（农产品加工及贮藏工程专业论文）黑曲霉Uγ2Aspergillus+niger+Uγ2菊粉酶的分布与性质研究.pdf

摘要 本实验建立了一套黑曲霉u y 2 ( a s p e r g i l l u sn i g e r uy 2 ) 胞壁、胞外菊粉 酶提纯方法，对细胞所产菊粉酶分布进行了研究，并系统的研究了其酶学性质。 细胞发酵液经过超滤、盐析、脱盐、离子交换层折、分子筛层析之后，经毛细管 电泳鉴定，得到了纯的胞外酶组分；细胞破碎液经过超滤、盐析、脱盐、离子交 换层析、分子筛层析、离子交换层析之后，也得到了纯的细胞内菊粉酶组分。所 得酶蛋白，经毛细管电泳鉴定，为单一的蛋白吸收峰其中。所得胞壁、胞外菊粉 酶经纯化均为单一组分，胞外提纯7 7 l 倍，纯品比活力为2 2 0 5 u m g ，胞壁提纯 7 0 0 4 倍，纯品比活力6 9 3 4 u m g 。结合实验室前期工作，确定所得细胞内组分 为胞壁组分，胞外组分与原始菌株相比，由原来的多个组分变为单个组分。 经s d s p a g e 测定，菊粉酶的胞壁组分分子量为1 0 8 7 k d 、胞外组分为 6 2 3 k d 。硫酸苯酚法测定糖基化程度，胞外为2 4 1 6 ，胞壁为1 2 3 8 。胞壁、 胞外酶组分的表面电荷性质有较大差异，毛细管电泳测定胞壁酶组分等电点为 5 | 3 7 ，胞外酶组分等电点4 1 0 。分别以菊糖、蔗糖为底物，测定酶的动力学为对 菊糖而言，经双倒数作图，胞外k m 值为0 8 4 3 7 5m m o l 1 ，v m a x 为 5 2 0 8 m m o l l - 1 ，胞壁酶菊糖k m 为0 6 3 3m m o l - l ，v m a x 为4 4 6 4m m o l l - 1 ；对 蔗糖而言，胞外k m 为5 1 5 1 5m m o l l - 1 ，蔗糖v m a x 为7 5 7 5m m o l l 1 ，胞壁蔗 糖k r n 为7 4 8 0 9m m o l l ，蔗糖v m a x 为7 6 3 3m m o l l - 1 ；在p h 3 5 的范围内， 胞壁、胞外酶活很高，在中性时，胞壁，胞外酶活都很低，它们的的最适p h 值 胞壁为p h5 0 ，胞外4 5 。胞壁、胞外最适温度均为6 0 ，它们在5 0 7 0 时酶活 性较高：在p h3 一- 7 的范围内，它们的稳定性很好，室温保温2 4 h ，基本无酶活 力丧失。胞壁酶的热稳定性略优于胞外，高温保温7 0 m i n 后，胞壁酶活的丧失程 度低于胞外。c u 2 + 对胞外酶有较强的抑制作用，对p b “无反应；胞壁对p b 2 + 较敏 感，对c u z + 无反应。 关键词：黑曲霉；菊粉酶：酶学性质；纯化： d i s t r i b u t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fi n u l i n a s eo n a s p e r g i l l u sn i g e ruy 2 a u t h o r ：h o n g w e iy u t u t o r ：y i n g m i nj i a m a j o r ：f o o dm i c r o b i o l o g y a b s t r a c t t h i se x p e r i m e n th a v ee s t a b l i s h e das e to fm e t h o do fp u r l f ”n gt h a te x t r a c e l l a r a n dc e l l w a l li n u l i n a s eo na s p e r g i u u sn i g e ruy 一2 ，a n dh a v es t u d i e di t sp r o p e r t i e s c e l lf e r m e n tl i q u i d p r o c e s se x c e e dt os t r a i n ，u l t r a f i l t r a t i o n a m m o i u ms u l f a t e f r a c t i o n ，a n dt h e i o n e x c h a n g e o f c h r o m a t o g r a p h y , s e p h a d e x g 一1 0 0 c h r o m a t o g r a p h y rb yc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sa p p r a i s a l ，h a v eg o t t e np u r e i n u l i n a s eo fe x t r a c e l lg r o u pt od i v i d e ；t h ec e l lb r o k e nl i q u i de n d u r e st oe x c e e d u l t r a f i l t r a t i o n ，a m m o i u m s u l f a t ef r