _ m n 0 4 溶液的体积 在4 6 m l 左右，如果所消耗体积过大或过小，都需要重新再取适量的水样进行测定。 2 2 5n 0 3 - n 的测定 采用酚二磺酸试剂显色法测定水体中的硝酸盐氮，其标准曲线如下图2 7 所示： 第1 2 页武汉科技大学硕士学位论文 重 丢 k o z oo 20 40 60 8 吸光度( a ) 图2 7 硝酸盐氮标准曲线 2 3 实验内容及条件 2 3 1 固定化小球的耐受性及不同投放量实验 ( 1 ) 将取自罗家桥的原水样( 原磷浓度为：4 m g l 左右) 与蒸馏水分别按3 ：5 、1 ：3 、l ：7 的比例进行配水，从而得到磷浓度分别为：1 5 m g l 、1 m l 、0 5 m g l 的三份水样。 ( 2 ) 将这三份水样装入三个2 5 l 的玻璃容器中。作三组水样的目的是想考察在不同磷 浓度下，固定系统对磷的耐受程度。 ( 3 ) 将制好的小球按2 ：4 ：6 的比例( 约9 0 m l 、1 8 0 m l 、2 8 0 m l ) 投放入三个玻璃容器中， 把它们放于楼顶的木桌上。 ( 4 ) 在玻璃容器上盖上玻璃片，以防止试验对象受到污染。在玻璃片与玻璃容器之间 挚以木方，以便空气可以流通。 2 3 2 固定化体系内藻菌体积比实验 即藻菌数量比对富营养水体的影响。取武汉动物园内湖水为水样，藻菌比分别为l ：l 、 1 ：2 、2 ：1 进行对比。藻类分别选用小球藻与栅裂藻，菌液选用天然湖水经人工曝气两周而 得的菌液。在小桶中加入4 5 l 水样，再分别加入3 5 0 m l 固定化小球，在室外进行实验。小 球藻计数：( 8 7 8 8 0 ) 4 0 0 x1 0 0 0 - - 4 3 9 x1 0 6 个m l 。栅裂藻计数：( 7 5 6 8 0 ) 4 0 0 1 0 0 0 = 3 7 8 1 0 6 个m l 。细菌计数1 0 9 x1 0 7 c f u m l - 1 。原水水质：t p = 0 7 2 m g l 、t n = 8 5 3 m g l 、 n h 4 + - n = 5 7 4 m g l 、n 0 3 n = 0 2 7 m g l 、p h = 7 31 、c o d m n = 13 9 0 m g l 、u v 2 5 4 = 0 19 5 、d o = 9 4 5 m g l 。 2 3 2 不同藻菌浓度实验 藻菌经不同倍数稀释后的固定化体系对富营养水体处理的影响。取武汉动物园内湖水 为水样，将小球藻与菌液分别稀释l 倍、2 倍、4 倍、8 倍、1 6 倍；小球藻与菌液比例为l ：1 ， 菌液选用天然湖水经人工曝气两周而得的菌液。在小桶中加入4 5 l 水样，再分别加入3 5 0 m l 固定化小球，在室外进行实验。小球藻计数( 8 6 7 8 0 ) 4 0 0 1 0 0 0 = 4 3 4 1 0 6 个m l 。细 武汉科技大学硕士学位论文第1 3 页 菌计数1 0 9 x1 0 1c f u m u l 。原水水质：t p = 0 7 3 m l 、t n = 9 3 2 m g l 、n h 4 + - n = 5 9 7 m l 、 n 0 3 - n = 0 2 6 m l 、p h = 7 2 0 、c o d m n = 1 3 4 4 m l 。 武汉动物园内湖水为水样，将栅裂藻与菌液分别稀释1 倍、2 倍、4 倍、8 倍、1 6 倍；栅 裂藻与菌液比例为1 ：1 ，菌液选用天然湖水经人工曝气两周而得的菌液。在小桶中加入4 5 l 水样，再分别加入3 5 0 m l 固定化小球，在室外进行实验。栅裂藻计数( 7 4 8 8 0 ) x 4 0 0 1 0 0 0 = 3 7 4 x1 0