a c t i o n ，i o n c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y o n d e a e c e l l u l o s ea n dt h e s e p h a d e x g 一1 0 0c h r o m a t o g r a p h y t h ei o n c h a n g e c h r o m a t o g r a p h yo nd e a e c e l l u l o s ea f t e r ，h a v ea l s og o t t e np u r ei n u l i n a s eo fc e l lw a l l g r o u p a n dt h ee x t r a c e l l a ra n d c e l l w a l la r eb o t hp u r eg r o u p t h ee x t r a c e l l a ri n u l i n a s e w a sp u r i f i e dt o7 7 1f o l d si t ss p e c i f i ca c t i v i t yw a s2 2 0 5 u m g t h ec e l l w a l li n u l i n a s e p u r l f y7 0 ，0 4t i m e s t h es p e c i f i c a c t i v i t yw a s6 9 3 4u m g b yu s i n gs d s p a g et om e a s u r e t h em o l e c u l a rw e i g ho fc e l l w a l li n u l i n a s ew a s 1 0 8 7k d ，a n dt h ee x t r a c e l l a ri n u l i n a s ew a s6 2 3m t h ee x t r a c e l l a rp r o t e i nh a s 2 4 1 6 s u g a ra n dc e l l w a l lp r o t e i nh a s1 2 3 8 s u g a rb a s eo fs u l p h u r i ca c i d b e n z 0 1 t h es u r f a c eo fe l e c t r i cc h a r g eo fb o t hp r t e i n sa r ev e r yd i f f e r e n t c a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s em e n s u r a t i o n t h ei s o e l e c t r i c p o i n to f c e l l w a l ii n u l i n a s ei s 5 3 7 e x t r a c e l l a ri n u l i n a s et h e4 1 0o fi s o e l e c t r i cp o i n t t ob ef o ri n u l i ne x t r a c e l l a ri n u l i n a s e k mv a l u ei s0 8 4 3 7 5m m o l l - 1 ，v m a xi s5 2 0 8m m o l l - 1 c e l l w a l li n u l i n a s ek mi s 0 6 3 3m m o l l 一，v m a xi s4 4 6 4m m 0 1 l 。；f o rs u c r o s e ，e x t r a c e l l a rk mi s5 1 5 1 5 m m o l l 1 ，v m a xi s7 5 7 5m m o l o l lc e l l w a l l ，i n u l i n a s ek mi s7 4 8 0 9m m o l l 1 v m a x i s7 6 3 3m m o l 。l - 1 ；i np hv a l u e3 - 5s c o p e ，t h ea c t i v i t yo fb o t he n z y m e si sv e r yh i g h ， w h e ni ti sn e u t r a l ，b o t ha r el o w ，t h em o s to p t i m u mp hv a l u ec e l l w a l li n u l i n a s ei s p h 5 0 ，e x t r a c e l l a ri n u l i n a s e4 5 ，f o rt h ec e l l w a l li n u l i n a s ea n de x t r a c e l l a ri n u l i n a s e t h em o s to p t i m u mt e m p e r a t u r e a r eb o t h6 0 t h e mi n5 0 7 0 e n z y m ea c t i v e h i g h e r ；i np hv a l u e3 - 7s c o p e ，t h e i rs t a b i l i t yi sv e r yg o o d k e e p i n g2 4ho fr o o m t e m p e r a t u r el o s e sb a s i c a l l yw i t h o u ta c t i v i t y i ti so u t s i d et h a tt h es u m m a r yo ft h e r m a l s t a b i l i t yc e l l w a l li n u l i n a s ei sb e t t e rt h a ne x t r a c e l l a ri n u l i n a s e ，a f t e rk e e p i n 9 7 0m i no f h i g ht e m p e r a t u r et h ea c t i v i t yo fc e l l w a l li n u l i n a s el o s el e v e li sl o w e rt h a ne x t r a c e l l a r i n u l i n a s e c u 2 + f o re x t r a c e l l a ri n u l i n a s eh a v em o r es t r o n gi n h i b i t i o n ，f o rp b 2 + h a v en o e f 诧c t ：t h ec e l l w a l li n u l i n a s ef o rp b 2 + i ss e n s i t i v e ，f o rc u 2 + d on o th a v ee f f e c t k e y w o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ；i n u l i n a s e ；p r o p e r t i e so fe n z y m e ；p u r i f i c a t i o n ； 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑j b 壑些太堂或其它 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：寸屹一伟签字日期：1 卅年i 月1 ，谓 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解酒j b 盛些盔堂有关保留及使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门( 机构) 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查( 借) 阅。本人授权泣j b 盛些盘堂可以将论文的全部或部分内容编入有关数据厍进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 学位论文作者签名：厅奴伟 签字日期：n 甲年6 月1 调 导师签名 签字日期： w 叶年占月、) 日 黑曲霉uy 一2 ( a s p e r g i l l u sn i g e ruy 一2 ) 菊粉酶的分布与性质研究 1 1 目的意义 1 引言 菊糖又称菊粉，是一种果糖聚合物，以b 2 ，1 糖苷键线性连接， 还原末端被一葡萄糖残基封闭，一般链长约2 5 个果糖单位，其含量尤 以菊芋为高。菊芋俗名洋姜，菊科，向日葵属，多年生草本植物。菊芋分 布广，在我国南北各地均有栽培；适应性强，耐贫瘠，耐寒，耐旱；种 植简易，一次播种多次收获：产量较高。据测定，鲜菊芋块茎中含水 7 9 8 、碳水化合物1 6 6 、蛋白质1 o 、粗纤维0 6 、灰分2 8 ( 其 中每1 0 0 9 鲜菊芋块茎含c a ：4 9 r a g 、p ：1 1 9 m g 、f e ：8 4 m g 等) 及一定 量的维生素( 其中每l o o g 鲜菊芋块茎含v b l ：0 1 3 m g 、v b2 ：0 0 6 m g 、 v p ：o 6 m g 、v c ：6 m g 等) 。其中干重菊芋碳水化合物的7 8 为菊糖，可 做为新的廉价糖源及功能性食品的原料加以开发。由此可见，菊芋是一 种极具开发潜力的半野生资源，但目前尚未得到很好的利用。 果糖甜度高，风味好，热值低，不易引起龋齿，糖尿病患者也可利 用，所以被广泛用于食品和医药工业。果糖可通过酸法生产得到，酸水 解法需在高温条件下进行，一方面色素重，无机离子含量高，副产物多， 分离精制难，去除它们不但增加成本，且污染环境；另一方面生产的果 糖褐变严重，改变果糖应有的风味，因此具有一定的局限性。目前工业 化生产果糖糖浆是采用玉米淀粉为原料，通过1 3 一淀粉酶和糖化酶的作 用，将淀粉水解为葡萄糖，又通过葡萄糖异构酶将葡萄糖异构转化为果 糖，生成含4 2 果糖的果葡糖浆。但此法酶促反应步骤多，转化率低，工 艺复杂，成本高。酶法的另一种方法是在温和条件下利用菊粉酶水解菊 粉，获得含9 0 果糖的糖浆，由于其果糖含量高，亦可称为“超高果葡 糖浆” ( u h f g s ) ( u l t r ah i g hf r u o t o s eg l u c o s es y r u p s ) 。高果糖浆价格低 廉，味甜、爽口，渗透压高，保藏效果好。8 0 年代，美国、法国、比利 时、加拿大等国的科学家开始研究菊粉酶酶法制果糖，其工艺简单，转化 率高，产物纯，果糖产量高，可直接生产超高果葡糖浆。由此可见菊粉酶在 果糖及果葡糖浆的生产上具有巨大的工业应用潜力。 河北农业大学硕士学位论文 1 2 研究现状 菊粉酶是一类呋喃果糖水解酶，按其作用方式，可分为两类：一类 为外切菊粉酶，它连续的从菊糖非还原末端切下一分子果糖，终产物为 果糖和少量葡萄糖；一类为内切酶，在菊糖内部随机切割，产物为低聚 果糖2 1 。菊粉酶主要产生于菊科植物和部分微生物中，在微生物中主要 分布于酵母和霉菌 3 - 5 1 从总体上看大多数微生物产生的菊粉酶包括三 部分，存在于细胞内的胞内酶、固定存在于细胞壁的细胞壁酶和分泌到 细胞外的胞外酶，不同菌种菊粉酶在细胞上的分布不一样。 关于菊粉酶的分布研究最多的是酵母和霉菌。s n y d e r 等发现克鲁维 酵母存在胞内外菊粉酶，细胞内含物的酶高于培养物的酶含量。 r o u w e n h o r s t 通过研究马克斯克鲁维氏酵母( k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u s ) 的 菊粉酶的分布，发现存在细胞外菊粉酶、细胞壁菊粉酶以及细胞壁结合 的菊粉酶 6 】。顾天成研究了枯草芽抱杆菌b 3 3 的菊粉酶分布，胞内酶 与胞外酶之比是1 ：2 。同时他研究k l u y v e r o m y c e su v g 一4 0 3 突变株所 产菊粉酶主要为胞外酶，胞外酶：胞壁酶：胞内酶= 5 7 ：1 6 ：1 。 m a r g a r u t t e s 报道酵母有2 5 的酶存在胞外，7 5 在胞壁和胞内邛 。关于 霉菌菊粉酶的分布，绝大部分是胞外组分，胞内、胞壁每组份有关报导 很少。 菊粉酶的分子生物学研究始于9 0 年代，l a l o u s 【8 】首次构建菊粉酶基 因文库，从k l u v e r y o m y c e sm a r x i n u s 中克隆出外切菊粉酶基因i n u l ，o r f 长度为1 6 6 8 b p ，编码5 5 5 个氨基酸，分子量为5 9 6 7 2 d a ，有1 6 个氨基酸为 信号肽，g + c 为4 7 2 ，共有1 3 个可能的糖基化位点。a s p e r g i l l u sn i g e r 1 2 【9 1 内切菊粉酶有两种基因i n u a 和i n u b ，为同一个基因衍生物，非常相 似，o r f 均为1 5 4 8 b p ，编码5 1 6 个氨基酸，前2 3 个为信号肽，不含内含予序 列；二者不同之处在于序列中有8 个氨基酸不同，二者g + c 分别为5 4 、 5 4 3 ，有5 个可能的糖基化位点。a s p e r g i l l u s f i c u u m 内切菊粉酶基因i n u 2 ，o r f 长度为15 5 l b p ，分子量为5 5 ，7 9 0 d a ，有2 2 个氨基酸组成信号肽， 与p e n i c i l l i u mp u r p u r o g e n “m 内切酶之间序列同源性为7 3 3 。将 a f i c u u m 内切菊粉酶基因i n u 2 】在s a c c h r o m y c e s c er e v i s i a e 中得到表达。 s c e r e v i s i a e s y s 2 6 4 2 c ( p r 4 i n u 2 ) 基因工程菌，只产内切酶，无外切酶。 a r t h r o b a t e r s p 4 1 内切菊粉酶基因o r f 长度为2 4 3 9b p ，有5 3 个信号肽氨 基酸和7 5 9 个成熟蛋白氨基酸组成，与果聚糖酶和转化酶的同源性分别 为1 3 3 、1 6 0 。p s e u d o m o n a ss p 3 5 1 内切菊粉酶基因i n u l 在e c o l i 中 黑曲霉uy - 2 ( a s p e r g i l l u sn i g e ruy 一2 ) 菊粉酶的分布与性质研究 得到表达，低聚糖产量达7 8 。枯草芽孢杆菌等中得到的外切型菊粉酶的 c d n a ，以及从产紫青霉( p p “r p u r o g e n u m ) 、黑曲霉等中得到的内粉酶c d n a 并对其序列进行了分析，发现这些酶的c d n a 序列推导出的氨基酸序列中 均存在一段保守序列一一b 果糖苷酶基序( 0 f r u c t o s s i d a s e m o t i f ) ，而且 同样的序列也存在于酿酒酵母( s n c c r d m y c g s c pr e v i s i a e ) 的转化酶以及枯 草芽孢杆菌的果聚糖酶中。在果聚糖酶和菊粉酶中该基序中的一个基团 是完全一致的，有学者预测此基团就是催化基团。b 一果糖苷酶基序及其周 围的序列是高度保守的【3 6 3 7 1 。 u h m 等通过对黑曲霉产生的胞外菊粉酶进行纯化得到3 个酶组分， 都含有4 个亚基。它们在分子量、亚单位组成以及氨基酸序列都很相似， 但是这三个组分在动力学系数上有明显的差别【l ”。e t t a l i b i 通过对无花 果曲霉产生的胞外菊粉酶纯化，得到5 个外切酶组分和3 个内切酶组分， 5 个外切酶组分具有相同的分子量7 4 0 0 0 d a ，3 个内切酶组分分子量为 6 4 0 0 0 d a 。同时还发现所有酶组分都是糖蛋白，糖含量在2 2 4 l 不 等3 1 。r o u w e n h o r s t 研究发现马克思克鲁维酵母c b s 6 5 5 6 产生的菊粉 酶一部分以胞外菊粉酶形式分泌到培养基中，另一类结合在细胞壁上， 这两类酶均有6 4k d 的多聚肽组成亚基。此多聚肽含有2 6 3 7 的碳 水化合物，细胞壁菊粉酶为四聚体，而细胞外的菊粉酶是二聚体。菊粉 酶在分泌的过程中伴随着糖基化，糖链部分占酶分子量2 6 3 7 ，胞 外酶分子量7 2 k d ( s d s p a g e ) ，脱糖基化处理后的胞外酶分子量6 4 k d ， 胞外酶以二聚体形式存在，分子量1 6 5 k d a ；胞壁结合酶为四聚体，分子 量3 3 3 k d a ，二聚体和四聚体菊粉酶k m 值( 蔗糖为底物) 分别为1 4 6 和 1 4 7 m m o l l 。【7 】。魏文玲对克鲁维酵母y 一8 5 产生的胞内菊粉酶和胞外菊 粉酶的粗酶液经过纯化，胞内菊粉酶含有两个菊粉酶组分，胞外菊粉酶 组分为单一组分【1 ”。董强通过纯化黑曲霉p 3 1 9 产生的胞外菊粉酶得到 三个菊粉酶组分5 1 。贾英民等对黑曲霉m 8 9 的提纯得到4 个菊粉酶组 分，分予量为1 0 2 6 、9 7 9 、6 1 2 、3 6 5 k d 1 ”。从细胞内菊粉酶和细胞外 菊粉酶的组成来看，菊粉酶停留在细胞内还是向外分泌不仅仅是由菊粉 酶的大小所决定的，而是与其他因素一起决定菊粉酶是否向外分泌。 对于混合酶，酶的纯化的方法有过滤、离心、沉淀、层析、电泳等。 国内外报导的菊粉酶提纯步骤一般分为：( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀、离子交换层 析及凝胶过滤色谱，聚丙烯酰胺凝胶电泳等。如白春阳采用( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀、d e a e 离子交换层析，超滤、s e p h a d e x g 15 0 凝胶过滤、f p l c 之后， 得到了2 个纯的菊粉酶组分。董强等利用( n h 4 ) 2 s 0 4 盐析、s e p h a d e x g 一2 5 凝胶过滤、d e a e 一5 2 离子交换层析，s e p h a d e x g 1 5 0 凝胶过滤、得到了3 河北农业大学硕士学位论文 个纯的菊粉酶组分i l5 1 。 离子交换层析可用来选择性地分离外切型菊粉酶和内切型菊粉酶， 通常用n a c l 进霉亍线性梯度洗脱，随着n a c l 浓度增加，内切菊粉酶先洗 出，外切酶后洗出【1 ”。有些微生物菊粉酶不宜用( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀，如 k m a r x i a n u svarb “l g a r i c u s 菊粉酶用( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀易失活，最好用丙 酮、乙醇沉淀或冷冻干燥【l9 1 。p e s s o a 等人研究了酵母胞外菊粉酶的纯化， 在离子色谱柱上，对于弱阴离子交换剂d e a e ，最佳吸附p h 为6 5 7 0 ， 对于强阴离子交换剂，最佳吸附p h 为4 0 2 ”。 为了研究酶的最佳作用条件，更好发挥酶活力的作用，进一步提高 菊粉酶的稳定性，开展了菊粉酶性质的砑究。 菊粉酶分子量报道的2 8 1 1 6 k d ，尤以4 0 7 0 k d 为多。报道的内切菊 粉酶基因也以1 5 0 0b p 左右的为多1 0 2 1 ，3 8 u ，菊粉酶为糖蛋白，含糖量为 2 6 3 7 ，低聚糖以糖营键的形式与酶蛋白中的天门冬酰胺残基相连。 所以相同菊粉酶基因编码的蛋白由于翻译后，由于修饰加工过程的不 同，可能有一定差异。纯化后的菊粉酶在s d s p a g e 和活性电泳中表现 出几条谱带是由于各组分含糖量不同所造成的，用e n d o h 去除酶蛋白 中的糖缀后，在电泳中得到单一谱带【7 l 。 v is w a n a t h a m 通过乙二醇、赤鲜糖醇、木糖醇和山梨醇对黑曲霉 t e i g h e m 菊粉酶热稳定性的研究发现，在4 m m o l l 的山梨醇中，7 5 菊 粉酶活性保存7 0 2 2 1 。王惠莲筛选得到的黑曲霉n o 2 6 分泌产生的外 切型菊粉酶在5 5 以下稳定，最适p h 3 5 【2 ”。贾英民等研究的黑曲霉 m 8 9 产生的菊粉酶的最适反应温度5 5 6 0 ，最适p h 为4 5 ，在6 0 下处理3 h 仅失活1 7 ，在p h 4 0 9 0 范围内处理1 2 h 无活力丧失 1 6 】。 a n i g e r l 2 内切菊粉酶，最适温度为4 5 ，4 0 以下稳定，5 0 以下开 始失活，8 0 时完全失活，最适p h 5 3 ，p h 4 0 7 5 时酶活为1 0 0 ，p h 3 2 时酶活为7 6 ，p h 9 0 时酶活为5 1 ，p h l 0 0 时酶完全失活 2 4 1 。王建华 等筛选到一株菊粉酶高产克鲁维酵母菌株，最适反应p h 值为4 4 ，在 p h 3 8 5 6 范围内均保持了最适p h 值活性的9 0 以上，最适反应温度 为5 5 ，在5 0 5 7 5 范围内能够保持较高活性，5 0 时酶的半衰期约 为1 6 h 【2 “。一株黑曲霉菊粉酶最适反应p h 值为5 0 ，在p h 5 o 5 8 范 围内菊粉酶稳定性很好，6 0 的菊粉酶半衰期为7 1 m i n 2 6 1 。 金属离子对于酶活性的影响是多方面的。一些金属离子对酶活性具 有一定的激活作用，也有一些金属离子对酶活性具有一定的抑制作用。 关于金属离子等对菊粉酶活性的影响依研究条件不同而有不同结论。 一些重金属离子如h g “( 0 0 2 2 m m o l l 1 ) 、a g + ( 0 3 2 m m o l l o ) 对 4 黑曲霉uy 一2 ( a s p a 瑁f ，n i g e ruy - 2 ) 菊粉酶的分布与性质研究 菊粉酶活性具有显著抑制效应，表明一s h 是菊粉酶活性中心重要基团， a 厂f c u u m 菊粉酶经纯化得到内切酶i ，h g “、a g + 、m n “强烈抑制酶活， 说明酶活性中心有一s h 基团，c a “使酶活增加，吲哚乙酸、e d t a 、磷酸 吡哆醇对酶活没有显著影响 2 ”。m n 2 + 对菊粉酶活性的正、负效应均有报 道，也有报道c u “、z n “、f e “( 浓度均为2 0 m m o l l 。1 ) 对菊粉酶活性无 显著效应， f e 3 + 可以显著提高菊粉酶活性，m 9 2 + 则能部分抑制酶活性或 效应不明显，也有报道，添加m g “提高酶活性1 1 2 8 ；n a + 使黑曲霉菊 粉酶活性提高1 5 ，b a 2 + 、p b 2 + 使酶活性显著下降28 1 。g u p t a 研究发现 米蓝霉的胞外菊粉酶受f e ”抑制，但是b a 2 + 和h 9 2 + 却促进菊粉酶的活 性29 1 。 1 3 本研究的主要内容 由于菊粉酶在食品工业中的巨大应用潜力，国外对微生物菊粉酶进行 了许多研究，包括菌株筛选，产酶条件，诱变育种，酶的分离纯化及酶学 性质，酶的固定化等方面，近1 5 年来尤其在日本，韩国和欧洲关于微生 物菊粉酶研究积累了丰富资料。我国关于菊粉酶研究始于8 0 年代，集中 在菌株筛选和酶学性质方面。虽然研究了很多菊粉酶的酶学性质，但是菊 粉酶的研究，主要还在实验室阶段，有生产意义的菌株并没有，为了提高 菌株的产酶活力，需要对菌株的产酶调控机理进行研究，促进酶最大限度 从细胞释放，实现菊粉酶的工业化生产。但系统研究菊粉酶调控机理及其 影响释放因素的报道很少。 本实验室已利用p a g e 方法，研究了菊粉酶高产菌株一一黑曲霉u y 一2 在发酵产酶过程中，菊粉酶的分布及其酶活力的动态变化，产酶的 影响因素，并发现胞内酶、胞外酶、胞壁酶的电泳迁移率有较大的差 异，这意味着3 者有着某些性质的不同，本课题的宗旨是在已有基础上 研究以下几个方面： ( 1 ) 研究黑曲霉uy 一2 菊粉酶与原始菌株菊粉酶的差异，探讨菊 粉酶高产原因。 ( 2 ) 对在产酶过程中分布在细胞不同部位的菊粉酶进行深入研 究，以期从理论上探讨菊粉酶的性质与菊粉酶的产生过程及 其释放过程的关系，同时为研究建立菊粉酶高产菌株的产酶 调控工艺提供基础。 通过以上内容的研究，预期达到以下研究结果： ( 1 ) 得到细胞内、胞外菊粉酶的纯品，系统研究其酶学性质。 ( 2 ) 探讨为菊粉酶高产原因，系统比较细胞内、胞外菊粉酶酶学 性质，研究菊粉酶高产菌株的产酶调控机理。 河北农业大学硕士学位论文 一 2 1 试验材料 2 材料和方法 2 1 1 菌种 黑曲霉( a 印p 增i l l i “5h i g e r ) uy 一2 ：由河北农业大学食品科技学院酶 工程实验室提供，该菌株是野生菌株经过四轮紫夕 线诱变和两轮6 。c 。y 射线诱变选育的菊粉酶高产菌株。 2 1 2 菊芋 采自傈定市郊区，1 1 月下旬采收，一2 0 c 保存备用a 2 1 ，3 培养基 ( 1 ) 菊芋汁培养基；鲜菊芋i 0 0g 一一1 0 0 杀酶5m i n 一一加8 0 a c 水适量搅碎一一双层1 0 0 目滤布过滤一一滤渣加适量水一一重复压榨 一一混合滤液定容到1 0 0g 菊芋出1 0 0m l 汁( 即为1 0 0 菊芋汁) 。p h 自然，0 5m p a 灭菌2 0m i n 。 ( 2 ) 斜面培养基：菊芋汁培养基添加2 的琼脂。 2 1 4 药品 菊糖( 上海生化试剂厂) d 一果糖：北京市西中化工厂； 牛血清蛋白( 上海长阳试剂厂) s e p h a d e xg 一1 0 0 、g 一2 5 ( w h a t a n ) t d e a e c e l l u l o s e 5 2 ( p h a r m a c i a ) ， p e g 2 0 0 0 0 ( 日本进口分装) ， 考马斯亮蓝g 一2 5 0 ( f l u k a ，进口分装) 其它试剂均为分析纯和化学纯。 2 1 5 仪器 7 2 1 1 3 型分光光度计：上海第三分析仪器厂 黑曲霉u y - 2 ( a s p e r g i l l u sn i g e ru y 一2 ) 菊粉酶的分布与性质研究 m i l i p o r e 超滤系统：日本密滤膜公司国际部； p h s 一3 c 型酸度计：萧山市慈龙医疗器械有限公司； h ya 恒温摇床：中国科学院武汉科学仪器厂； 高速冷冻离心机：上海安亨科学仪器厂 s w c 0 一l b 超净台：苏净集团 y x q g 0 2 型电热式蒸汽消毒器：山东新华医疗器械厂 l r h 一2 5 0 a 生化培养箱：广东省医疗器械厂 f a l 0 0 4 电子天平：上海天平仪器厂 电子恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器厂 b i o f 一2 0 1 0 型玻璃发酵罐：上海理工大学高机实业总公司 u v 1 0 0 0 紫外分光光度计( 北京瑞利仪器有限公司) ， t h 一梯度混合仪( 上海青浦沪西仪器厂) ， b s z 1 0 0 部分收集器( 上海青浦沪西仪器厂) ， e c p 3 0 0 0 三恒电泳仪( 北京六一仪器厂) ， b i o f o c u s3 0 0 0 毛细管电泳系统( 美国伯乐) 。 2 2 菊粉酶发酵方法 2 2 1 斜面培养 菊芋汁固体培养基，接种孢子，2 8 培养7 2 h 。 2 2 2 孢子悬液制备 菌种在斜面上2 8 培养3d ，刮下孢子，悬浮在灭菌的生理盐水中 振荡打散，通过带脱脂棉的漏斗进行过滤，备用。 2 2 3 摇瓶发酵试验 2 5 0m l 三角瓶装5 0m l 液体培养基，接种孢子悬液1 ，置往复式 摇床上( 18 0 r m i n 。) 3 0 培养。 2 2 4 模拟发酵 菊芋湿重1 0 0 9 ，煮沸，切碎，纱布过滤，p h 值自然，定容至1 0 0 m l ，定义 为l o o 菊芋汁。1 0 0 菊芋汁7 l ，1 2 1 灭菌3 0 m i n ，接种黑曲霉孢子，接 种浓度为1 0 4 个m l ，液态发酵8 天达产酶高峰。 河北农业大学硕士学位论文 2 3 菊粉酶提纯 2 3 1 粗酶液制备 在发酵液中加入0 1 m 0 1 l 的醋酸缓冲液( p h4 5 ) 浸酶，纱布过滤，双层 滤纸抽滤，即得滤液即为胞外酶的粗酶液。菌体洗涤后，反复冻融，醋酸 缓冲液( p h4 5 ) 浸酶，即得细胞内菊粉酶粗酶液。 2 3 2 粗酶液浓缩 取粗酶液1 0 0 0 m l ，为除去杂蛋白，并达到浓缩酶液的目的，选择截 留分子量为3 0 0 0 0 的膜，确定压力l o p s i ( 7 0 k p a ) ，进行超滤浓缩，超滤后， 缓冲液洗膜，与超滤液合并，最终得到1 0 0 m l 左右，但远远超出离子交 换的处理量，需进一步浓缩，待用。 2 3 3 硫酸铵分级盐析 为进一步除去杂蛋白，并减少离子交换的处理量，进行盐析处理。 0 0c 条件下，用4 0 硫酸铵盐析12 小时，12 0 0 0 r p m 离心除杂蛋白，9 0 硫酸 铵盐析1 2 小时1 2 0 0 0 r p m 离心，胞外沉淀用尽量少的t r is - h c l 缓冲液 ( p h 6 0 、0 1 m o l l 。1 ) 溶解；细胞内菊粉酶沉淀用尽量少的t r is h c i 缓 冲液( p h 7 0 、0 1 m o lo l “) 溶解。 2 3 4 脱盐 盐析沉淀在4 。c 下，s e p h a d e x g 一2 5 脱盐，胞外沉淀用t r is h c l 缓冲 液( p h 6 0 ，0 i m 0 1 l j ) 洗脱，胞壁沉淀用t r is h c l缓冲液 ( p h 7 0 ，0 1 m o 卜l 。1 ) 洗脱，收集蛋白洗脱液，待用。 2 3 5 离子交换层析 将含胞外蛋白洗脱液加到预先用t r is h c i 缓冲液( p h 6 0 ，0 i m 0 1 l 。1 ) 平衡的d e a e 一纤维素5 2 层析柱( 由1 6 3 0 c m ) ，用0 1 o m o l 1 n a c l ( 同种 缓冲液配制) 进行线性梯度洗脱；细胞内菊粉酶蛋白洗脱液加到预先用 t r is h c l 缓冲液( p h 7 0 ，0 1 m 0 1 l 。) 平衡的d e a e 一纤维素5 2 层析柱( 由 1 6 3 0 c m ) ，用0 0 8 m o l l 。1 n a c l ( 同种缓冲液配制) 进行线性梯度洗脱在 2 8 0 n m 测紫外吸光值，收集含蛋白各管，测定各管酶活。p e g 一2 0 0 0 0 浓缩 酶活性部分。 黑曲霉uy 一2 ( a s p e r g i l l u sn i g e ruy - 2 ) 菊粉酶的分布与性质研究 2 3 6 分子筛层析 所得浓缩液加到预先用乙酸缓冲液( p h 5 o ，0 0 5 m o l l 。) 平衡的 s e p h a d e x g 一10 0 层析柱( 由1 6 8 0 a m ) ，用同样的缓冲液洗脱，洗脱液在 2 8 0 n m 测紫外吸光值，收集含蛋白各管，测酶活，收集冷藏。 2 3 7 离子交换层析 将s e p h a d e x g 一10 0 层析得到细胞内菊粉酶活性的组分，加到预先用 t r is h c l 缓冲液( p h 7 0 ，0 i m o l l 1 ) 平衡的d e a e 一纤维素5 2 层析柱( 由 1 6 3 0 c m ) ，用o 。0 8 m o l l 。1 n a c l ( 同种缓冲液配制) 进行线性梯度洗脱 在2 8 0 r i m 测紫外吸光值，收集含蛋白各管，测定各管酶活。冷冻干燥浓 缩酶活性部分。 2 3 8 高效毛细管电泳鉴定 电泳缓冲液：硼酸缓冲液 5 0 m m o l l p h ：4 1 0 恒压模 式：1 5 k v+ 到 压力进样：2 0 p s i * s e c 石英毛细管5 0 t ami d x3 7 5 1 tmo d ，长度5 0 c m ( 有效长度4 5 5 c m ) 2 4 分析测定方法 2 4 1 酶活测定方法啪1 参照u h m 等报道的方法，取适当稀释酶液5 0 u 1 ，加入4 5 0 i - tl5 的 菊糖( 0 1 m o l l p h 4 5 ) 5 5 。c ，恒温水浴l o m i n ，1 0 0 0c 沸水浴5 m in 快 速灭活，取出迅速冷却，加入4 5 m l 蒸馏水迅速混匀；s o m o g y i n e lson 方法测定还原糖；用相同稀释的酶液预先灭活后，在上述完全相同条件 下作对照。在上述条件下每分钟水解菊糖产生lun 0 1 还原糖的量即为i 个酶活单位( o ) 。 2 4 2 可溶性蛋白测定 采用考马斯亮蓝g - 2 5 0 法结合紫外吸收 6 1 测定可溶性蛋自含量。考 马斯亮兰g 一2 5 0 法，取1 m l 待测样品，分别加入1 0 m l 刻度的试管中， 加入5m l 考马斯亮兰g 一2 5 0 试剂，混匀静置2m i n ，5 9 5n m 测其吸 光值，以牛血清白蛋白为标样。根据蛋白浓度c 对相应的吸光值a ，利 用最小二乘法建立回归方程： a = 7 0 4 10 1 c + 0 1 3 3 5 河北农业大学硕士学位论文 相关系数r 2 = o 9 9 6 4 8 ； c 的测定范围为1 0ug - 1 0 0ug r n l 。 紫外吸收法，以牛血清白蛋白为标样，2 8 0 n m 测其吸光值。利用最 小二乘法建立回归方程： a = 9 7 4 1 0 1 c 一0 0 9 9 5 r 2 = 0 9 7 7 2 相关系数 c 的测定范围为1 0 0og - 1 0 0 0pg m l a 根据回归方程由吸光值a 计算出蛋白的浓度c 。 2 4 3 酶蛋白分子量测定。1 1 s d s p a g e 法垂直板测定分子量，浓缩胶浓度4 ，分离胶浓度9 ， 交联度3 。电极液为p h 8 3 的t r is g 1 y - s d s 缓冲液电泳前样品先与样 品缓冲液按1 ：1 ( v ：v ) 混合。浓缩胶电压1 2 0 v ，分离胶电压2 0 0 v 。标准蛋 白为：兔磷酸化酶b ( 9 7 4 0 0 ) ，牛血清白蛋白( 6 6 2 0 0 ) ，兔肌动蛋白 ( 4 3 0 0 0 ) ，鸡蛋清溶菌酶( 1 4 4 0 0 ) 。 2 4 4 酶蛋白等电点测定 高效毛细管电泳测定，恒压模式： 1 5 k v + 到一压力进样： 2 0 p s i s e c 石英毛细管5 0 “mi d 3 7 5 “mo d ，长度5 0 c m ( 有效长度 4 5 5 c m ) 当电渗流p h 值与蛋白等电点一致时，蛋白不带电，其迁移率与 电渗流一致，因此，不断调整进样缓冲液p h ，当酶蛋白与对照的中性物 质迁移率一样时，即此缓冲液的p h 值与酶蛋白p h 相等。以甲醇为中性 对照，乙酸缓冲液为进样缓冲液，测定酶的等电点。 蛋白迁移率按下式计算 ：! ：二么! 竺：! ：釜! ! ：竺! ：垫：竺：! 习 t + 矗t 一彳 t 为待测蛋白迁移时间t h , m b o h 为甲醇迁移时间，垴为单个氢离子迁 移时间。 图l 显示为甲醇在p h 4 10 的迁移时间，约为8m i n l o 黑曲霉uy 一2 ( a s p e r g i l u sn i g e ruy 一2 ) 菊粉酶的分布与性质研究 蚓蹲售厘t min 图1 甲醇迁移时间 f i g 1t h em o v i n gt i m eo fm e t h a n o l 24 5 酶蛋白含糖量测定 硫酸苯酚法，以葡萄糖为标准，作标准益线。取l m l 待测样品，加 入l m l 6 苯酚，加入5 m l 浓硫酸，静置1 0 m i n ，在4 9 0 n m 测吸光值3 2 。 根据蛋白浓度c 对相应的吸光值a ，利用最小二乘法建立回归方